新突变型氨甲酰磷酸合成酶以及生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物的方法

专利名称:新突变型氨甲酰磷酸合成酶以及生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学行业，具体涉及生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物的方法。更具体地讲，本发明涉及利用参与大肠杆菌菌株的精氨酸和嘧啶生物合成途径的新的抗反馈酶生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物，如精氨酸、瓜氨酸和包括乳清酸、尿苷、尿苷5’-一磷酸(UMP)、胞苷和胞苷5’-一磷酸(CMP)在内的嘧啶衍生物。
背景技术：
大肠杆菌的氨甲酰磷酸合成酶(CPSase)能催化由碳酸氢盐、谷氨酰胺和两个Mg-ATP分子产生氨甲酰磷酸(CP)的复杂的合成过程，同时释放出谷氨酸、磷酸和两个Mg-ADP[Meister A.，Advan.Enzymol.Mol.Biol.，62卷，315-374页，1989]。CP的合成是两种生物合成途径的中间步骤，即嘧啶核苷酸和精氨酸的生物合成途径中间步骤。在第一个途径中，CP与天冬氨酸氨甲酰转移酶(ATCase)偶联，导致通过两个步骤形成乳清酸。乳清酸是嘧啶衍生物生物合成的重要的代谢中间产物，所述衍生物包括嘧啶，如尿嘧啶；嘧啶核苷，如乳清苷、尿苷、和胞苷；以及嘧啶核苷酸，如乳清苷5’-一磷酸(OMP)、UMP和CMP。业已证实，在多种细菌的发酵过程中，在培养基中存在乳清酸明显有助于嘧啶衍生物，即尿嘧啶的生产和积累(US专利3214344)。在第二个途径中，CP通过乌氨酸氨甲酰转移酶(OTCase)与乌氨酸偶联，构成精氨酸生物合成途径的第六个步骤(由谷氨酸开始)。CPSase由鸟氨酸和IMP(嘌呤核苷酸的前体)激活，并且由UMP抑制。氨甲酰磷酸合成酶由两个亚基组成。对于棒状杆菌(EP1026247A1)和属于埃希氏菌属和芽孢杆菌属的细菌来说，业已证实所述亚基是由carA和carB基因编码的。carAB操纵子的转录受到两个途径的终产物的累计性抑制[Charlier D.等，分子生物学杂志，226卷，367-386页，1992；Wang H.等，分子生物学杂志，277卷，805-824页，1998；Glansdorff N.等，嘧啶途径，6卷，53-62页，1998]。天然大肠杆菌CPSase是由一个41270Da的小亚基和一个117710Da的大亚基组成的异源二聚体，所述两个亚基分别由carA和carB基因编码。小亚基催化谷氨酰胺的水解，并且负责NH3向大亚基的转移，在大亚基上进行CP的实际合成。大亚基包括底物即碳酸氨盐、氨的结合位点，两个独立的用于结合Mg-ATP的位点，和构成调控结构域的18kDa羧基末端区[Rubio V.等，生物化学，30卷，1068-1075页，1991；Cervera J.等，生物化学，35卷，7247-7255页，1996]。另外，有人认为，大亚基具有独自催化氨甲酰磷酸的合成反应的活性(Stephen D.Rubino等，生物学化学杂志，206，4382-4386，1987)。
最近披露了CPSase的变构活化形式的结晶结构[Thoden J.等，生物化学，36卷，6305-6316页，1997；Thoden J.等，ActaCrystallogr.Sec.D.，55卷，8-24页，1999]。大亚基上被称为A、B、C的前三个独立的结构域在结构方面非常相似，但第四个结构域完全不同。D结构域(937-1073号残基)负责结合以及由效应物IMP、UMP和鸟氨酸进行变构调控。另外，业已证实，两个残基，948号丝氨酸和1042号苏氨酸似乎对于CPSase的变构调控起关键作用[Delannay S.等，分子生物学杂志，286卷，1217-1228页，1999]。当948号丝氨酸被苯丙氨酸取代时，这种酶变得对UMP和IMP不敏感，但仍然能被鸟氨酸激活，不过激活的程度降低。具有T1042I突变的酶表现出鸟氨酸激活作用的大大减弱。
原则上讲，酶的抗反馈(fbr)表现型，是作为在氨基酸序列上的一个或几个位点上用另一种氨基酸取代相应的氨基酸残基的结果出现的，并且，这种取代会导致酶的活性降低。例如，用19种其它氨基酸残基的每一种取代大肠杆菌丝氨酸乙酰转移酶(SAT)(cysE基因)上的天然Met256，在大多数情况下会导致fbr表现型，但是，突变型SAT蛋白不能恢复天然SAT的活性水平[NakamoriS.等，AEM，64卷，1607-1611页，1998]。因此，通过上述方法获得的突变型酶的缺陷是，与野生型酶相比，突变型酶的活性降低。

发明内容
本发明涉及构建在大肠杆菌嘧啶和精氨酸或瓜氨酸生物合成中起关键作用的抗反馈的、高活性的酶。
在本发明中，提出了利用carB基因片段的完全随机化合成大量突变型carB基因的新方法。同时取代氨基酸序列片段上的某些氨基酸残基(其中，可以定位fbr突变)，能够产生将活性水平恢复到接近天然蛋白的突变型蛋白，这是因为这种酶的三维结构与天然结构更符合。因此，完成了下面所描述的本发明。
就是说，本发明提供了(1)氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，其中，相当于SEQ ID NO20的947-951号位置的氨基酸序列被SEQ ID NO1-9中的任一个氨基酸序列所取代，并且，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏；(2)如(1)的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，其中，氨甲酰磷酸合成酶是大肠杆菌氨甲酰磷酸合成酶。
(3)如(1)的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，其中，SEQ ID NO20的947-951号位置的氨基酸序列被SEQ ID NO1-9中的任一个氨基酸序列所取代，并且，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏；(4)如(1)的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，它包括在除了947-951号位置以外的一个或多个位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，其中，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏；(5)氨甲酰磷酸合成酶，它包括如(1)-(4)中任一项的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基；(6)编码如(1)-(4)中任一项的氨甲酰磷酸合成酶的DNA，其中，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏；(7)编码如(1)-(4)中任一项的尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏的氨甲酰磷酸合成酶大亚基以及大肠杆菌氨甲酰磷酸合成酶的小亚基的DNA；(8)属于埃希氏菌属的细菌，它具有如(6)或(7)的DNA；(9)如(8)的细菌，它具有产生选自L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的能力；(10)如(9)的细菌，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP；(11)一种生产选自L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的方法，该方法包括以下步骤在一种培养基中培养如(8)-(10)中任一项的细菌，以便在培养基中产生并积累所述化合物，并且从所述培养基中收集所述化合物；和(12)如(11)的方法，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP。
在本发明中，术语“CPSase活性”表示催化由碳酸氢盐、谷氨酰胺和两个Mg-ATP分子产生氨甲酰磷酸的复杂的合成反应的活性。本发明的“CPSase”可以是由大亚基组成的单一的多肽，或者是包括大亚基和小亚基的异二聚体，只要CPSase具有CPSase活性就行。在本申请中，上面所提到的大亚基和异二聚体可以被统称为“CPSase”。编码大亚基和小亚基的DNA可以被称为“carAB”。
根据本实施方案，具有上述任意一种fbr突变的CTPase可以被称为“突变型CPSase”，而编码突变型CPSase的DNA可以被称为“突变型carB基因”或“突变型carAB基因”，而没有突变的CPSase可以被称为“野生型CPSase”。
下面将对本发明作详细说明。
<1>突变型CPSase和突变型carB基因随后，对携带有作为carAB操纵子克隆到表达载体上的突变型carB基因的重组克隆的选择和筛选，以便允许选择具有不同水平的生物学活性的突变型CPSase的fbr变体。
根据S.Delannay等所获得的资料(Delannay S.等，分子生物学杂志，286卷，1217-1228，1999)，大肠杆菌氨甲酰磷酸合成酶的突变型(S948F)对UMP不敏感。根据这些资料，选择CPSase上包括948号位置在内的部分作为修饰的目标。
所述突变型CPSase和突变型carB基因是通过随机片段定向诱变获得的。为了在carB基因上获得多个突变，将编码SEQ ID NO20的氨基酸序列上947号亮氨酸-951号谷氨酸残基的部分的carB基因的15个核苷酸的片段随机化(参见下文)。随机化的15个核苷酸的片段能产生412或接近1.5×107个不同的DNA序列，这些序列能编码五聚体肽的4×105种不同的氨基酸残基。在这些序列的读框内不引入终止密码子的可能性大约为0.95或95。因此，编码所述肽的947-951号氨基酸残基的carB片段的随机化必定能产生大约4×105种不同的氨基酸序列，在CPSase结构的这一肽片段具有多样性。随后选择并筛选携带有克隆到表达载体上的突变型carB基因的重组克隆，可以选择具有不同水平的生物学活性的突变型CPSase的fbr变异体。
本发明定义了适合CPSase的fbr表现型的突变型CPSase的氨基酸序列。因此，根据所述序列，通过用普通方法将突变导入野生型carB基因可以获得突变型CPSase。野生型carB基因可以是大肠杆菌的carB基因(GenBank保藏号AE000113 U00096SEQ ID NO19的序列上的10158-13379号核苷酸)。carA基因相当于GenBank保藏号U00096的序列上的8992-10140号核苷酸。
在carB基因被用作获得编码突变型CPSase的DNA的材料的情况下，突变型carB基因编码该突变型CPSase的大亚基。在carAB基因被用作所述材料的情况下，突变型carAB基因同时编码突变型CPSase的大亚基和小亚基。
本发明的突变型CPSase上的947-951号位置上的氨基酸序列是SEQ ID NO1-9中的任意一种序列。在表1中示出了已知fbr CPSase的相应的氨基酸序列，其中，948号位置上的丝氨酸被苯丙氨酸所取代，以及大肠杆菌野生型CPSase的氨基酸序列。在表1中还示出了编码所述氨基酸序列的核苷酸序列的例子。
表1


突变型CPSase可以包括在除了947-951号位置以外的一个或多个位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，只要不损害CPSase的活性就行。“几个”氨基酸的数量，根据该蛋白三维结构上的氨基酸残基的位置或类型而有所不同。这是因为以下原因。就是说，某些氨基酸之间具有较高的同源性，并且，这些氨基酸的差别不会对该蛋白的三维结构产生大的影响。因此，本发明的突变型CPSase，可以与构成CPSase的所有氨基酸残基的同源性不低于30-50％，优选50-70％，并且它具有fbr CPSase活性。在存在尿苷5’-一磷酸的条件下，所述突变型CPSase保留的CPSase活性理想地不低于野生型CPSase活性的25％，优选不低于30％，更优选不低于40％。
在本发明中，“相当于947-951号位置的序列的氨基酸序列”表示相当于SEQ ID NO20的氨基酸序列上947-951号位置上的氨基酸序列的氨基酸序列。氨基酸残基的位置可以改变。例如，如果将一个氨基酸残基插入N-末端部分，本来位于947号位置上的氨基酸残基就变成了948号位置。在这种情况下，相当于原有947号位置的氨基酸残基，在本发明中被称为947号位置上的氨基酸残基。
短语“尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏”表示反馈抑制作用的程度降低。反馈抑制程度的降低可以通过以下方法测定测定在有尿苷5’-一磷酸的条件下CPSase活性的降低，并且将其与具有SEQ IDNO20的氨基酸序列的蛋白的活性进行比较。另外，短语“尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏化”表示抑制作用基本上脱敏就足够了，并且不需要完全脱敏。具体地讲，在用5mM谷氨酰胺作底物时，在有10mM尿苷5’-一磷酸的条件下，突变型CPSase的活性与在没有尿苷5’-一磷酸的条件下的活性之比理想地不低于50％，优选不低于70％，更优选不低于90％。
例如，可以通过诸如定位诱变的方法修饰所述核苷酸序列，获得编码与上述突变型CPSase基本相同的蛋白的DNA，以便使位于特定位点上的一个或几个氨基酸残基发生缺失、取代、插入或添加。上述DNA修饰可以通过常用的已知突变处理实现。所述突变处理包括在体外处理含有突变型carB基因的DNA的方法，例如，用羟胺处理，以及用紫外线辐射或诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝酸胍(NTG)以及亚硝酸之类的通常被用于这种处理的诱变剂处理微生物，例如，具有突变型carB基因的属于埃希氏菌属的细菌的方法。
