制备l-精氨酸的方法

专利名称:制备l-精氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及具有生产L-精氨酸能力的微生物，以及应用这种微生物制备L-精氨酸的方法。L-精氨酸是一种具有工业用途的氨基酸，可以作为肝功能促进剂、氨基酸输注液以及复合氨基酸药物等的成分。
背景技术：
通过发酵进行L-精氨酸制备的传统方法通常应用野生型棒状细菌菌株；耐某些试剂包括磺胺类药物，2-噻唑丙氨酸，α -氨基-β -羟基戊酸等的棒状细菌；除了耐2-噻唑丙氨酸外，还是L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸营养缺陷型的棒状细菌(日本专利公开(Kokai)号Μ-44096)；耐酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸的棒状细菌(日本专利公开号57-18989)；耐精氨醇(argininol)的棒状细菌(日本专利公开号62-24075)；耐X-胍的棒状细菌(X代表脂肪酸或脂肪链衍生物，日本专利公开号 2-186995)等。
另一方面，业已公开了多种应用重组DNA技术、通过增强L-精氨酸生物合成酶活性的方法增加L-精氨酸产量的技术。例如，业已公开了通过应用微生物制备L-精氨酸的方法，所述微生物属于拥有重组DNA的棒状杆菌或短杆菌属，所述重组DNA包括载体DNA和含有乙酰鸟氨酸脱乙酰酶、N-乙酰谷氨酸-Y -半醛脱氢酶、N-乙酰谷氨酸激酶 (glutamokinase)和精氨琥珀酸裂解酶的DNA片段，所述DNA片段源于属于埃希氏菌属的微生物(日本专利公告(Kokoku)号5-23750)，所述微生物如具有谷氨酸脱氢酶活性增强的棒状细菌(EP 1057 893A1)、引入了 N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)的大肠杆菌(参考日本专利公开号57-5693)等。
而且，对于棒状细菌业已表明，L-精氨酸生物合成途径中一些酶的生成受到L-精氨酸的抑制。而且，有报道指出，虽然L-精氨酸生物合成途径中的一些酶会受到L-精氨酸的抑制，但是L-精氨酸对这些酶的抑制作用在一些棒状细菌突变株中不敏感，并显示L-精氨酸积累量的增加(Agric. Biol. Chem.，43 (1)，105，1979)。
而且，对于大肠杆菌来说，业已鉴定了 L-精氨酸生物合成途径的阻遏物和编码该阻遏物的基因(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1987)，84(19)，6697-701)，并对阻遏物蛋白与多种L-精氨酸生物合成途径基因的相互作用进行了研究(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1987)，84 (19) ,6697-701，J. Mol. Biol. (1992)，226，367-386)。
但是，在棒状细菌中尚未鉴定L-精氨酸生物合成途径的阻遏物蛋白。尽管阻遏物蛋白基因(argR)的核苷酸序列和由此推导的编码氨基酸序列已经在GenBank基因数据库中登记(AF049897)，但该基因之所以被命名为argR据信是因为在上述氨基酸序列和已知精氨酸阻遏物之间存在同源性。
同时，最近鉴定了具有将L-氨基酸分泌到微生物菌体外功能的特异性蛋白质和基因，特别是，Vrlijc et al.鉴定了一个涉及棒状杆菌细菌菌体外分泌L-赖氨酸的基因 (Vrlijc M.，Sahm H.，Eggeling L.，MolecularMicrobiology, 22 :815-826 (1996))。该基
3因被命名为lysE，有报道指出，通过在棒状杆菌细菌中增强该基因表达，可以改善棒状杆菌细菌生成L-赖氨酸的能力(W097/23597)。而且，已知在大肠杆菌中增加氨基酸分泌蛋白的表达量，可以改善某些L-氨基酸的产量(日本专利公开号2000-189180)。例如，业已报道，通过将多拷贝yggA基因导入大肠杆菌，可以改善赖氨酸和精氨酸的产量(日本专利公开公告号2000-189180)。而且，有报道指出，通过在大肠杆菌中增加0RF306基因的表达，可以改善胱氨酸、半胱氨酸等的产量(EP88596》。但是，IysE基因是否具有分泌L-赖氨酸以外其他氨基酸的功能，目前尚不知晓。

发明内容
本发明的一个目标是改善微生物生产L-精氨酸的能力，并提供有效制备L-精氨酸的方法。所述微生物如棒状细菌和属于埃希氏菌属的细菌。
在研究L-精氨酸生产细菌的过程中，本发明的发明者发现，可以通过增强IysE基因的表达来改善L-精氨酸的生产能力。而且，他们还发现，可以通过增强IysE基因，同时破坏argR基因或增强L-精氨酸生物合成途径中的酶活性，显著改善L-精氨酸的生产能力， 进而实现本发明目标。即，本发明提供了以下方面。
(1)具有L-精氨酸生产能力的微生物，所述微生物经过修饰，使IysE基因的表达增强。
(2)根据(1)的微生物，其中通过增加IysE基因的拷贝数或者修饰IysE基因的表达调控序列来增强IysE基因的表达，这样微生物细胞内IysE基因的表达水平得到增强。
(3)根据⑴或⑵的微生物，所述微生物经进一步修饰，使精氨酸阻遏物不能发挥正常功能。
(4)根据(3)的微生物，其中精氨酸阻遏物不能发挥正常功能是因为染色体上编码精氨酸阻遏物的基因被破坏。
(5)根据(1)-(4)的任一微生物，所述微生物经进一步修饰，使细胞内L-精氨酸生物合成途径中的酶活性得到增强。
(6)根据(1)-( 的任一微生物，其中所述微生物是棒状细菌。
(7)根据(1)-(5)的任一微生物，其中所述微生物是属于埃希氏菌属的细菌。
(8)制备L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养根据(1)-(7)的任一微生物，并在培养基中产生、积累L-精氨酸，然后从培养基中收获L-精氨酸。
本发明中，“生产L-精氨酸的能力(产L-精氨酸能力)，，意味着当微生物在培养基中培养时，本发明微生物在培养基中积累L-精氨酸的能力。这种产L-精氨酸能力可以是微生物作为野生型菌株天然拥有的，也可以是通过培养获得的或得到增强的。
根据本发明，微生物的产L-精氨酸能力能够得到改善，所述微生物如具有L-精氨酸生产能力的棒状细菌或属于埃希氏菌属的细菌。


图1显示了质粒pKl的构建过程。
图2显示了质粒pSH(6的构建过程。
图3显示了质粒pSH(T2的构建过程。
4[0023]图4显示了质粒plysE的构建过程，所述质粒含有lysE。
图5显示了质粒pargCJBDFGH和pargCJBDFGH-E的构建过程，所述质粒 pargCJBDFGH含有L-精氨酸生物合成酶基因，不含argR基因，质粒pargCJBDFGH-E含有 IysE和L-精氨酸生物合成酶基因。
图6显示了含有tac启动子的pRMac的构建，以及质粒pRSlysE的构建，后者通过将IysE基因插入质粒pl^tac获得。
具体实施方式
从此往后，本发明将给予详细阐述。
<1>本发明微生物
本发明微生物是具有产L-精氨酸能力的微生物，并经过修饰，使IysE基因的表达得到增强。本发明微生物可以通过下述途经获得，包括增加具有产L-精氨酸能力的微生物的IysE基因表达，或者通过增加微生物IysE基因的表达使微生物获得产L-精氨酸的能力。
本发明微生物的特异性实例包括具有IysE基因或IysE基因同系物的微生物，具体地说，包括棒状细菌，属于芽孢杆菌属、沙雷氏菌属或埃希氏菌属的细菌，属于酵母菌属或念珠菌属的酵母菌。在这些细菌中，优选棒状细菌和属于埃希氏菌属的细菌。
示例微生物包括属于芽孢杆菌属的细菌如枯草芽孢杆菌，属于沙雷氏菌属的细菌如粘质沙雷菌，属于埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌，属于酵母菌属的酵母菌如酿酒酵母， 属于念珠菌属的酵母菌如热带念珠菌。
具有产L-精氨酸能力的示例微生物包括耐5-氮尿嘧啶、6-氮尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氮胞嘧啶、6-氮胞嘧啶等的枯草芽孢杆菌，耐精氨酸氧肟酸和2-硫尿嘧啶的枯草芽孢杆菌，耐精氨酸氧肟酸和6-氮尿嘧啶的枯草芽孢杆菌(参考日本专利公开号49-U68191)；
耐组氨酸类似物或色氨酸类似物的枯草芽孢杆菌(参考日本专利公开号 52-114092)；
对至少一种下述物质呈现营养缺陷的突变枯草芽孢杆菌菌株，所述物质包括蛋氨酸，组氨酸，苏氨酸，脯氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，腺嘌呤，鸟嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前体) (参考日本专利公开号52-99289)；
耐精氨酸氧肟酸的枯草芽孢杆菌(参考日本专利公开号51-6754)；
粘质沙雷菌，对琥珀酸呈现营养缺陷，或耐核酸碱基类似物(参考日本专利公开号 58-9692)；
粘质沙雷菌，在代谢精氨酸能力上存在缺陷，并耐精氨酸拮抗剂和刀豆氨酸，对赖氨酸呈现营养缺陷(参考日本专利公开号52-8729)；
导入了 argA基因的大肠杆菌(参考日本专利公开号57-5693)；
酿酒酵母，耐精氨酸、精氨酸氧肟酸、高精氨酸、D-精氨酸和刀豆氨酸，或者耐精氨酸氧肟酸和6-氮尿嘧啶(参考日本专利公开号53-143观8)；
耐刀豆氨酸(参考日本专利公开号53-3586)等的热带念珠菌。
棒状细菌包括迄今为止分类属于短杆菌属但目前并入棒杆菌属的细菌ant.
5J. Syst. Bacteriol.，41，255 (1981))，还包括属于短杆菌属并与棒杆菌属密切相关的细菌。 这些棒状细菌的示例在下列出。
嗜乙酰乙酸棒杆菌
醋谷棒杆菌
Corynebacterium alkanolyticum
美棒杆菌
谷氨酸棒杆菌
百合花棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes
力士棒杆菌
分支短杆菌(Corynebacterium glutamicum)
黄色短杆菌(Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Corynebacterium glutamicum)
玫瑰色短杆菌
解糖短杆菌
生硫短杆菌
白色短杆菌
蜡状短杆菌
嗜氨短杆菌
具有L-精氨酸产生能力的棒状细菌并没有特别限制，只要它们具有产L-精氨酸的能力。它们包括，例如，棒状细菌的野生型菌株；耐某些制剂的棒状细菌，所述制剂包括磺胺类药物，2-噻唑丙氨酸，α -氨基-β -羟基戊酸等；除了耐2-噻唑丙氨酸外，还对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸呈现营养缺陷的棒状细菌(日本专利公开号Μ-44096)；耐酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸的棒状细菌(日本专利公开号57-18989)；耐精氨醇的棒状细菌(日本专利公开号62-24075)；耐X-胍的棒状细菌 (X代表脂肪酸或脂肪链衍生物，日本专利公开号2-1869%)等。
具体地说，下列细菌菌株可以作为示例。
黄色短杆菌AJ11169(FERM P-4161)
乳发酵短杆菌AJ12092(FERM P-7273)
黄色短杆菌AJll336 (FERM P-4939)
黄色短杆菌AJlliM5 (FERM P-4948)
乳发酵短杆菌AJ 12430 (FERM BP-2228)
AJl 1169于1977年8月3日保藏于独立的管理机构，国立尖端工业科学技术研究所，国际专利生物保藏处(Chuo Dai-6,1-1 HigashiI-Chome, Tsukuba-shi，Ibaraki-ken, Japan, postal code :305-5466)(原工业技术院发酵研究所，之后相同的应用于同一情况)，编号为FERM P-4161。然后，又根据布达佩斯条约于1999年9月27日转为国际保藏， 编号为 FERMBP-6892。
6[0068]AJ12092于1983年9月四日保藏于独立的管理机构，国立尖端工业科学技术研究所，国际专利生物保藏处，编号为FERM P-7273。然后，又根据布达佩斯条约于1999年10 月1日转为国际保藏，编号为FERMBP-6906。
AJ11336于1979年4月25日保藏于独立的管理机构，国立尖端工业科学技术研究所，国际专利生物保藏处，编号为FERM P-4939。然后，又根据布达佩斯条约于1999年9月 27日转为国际保藏，编号为FERMBP-6893。
AJ11345月1979年4月25日保藏于独立的管理机构，国立尖端工业科学技术研究所，国际专利生物保藏处，编号为FERM P-4948。然后，又根据布达佩斯条约于1999年9月 27日转为国际保藏，编号为FERMBP-6894。
根据布达佩斯条约，AJ1M30于1988年12月沈日作为国际保藏保藏于独立的管理机构，国立尖端工业科学技术研究所，国际专利生物保藏处，编号为FERM BP-2228。
作为属于埃希氏菌属的细菌，可以应用那些在Neidhardt等(Neidhardt， F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C.，1208，表1)的工作中涉及的细菌，如大肠杆菌。
作为属于具有L-精氨酸生产能力的埃希氏菌属的细菌，可以涉及大肠杆菌菌株 237(俄罗斯专利申请号2000117677)等。
本发明微生物的第一方面是具有L-精氨酸生产能力的细菌，如上面提到的那些细菌，所述细菌经过修饰，使IysE基因的表达得到增强。
本发明微生物的第二方面是如上所述的微生物，经过进一步修饰，使精氨酸阻遏物不能发挥正常功能。
本发明微生物的第三方面是本发明第一、第二方面提到的微生物，经过进一步修饰，使细胞内L-精氨酸生物合成途径的酶活性得到提高。
此后，将阐述每一个实施方案。
(1) IysE基因表达得到增强的微生物
增强微生物IysE基因的表达可以通过下述途经达成，即在涉及L-精氨酸分泌系统的蛋白质编码基因中引入突变，使该蛋白的活性得到增强，或者通过应用利用该基因的基因重组技术。具体地说，该基因可以是IysE基因(Vrlijc M.，Sahm H.，Eggeling L.， Molecular Microbiology 22 :815-826(1996)，W097/23597)。
此后，将把IysE基因作为示例进行阐释。
可以增强IysE基因编码蛋白(LysE)活性的示例突变包括启动子序列突变，IysE 基因编码区突变等，前者增加IysE基因的转录数量，后者增加LysE蛋白的特异性活性。
而且，对于应用基因重组技术增强LysE活性来说，可以通过下述方法达成，例如， 增加细胞内IysE基因的拷贝数。例如，可以通过将含有IysE基因的DNA片段与微生物功能载体连接来制备重组DNA，优选多拷贝类型的载体，然后引入微生物，进行转化。
至于IysE基因，可以应用来自棒状细菌的基因，属于埃希氏菌属细菌的基因，或任意其他微生物的基因。在这些基因中，从表达容易程度的角度来评价，优选来自棒状细菌或属于埃希氏菌属细菌的基因。
因为棒状细菌的IysE基因序列已经阐明(GenBank编号x96471)，因此可以应用棒状细菌染色体DNA作为模板，通过PCR方法(多聚酶链反应，参考White，Τ. J. et al.，
7Trends Genet.，5，185 (1989))获得IysE基因，PCR中所用引物可以根据核苷酸序列进行制备，如序列表中序列23和M的引物。序列25显示了含有谷氨酸棒杆菌IysG和IysE基因 (GenBank编号X96471)的DNA片段的核苷酸序列，序列沈显示了 LysE的氨基酸序列。序列25中，互补链对应于核苷酸1723-2352的位点编码LysG。
其他任意微生物的IysE基因也可以通过PCR从微生物染色体DNA或染色体DNA文库中获得，也可以通过杂交的方法获得，PCR中所用的引物可以是根据已知微生物IysE基因制备的寡核苷酸，也可以是根据另一种微生物的IysE或LysE蛋白序列信息制备的寡核苷酸，还可以根据上述序列信息制备寡核苷酸作为杂交所用的探针。
而且，本发明应用的IysE基因并不限于野生型基因，它可以是编码蛋白的突变或人工修饰基因，包括取代、缺失、插入或在一个或多个位点增加一个或多个氨基酸残基，只要编码的LysE蛋白的功能没有缺陷。尽管本文所指的“多个”氨基酸的具体数目由于蛋白三维结构中氨基酸残基的位置或类型不同而有差异，但具体地说，这一数目可以是2-30，优选2-20，更优选2-10。至于编码与上述LysE基本类似的蛋白的DNA，这里示例的DNA是， 能够在严格条件下与探针杂交并编码与LysE具有相同或相似活性的蛋白质的DNA，所述探针的核苷酸序列含有，例如对应于序列25的1025-1723号核苷酸。本文所指的“严格条件” 是这样的条件，在该条件下，可以形成所谓的特异性杂交，而不能形成非特异性杂交。应用具体的数字来清晰描述这种条件是非常困难的。但是，例如，严格条件可以通过这样的条件进行示例，在该条件下，具有很高同源性的DNA，例如，不少于50%同源性的DNA可以彼此杂交，但是同源性低于上述水平的DNA则不能彼此杂交。此外，严格条件还可以通过这样的条件进行示例，在该条件下，在对应于Southern杂交常规洗脱条件的盐浓度下，DNA可以彼此杂交，即，60°C，lx SSC，0. SDS，优选 0. Ix SSC, 0. 1% SDS0
例如，可以应用Saito and Miura 的方法(参考 H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta,72,619(1963), Text for BioengineeringExperiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-98, Baifukan, 1992)等，在作为DNA供体的细菌中制备染色体DNA。
如果通过PCR扩增的IysE基因可以与载体DNA连接形成重组DNA，并将其引入大肠杆菌，那么随后的事情就简单多了。所述载体DNA能够在大肠杆菌和/或棒状细菌菌体中自主复制。能够在大肠杆菌菌体内自主复制的载体实例包括PUC19，pUC18，pHSG299, PHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 等。
在棒状细菌中能够发挥作用的载体是指，例如能够在棒状细菌中自主复制的质粒。其特异性实例包括下述质粒。
pAM330 (参考日本专利公开公告号58-67699)
pHM1519(参考日本专利公开公告号58-77895)
pSFK6 (参考日本专利公开公告号2000-262^8)
而且，如果从这些载体中把能够使质粒在棒状细菌中自主复制的DNA片段切除， 再插入到上述大肠杆菌载体中，这样的载体可以作为所谓的穿梭载体，在大肠杆菌和棒状细菌中均能自主复制。
这种穿梭载体的实例包括下述质粒。应该指出，拥有每种载体的微生物及其在国际保藏处的编号分别在圆括号中给出。
8[0095]pAJ655 大肠杆菌 AJll882 (FERM BP-136)
谷氨酸棒杆菌 SR8201(ATCC 39135)
pAJ1844 大肠杆菌 AJl 1883 (FERM BP-137)
谷氨酸棒杆菌 SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611 大肠杆菌 AJl 1884 (FERM BP-138)
pAJ3148 谷氨酸棒杆菌 SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440 枯草芽孢杆菌 AJll9Ol (FERM BP-140)
pHC4 大肠杆菌 AJU617(FERM BP-3532)
这些载体可以从如下保藏微生物中获得。即，收集处于指数生长期的微生物菌体， 应用溶菌酶和SDS裂解细菌，并以30000xg离心。向获得的裂解液上清加入聚乙烯乙二醇， 通过氯化铯溴化乙啶平衡密度梯度离心进行分层、纯化。
为了将IysE基因与能够在棒状细菌中发挥作用的载体连接，制备重组DNA，应用对应于IysE基因末端的限制性酶消化载体。通常应用连接酶，如T4DNA连接酶进行连接。
