专利名称:一种高产多糖的紫芝及其发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域：
，涉及一株高产多糖的紫芝菌及其发酵方法与在生产灵芝多糖中的应用。
背景技术：
灵芝是药用、保健价值极高的大型担子真菌。灵芝属已知品种约有100多种，其中以赤芝和紫芝的用途最为广泛。近年来国内外对赤芝菌种、产品开发及其药理方面的研究均做了大量工作。研究表明灵芝具有镇痛、镇静、安定、催眠、镇咳、平喘、祛痰、保肝解毒以及增强心肌收缩力和扩张冠状动脉的功效；灵芝多糖、肽聚糖具有降血糖、调节内分泌与代谢的保健作用。灵芝在临床上可用于治疗神经衰弱，有效率为96％；用于治疗慢性病毒性肝炎，总有效率为95.18％(灵芝的研究及进展-11，何来英等，卫生部食品卫生监督检验所)。
紫芝是中国传统的灵芝之精品，但紫芝人工较难驯化培养，因而市场上的紫芝产品较少见。2001年4月卫生部下达文件鼓励包括紫芝在内的三个灵芝品种的药用真菌的研究与产品开发。
目前，国内外对灵芝多糖的研究一般都停留在子实体多糖的提取和液态菌丝体多糖的提取上。随着现代生物技术的发展，用生物发酵技术培养灵芝的菌丝体已形成产业化规模。我国在这方面的科研成果主要体现在液态发酵培养菌丝体的培养条件以及液态培养过程中菌丝体代谢产物的研究上，但大多以赤芝多糖为研究对象，较少涉及对紫芝的研究。对紫芝半固态发酵生产条件的研究还未见报道，特别是以紫芝为研究对象对其半固态培养过程中菌丝体代谢产物及次生代谢产物的研究更为少见。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产多糖的紫芝菌和对该菌株进行半固态发酵的方法。
本发明所提供的紫芝菌为紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9k1 CGMCC No.0742，已于2002年04月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.0742。本发明的紫芝菌YTZ9k1，是采用Co60人工诱变的方法选育筛选出的，经中国科学院微生物研究所鉴定为紫芝菌(GanodermasinenseJ.D.Zhao，L.W.Hsu & X.Q.Zhang)。
本发明所提供的发酵紫芝菌YTZ9k1 CGMCC NO.0742的方法，包括母种培养、一级种子培养、二级种子培养和生产发酵培养；其中母种和一级种子培养的培养基为含有土豆20-35％、葡萄糖5-10％、蛋白胨2-5％的马铃薯培养基，二级种子和生产发酵培养的培养基为含有黄豆10-20％、玉米粉5-10％、硫酸镁0.5-1％、磷酸二氢钾0.5-1％、碳酸钙0.5-1％的大豆培养基。
在实际操作中，母种培养的接种量为1-2％；一级种子培养、二级种子培养和生产发酵培养的接种量均为5-10％。母种和一级种子培养的温度均为28±2℃；二级种子培养的温度为27±2℃；生产发酵培养的温度为26±2℃。母种和一级种子培养的时间均为5-7天；二级种子培养的时间为7-10天；生产发酵培养的时间为12-15天。母种和一级种子培养的相对湿度均为85-90％；二级种子培养的相对湿度为80-85％；生产发酵培养的相对湿度为75-85％。
本发明的另一个目的是提供一种自紫芝菌YTZ9k1 CGMCC No.0742中分离的灵芝多糖及其分离方法。
本发明所提供的灵芝多糖是用下述方法得到的将紫芝菌YTZ9k1 CGMCC No.0742的菌丝粉水浸提后，用己酸铅去除蛋白质，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗涤多糖，再用蒸馏水加热溶解多糖，加无水乙醇，使含醇量达20％，离心去除杂质，得到多糖液，继续加无水乙醇，使含醇量达80％，静置过夜后，经4000rpm离心20分钟，得灵芝粗多糖，用水溶解多糖后，流动水透析糖液3天，然后依次加无水乙醇，使含醇量达到50％、60％、70％、80％静置过夜，自然风干，得到产品。
本发明的紫芝菌YTZ9K1是一株高产多糖的紫芝菌株，用本发明的半固态发酵法生产的紫芝菌YTZ9K1的菌丝体多糖、菌丝体代谢产物以及次生代谢产物具有较高的营养价值和保健功效，每100克菌丝粉可获得灵芝多糖高达14克左右，比原菌种以及报道过的灵芝多糖的产量提高了50-100％，具有广阔的市场前景。
本发明将紫芝菌丝体发酵从普通应用的工业化液态深层发酵技术发展成为半固态浅层发酵技术，根据紫芝菌YTZ9K1的半固态发酵的生长、发酵条件及发酵动力学的研究，设计了一条较完整的年产10吨级的半自动化半固态菌丝发酵工艺生产线，其工艺流程如图1所示。
图1为紫芝菌YTZ9k1 CGMCC NO.0742的发酵工艺流程图具体实施方式
实施例1、紫芝菌CGMCC NO.0742菌丝体的发酵生产1、培养基配方1)母种马玲薯培养基；土豆20-35％、葡萄糖5-10％、蛋白胨2-5％。120℃，高压(1.4公斤/平方厘米)灭菌30分钟。
2)一级种子培养基同母种培养基。
3)二级种子大豆培养基黄豆10-20％，玉米粉5-10％；硫酸镁0.5-1％；磷酸二氢钾0.5-1％；碳酸钙0.5-1％。120℃，高压(1.4公斤/平方厘米)灭菌30分钟。
4)生产发酵培养基黄豆10-20％，玉米粉5-10％；硫酸镁0.5-1％；磷酸二氢钾0.5-1％；碳酸钙0.5-1％。120℃，高压(1.4公斤/平方厘米)灭菌90分钟。