上述核苷酸的取代、缺失、插入或添加还包括天然发生的突变(突变体或变异体)，例如，以具有CPSase的细菌个体的差异或种或属的差异为基础。
可以通过从接受过突变处理的具有突变型CPSase的细胞中分离能在严格条件下与作为探针的具有已知carB基因序列或其一部分的DNA杂交的DNA，和编码具有CPSase活性的蛋白的DNA，获得编码基本与突变型CPSase相同的蛋白的DNA。
在本文中，术语“严格条件”表示能形成所谓的特异性杂交，而不能形成非特异性杂交的条件。用任何数字化的值来精确表达该条件都是困难的。不过，举例来说，严格条件包括这样一种条件，例如，在这种条件下，彼此之间的同源性不低于50％的DNA可以杂交，而彼此之间的同源性低于以上标准的DNA不能杂交。另外，严格条件可以表达为在相当于Southern杂交中的普通洗涤条件的盐浓度下DNA彼此之间能杂交的条件，例如，60℃，1XSSC，0.1％SDS，优选0.1XSSC，0.1％SDS。
在上述条件下可以杂交的基因包括在该基因的编码区内产生了一个终止密码子的基因，以及由于活性中心的突变而没有活性的基因。不过，通过以下方法可以很方便地消除上述困难将所述基因连接在商业化的表达载体上，并且研究所表达的蛋白的CPSase活性。
当本发明的CPSase是包括突变型大亚基和小亚基的异二聚体时，所述小亚基可以是大肠杆菌野生型CPSase的小亚基。
在本发明中，小亚基可以包括出现在一个或多个位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，只要它在与大亚基结合时能具有CPSase活性就行。术语“几个”的含义与上文描述大亚基时的含义相同。
作为编码与上述小亚基基本上相同的多肽的DNA，它可以是能在严格条件下与含有carA或其部分的DNA杂交的DNA。术语“严格条件”的含义与上文所述相同。
<2>本发明的属于埃希氏菌属的细菌。
本发明的属于埃希氏菌属的细菌是向其中导入了突变型carB基因的属于埃希氏菌属的细菌。例如，属于埃希氏菌属的细菌是大肠杆菌。例如，可以通过用重组DNA转化属于埃希氏菌属的细菌，从而导入突变型carB基因，所述重组DNA包括能在属于埃希氏菌属的细菌中起作用的载体以及所述突变型carB基因。还可以通过用突变型carB基因取代染色体上的carB基因来导入突变型carB基因。
例如，用于导入所述突变型carB基因的载体可以是诸如pBR322、pMW118、或pUC19之类的质粒载体，诸如11059、1BF101、或M13mp9之类的噬菌体载体，以及诸如Mu、Tn10、或Tn5之类的转座子。
例如，可以通过以下方法完成将DNA导入属于埃希氏菌属的细菌D.A.Morrison的方法(酶学方法，68，326，1979)或用氯化钙处理受体细菌细胞，以便提高DNA的穿透能力的方法(Mandel，M.，和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159，1970)等。
通过将突变型carB基因导入上述属于埃希氏菌属的生产菌，可以提高由氨甲酰磷酸衍生的化合物的产量，所述化合物如L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物。另外，可以赋予事先导入了突变型carB基因的细菌产生诸如L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的能力。上述嘧啶衍生物包括乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP。
例如，具有产生L-精氨酸的活性的属于埃希氏菌属的细菌，可以是大肠杆菌菌株AJ11531和AF11538(JP56106598A2)、AJ11593(FERMP-5616)和AJ11594(FERM P-5617)(日本专利公开号57-5693)，VKPM B-7925(俄罗斯专利申请号2000117677)。菌株VKPM B-7925业已于2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。
目前还不知道属于埃希氏菌属的L-瓜氨酸生产菌，属于埃希氏菌属的乳清酸生产菌，以及属于埃希氏菌属的尿苷5’-一磷酸(UMP)生产菌。
例如，具有产生L-瓜氨酸活性的属于芽孢杆菌属的细菌，可以是枯草芽孢杆菌菌株K-X-1 A-1(ATCC No 15561)和K-X-1 A-9(ATCCNo15562)(美国专利3282794)，芽孢杆菌菌株cit-70(日本公开专利申请号08-089269)。例如，具有产生L-瓜氨酸活性的属于短杆菌属的细菌，可以是黄色短杆菌菌株AJ3408(FERM P-1645)(美国专利5164307)和AJ11677(日本后期公开专利申请号57-163488)。例如，具有产生L-瓜氨酸活性的属于棒杆菌属的细菌，可以是谷氨酸棒杆菌菌株AJ11588(FERM P-5643)(美国专利5164307)。
例如，具有产生乳清酸活性的属于芽孢杆菌属的细菌，可以是枯草芽孢杆菌菌株FERM P-11402，它缺乏乳清酸磷酸核糖基转移酶(日本公开专利申请号04-004891)。例如，具有产生UMP活性的属于棒杆菌属的细菌，可以是抗5-氟尿嘧啶的谷氨酸棒杆菌菌株T-26(FERMBP-1487)，它抗5-氟尿嘧啶和三甲氧苄二氨嘧啶的T-29(FERMBP1488)，以及抗5-氟尿嘧啶和磺胺胍的T-30(FERM BP1489)(欧洲专利EP0312912)。
例如，具有产生UMP活性的属于棒杆菌属的细菌，可以是产氨棒杆菌菌株LK40-2(VKPM B-7811)、LK75-15(VKPM B-7812)和LK75-66(VKPM B-7813)(俄罗斯专利申请号99122774)。
<3>生产L-精氨酸、瓜氨酸和嘧啶衍生物的方法。
通过以下方法能有效生产L-精氨酸，瓜氨酸和嘧啶衍生物等化合物在培养基中培养向其中导入了突变型carB基因的，并且具有产生所述化合物的能力的细菌，在所述培养基中产生并积累所述化合物，以及从所述培养基中收集所述化合物。上述嘧啶衍生物包括乳清酸、尿苷、UMP、胞苷和CMP。
在本发明的方法中，属于埃希氏菌属的细菌的培养，从液体培养基中收集并纯化化合物，可以用类似于利用细菌通过发酵生产L-精氨酸的常规方法的方式完成。用于培养的培养基可以是合成培养基或天然培养基，只要该培养基包含适量的碳源和氮源以及矿物质，如果必要，还有所使用的细菌所需要的适量养分就行。碳源可以包括各种碳水化合物，如葡萄糖和蔗糖，以及各种有机酸，这取决于所使用细菌的同化能力。可以使用包括乙醇和甘油在内的醇。作为氮源，可以使用氨、诸如硫酸铵的各种铵盐，诸如胺的其它氮化合物，诸如蛋白胨、大豆水解物和消化过的发酵微生物的天然氮源。作为矿物质，可以使用磷酸二氢钾，硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙。