为了将上述制备的重组DNA引入微生物，可以采用迄今为止报道的任何已知转化方法。例如，可以采用的方法包括应用氯化钙处理受体细胞，以增加细胞对DNA的穿透力，该方法业已报道可用以处理大肠杆菌K-12(Mandel，Μ. and Higa，A. J. Mol. Biol.， 53，159 (1970))，另一种方法是在生长期细胞中制备活性细胞，然后将DNA导入，该方法业已报道可用以处理枯草芽孢杆菌(Duncan，C. H.，Wilson, G. A. and Young, F. Ε.，Gene, 1， 153(1977))。除了这些方法，还可采用的方法是将DNA受体细胞制备成原生质体或原生质球，可以容易地摄取重组DNA，然后将重组DNA引入DNA受体细胞，该方法已知可以用于枯草芽孢杆菌，放线菌类和酵母菌(Chang，S. and Choen, S. N.，Molec. Gen. Genet.，168， 111(1979) ；Bibb,Μ. J. ,Ward, J. M. and Hopwood, 0. A. ,Nature, 274, 398 (1978) ;Hinnen，A·， Hicks, J. B. and Fink, G. R. Proc. Natl. Sci. USA, 75,1929 (1978)) 棒状细菌的转化可以通过电击转化的方法进行(Sugimoto et al.，日本专利公开号2-207791)。
增加IysE基因的拷贝数还可以通过将多拷贝IysE基因导入微生物染色体DNA来达成。为了将多拷贝IysE基因导入微生物染色体DNA，对于多拷贝序列业已存在于染色体 DNA作为靶目标的序列来说，可以采用同源重组的方法。对于多拷贝序列业已存在于染色体 DNA的序列，可以应用存在于可转座元件末端的重复DNA，反转重复序列。而且，如日本专利公开号2-109985所述内容，可以将IysE基因整合到转座子上，并使它们转座，将多拷贝基因引入染色体DNA。
除了前述基于基因扩增的方法，增强IysE活性还可通过下述方法达到，如将染色体DNA或质粒上IysE基因的表达调控序列如启动子进行置换，换成更强的(W000/18935) 的启动子。例如，Iac启动子，trp启动子，trc启动子等都已知是强启动子。而且，还可以将核苷酸取代等导入IysE基因的启动子区域，使其修饰成为更具潜力的启动子。启动子通过这样的取代或修饰，IysE基因的表达得到增强。这种表达调控序列的修饰可以与增加 IysE基因拷贝数共同进行。
表达调控序列的取代还可以通过，例如应用后述温度敏感性质粒，采取与基因取代相同的方式进行。棒状细菌温度敏感性质粒的实例包括P48K和pSH(T2 (参考日本专利公开公告号2000-262^8)，pHSC4(参考法国专利公开公告号沈67875，1992和日本专利公开公告号5-7491)等。在棒状细菌中，这些质粒至少在25°C可以自主复制，但在37°C则不能自主复制。尽管在后面提到的实施例中应用PSH(T2取代了 GDH基因的启动子序列，但可以相同的方式应用PHSC4而不是pSH(T2进行基因替代。大肠杆菌AJ12571于1990年10月 11日保藏于独立的管理机构，国立尖端工业科学技术研究所，国际专利生物保藏处(Chuo Dai_6，I-IHigashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken,Japan,postal code :305-5466)， 编号为FERM P-11763。然后，又根据布达佩斯条约于1991年8月沈日转为国际保藏，编号为 FERM BP-3524o
(2)精氨酸阻遏物不能发挥正常功能的微生物
本发明“精氨酸阻遏物”是指具有抑制L-精氨酸生物合成效应的蛋白质，如果微生物中编码该蛋白的基因表达数量增加，L-精氨酸生产能力下降，而且如果该基因表达数量下降或者该蛋白消失，L-精氨酸生产能力改善。以后，编码精氨酸阻遏物的基因又称为 argR基因。术语“精氨酸阻遏物不能发挥正常功能”意味着与野生型菌株或未修饰菌株相比，精氨酸阻遏物的活性降低或消失。
可以通过如下方法获得精氨酸阻遏物不能以正常方式发挥作用的微生物，如修饰其argR基因，使其基因产物精氨酸阻遏物的活性下降或消失，或者使argR基因的转录下降或消失。这样的微生物可以通过如下方法获得，例如，可以应用如基于基因重组技术的同源重组方法(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972) ；Matsuyama, S. and Mizushima, S.，J. Bacteriol.，162，1196 (1985))，用不能以正常方式发挥作用的argR基因(之后通常称之为“被破坏的argR基因”)置换染色体 argR基因。
当携带与染色体序列具有同源性序列的质粒被导入相应细胞后，同源重组会以一定的频率在同源序列位点发生，这样，导入的质粒就以整体的形式整合到染色体中。然后， 通过导致再次同源重组，在染色体同源序列位点可以将质粒从染色体上清除。但是，根据同源重组发生的位点，被破坏的基因可能依然保留在染色体上，而原来正常的基因可能与质粒一起从染色体上消失。通过筛选这些菌株，可以获得正常argR基因被破坏argR基因置换的菌株。
业已建立了这种基于同源重组的基因破坏技术，可以应用的方法包括应用线形 DNA的方法，应用温度敏感性质粒的方法等。argR基因还可通过以下方式进行破坏，如应用不能在靶微生物菌体内复制的含有argR基因和插入标识基因的质粒，所述插入标识如耐药基因。即，转化了这种质粒的转化株获得了耐药性，标识基因整合到染色体DNA中。该标识基因的整合可能是通过同源重组技术，即位于该标识基因两侧的argR基因与染色体 argR基因之间进行同源重组，因此，基因破坏株可以非常有效地进行筛选。
