一种治疗肠道疾病的微生物制剂的制作方法

专利名称：一种治疗肠道疾病的微生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酪酸梭菌的用途及其微生物制剂。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案本发明是采用酪酸梭菌，该酪酸梭菌已在北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名Clostridium butyricum酪酸梭菌，保存编号0313-1，该酪酸梭菌在制备慢性、急性肠炎、腹泻的药物中的应用。
采用酪酸梭菌制成的微生物制剂，该制剂包含有所述酪酸梭菌和药用载体。药用载体可以采用脱脂奶粉、葡萄糖、或其它药用载体。
在本发明的微生物制剂中，该制剂还包含有双歧杆菌，所述双歧杆菌选自婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis、CGMCC、保存编号0313-2，长双歧杆菌Bifidobacterium longum、CGMCC、保存编号0313-5，短双歧杆菌Bifidobacterium breve、CGMCC、保存编号0313-6，两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、CGMCC，保存编号0313-7。酪酸梭菌对双歧杆菌无抑制作用；双歧杆菌对酪酸梭菌也无不良作用。经实验，结果表明，二者还略有促生作用。
在本发明中含有单一的酪酸梭菌的微生物制剂中，该微生物制剂物中的酪酸梭菌数不少于1.0×108CFU/g。
在本发明的含有酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂中，该微生物制剂中的酪酸梭菌和双歧杆菌数均不少1.0×108CFU/g。
在本发明的微生物制剂中，该微生物制剂可制成胶囊、微囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂。
本发明所使用的婴儿双歧杆菌是由下述方法分离出来的取一健康幼儿大便，用选择性培养基筛选得到10株双歧杆菌，经5次传代培养，从中选出对环境适应性强、生长旺盛的B19菌株，作生化反应试验和气相色谱测定代谢产物，确定B19为婴儿双歧杆菌，并经中国药品、生物制品检定所微生态检定认可。
本发明所使用的酪酸梭菌对O1及O139型霍乱弧菌、致病性大肠杆菌O157、痢疾志贺氏菌及霍乱门氏菌的生长、繁殖均有显著的抑制作用。
本发明中所使用的酪酸梭菌对O1及O139型霍乱弧菌、致病性大肠杆菌O157生长影响的检测报告如下检测目的酪酸梭菌对O1群埃尔托型霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌及肠出血性大肠杆菌O157H7等肠道致病菌的生长影响。
该检测所用的材料与方法如下一、实验菌株1、酪酸梭菌CGMCC NO.0313-1株，由北京东方百信生物技术有限公司提供。
2、O1群霍乱弧菌埃尔托生物型小川血清型CMCC(B)18514株；埃尔托生物型稻叶血清型CMCC(B)18512株；两菌株均为国内标准株。
3、O139群霍乱弧菌MO45株，国际标准株。
4、肠出血性大肠杆菌O157H7EJ97001株，国际标准株。
以上致病菌由本实验室保藏。
二、培养基1、脑心浸液(Brain Heart Infusion)，美国Difco公司生产。
2、普通营养肉汤及普通营养琼脂(PH7.0)，为检测单位生产的培养基干粉，使用时配制。
3、酪酸梭菌增强培养液及固体培养基，由北京东方百信生物技术有限公司提供配方，检测单位的实验室配制。
三、活菌数的测定采用常规的平板菌落计数法，将待测菌的培养物用灭菌生理盐水做连续10倍稀释至所需浓度，涂抹平板培养，做菌落计数。每一计数浓度涂三块平板，取其平均值，用cfu/ml表示。
四、测定酪酸梭菌对肠道病菌的生长影响1、霍乱弧菌(O1群的两个血清型及O139群)、肠出血性大肠杆菌等4个致病菌在单独培养及与酪酸梭菌混合培养时生长状况的比较单独培养将初始浓度为103cfu/ml的的致病置37℃下培养，于0、4、8、12、24小时测定其PH值及活菌数。
混合培养在培养开始时，除加入与上述等量的致病菌外，还要加初始度为103cfu/ml酪酸梭菌与之混合培养，并同于0、4、8、12、24小时测定PH值及活菌数。
生长曲线制作依据24小时内待测菌单独及与酪酸梭菌混合培养时的活菌计数结果(取其对数)，绘制生长曲线。
2、酪酸梭菌培养上清滤液抑制作用的测定将酪酸梭菌的24小时培养液离心，取上清，测定PH值，并用0.45u滤板过滤除菌。按不同比例加入酪酸梭菌增强培养液，然后接种初始浓度达到103cfu/ml的O139群霍乱弧菌，过夜培养后做活菌计数。
同时用NaOH将酪酸梭菌上清滤液的PH值调至7.0后，按同样步骤完成上述试验，做为对照。
实验结果一、酪酸梭菌对肠道致病菌生长的影响1、表1、表2、表3、表4分别为24小时内O1群霍乱弧菌小川型18514株，稻叶型18512株，O139群霍乱弧菌MO45株及肠出血性大肠杆菌O157H7的EJ97001株之单独与酪酸梭菌混合培养时PH值，活菌计数测定结果。
表1 酪酸菌对O1群霍乱弧菌小川型18514株的生长影响 表2 酪酸菌对O1群霍乱弧菌稻叶型18512株的生长影响
表3 酪酸菌对O139群霍乱弧菌MO45株的生长影响 表4 酪酸菌对肠出血性大肠杆菌O157H7 EJ97001株的生长影响 2、

图1、图2、图3、图4分别为24小时内18514株、18512株、MO45株、EJ97001株单培养及与酪酸梭菌混合培养的生长曲线。
二、酪酸梭菌上清滤液的抑菌作用表5为酪酸梭菌培养上清滤液(PH4.6)在不同浓度下，对O139群霍乱弧菌(MO45株)的抑制试验结果，以及将PH值调至7.0以后的对照。
表5 酪酸菌培养上清滤液对O139群霍乱弧菌的抑菌作用 结论酪酸梭菌与肠道致病菌混合培养时，酪酸梭菌对霍乱弧菌、致病性大肠杆菌等肠道致病菌的生长有明显的抑制作用，特别是对霍乱弧菌，本实验中培养8小时以后未检出活菌。酪酸梭菌在单独培养时，其培养物PH值从7.0降至4.6，其培养上清滤对O139群霍乱弧菌的生长有抑制作用，将PH值调至7.0后，该作用丧失。
由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所、腹泻病研究室霍乱弧菌专业实验室完成上述检测报告。
本发明中所使用的酪酸梭菌对痢疾志贺氏菌、霍乱沙门氏菌的抑菌实验报告如下摘要本实验通过酪酸梭菌(Clostridium butyricum CGMCC No.0313-1)和痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae 51005)、霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae 50018)及肠道非致病性大肠杆菌(E.coli 44112)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)混合培养，并对照以上五种菌单独培养时的生长曲线发现，酪酸梭菌对大肠杆菌抑制作用不明显；对婴儿双歧杆菌无抑制作用；对痢疾志贺氏菌、霍乱沙门氏菌抑制作用显著，特别是霍乱沙门氏菌被强烈抑制，其单独和混合培养24小时活菌数分别为1.7×109和1.5×102，PH值分别为4.9和4.65。
1、材料与方法1.1 材料菌种及来源酪酸梭菌即丁酸梭菌(colslridium butyricum CGMCC No.0313-1)和婴儿双歧杆菌(Binfantis CGMCC No.0313-2)由北京东方百信生物技术有限公司提供。
致病性菌种痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae 51055)，霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae 50018)，从中国药品生物制品检定所购买。
非致病性菌种大肠杆菌(E.coli 44112)，从中国药品生物制品检定所购买。
1.2 培养基配方及主要原料1.2 酪酸梭菌增强培养基胰蛋白胨1％ 酵母粉0.3 牛肉浸粉1％ 葡萄糖0.5％可溶性淀粉0.1％ NaCl 0.5％ 无水乙酸钠0.3％半胱氨酸盐0.05％ PH7.5 水1000ml 115℃/15min灭菌备用1.2.2 固体培养基胰蛋白胨1％ 酵母粉0.3 牛肉浸粉1％ 葡萄糖0.5％可溶性淀粉0.1％ NaCl 0.5％ 无水乙酸钠 0.3％ 琼脂1.3％PH7.5 水1000ml 115℃/15min灭菌备用
1.3 主要仪器与设备医用超净工作台，电热恒温培养箱，自动PH测定仪、天平、电热高压、消毒器、显微镜、冰箱、培养皿、吸管、试管、烧杯、三角瓶(100ml/瓶)、量筒、酒精灯、接种环等。
1.4 方法1.4.1 菌种的活化1.4.1.1 酪酸梭菌的活化冻干管接种于装有液体培养基的小三角瓶，装量90ml，耐热薄膜塑料封口静止厌氧培养37℃，24小时，置80℃水浴10分钟后转接小三角瓶，接种量为10％(v/v)。
1.4.1.2 实验菌的活化大肠杆菌44112，痢疾志贺氏菌51055，霍乱沙门氏菌50018冻干管转接斜面试管，双歧菌活化，置37℃电热恒温箱厌氧培养48小时后，放置于冰箱4℃保存备用。
1.4.2 活菌数的测定1.4.2.1 致病菌与婴儿双歧杆菌活菌测定平板菌落计数法，即取一定数量试管，每个试管分装9ml生理盐水高温灭菌冷却后，用灭菌的1ml吸管吸取1ml菌液，稀释到装有9ml生理盐水的试管，摇匀；再用一支无菌吸管吸取1ml稀释菌悬液移入另外一支装有9ml生理盐水的试管，依次类推直到所需稀释度为止，然后取三个不同稀释度试管，例如10-7，10-8，10-9从每个稀释度里分取0.1ml放入已制好的固体平板，用涂布器涂匀，每个稀释度重复3个，然后放置37℃(婴儿双歧杆菌放置于厌氧罐中37℃恒温培养48-72小时)电热恒温培养箱24小时恒温培养，再计算其菌落数后取平均值。
1.4.2.2 酪酸梭菌活菌数的测定采用MPN法，稀释过程与上述稀释方法相同，最后分取所需三个不同稀释度，每个稀释度吸取1ml菌悬液移入装有液体培养的试管，橡胶塞火焰上方封口，放置37℃电热恒温培养箱，恒温静止培养24小时，观察产气的试管数，查最大概率表，算出活菌数。
1.4.3 培养方法37℃静止培养。
1.4.4PH测定每隔4小时测发酵液PH值一次。
1.4.5酪酸梭菌抑菌实验方法1.4.5.1对大肠杆菌的抑菌实验方法如下a、单独培养大肠杆菌把培养好的大肠杆菌转接液体三角瓶装量90ml/瓶，37℃静止恒温培养，然后分别以0、4、8、12、24小时，不同培养时间取培养菌液测活菌数PH值，绘制生长曲线。
b、酪酸梭菌的单独培养活化好的酪酸梭菌菌种液接种到装量为90ml的液体三角瓶耐热塑料薄膜封口，置于37℃静止恒温培养，然后分别以0、4、8、12、24小时不同培养时间测培养液活菌数PH值，绘制生长曲线。
c、酪酸梭菌和大肠杆菌的混合培养活化好的酪酸梭菌菌种液以103-104cfu/ml接种到液体三角瓶、装量为90ml/瓶，再把培养好的大肠杆菌同时接入该液体三角瓶，接处量为103-104cfu/ml，耐热塑料薄膜封口，37℃电热恒温静止培养。分别以0、4、8、12、24小时不同培养的时间测PH值，大肠杆菌活菌数，酪酸梭菌活菌数，所得数据列表并绘制生长曲线，与单独培养时对照。
1.4.5.2 对痢疾志贺氏菌51055抑菌实验方法同上，但不测酪酸梭菌生长曲线。
1.4.5.3 对霍乱沙门氏菌50018抑菌实验方法同上，但不测酪酸梭菌生长曲线。
1.4.5.4 对婴儿双歧杆菌抑菌实验方法同上，但同时测酪酸梭菌单独培养与混合培养时的生长曲线。
2、结果与分析2.1 酪酸梭菌对大肠杆菌抑菌实验结果2.1.1 大肠杆菌44112三角瓶培养不同时间活菌数和PH值

2.1.2 酪酸梭菌培养不同时间活菌数和PH值

2.1.3 酪酸梭菌和大肠杆菌44112混合培养不同时间的活菌数和PH值

a大肠杆菌；b酪酸梭菌参看图5(A)、图5(B)，图5(A)为大肠杆菌E.coli 44112生长曲线，图5(B)为酪酸梭菌C.butyricum的生长曲线。
2.2 酪酸梭菌对痢疾志贺氏菌抑菌实验结2.2.1 痢疾志贺氏菌(51055)培养不同日期活菌数和PH值

2.2.2 痢疾志贺氏菌51055和酪酸梭菌混合培养不同时期活期活菌数和PH值

参看图6，图6为痢疾志贺氏菌51055单独和混合培养生长曲线。
2.3 酪酸梭菌对霍乱沙门氏菌实验结果2.3.1 霍乱沙门氏菌50018-5单独培养不同时期活菌数和PH值

2.3.2 霍乱沙门氏菌50018与酪酸梭菌混合培养不同时期活菌数和PH值

参看图7，图7霍乱沙门氏菌单独和混合培养时的生长曲线。
2.4 酪酸梭菌对婴儿双歧杆菌抑菌实验结果2.4.1 婴儿双歧杆菌培养不同时间活菌数和PH值

2.4.2 酪酸梭菌培养不同时间活菌数和PH值

2.4.3 酪酸梭菌和婴儿双歧杆菌混合培养不同时期活菌数和PH值

参看图8(A)、(B)，图8(A)为婴儿双歧杆菌B.infantis生长曲线，图8(B)为酪酸梭菌C.butyricum生长曲线5讨论本试验表明酪酸梭菌对痢疾志贺氏菌、霍乱沙门氏菌的拮抗效果较明显，酪酸梭菌的抑菌原因，可能是酪酸梭菌本身在生长过程中产酸而迅速降低培养液PH值，从而不利于致病菌的生长代谢而起到抑制病菌的作用，也有可能酪酸梭菌在代谢过程中产生了一种对致病菌有抗性的代谢物质，从而起到拮抗致病菌的生长、繁殖、直至该病菌完全失活。
综上所述，采用酪酸梭菌和O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、痢疾志贺氏菌、霍乱沙门氏菌、非致病性大肠菌及婴儿双歧杆菌混合培养，并对照以上8种菌单独培养时的生长曲线，发现酪酸梭菌对O1及O139型霍乱弧菌/致病性大肠杆菌O157、痢疾志贺氏菌及霍乱沙门氏菌的生长、繁殖均有显著的抑制作用，特别是对O1和O139群霍乱弧菌的抑制、清除作用极强，混合培养至第8小时，培养液中检不出活的致病菌，而同等条件下单独培养的三种致病菌的活菌数，此时均达到108CFU/ml。O157、痢疾志贺氏菌、霍乱沙门氏菌和酪酸梭菌混合培养时的活菌数仅为单独培养时的千分之一、万分之一及十万分之一。酪酸梭菌对双歧杆菌无抑制作用，双歧杆菌对酪酸梭菌也无不良作用，实验结果表明，二者还略有促生作用。基于上述实验结果，以单一的酪酸梭菌及酪酸梭菌和双歧杆菌二联菌制成的微生物制剂可以治疗急慢性肠炎、腹泻及伪膜性肠炎，肠易激综合症，肠功能紊乱和便秘。并以下述的实验报告及临床试验进行详细说明。其中，单一的酪酸梭菌的微生物制剂称为肠立宁；酪酸梭菌和双歧杆菌二联菌制剂称为百信肠乐康。
单一的酪酸梭菌的微生物制剂的药效学实验报告如下一、目的利用熊氏“抗生素致腹泻的动物模型”，观察喂服肠立宁制剂对腹泻动物的药效作用，并与日本进口的同类产品“米雅”进行比较之。
二、材料和方法
1、试药(1)肠立宁系单价格酪酸梭菌活菌制剂。内含酪酸梭菌活菌为108CFU/g，由北京东方百信生物技术有限公司提供；(2)米雅；也是单一的酪酸梭菌制剂，日本米雅利桑株式会社制造(成都药业有限责任公司分装)，生产批号174061，内含活菌108CFU/g。
2、培养基TPY培养基胰蛋白胨1％ 酵母粉0.3％牛肉浸膏1％ 葡萄糖0.5％ 可溶性淀粉0.1％ NaCl 0.5％无水硫乙醇酸钠0.3％ L-半胱氨酸盐0.05％ PH7.53、动物175只BALB/C小鼠，雄性，体重20±1g，标准2级，即清洁型动物，购自中国医学科学院实验动物中心，动物证号京动字8910MO47，购进动物饲养至第3日随机分组和制备模型。
(1)动物分组BALB/C小鼠一边称重一边随机编号分组，175只鼠分成5组，每组35只。
1-35号大剂量107CFU/0.5ml/只a、肠立宁组36-71号 小剂量106CFU/0.5ml/只72-105号 大剂量107CFU/0.5ml/只b、米雅组106-141 小剂量106CFU/0.5ml/只C、生理盐水对照组142-175 0.5ml/只分笼进行单养以利于观察动物腹泻的情况和治疗效果(2)腹泻模型制备按熊氏方法a、药液配制氨苄西林纳15g(30瓶)华北制药厂0.5g/瓶、生产批号9803103，加灭菌生理盐水溶解并稀释到50ml，即0.15g/0.5ml。
b、给药 实行每日2次给药即AM 9.00-11.00 0.5ml/只。
PM 2.00-4.00 0.5ml/只。
c、结果腹泻模型制备当天上午所见小鼠活动减弱、懒惰，90％小鼠拉稀软便或水样便，模型制备过程中原则上出现水样便就不再给氨苄，若大使未改变，仍继续给第2次或第3次药即可。
本次模型制备发现BALB/C小鼠二级动物一般0.15g/次可致泻，当动物喂服至0.3g/2次，100％小鼠出现腹泻。便型变化开始水样便(2-5次)-稀便(2-3)-软便(不成形1-2次)-成形便(1-2次/日)。
(3)腹泻动物保护作用的观察a、试药的配制 肠立宁制剂取菌粉5g加灭菌生理盐水50ml，原菌粉为108CFU/g(大剂量107CFU/0.5ml/次)，取上述菌液5ml加灭菌生理盐水45ml共50ml(形成106CFU/0.5ml/次，小剂量组)；米雅片剂取10片研成细粉加生理盐水并稀释至50ml(大剂量107CFU/0.5ml/次)，又取上述菌液5ml加生理盐水至50ml形成106CFU/0.5ml/次，小剂量组)。
b、喂服 每日2次，每次0.5ml/只，菌液或无菌生理盐水，观察动物排便情况。
(4)标本的采集和检测a、喂服酪酸梭菌计数给腹泻BALB/C小鼠，治疗后第2天(即给药的24h，已喂肠立宁和米雅1-2次被保护的动物)；第3天(即48h)；第4天(即72h)；第6天(即120h)，从保护各组中组中取5只小鼠活杀(包括生理盐水对照组)，取盲肠内内容物，称量后10倍稀释，第一天取10-2、10-3、10-4各稀释均浆液0.5ml加入4.5ml液体培养基中(TP)培养基并加入丁胺卡那霉素10μg/ml，一组5管接种后置厌氧手套箱中厌氧培养24-48小时观察结果，有气泡生长的为生长管，否则为未生长管，按Taylor概率表计算酪酸梭菌的活菌数。
b、菌群分析 制备腹泻模型前取30只鼠的新鲜大便作粪便菌群分析，药物保护的第5天各组活杀10只小鼠取结肠内容物作菌群分析。
三、结果与分析1、使用肠立宁和米雅对腹泻动物保护作用列于表6中，表6
表6 使用国产肠立宁制剂与日本米雅制剂对腹泻动物保护作用结果

注*使用X2计算其P＜0.001示差异极其显著。
2、定时活杀被保护动物取其结肠内容物进行酪酸梭菌计数结果列于表7中。
表7 各保护组酪酸梭菌活菌计数结果

3 各保护动物组肠道菌群恢复情况比较列于表8中。
表8各制剂保护组肠道菌群分析结果

注△示P＜0.05.△△示P＜0.01(与生理盐水组相比)，○示P＞0.05与造型前相比，与制备模型前动物肠道菌群相比*示P＜0.05，**示P＜0.01，□示P＞0.05。四、讨论我们利用超量氨苄青霉素喂服BACB/C小鼠，制备腹泻动物模型，然后喂服肠立宁活菌制剂和米雅活菌制剂、比较观察它们对腹泻动物保护作用的药效学。
我们在实验中使用2级BALB/C小鼠，并以氨苄青霉素0.1-0.2g/次喂服、100％小鼠腹泻(见表6)并都再现了菌群失调(见表8，生理盐水防治组)，各组都有稀便或软便，未用药的生理盐水对照组未见正常粪便小鼠出现，说明本次实验制备的菌群失调的腹泻动物模型合格。
对腹泻动物的保护，我们使用了北京东方百信生物技术有限公司提供的肠立宁活菌制剂，内含酪酸梭菌活菌108CFU/g和市场购买的米雅，日本米雅利桑株式会社生产，成都药业有限责任公司分装，生产批号174061，内含酪酸梭菌活菌108CFU/g。喂服肠立宁(大小剂量组)第一天就各有1只鼠完全恢复正常便，与生理盐水(阴性)对照相比其差异极其显著P＜0.001。大小剂量与米雅组相比稀便动物减少，软便有增加，两者相比也有差异，从表6可知肠立宁组对有肠道菌群紊乱的腹泻动物的保护作用优于米雅剂剂组。使用药物治疗第2天。肠立宁治疗组大部分动物恢复正常便，少量小鼠还有软便，大小剂量分别与米雅组相比，优于米雅组，两组之间也有极显著性差异即p＜0.001，到第3天除了米雅治疗组有个别小鼠有软便外，两组动物基本上全部得到了保护，由表6比较可知肠立宁制剂在治疗有菌群失调的腹泻病症方面优于米雅制剂，米雅制剂可以治疗急慢性肠炎、腹泻及伪膜性肠炎，抗生素相关性肠炎，肠易激综合症及便秘，肠立宁制剂同样可以用于这些疾病的防治，结果优于米雅制剂。
从表8我们对上述两组保护菌群失调腹泻动物药效果比较可知，无论是大剂量还是小剂量治疗组肠立宁制剂从喂服药物第一天至第5天其的中酪酸梭菌活菌活菌数大于米雅制剂组，两者对动物保护作用的显著差异，分析其主要原因是它们在结肠活菌数有显著差异(见表7)。本实验进一步还证实酪酸梭菌能够在体内定植，定植数量6.86×104-4.4×108CFU/g，随喂服酪酸梭菌数量和次数，其定植数量而有变化(见表7)。
给肠立宁组尤其是大剂量组在给药48h腹泻症状就完全控制，而且在给药的第5天(活杀第6天)，肠道菌群恢复得最理想，而米雅组即使是大剂量，其肠杆菌和肠球菌数量仍偏大，其与肠立宁相比差异显著P＜0.01，可见肠立宁活菌组比米雅活菌组不仅在控制腹泻症状方面占优势，而且在调整肠道菌群失调促进微生态平衡等方面，肠立宁比米雅好。
五、结论北京东方百信公司生产的单一酪酸梭菌活菌制剂即肠立宁与进口分装单一酪酸梭菌活菌制剂的米雅相比，对腹泻动物保护作用强，效果较好，活菌在肠道内定植数量大，定植力强，调整肠道菌群失调促进微生态平衡作用强，值得尽快地临床推广使用。
本发明的酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂的药效学实验如下对氨苄青霉素引起的小鼠腹泻的影响百信肠乐康1×107CFU/0.5ml和1×105CFU/0.5ml及阳性对照药丽珠肠乐1×105CFU/0.5ml、米雅1×105CFU/0.5ml，给小鼠灌胃，治疗至第4天时，百信肠乐康的高、低剂量组均有85.71％的小鼠恢复正常便，而丽珠肠乐组恢复正常便仅有46.15％，米雅组恢复正常便的仅有28.57％。此结果表明，酪酸梭菌和双歧杆菌的二联活菌的微生物制剂(百信肠乐康)对抗生素引起的小鼠腹泻的治疗效果，好于单一的双歧杆菌制剂丽球肠乐和日本进口产品米雅片。研究工作由中国药品生物制品检定所完成。
本发明的酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂经过I期、II期、III期的临床试验，其试验过程及结果如下1、I期临床试验的过程及结果选健康受试者60例，男女各半，散剂30例，胶囊30例，签署知情同意书后，按药物剂量服药，百信肠乐康散剂分为0.5、1.0和2.0g 3个剂量，百信肠乐康胶囊分为0.42、0.84和1.68g 3个剂量组，po，bid，连用10天，结果所有受试者均能耐受较大药物剂量，未出现不良反应，证实药物耐受性好，安全性大。推荐临床用药剂量，散剂为1.0-1.5g，bid；胶囊为0.84-1.26g，bid。于1999年10月16日进行了I期临床研究总结。60例志愿受试者肠道菌群培养分析表明大便pH值明显下降，有益菌有增加趋势。
2、II期临床试验的过程及结果由山东省立医院、304医院、北京宣武医院、北京天坛医院、山东医大附院组成5个试验中心，共同完成治疗急慢性腹泻300余例任务，每个中心完成60例。采用随机盲三模拟平行对照试验方法入选病人和治疗。百信肠乐康胶囊，口服，1.26g，bid；百信肠乐康散剂，口服1.5g，bid；米雅，1.05g，bid，疗程急性腹泻3-7天，慢性腹泻14-21天。试验期间北京东方百信生物技术有限公司派出监督员对临床试验情况进行检查；北京地区医院每周访视1次，外地医院每月访视1次，检查研究进度和研究质量，即研究者是否按方案规定和GCP要求进行研究，监查员将访视结果随时报告医院主要研究者和申办者，以求研究任务顺利地完成。5个中心共完成治疗急慢性腹泻311例，其中山东省立医院74例，北京天坛医院64例，304医院和北京宣武医院各60例，山东医大附院54例。临床试验结果表明百信肠乐康胶囊治疗急性腹泻有效率87.3％(95％可信限78-96)，慢性腹泻有效率78.3％(64-89)；百信肠乐康散剂对急性腹泻有效率93.6％(83-98)，慢性腹泻72.9％(68-87)；对照药米雅片分别为81.6％(68-91)和74.5％(63-86)；组间疗效无明显差异。三种药均未发现与药物有关的严重不良反应，30例腹泻患者肠道菌群培养分析同样表明大便pH明显下降，有益菌有增加趋势。
3、III期临床试验的过程及结果除II期5个试验中心不变外，增加了301医院、北京军区总医院、西安医科大学第一附属医院，共8个试验中心。
由8个中心完成700余例，每个中心约90例，采用开放随机对照多中心试验。百信肠乐康胶囊1.26g，bid；百信肠乐康散剂1.5g，bid；对照药米雅片0.7g，tid。急性腹泻疗程3-7d，慢性腹泻疗和14-21d。III期临床研究过程中，北京东方百信生物技术有限公司同样派出了监查员对各试验中心进行定期随访、监查。
8个试验中心共完成任务730例，其中北京军区总医院192例，西安医大二附院124例，北京天坛医院100例，山东省立医院98例，304医院72例，301医院70例，北京宣武医院和山东医大附院均为37例。试验结果进一步表明百信肠乐康胶囊治疗急性腹泻有效率93.2％(95％可信限90-97)，慢性腹泻有效率81.5％(73-90)；百信肠乐康散剂对急性腹泻有效率94.3％(91-97)，慢性腹泻80.8％(72-90)；而对照药米雅片分别为93.8％(89-99)和78.8％(61-91)；组间疗效无明显差异。三种药均未发现与药物有关的严重不良反应。
本发明的微生物制剂无毒、安全。
单一的酪酸梭菌和微生物制剂(以下称为肠立宁)的小鼠急性毒性试验报告如下提要小白鼠灌服肠立宁75g/kg，7天中一切正常，无死亡，安全性很大。
试验目的观察肠立宁对小白鼠的急性毒性反应，以评价该品的安全性1、材料1.1 试药肠立宁菌粉由北京东方百信生物技术有限公司提供，用蒸馏水配100％浓度应用。
1.2动物昆明种小白鼠，标准2级，体重18-20g，雌雄各半，购自中国医学科学院实验动物中心。
2、方法和结果2.1方法取小白鼠20只，用肠立宁75g/kg(1.5ml/20g)一天内分3次灌胃，观察药后7天内小白鼠的饮食、活动等情况，有无死亡。
2.2 结果7天内小白鼠的进食、饮水、活动等正常，未见任何毒性反应，亦无死亡。
3、结语小白鼠灌服肠立宁75g/kg剂量，相当于成人临床日用量(2.52g)的1805.6倍，安全性很大。
证明本发明的单一的酪酸梭菌的微生物制剂无毒，安全。
酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂(以下称为百信肠乐康)的药理学试验报告如下1、对麻醉犬呼吸、血压、心率及心电图的影响百信肠乐康0.5和0.25g/kg经十二脂肠给药，结果表明试药对正常麻醉犬呼吸频率、呼吸幅度、动脉收缩压、舒张压和心率均无明显影响。
2、协同或拮抗戊巴比妥钠催眠作用的影响百信肠乐康1.5亿活菌、1.0亿活菌和0.5亿活菌/kg给小鼠灌胃，1h后腹腔注射阈剂量戊巴比妥钠，结果表明试药无协同或拮抗戊巴比妥钠的作用。
3、对小鼠自主活动和协调运动的影响百信肠乐康按照前述2方法中的剂量给小鼠灌胃，给药后观察小鼠的自主活动和转棒坠落率，结果表明试药对小鼠的自主活动和协调运动无明显影响。研究工作由中国中医研究院西苑医院基础研究所完成。
酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂的毒理学试验报告如下1、小鼠急性毒性试验小鼠灌服百信肠乐康40g/kg，7天中一切正常，无死亡，此剂量相当于成人临床日用量(1.68g)的1666.6倍，安全性很大。
2、大鼠长期毒性试验用Wistar大鼠80只，分设对照组，百信肠乐康0.75、1.5和3.0g/kg三个剂量组(分别为成人用量的25、50和100倍)连续灌胃给药一个半月，观察试药对动物各项指标的影响。实验结果表明试药对大鼠体重、摄食、血象、心肝、肾功能等十项生化指标及心电图等均无明显影响，各脏器大体及镜下检查均未见病理性中毒改变。研究工作完成单位与同药理学试验研究单位。
证明酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂无毒、安全。
本发明的微生微制剂稳定性好，保存期长。其稳定性可以通过下述试验报告证明。
单一酪酸梭菌活菌制剂(胶囊)(肠立宁)在室温条件下稳定性试验报告如下1、试验方法按本质量标准(规程)所规定项目及检测方法对三批中试包装样品，置室温干燥处避光存放，每3个月检测一次，连续9个月，以后每4个月检测一次，共8次。
2、试验结果试验结果表明，样品在室温避光干燥处放置24个月，酪酸梭菌活菌数约下降20-30％，其它各项指标与0月比较均未见明显改变，见表9、10、11。
表9样品名称肠立宁胶囊 批号970501
表10 样品名称肠立宁胶囊 批号970502 表11 样品名称肠立宁胶囊 批号970503
单一酪酸梭菌活菌胶囊(肠立宁)在55℃条件下稳定性实验报告如下1、试验方法按本质量标准(规程)所规定项目及检测方法对三批中试包装样品，置55℃避光干燥处存放，每12小时取样进行检测，连续60个小时，共6次。
2、试验结果试验结果表明样品在55℃避光干燥箱内存放60小时，酪酸梭菌的活菌数约下降20-30％，其它各项指标与0月比较均末见明显改变。
表12 样品名称肠立宁胶囊 批号971201
表13 样品名称肠立宁胶囊 批号971202 表14 样品名称肠立宁胶囊 批号971203
酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌胶囊(百信肠乐康胶囊)的稳定性试验报告如下1、试验方法按本质量标准(规程)所规定项目及检测方法对三批中试样品在模拟市售包装条件下，置2-8℃避光干燥处存放，继初步稳定性考核后，放置三个月再考核一次，以后每半年一次，共7次。
2、试验结果试验结果表明样品在2-8℃避光干燥处放置18个月，除双歧杆菌的活菌数有下降外，其它各项指标与0月比较均未见明显改变，见表15、16、17。
表15 样品名称百信肠乐康胶囊 批号980602
表16 样品名称百信肠乐康胶囊 批号980603 表17 样品名称百信肠乐康胶囊 批号980604
实施例1、制造酪酸梭菌菌粉取酪酸梭菌生产菌种冻干一支，接种于50ml种子培养基中，37℃静止培养24小时，80℃水浴10分钟，转接于450ml扩增培养基中。37℃静止培养20小时，镜检无杂菌再转接于4.5升扩增培养基中，37℃静止培养20小时，镜检无杂菌，转接于45升发酵培养中，37℃静止培养24小时，镜检芽孢率达80％以上时，停止培养，用连续离心机，12000rpm/min，离心收集湿菌体，称重，按2∶1(w/v)添加冻干保护剂，冻干，研细，过100目筛，活菌数应不低于1.0×109CFU/g，最高可达1.0×1011CFU/g，密封置2-8℃保存备用。
上述的种子培养基，扩增培养基，发酵培养基均为常规培养基。
2、制造双歧杆菌菌粉取双歧杆菌生产菌种冻干管一支，接种牛奶管，37℃培养至凝乳，转接于50mlBEBM培养基中，37℃培养20小时，镜检无杂菌，转接于450ml BEBM培养基中，37℃静止培养20小时，镜检正常，转接于4.5升BEBM培养基中，37℃静止培养20小时，镜检无杂菌，再转接于45升BEBM培养基中，37℃静止培养24小时，pH值降至4.5时停止培养，用连续离心机，以12000rpm/min转速，离心收集湿菌体，称重，按2∶1(w/v)比例添加冻干保护剂，混匀，冻干，研细，过100目筛，活菌数应不低于1.0×109CFU/g，最高可达1.0×1011CFU/g，密封置2-8℃保存备用。上述BEBM培养基为常规培养基。
3、制造含有单一的酪酸梭菌的微生物制剂先检测酪酸梭菌的活菌数(CFU/g)，再依据其活菌数称取菌粉，并按制剂中的各成份的如下含量配制脱脂奶粉6重量份、葡萄糖4重量份、且制剂中的酪酸梭菌的活菌数为1.0×108-1.0×1010CFU/g。混匀后制成含有单一的酪酸梭菌的微生物制剂。装胶囊或装于铝箔袋，制成胶囊420mg/粒或散剂500mg/袋。
4、制造含有酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂，先检测酪酸梭菌和双歧杆菌二种菌粉的活菌数(CFU/g)，再依据其活菌数称取菌粉，并按制剂中的各成份的如下含量配制脱脂奶粉6重量份，葡萄糖4重量份，且制剂中的酪酸梭菌的活菌数为1.0×108-1.0×1010CFU/g、双歧杆菌的活菌数为1.0×108-1.0×1010CFU/g。混匀后制成含有酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌的微生物制剂。装胶囊或装于铝箔袋，制成胶囊420mg/粒或散剂500mg/袋。
胶囊用法用量成人每次2粒，每日3次，口服。
本发明的微生物制剂可治疗急慢性肠炎、腹泻及伪膜性肠炎、肠易激综合症、肠功能紊乱和便秘。并且无毒、安全、稳定性好，保存期长。
权利要求
1.一种酪酸梭菌的用途，该酪酸梭菌已在北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名Clostridium butyricum酪酸梭菌，保存编号0313-1，其特征在于该酪酸梭菌在制备慢性、急性肠炎、腹泻的药物中的应用。
2.一种包含权利要求1所述的酪酸梭菌的微生物制剂，其特征在于该制剂包含有所述酪酸梭菌和药用载体。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于该制剂还包含有双歧杆菌，所述双歧杆菌选自婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis、CGMCC、保存编号0313-2，长双歧杆菌Bifidobacterium longum、CGMCC、保存编号0313-5，短双歧杆菌Bifidobacterium breve、CGMCC、保存编号0313-6，两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、CGMCC，保存编号0313-7。
4.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于该微生物制剂物中的酪酸梭菌数不少于1.0×108CFU/g。
5.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于该微生物制剂中的酪酸梭菌和双歧杆菌数均不少1.0×108CFU/g。
6.根据权利要求4或5所述的微生物制剂，其特征在于该微生物制剂可制成胶囊、微囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂。
全文摘要
本发明公开了一种酪酸梭菌的用途及其微生物制剂，该酪酸梭菌已在北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名Clostridium butyricum酪酸梭菌，保存编号0313－1，该酪酸梭菌在制备慢性、急性肠炎、腹泻的药物中的应用。该制剂还包含有双歧杆菌，所述双歧杆菌选自婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis、CGMCC、保存编号0313－2，长双歧杆菌Bifidobacterium longum、CGMCC、保存编号0313－5，短双歧杆菌Bifidobacterium breve、CGMCC、保存编号0313－6，两歧双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum、CGMCC，保存编号0313－7。该微生物制剂无毒、安全、稳定性好，保存期长。
文档编号A61K35/66GK1391905SQ01129258
公开日2003年1月22日 申请日期2001年6月19日 优先权日2001年6月19日
发明者崔云龙, 崔云雨 申请人:北京东方百信生物技术有限公司, 北京天施康医药科技发展有限公司