培养优选在有氧条件下进行，如摇床培养、通气培养和搅拌培养。培养通常是在20-40℃的温度下进行的，优选30-38℃。培养通常是在pH5-9，优选6.5-7.2的条件下进行的。培养基的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节。通常，培养1-3天就会导致所述化合物在培养基中积累。
在培养之后，可以通过离心或膜过滤除去诸如细胞等固体物质，分离所述化合物，然后收集并通过离子交换、浓缩和结晶级份之类的方法纯化所述化合物。
附图简述
图1表示构建质粒pEL-carAB-wt的示意图。
图2表示构建突变型carB基因库的示意图。
具体实施方式
将结合下面的实施例对本发明做具体说明。
实施例1通过将来自大肠杆菌染色体的AvaIII-BglII DNA片段(4911bp)克隆到事先用BamHI和PstI消化过的pBluescript II SK(+)载体(Fermentas，Lithuania)上，构建携带来自大肠杆菌的野生型carAB基因的质粒pBScarAB-13。
通过用lac启动子取代T7启动子，对质粒pET22-b(+)(Novagen，USA)进行修饰。Lac启动子是通过用质粒pUC18做模板，并用寡核苷酸5’-accagatctgcgggcagtgagcaacgc-3’(SEQ ID NO21)和5’-gtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3’(SEQ ID NO22)做引物，通过PCR扩增获得的。用限制酶BglII和XbaI消化所得到的具有lac启动子的片段(0.14kb)，并克隆到事先用相同的限制酶消化过的pET22-b(+)载体上。将所得到的质粒pET-Plac用于克隆来自质粒pBScarAB-13的没有启动子的carAB基因。
用pBScarAB-13作模板，并且用寡核苷酸5’-cctctagaaataaagtgagtgaatattc-3’(SEQ ID NO23)和5’-cttagcggttttacggtactgc-3’(SEQ ID NO24)作引物，通过PCR扩增获得carA基因的5’末端(1.18kb)。用XbaI和DraIII消化所得到的片段，并且，通过琼脂糖电泳纯化具有carA基因的5’末端序列的XbaI-DraIII片段(0.61kb)。连接该片段、来自质粒pBScarAB-13的DraIII-SacI片段(具有carA基因和carB基因的3’末端的序列)和载体pET-Plac/XbaI-SacI的混合物，并转化到大肠杆菌TG1细胞。所获得的重组质粒pEL-carAB-wt具有受lac启动子控制的野生型carAB操纵子的序列。
用于PCR扩增的TaKaRa La DNA聚合酶是从Takara Shuzo公司(日本)获得的，并且在供货商推荐的条件下使用。
<1>随机片段定向诱变用质粒pBScarAB-13作模板，正义引物P15’-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CNN(T/C)NNN(G/A)NNggcgataaagaacgcgtggtg-3’(SEQ ID NO25)(48个碱基)是根据carB基因的核苷酸序列设计的，并且用标准M13导向序列引物作反义引物。引物P1的固定的12个核苷酸的5’末端和固定的21个核苷酸的3’末端区，分别与carB基因Glu951密码子下游和Leu947密码子上游的序列同源。
在第一轮PCR中(15次循环)，用具有随机化15核苷酸区的引物P1合成0.75kb的DNA片段(carB基因的3’-末端)。第一轮PCR是按以下方法进行的。将100纳克质粒pBScarAB-13作为模板添加到含有浓度为10皮摩尔的两种引物的PCR溶液中(50微升)。用2400型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司，Foster市，加利弗尼亚)进行15次PCR循环(94℃15秒，52℃20秒，72℃1分钟)。
在第二轮扩增中，再进行15轮扩增(94℃1分钟，35℃1分钟，72℃2分钟)，其中，该片段的(-)链起着“引物”作用，进行延伸，以便得到完整的基因序列。
在第三轮扩增中，将10微升该反应混合物的等分样品添加到含有100皮摩尔正义引物标准M13导向序列引物和作为反义引物的P25’-ccacttcctcgatgacgcgg-3’(SEQ ID NO26)的新鲜90微升反应混合物中，并再进行15次循环(94℃0.5分钟，55℃20秒，72℃2分钟)。
通过琼脂糖凝胶电泳纯化编码carB基因的3’-末端片段的突变型变异体文库的1.32kb DNA片段，然后用AflII和SacI消化，并进一步与事先用相同的限制酶消化过的pEL-carAB-wt载体连接，以便获得pEL-carAB-NN。
在随后的实验中将大约150纳克连接的DNA用于转化大肠杆菌TG1(supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F’[traD36 proAB+lacIqlacZΔM15])(J.Sambrook等，分子克隆，1989)受体细胞，以便在每一次都得到大约2000个克隆。纯化重组质粒(pEL-carAB-NN)文库，并转入大肠杆菌细胞VKPM B-6969(carBTn10)，将其用于筛选具有编码活性CarAB酶的carAB基因的重组质粒pEL-carAB-NN。
<2>定位诱变为了导入单一突变Ser948Phe，用质粒pBScarAB-13作模板，并且用根据carB基因的核苷酸序列设计的正义引物5’-cgtgcgctgcttttcgtgcgcgaaggcgataaag-3’(34个碱基)(SEQ ID NO27)和标准M13导向序列引物作反义引物进行PCR。PCR扩增和该片段的克隆是按上述方法进行的。
通过琼脂糖凝胶电泳，纯化具有单一突变的编码carB基因的3’末端片段的1.32kb DNA片段，用AflII和SacI消化，然后连接到事先用相同的限制酶消化过的pEL-carAB-wt载体上。
用大约100纳克所得到的DNA质粒转化大肠杆菌细胞VKPM B-6969，并筛选携带具有单一取代Ser948Phe的活性CarAB酶的重组质粒pEL-carAB-6。
实施例2.新的carB突变型的分离，以及在CPSase上氨基酸取代对催化特性的影响首先在40种重组B-6969(pEL-carAB-NN)克隆上，在由carAB和ArgI(鸟氨酸氨甲基转移酶)酶催化的由鸟氨酸生物合成瓜氨酸的反应中，评估carAB活性及其对UMP的抗反馈作用。
反应的公式如下CarAB+ArgINH3+HCO3-+2MgATP+鸟氨酸------→瓜氨酸+2MgADP+2Pi在该反应中氨甲酰磷酸合成酶用游离NH4+作底物来自40种B-6969(pEL-carAB-NN)菌株和TG1(pUC18-argI)细胞的蛋白提取物，是通过用硫酸铵(75％的饱和度)沉淀从超声波处理过的细胞的粗制细胞提取物中制备的。将所述蛋白沉淀溶解在具有以下配方的缓冲液中Tris-HCl(50mM)，pH7.5，2-巯基乙醇(2mM)。
该测试系统包括来自菌株B-6969(pEL-carAB-NN)和TG1(pUC18-argI)的蛋白提取物和以下试剂ATP(8mM)，硫酸镁(8mM)，硫酸铵(200mM)，碳酸钠(8mM)以及鸟氨酸(1mM)，pH7.5。使用具有以下配方的液相，通过TLC分析反应混合物中鸟氨酸和瓜氨酸的含量。异丙醇/乙酸乙酯/氢氧化铵/水＝40/20/13/27(v/v)。
将表达活性的并且对UMP有抗反馈作用的突变型CPSase的9个克隆和表达具有单一的Ser948Phe取代的突变型CPSase的一个克隆用于测定突变型酶的活性。
纯化来自上述10个克隆的质粒，并通过双脱氧链终止法测定carB基因的随机片段的序列(表1)。
然后将来自上述9个克隆B-6969(pEL-carAB-NN)和一个克隆B-6969(pEL-carAB-6)的蛋白提取物，用于在由谷氨酰胺或氨合成氨甲酰磷酸(CP)的反应中评估突变型CPSase的活性和fbr。
来自细胞的粗制细胞提取物是通过以下方法制备的对悬浮在0.5毫升缓冲液A(200mM磷酸氢钾/磷酸二氢钾，pH8.0，1mM EDTA，1mMPMSF，1mM DTT)的20毫克湿的细胞沉淀进行超声波处理，然后，用固体硫酸铵进行处理，达到65％的饱和度。在4℃下培养10分钟之后，以13000rpm的速度将悬浮液离心10分钟，然后将沉淀溶解在1毫升缓冲液B(20mM磷酸氢钾/磷酸二氢钾，pH8.0，50mM氯化钾，1mM PMSF，1mM DTT)中。用所获得的蛋白提取物的等分样品评估CPSase活性。反应公式如下I.谷氨酰胺+CO2+2MgATP+H2O→NH2COOPO32-+2 MgADP+谷氨酸+PiII.NH3+CO2+2MgATP+H2O→NH2COOPO32-+2 MgADP+Pi50微升每一种反应混合物包括反应I--20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM氯化钾，5mM碳酸钠，10mM ATP，10mM氯化镁，5mM谷氨酰胺，10微升蛋白提取物；反应II--20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM氯化钾，5mM碳酸钠，10mM ATP，10mM氯化镁，200mM硫酸铵，10微升蛋白提取物。
另外，在有10mM UTP的情况下，进行一系列的反应I，以便评估CPSase的反馈抑制水平。
在37℃下温育10分钟之后，通过添加等体积的乙醇终止反应，在-20℃下冷却10分钟，并且在室温下以13000rpm的速度离心1分钟。在-20℃下冷却上清液。
通过毛细管区带电泳分析反应混合物中CP的含量。分离是在Quanta 4000E毛细管电泳系统(“Waters”，USA)上进行的，在254纳米下用UV间接检测。通过静水压力实施注射25秒。所述分离是用未包衣的熔凝硅石毛细管进行的(75u内径，*60厘米，有效长度为53厘米)，并且在-25kV电压下工作。将温度保持在20℃。分离缓冲液由50mM Tris-碱，25mM苯甲酸(用于间接检测)，pH8.5，0.25mM TTAB(四乙酰-三甲基-溴化铵)(用于恢复电渗流)组成。
在表2中，示出了在CP合成反应中测定的突变型CPSase的活性和fbr的数据。
表2.突变型CPSase的活性


因此，突变型CPSase对UMP基本上是不敏感的，但是，所述单一突变能显著降低酶的活性。这些结果表明，947-951号氨基酸残基的肽片段决定UMP的反馈抑制作用，并且决定突变型CPSase的催化效率。
将编码wt CarAB和突变型CarAB-34的基因克隆到质粒pMW119上。为此，用限制酶SacI和XbaI消化质粒pEL-carAB-wt和pEL-carAB-34(因为所述质粒具有两个XbaI位点，要进行部分消化)，并且将编码carAB基因的片段克隆到事先用相同限制酶消化过的pMW119载体上。结果，构建了具有受lac启动子控制的carAB基因的低拷贝数质粒pMW119-carAB-wt和pMW119-carAB-34。
实施例3.用具有突变型carAB基因的菌株生产乳清酸作为抗6-氮尿嘧啶(1毫克/毫升)的突变型菌株，菌株311来源于具有插入argA基因的Tn10的大肠杆菌K12(VKPM B-3853)。菌株311业已在2001年3月5日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，保藏号为VKPM B-8085，并且，按照布达佩斯条约的规定于2002年7月17日将原始保藏转成了国际保藏。
用质粒pMW-carAB-wt和pMW-carAB-34转化菌株311，并且在有不同浓度的尿苷的条件下检测所得到的菌株的乳清酸产量。
试管发酵的培养条件如下1/20稀释过的过夜培养物，60克/升葡萄糖，25克/升硫酸铵，2克/升磷酸二氢钾，1克/升硫酸镁，0.1毫克/升硫胺素，5克/升酵母提取物Difco，25克/升白垩，1升自来水(pH7.2)。葡萄糖和白垩是分别消毒的。将2毫升培养基放入试管中，并在32℃下摇动培养3天。通过HPLC评估乳清酸产量(表3)。
表3.菌株311(pMW119)、311(pMW-carAB-wt)、311(pMW-carAB-34)的乳清酸产量水平


如表3所示，具有突变型carAB基因的菌株311(pMW-carAB-34)能比具有野生型carAB基因的亲本菌株311(pMW119)和菌株311(pMW-carAB-wt)产生更多的乳清酸。
实施例4.利用具有突变型carAB基因的菌株生产精氨酸和/或瓜氨酸作为抗6-氮尿嘧啶(1毫克/毫升)的突变体，业已从在基因ilvA上插入了转座子Tn5的菌株大肠杆菌57(VKPM B-7386)的衍生物中筛选到了精氨酸生产菌株333和374。菌株333和374业已在2001年3月5日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，保藏号分别为VKPM B-8084和VKPM B-8086，随后按照布达佩斯条约的规定于2002年7月将原始保藏转成了国际保藏。
用质粒pMW-carAB-wt和pMW-carAB-34转化菌株333和374，并检测这些重组菌株的精氨酸和瓜氨酸产量。
试管发酵是按照与例3相同的方法进行的。
在含有100毫克/升尿苷的合成培养基中，菌株333(pMW-carAB-wt)和333(pMW-carAB-34)的精氨酸和/或瓜氨酸产量水平如表4所示。
表4.菌株333(pMW-carAB-wt)和333(pMW-carAB-34)的精氨酸和/或瓜氨酸产量水平


在含有100毫克/升尿苷的合成培养基中，菌株374(pMW-carAB-wt)和374(pMW-carAB-34)的瓜氨酸产量水平如表5所示。
表5.菌株374(pMW-carAB-wt)和374(pMW-carAB-34)的瓜氨酸产量水平


如表4所示，具有突变型carAB基因的菌株333(pMW-carAB-34)比具有野生型carAB基因的菌株能产生更多的精氨酸和瓜氨酸。如表5所示，菌株374(pMW-carAB-34)能比具有野生型carAB基因的菌株产生更多的瓜氨酸。
<110>味之素株式会社<120>新突变型氨甲酰磷酸合成酶以及生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物的方法<130>OP1367<140>
<141>2002-08-<150>RU 2001121697<151>2001-08-03<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述由随机序列编码的部分氨基酸序列<400>1Pro Leu Arg Glu Gly1 5<210>2<211>5
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述由随机序列编码的部分氨基酸序列<400>2Ala Val Ala Leu Lys1 5<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述由随机序列编码的部分氨基酸序列<400>3Gly Val Phe Leu Met1 5<210>4<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>人工序列描述随机序列<400>18gccttctgtg gggtg 15<210>19<211>3222
<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220>
<221>CDS<222>(1)..(3222)<400>19atgccaaaac gtacagatat aaaaagtatc ctgattctgg gtgcgggccc gattgttatc 60ggtcaggcgt gtgagtttga ctactctggc gcgcaagcgt gtaaagccct gcgtgaagag 120ggttaccgcg tcattctggt gaactccaac ccggcgacca tcatgaccga cccggaaatg 180gctgatgcaa cctacatcga gccgattcac tgggaagttg tacgcaagat tattgaaaaa 240gagcgcccgg acgcggtgct gccaacgatg ggcggtcaga cggcgctgaa ctgcgcgctg 300gagctggaac gtcagggcgt gttggaagag ttcggtgtca ccatgattgg tgccactgcc 360gatgcgattg ataaagcaga agaccgccgt cgtttcgacg tagcgatgaa gaaaattggt 420ctggaaaccg cgcgttccgg tatcgcacac acgatggaag aagcgctggc ggttgccgct 480gacgtgggct tcccgtgcat tattcgccca tcctttacca tgggcggtag cggcggcggt 540atcgcttat aaccgtgaaga gtttgaagaa atttgcgccc gcggtctgga tctctctccg 600accaaagagt tgctgattga tgagtcgctg atcggctgga aagagtacga gatggaagtg 660gtgcgtgata aaaacgacaa ctgcatcatc gtctgctcta tcgaaaactt cgatgcgatg 720ggcatccaca ccggtgactc catcactgtc gcgccagccc aaacgctgac cgacaaagaa 780tatcaaatca tgcgtaacgc ctcgatggcg gtgctgcgtg aaatcggcgt tgaaaccggt 840ggttccaacg ttcagtttgc ggtgaacccg aaaaacggtc gtctgattgt tatcgaaatg 900aacccacgcg tgtcccgttc ttcggcgctg gcgtcgaaag cgaccggttt cccgattgct 960aaagtggcgg cgaaactggc ggtgggttac accctcgacg aactgatgaa cgacatcact 1020ggcggacgta ctccggcctc cttcgagccg tccatcgact atgtggttac taaaattcct 1080cgcttcaact tcgaaaaatt cgccggtgct aacgaccgtc tgaccactca gatgaaatcg 1140gttggcgaag tgatggcgat tggtcgcacg cagcaggaat ccctgca8aa agcgctgcgc 1200ggcctggaag tcggtgcgac tggattcgac ccgaaagtga gcctggatga cccggaagcg 1260ttaaccaaaa tccgtcgcga actgaaagac gcaggcgcag atcgtatctg gtacatcgcc 1320gatgcgttcc gtgcgggcct gtctgtggac ggcgtcttca acctgaccaa cattgaccgc 1380tggttcctgg tacagattga agagctggtg cgtctggaag agaaagtggc ggaagtgggc 1440atcactggcc tgaacgctga cttcctgcgc cagctgaaac gcaaaggctt tgccgatgcg 1500cgcttggcaa aactggcggg cgtacgcgaa gcggaaatcc gtaagctgcg tgaccagtat 1560gacctgcacc cggtttataa gcgcgtggat acctgtgcgg cagagttcgc caccgacacc 1620gcttacatgt actccactta tgaagaagag tgcgaagcga atccgtctac cgaccgtgaa 1680aaaatcatgg tgcttggcgg cggcccgaac cgtatcggtc agggtatcga attcgactac 1740tgttgcgtac acgcctcgct ggcgctgcgc gaagacggtt acgaaaccat tatggttaac 1800tgtaacccgg aaaccgtctc caccgactac gacacttccg accgcctcta cttcgagccg 1860gtaactctgg aagatgtgct ggaaatcgtg cgtatcgaga agccgaaagg cgttatcgtc 1920cagtacggcg gtcagacccc gctgaaactg gcgcgcgcgc tggaagctgc tggcgtaccg 1980