2、发酵生产发酵包括以下步骤1)母种培养将紫芝菌CGMCC NO.0742按1-2％的比例在超净工作台中接种于母种马玲薯培养基中，28±2℃，湿度85-90％，培养箱内静置培养5-7天；2)一级种子扩大培养将母种按5-10％的比例在超净工作台中接种于一级培养马玲薯培养基中，28±2℃，湿度85-90％，培养箱内摇床培养5-7天；3)二级种子扩大培养将一级种子按5-10％的比例在超净工作台中接种于二级培养大豆培养基中，27±2℃，湿度80-85％，无菌间内摇床培养7-10天；4)生产发酵培养将二级种子按5-10％的比例在无菌间内接种于生产发酵培养基中，26±2℃，湿度75-85％，无菌间内静置培养12-15天，得到大量紫芝菌CGMCCNO.0742的菌丝体。
实施例2、灵芝多糖的分离和纯化灵芝多糖的分离和纯化步骤是通过发酵制备的紫芝菌YTZ9k1 CGMCC No.0742菌丝粉经水浸提后，用己酸铅去除蛋白质，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗涤多糖，再用蒸馏水加热溶解多糖，加无水乙醇，使含醇量达20％，离心去除杂质，得到多糖液，继续加无水乙醇，使含醇量达80％，静置过夜后，经4000rpm离心20分钟，得紫芝粗多糖，用水溶解多糖后，流动水透析糖液3天，然后依次加无水乙醇，使含醇量达到50％、60％、70％、80％静置过夜，自然风干，得到产品。
权利要求
1.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742。
2.一种发酵紫芝菌YTZ9kl CGMCC NO.0742的方法，包括母种培养、一级种子培养、二级种子培养和生产发酵培养；其中母种和一级种子培养的培养基为含有土豆20-35％、葡萄糖5-10％、蛋白胨2-5％的马铃薯培养基，二级种子和生产发酵培养的培养基为含有黄豆10-20％、玉米粉5-10％、硫酸镁0.5-1％、磷酸二氢钾0.5-1％、碳酸钙0.5-1％的大豆培养基。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述母种培养的接种量为1-2％；所述一级种子培养、二级种子培养和生产发酵培养的接种量均为5-10％。
4.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述母种和一级种子培养的温度均为28±2℃；二级种子培养的温度为27±2℃；生产发酵培养的温度为26±2℃。
5.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述母种和一级种子培养的时间均为5-7天；二级种子培养的时间为7-10天；生产发酵培养的时间为12-15天。
6.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述母种和一级种子培养的相对湿度均为85-90％；二级种子培养的相对湿度为80-85％；生产发酵培养的相对湿度为75-85％。
7.一种自紫芝菌YTZ9kl CGMCC No.0742中分离灵芝多糖的方法，是将紫芝菌丝粉经水浸提后，用己酸铅去除蛋白质，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗涤多糖，再用蒸馏水加热溶解多糖，加无水乙醇，使含醇量达20％，离心去除杂质，得到多糖液，继续加无水乙醇，使含醇量达80％，静置过夜后，经4000rpm离心20分钟，得紫芝粗多糖，用水溶解多糖后，流动水透析糖液3天，然后依次加无水乙醇，使含醇量达到50％、60％、70％、80％静置过夜，自然风干，得到产品。
8.自紫芝菌YTZ9kl CGMCC No.0742中分离的灵芝多糖，它是用下述方法得到的将紫芝菌丝粉经水浸提后，用己酸铅去除蛋白质，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗涤多糖，再用蒸馏水加热溶解多糖，加无水乙醇，使含醇量达20％，离心去除杂质，得到多糖液，继续加无水乙醇，使含醇量达80％，静置过夜后，经4000rpm离心20分钟，得灵芝粗多糖，用水溶解多糖后，流动水透析糖液3天，然后依次加无水乙醇，使含醇量达到50％、60％、70％、80％静置过夜，自然风干，得到产品。
9.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742在生产紫芝多糖中的应用。
10.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742在生产灵芝多糖中的应用。
11.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742在生产紫芝菌丝粉中的应用。
专利摘要
本发明公开了一株紫芝菌及其发酵方法与应用。紫芝菌YTZ9kl CGMCC No.0742的发酵包括母种培养、一级种子培养、二级种子培养和生产发酵培养；其中母种和一级种子培养的培养基为含有土豆20-35%、葡萄糖5-10%、蛋白胨2-5%的马铃薯培养基，二级种子和生产发酵培养的培养基为含有黄豆10-20%、玉米粉5-10%、硫酸镁0.5-1%、磷酸二氢钾0.5-1%、碳酸钙0.5-1%的大豆培养基。紫芝菌YTZ9K1是一株高产多糖的紫芝菌株，每100克菌丝粉可获得灵芝多糖高达14克左右，比原菌种以及报道过的灵芝多糖的产量提高了50-100%，具有广阔的市场前景。
文档编号C12N1/14GKCN1202238SQ02134967
公开日2005年5月18日 申请日期2002年10月26日
发明者林萍 申请人:东莞市英芝堂生物工程有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan