专利名称：灰树花子实体多糖肽的提取分离方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成份提取分离方法，具体涉及一种灰树花子实体多糖肽的提取分离方法。
本发明实现灰树花子实体多糖肽分级分离纯化的技术方案为将原料粉碎，热水提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得水溶性多糖肽，然后进行分级分离；提取水溶性多糖肽后得残渣加稀酸提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得酸溶性粗多糖肽；提取酸溶性多糖肽后的残渣加稀碱提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得碱溶性粗多糖肽。
本发明分离纯化技术方案是通过下述具体步骤得以实现的1.水溶性粗多糖的提取以灰树花子实体为原料，粉碎成细粉，加2-20倍蒸馏水，热水50-121℃提取1-20小时，离心，上清液备用；残渣重复提取2-5次合并所有上清液，减压浓缩，缓慢加入1-4倍体积95％乙醇，搅匀，4℃过夜，离心，沉淀减压干燥，粉碎过100目，即得灰树花水溶性粗多糖肽；多糖含量为5％-90％，多肽含量为80％-5％。
2.水溶性多糖肽的分级分离(1)粗多糖肽溶解于蒸馏水中，加1倍量95％乙醇沉淀，离心分离，沉淀溶于蒸馏水中。
(2)加1-20％CAT-OH至不再产生沉淀或加CAT-Br并用NaOH溶液调节pH≥8，离心分离，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-1。
(3)取上述(2)分离后沉淀加入1-50％乙酸5-100ml，离心，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-2。
(4)取上述(3)分离后沉淀加入0.5-20％NaOH溶液溶解，离心，取上清液，用乙酸调节pH5-8，加入1-4倍量95％乙醇，离心分离沉淀，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-3。
5)取上述(4)分离后沉淀溶解于蒸馏水中，脱蛋白，加1-4倍量95％乙醇，离心，沉淀用95％乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，减压干燥，碾碎即得FB-4。
FB-1组分为不与CAT-基团结合的多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。
FB-2、3、4组分别为能与CAT-基团结合的多糖肽，结合物不溶于水，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。
FB-2的主要组分为溶于乙酸的酸溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。
FB-3的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。
FB-4的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。FB-4组分的多糖平均分子量为1×104-1×106，其单糖组成以葡萄糖为主，其中以β-1，3糖苷键为主要连接键。
3.酸溶性多糖肽的提取将上述步骤1中灰树花子实体热水提取后留下的残渣加入3-20倍量1-10％盐酸、醋酸等酸，室温至80℃下浸提6-48小时，离心得到酸提液，重复3次，酸提液合并，用碱调节pH7-10，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBAc-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbAc-2。酸溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。
4.碱溶性多糖肽得提取将上述步骤3中灰树花子实体热水提取后留下得残渣加入3-20倍量1-30％碱，此碱可以是氢氧化钠、氢氧化钙等，室温至80℃下浸提12-48小时，离心得到碱提液，重复3次，碱提液合并，用乙酸调节pH4-9，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBA1-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbA1-2。碱溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。
用本发明分离获得的多糖肽可用Sevag法、三氯乙酸法和酶法或几种方法同时应用进行脱蛋白处理，以得到纯化多糖，多糖含量为10-99.5％。
本发明采用有机溶剂沉淀，除上述所用的乙醇外，还可采用丙酮。
本发明利用水提有机溶剂沉法提取总多糖肽，再利用酸性多糖肽、碱性多糖肽在不同PH条件下呈现的不同性质而得到分离纯化。本发明方法操作简便，各种多糖肽分离效果显著，为发挥各种灰树花子实体多糖肽的药效作用，制备各种适应症的药物提供了可能。
权利要求
1.灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于该方法是将灰树花子实体粉碎，热水提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得水溶性粗多糖肽，然后进行分级分离；提取水溶性多糖肽后得残渣加稀酸提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得酸溶性粗多糖肽；提取酸溶性多糖肽后的残渣加稀碱提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得碱溶性粗多糖肽。
2.如权利要求1所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的水溶性多糖肽的分离包括下列步骤A、水溶性粗多糖的提取以灰树花子实体为原料，粉碎成细粉，加2-20倍蒸馏水，热水50-121℃提取1-20小时，离心，上清液备用；残渣重复提取2-5次合并所有上清液，减压浓缩，缓慢加入1-4倍体积95％乙醇，搅匀，4℃过夜，离心，沉淀减压干燥，粉碎过100目，即得灰树花水溶性粗多糖肽；多糖含量为5％-90％，多肽含量为80％-5％；B.水溶性多糖肽的分级分离(1)粗多糖肽溶解于蒸馏水中，加1倍量95％乙醇沉淀，离心分离，沉淀溶于蒸馏水中；(2)加1-20％CAT-OH至不再产生沉淀或加CAT-Br并用NaOH溶液调节pH≥8，离心分离，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-1；(3)取上述(2)分离后沉淀加入1-50％乙酸5-100ml，离心，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-2；(4)取上述(3)分离后沉淀加入0.5-20％NaOH溶液溶解，离心，取上清液，用乙酸调节pH5-8，加入1-4倍量95％乙醇，离心分离沉淀，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-3；5)取上述(4)分离后沉淀溶解于蒸馏水中，脱蛋白，加1-4倍量95％乙醇，离心，沉淀用95％乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，减压干燥，碾碎即得FB-4。
3.如权利要求1所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的酸溶性多糖肽的提取包括下列步骤将权利要求2步骤A中灰树花子实体热水提取后留下的残渣加入3-20倍量1-10％盐酸、醋酸等酸，室温至80℃下浸提6-48小时，离心得到酸提液，重复3次，酸提液合并，用碱调节pH7-10，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBAc-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbAc-2；酸溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。
4.如权利要求1所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的碱溶性多糖肽得提取包括下列步骤将权利要求3中灰树花子实体热水提取后留下得残渣加入3-20倍量1-30％碱，此碱可以是氢氧化钠、氢氧化钙等，室温至80℃下浸提12-48小时，离心得到碱提液，重复3次，碱提液合并，用乙酸调节pH4-9，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBA1-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbA1-2；碱溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。
5.如权利要求1或2所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的FB-1组分为不与CAT-基团结合的多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；FB-2、3、4组分为能与CAT-基团结合的多糖肽，结合物不溶于水，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量分别为80-5％；FB-2的主要组分为溶于乙酸的酸溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；FB-3的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；FB-4的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；FB-4组分的多糖平均分子量为1×104-1×106，其单糖组成以葡萄糖为主，其中以β-1，3糖苷键为主要连接键。
6.如权利要求1或2或3或4所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的分离获得的多糖肽可用Sevag法、三氯乙酸法、盒酶法或几种方法同时应用进行脱蛋白处理，以得到纯化多糖，多糖含量为10-99.5％。
全文摘要
本发明涉及灰树花子实体多糖肽的提取分离方法。该方法是将灰树花子实体粉碎，热水提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得水溶性粗多糖肽，然后进行分级分离；提取水溶性多糖肽后得残渣加稀酸提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得酸溶性粗多糖肽；提取酸溶性多糖肽后的残渣加稀碱提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得碱溶性粗多糖肽。本发明利用酸性多糖肽、碱性多糖肽在不同pH条件下呈现的不同性质将灰树花子实体多糖肽分离纯化，为发挥各种灰树花子实体多糖肽的药效作用，制备各种适应症的药物提供了可能。
文档编号A61P3/00GK1398898SQ0213669
公开日2003年2月26日 申请日期2002年8月28日 优先权日2002年8月28日
发明者茅仁刚, 蓝德刚, 王强 申请人:维京仲华(上海)生物医药科技有限公司