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<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>22gtttctagat cctgtgtgaa attgttatccgc 32<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物
<400>24cttagcggtt ttacggtact gc 22<210>25<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<220>
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<223>人工序列描述引物<400>26ccacttcctc gatgacgcgg 20<210>27<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>27cgtgcgc tgcttttcgtgcg cgaaggcgat aaag 34
<210>28<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述由野生型carB基因编码的部分氨基酸序列<400>28Leu Ser Val Arg Glu1 5<210>29<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述由具有单一突变的carB基因编码的部分氨基酸序列<400>29Leu Phe Val Arg Glu1 5<210>30<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>30ctttccgtgc gcgaa 15<210>31<211>15<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述引物<400>31cttttcgtgc gcgaa 15<210>32<211>1149<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>32ttgattaagt cagcgctatt ggttctggaa gacggaaccc agtttcacgg tcgggccata 60ggggcaacag gttcggcggt tggggaagtc gttttcaata cttcaatgac cggttatcaa 120gaaatcctca ctgatccttc ctattctcgt caaatcgtta ctcttactta tccccatatt 180ggcaatgtcg gcaccaatga cgccgatgaa gaatcttctc aggtacatgc acaaggtctg 240gtgattcgcg acctgccgct gattgccagc aacttccgta ataccgaaga cctctcttct 300tacctgaaac gccataacat cgtggcgatt gccgatatcg atacccgtaa gctgacgcgt 360ttactgcgcg agaaaggcgc acagaatggc tgcattatcg cgggcgataa cccggatgcg 420gcgctggcgt tagaaaaagc ccgcgcgttc ccaggtctga atggcatgga tctggcaaaa 480gaagtgacca ccgcagaagc ctatagctgg acacaaggga gctggacgtt gaccggtggc 540ctgccagaag cgaaaaaaga agacgagctg ccgttccacg tcgtggctta tgattttggt 600gccaagcgca acatcctgcg gatgctggtg gatagaggct gtcgcctgac catcgttccg 660gcgcaaactt ctgcggaaga tgtgctgaaa atgaatccag acggcatctt cctctccaac 720ggtcctggcg acccggcccc gtgcgattac gccattaccg ccatccagaa attcctcgaa 780accgatattc cggtattcgg catctgtctc ggtcatcagc tgctggcgct ggcgagcggt 840gcgaagactg tcaaaatgaa atttggtcac cacggcggca accatccggt taaagatgtg 900gagaaaaacg tggtaatgat caccgcccag aaccacggtt ttgcggtgga cgaagcaaca 960ttacctgcaa acctgcgtgt cacgcataaa tccctgttcg acggtacgtt acagggcatt 1020catcgcaccg ataaaccggc attcagcttc caggggcacc ctgaagccag ccctggtcca 1080cacgacgccg cgccgttgtt cgaccacttt atcgagttaa ttgagcagta ccgtaaaacc 1140gctaagtaa 1149<210>33<211>382<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>33Leu Ile Lys Ser Ala Leu Leu Val Leu Glu Asp Gly Thr Gln Phe His
1 5 10 15Gly Arg Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ser Ala Val Gly Glu Val Val Phe20 25 30Asn Thr Ser Met Thr Gly Tyr Gln Glu Ile Leu Thr Asp Pro Ser Tyr35 40 45Ser Arg Gln Ile Val Thr Leu Thr Tyr Pro His Ile Gly Asn Val Gly50 55 60Thr Asn Asp Ala Asp Glu Glu Ser Ser Gln Val His Ala Gln Gly Leu65 70 75 80Val Ile Arg Asp Leu Pro Leu Ile Ala Ser Asn Phe Arg Asn Thr Glu85 90 95Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Lys Arg His Asn Ile Val Ala Ile Ala Asp100 105 110Ile Asp Thr Arg Lys Leu Thr Arg Leu Leu Arg Glu Lys Gly Ala Gln115 120 125Asn Gly Cys Ile Ile Ala Gly Asp Asn Pro Asp Ala Ala Leu Ala Leu130 135 140Glu Lys Ala Arg Ala Phe Pro Gly Leu Asn Gly Met Asp Leu Ala Lys145 150 155 160Glu Val Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Ser Trp Thr Gln Gly Ser Trp Thr165 170 175Leu Thr Gly Gly Leu Pro Glu Ala Lys Lys Glu Asp Glu Leu Pro Phe180 185 190His Val Val Ala Tyr Asp Phe Gly Ala Lys Arg Asn Ile Leu Arg Met195 200 205Leu Val Asp Arg Gly Cys Arg Leu Thr Ile Val Pro Ala Gln Thr Ser210 215 220Ala Glu Asp Val Leu Lys Met Asn Pro Asp Gly Ile Phe Leu Ser Asn225 230 235 240Gly Pro Gly Asp Pro Ala Pro Cys Asp Tyr Ala Ile Thr Ala Ile Gln245 250 255Lys Phe Leu Glu Thr Asp Ile Pro Val Phe Gly Ile Cys Leu Gly His260 265 270Gln Leu Leu Ala Leu Ala Ser Gly Ala Lys Thr Val Lys Met Lys Phe275 280 285Gly His His Gly Gly Asn His Pro Val Lys Asp Val Glu Lys Asn Val290 295 300Val Met Ile Tbr Ala Gln Asn His Gly Phe Ala Val Asp Glu Ala Thr305 310 315 320Leu Pro Ala Asn Leu Arg Val Thr His Lys Ser Leu Phe Asp Gly Thr325 330 335
Leu Gln Gly Ile His Arg Thr Asp Lys Pro Ala Phe Ser Phe Gln Gly340 345 350His Pro Glu Ala Ser Pro Gly Pro His Asp Ala Ala Pro Leu Phe Asp355 360 365His Phe Ile Glu Leu Ile Glu Gln Tyr Arg Lys Thr Ala Lys370 375 380
权利要求
1.氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，其中，SEQ ID NO20的947-951位的氨基酸序列被SEQ ID NO1-9中的任意一种氨基酸序列所取代，并且，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制被脱敏。
2.权利要求
1的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，其中，所述的氨甲酰磷酸合成酶是来自大肠杆菌的野生型氨甲酰磷酸合成酶。
3.一种氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，其由SEQ ID NO20中的947-951号位置的氨基酸序列被SEQ ID NO1-9中任意一种氨基酸序列所取代后所得的氨基酸序列组成，并且，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制被脱敏。
4.权利要求
1的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，它包括在除了947-951号位置以外的位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，其中，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制被脱敏。
5.一种氨甲酰磷酸合成酶，它包含权利要求
1-4中任意一项的氨甲酰磷酸合成酶的大亚基。
6.一种编码权利要求
1-4中任一项的氨甲酰磷酸合成酶大亚基的DNA，其中，尿苷5’-一磷酸的反馈抑制被脱敏。
7.一种编码权利要求
1-4中任一项的尿苷5’-一磷酸反馈抑制被脱敏的氨甲酰磷酸合成酶大亚基和大肠杆菌氨甲酰磷酸合成酶小亚基的DNA，其中，所述的小亚基是由SEQ ID NO33所示的氨基酸序列组成的蛋白。
8.一种属于埃希氏菌属的细菌，它具有权利要求
6或7的DNA。
9.权利要求
8的细菌，它具有生产选自L-精氨酸、瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的能力。
10.权利要求
9的细菌，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、尿苷5’-一磷酸、胞苷和胞苷5’-一磷酸。
11.一种生产选自L-精氨酸、瓜氨酸和嘧啶衍生物的化合物的方法，该方法包括以下步骤在培养基中培养权利要求
8-10中任意一项的细菌，以便在该培养基中产生并积累所述化合物，以及从所述培养基中收集所述化合物。
12.权利要求
11的方法，其中，所述嘧啶衍生物是乳清酸、尿苷、尿苷5’-一磷酸、胞苷和胞苷5’-一磷酸。
专利摘要
利用具有突变型氨甲酰磷酸合成酶的属于埃希氏菌属的细菌生产了L-精氨酸、瓜氨酸和包括乳清酸、尿苷、尿苷5’-一磷酸(UMP)、胞苷和胞苷5’-一磷酸(CMP)在内的嘧啶衍生物，其中，相当于野生型氨甲酰磷酸合成酶上947-951号位置的氨基酸序列被SEQ ID NO1-9中任意一种氨基酸序列所取代，并且该细菌中尿苷5’-一磷酸的反馈抑制作用被脱敏。
文档编号C12N9/00GKCN1316015SQ02127623
公开日2007年5月16日 申请日期2002年8月5日
发明者L·R·普蒂特斯恩, S·V·斯米尔诺夫, I·B·奥尔特曼, A·E·诺维科瓦, V·A·科利亚罗瓦, M·M·古斯亚廷尔, Y·G·罗斯托瓦, T·A·亚珀斯卡亚 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (1),