具体地说，用于基因破坏的argR破坏基因可以通过下述方法得到，包括从argR基因中去除某一特定区域，去除方法可以采用限制性酶切消化后再连接；在argR基因中插入另一段DNA(标识基因等)；或者通过位点特异性突变法在argR基因编码区、启动子区等核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、缺失、插入、添加或倒转(Kramer，W.and Frits, H. J. , Methods in Enzymology, 154, 350 (1987))；或者应用化学试剂如硫代硫酸钠和羟胺等处理(Shortle，D. and Nathans, D.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,75, 270 (1978))，使编码的阻遏物活性下降或消失，或者使argR基因的转录下降或消失。在这些实施方案中，从
10可靠性和稳定性的观点来看，优选通过限制性酶切消化后再连接去除argR基因的某一特定区域的方法，和在argR基因中插入另一 DNA片段的方法。
用于argR破坏基因的质粒可以通过PCR(多聚酶链反应)方法进行制备，PCR应用含有argR基因的质粒及其侧翼序列作为模板，对应于argR基因末端部位或侧翼区(的核苷酸)作为引物，扩增不包括完整argR基因内部的部分，并将获得的产物进行环化。在后述实施例中，argR基因通过该方法进行破坏。
argR基因可以通过PCR技术从微生物染色体DNA中获得，并应用根据argR基因已知核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物。argR基因还可通过杂交技术从微生物染色体DNA 文库中获得，应用根据argR基因已知核苷酸序列制备的寡核苷酸作为探针。根据本发明目的，argR基因是用于制备argR破坏基因，所以不需要包括全长的序列，可能只需要包括能够导致基因破坏的长度。
argR基因的来源没有特别限制，只要它具有一定程度的同源性，可以与靶微生物的argR基因进行同源重组。具体地说，黄色短杆菌的argR基因(其核苷酸序列如序列17 所示)和谷氨酸棒杆菌的argR基因(GenBank编号AF049897)可以作为棒状细菌的argR 基因。这些argR基因高度同源，据信，即使棒状细菌种属的argR基因与欲进行argR基因破坏的棒状细菌的argR基因不同，也可以用于该基因的破坏。
本发明中，序列18所示的氨基酸序列或者与该氨基酸序列同源的氨基酸序列意味着，argG基因编码的氨基酸序列具有如此的同源程度，它可以与序列18所示的argG基因编码氨基酸序列进行同源重组(例如，具有序列17所示核苷酸序列的argG基因)。同源是，例如优选70%或以上同源，更优选80%或以上同源，更优选90%或以上同源。如上所述argG基因，其示例DNA能够在严格条件下与探针杂交，所述探针的核苷酸序列包括，例如对应于序列17的1852-2364号核苷酸的核苷酸序列。本文所指的“严格条件”是这样的条件，在该条件下，可以形成所谓的特异性杂交，而不能形成非特异性杂交。应用具体的数字来清晰描述这种条件是非常困难的。但是，例如，严格条件可以通过这样的条件进行示例， 在该条件下，具有很高同源性的DNA，例如，不少于50%同源性的DNA可以彼此杂交，但是同源性低于上述水平的DNA则不能彼此杂交。此外，严格条件还可以通过这样的条件进行示例，在该条件下，在对应于Southern杂交常规洗脱条件的盐浓度下，DNA可以彼此杂交，即， 600C，Ix SSC, 0. 1 % SDS,优选 0. Ix SSC, 0. 1% SDS0
对于用于PCR的引物，可以应用任何能够扩增argR基因的引物。其特异性实例包括具有如序列19和20所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
而且，标识基因的实例包括耐药基因，如卡那霉素耐药基因。卡那霉素耐药基因可以从含有粪链球菌卡那霉素耐药基因的已知质粒中通过PCR扩增获得，如 pDG783(Anne-Marie Guerout-Fleury et al. , Gene,167,335-337(1995))。
当应用耐药基因作为标识基因时，argR破坏基因型菌株可以通过下述方法获得， 包括在适宜位点将耐药基因插入到质粒携带的argR基因中，应用质粒转化微生物，然后筛选具有耐药性的转化株。可以应用Southern印记和PCR等方法，通过分析染色体上的argR 基因或标识基因，证实染色体上argR基因的破坏。可以通过PCR技术证实卡那霉素耐药基因是否整合到染色体DNA中，PCR所用引物应该能够扩增卡那霉素耐药基因(如具有如序列1和2所示的核苷酸序列的寡核苷酸)。
11[0122](3)增强L-精氨酸生物合成途径酶的活性
增强L-精氨酸生物合成途径酶活性可以通过以下方法获得，包括在编码酶基因中引入突变，使细胞内L-精氨酸生物合成途径酶活性增强，或者应用基因重组技术利用该基因。L-精氨酸生物合成途径酶可以是选择下述酶中的一种或多种，包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)，鸟氨酸乙酰转移酶(argj)，N-乙酰谷氨酸激酶(argB)，乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)，鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)，精氨琥珀酸合成酶(argG)和精氨琥珀酸裂解酶 (argH)。编码这些酶的基因命名分别在每个酶后面的圆括号中给出。
而且，L-精氨酸的生产能力还可以通过增强谷氨酸脱氢酶活性得到加强(EP 1057 893A1)。
应用基因重组技术增强L-精氨酸生物合成途径酶活性可以通过增加每个基因的拷贝数或修饰这些基因的表达调控序列达到，这样，可以如上述LysE活性增强一样，使每个基因的表达得到加强。
谷氨酸棒杆菌的这些基因的核苷酸序列在GenBank均有登记，编号为AF049897。 在谷氨酸棒杆菌中，这些基因以argC，argj，argB, argD，argF，argR，argG和argH的顺序存在于染色体DNA上，并可通过PCR技术获得这些基因，PCR中应用诸如序列27和28所示核苷酸序列作为引物，谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌染色体DNA作为模板。而且，如果将正常 argR基因与另一种编码L-精氨酸生物合成途径酶的基因共同引入棒状细菌，L-精氨酸产量的增加就会受到抑制。因此，本发明优选在获得的PCR扩增片段中破坏或去除argR。这可以通过下述方法达成，例如，进行PCR时，应用含有PCR扩增片段的质粒作为模板，应用具有序列四和30所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。
本发明中，L-精氨酸生物合成途径酶活性的增强可以与染色体argR基因的破坏同时进行。
<2>制备L-精氨酸的方法
L-精氨酸可以通过下述方法有效制备，在培养基中培养如上所述IysE基因表达增强并具有L-精氨酸生产能力的微生物，在培养物中产生并积累L-精氨酸，然后从培养基中收获L-精氨酸。
采用的培养基可以选择众所周知的应用微生物发酵制备氨基酸的传统培养基。 即，它可以根据需要，含有碳源、氮源、无机离子和其他有机成分的常用培养基。
作为碳源，可以应用糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解产物，也可以应用醇类，如甘油或山梨醇，还可以应用有机酸，如富马酸、柠檬酸或琥珀酸。
作为氮源，可以应用无机氨盐，如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵，也可以应用有机氮，如大豆蛋白水解产物、氨气、氨水等。
需要往培养基中添加适宜剂量的所需物质，如维生素Bi、酵母提取物等，作为有机痕量营养元素。除了上面提到的物质，还可根据需要，添加少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
优选在有氧条件下培养1-7天。培养过程中，培养温度优选控制在M_37°C，PH优选控制在5-9。有机物或无机物，酸性物质或碱性物质，以及氨气等可用来调节pH。可以采用众所周知的技术组合从发酵肉汤中收获L-精氨酸，如应用离子交换树脂和其他技术。
实施例
12[0136]此后，本发明将参考下面的实施例给予更加特异的阐述。
实施例1 构津大肠杆菌和棒状细菌的穿梭载体和温度敏感件载体
首先，构建用于将argR基因导入棒状细菌的载体以及用于制备棒状细菌argR缺陷型菌株的温度敏感性载体。
<1>构建具有粪链球菌耐药基因的载体
从已知含有卡那霉素耐药基因的质粒中，通过PCR扩增粪链球菌卡那霉素耐药基因。粪链球菌卡那霉素耐药基因的核苷酸序列业已阐明(Trieu-Cuot，P. and Courvalin, P. =Gene 23 (3)，331-341 (1983))。根据该序列，合成序列1和2所示的引物，并应用这对引物和作为模板的 PDG783 (Anne-Marie Guerout-Fleury et al.，Gene，167，335-337 (1995)) 通过PCR扩增含有卡那霉素耐药基因及其启动子的DNA片段。
应用Takara Shuzo出品的SUPREC02纯化上述DNA片段，然后应用限制性酶Hind III和Hinc II进行彻底消化，并进行末端补平。该末端补平过程可以通过应用Takara Shuzo出品的末端补平试剂盒进行。然后将该DNA片段与另一 DNA片段混合，并连接其上；后者是经过纯化并末端补平处理的PCR扩增产物，该PCR反应应用序列3和4所示的核苷酸序列作为引物，应用 pHSG399(参考 S. Takeshita et al.，Gene，61，63-74(1987)) 作为模板。该连接反应通过应用Takara Shuzo出品的DNA连接试剂盒Ver. 2进行。应用该连接DNA转化大肠杆菌活性细胞JM109(Takara Shuzo)，接种于L培养基(10g/L Bacto胰蛋白胨，5g/L Bacto酵母提取物，5g/L NaCl，15g/L琼脂，pH 7. 2)，所述培养基含有10ug/mlIPTG(异丙基- β -D-硫半乳糖吡喃糖苷)，40ug/ml X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和25ug/ml卡那霉素，培养过夜。然后，收集呈现蓝色的集落，分离成单细胞集落，获得转化株。
fflM ^ (SEIBUTSU KOGAKU JIKKENSYO(Text forBioengineering Experiments)， Edited by the Society for Bioscience andBioengineering, Japan, p. 105，Baifukan, 1992)从转化株中制备质粒，然后准备限制性酶切图谱。具有等同于图1 所示限制性酶切图谱的质粒被命名为PK1。该质粒在大肠杆菌中稳定保留，可以将卡那霉素耐药性赋予宿主。而且，由于它含有lacZ’基因，所以适用于克隆载体。
<2>构建穿梭载体pSH(6
作为可以获得温度敏感性复制控制区的物质，制备了在大肠杆菌和棒状细菌中均可自主复制的质粒载体。从乳发酵短杆菌ATCC13869中抽提质粒pAM330 (参考日本专利公开公告号58-67699)，然后用限制性酶Hind III进行彻底消化，并进行末端补平。该片段与应用限制性酶BsaAI彻底消化上述pKl获得的片段进行连接。应用连接DNA转化乳发酵短杆菌ATCC13869。该转化反应通过电脉冲法进行(参考日本专利公开公告号2-207791)。 在含有25ug/ml卡那霉素的M-CM2B平板(10g/L聚蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl, lOug/L生物素，15g/L琼脂，pH 7.2)上筛选转化株。培养2天后，收集集落并分离单细胞集落，获得转化株。从转化株中制备质粒DNA，准备限制性酶切图谱。具有等同于图2所示限制性酶切图谱的质粒被命名为pSH(6。该质粒在大肠杆菌和棒状细菌中均可自主复制，并将卡那霉素耐药性赋予宿主。
<3>构建具有温度敏感性复制控制区的质粒
体外应用羟胺处理pSH(6。根据已知方法进行羟胺处理(参考，例如，
13G. 0. Humpherys et al. ,Molec. Gen. Genet. , 145,101-108 (1976)) 收集处理后的 DNA，用于转化乳发酵短杆菌ATCC13869菌株。在含有25ug/ml卡那霉素的M-CM2B平板上以较低温度(25°C )筛选转化株。出现的转化株在相似的筛选平板上复制，并在较高温度(34°C ) 培养。获得不能在较高温度、含有卡那霉素的筛选平板上生长的菌株。从该菌株中获得的质粒被命名为P48K。
<4>测定温度敏感性复制控制区的核苷酸序列
测定了具有野生型复制控制区的质粒pSH(6和具有温度敏感性复制控制区的质粒P48K的复制控制区片段的核苷酸序列。核苷酸序列的测定是应用ABI出品的DNA测序试剂盒，在全自动测序仪ΑΒΙ310(ΑΒΙ)上进行的。结果发现，在野生型复制控制区和温度敏感性复制控制区之间存在6个核苷酸取代。序列5给出了在棒状细菌中发挥作用的pSH(6 (全部序列源自PAM330)所含的温度敏感性复制控制区片段的核苷酸序列，序列7给出了在棒状细菌中发挥作用的P48K所含的温度敏感性复制控制区片段的核苷酸序列。而且，序列6 和8给出了这些核苷酸序列中含有的编码氨基酸序列的0RF。在温度敏感性复制控制区，第 1255位点的C突变为Τ，第1534位点的C突变为Τ，第1866位点的G突变为Α，第2058位点的G突变为Α，第2187位点的C突变为Τ，第3193位点的G突变为Α。在这些突变中，只有第1534位点的突变伴随氨基酸突变，并导致丝氨酸取代脯氨酸。
<5>构建具有温度敏感性突变的穿梭载体
将ρ48Κ中6个突变的每一个都引入穿梭载体pSH(6(参考图3)。应用已知方法进行突变引入(Mikaelian，I. ,Sergeant, A. ,Nucleic AcidsRes.，20，376 (1992))。具体的操作过程将在下面给出。为了引入3193位点的G到A的突变，应用序列9和10所示的引物， 以及序列11和12所示的引物，并将PAM330作为模板进行PCR。通过将获得的每种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并从凝胶中收获这些产物。应用EASYTRAP Ver. 2 (Takara amzo)处理凝胶中获得的DNA片段。将纯化的DNAWl 1的摩尔比率进行混合，并作为 PCR的模板，引物应用序列13和14。应用限制性酶MluI对扩增产物进行彻底消化，然后在琼脂糖凝胶电泳上收获大约为3. 21Λ的DNA片段。同样，应用限制性酶MluI彻底消化 pSH(6，然后在琼脂糖凝胶电泳上收获大约为3. Skb的DNA片段。将获得的DNA片段混合连接，用于转化大肠杆菌活性细胞JM109 (Takara Shuzo)。将细胞接种于含有25ug/ml卡那霉素的L培养基中，培养过夜。收集出现的集落并分离单细胞集落，获得转化株。应用碱法从转化菌株中制备质粒，然后对质粒进行核苷酸序列测序，证实序列17所示序列第1534位点的C突变成了 T。该质粒被命名为pSH(T2 (图3)。
实施例2 克隆argR基因并在棒状细菌中观察其扩增效应
应用黄色短杆菌野生型菌株2247 (AJ14067)的染色体DNA作为模板，应用具有序列15(序列17的1717-1741核苷酸序列)和序列16(序列17的2386-2362核苷酸序列的互补序列)所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，进行PCR。PCR应用Pyrobest DNA多聚酶(Takara Shuzo)进行30个循环，每个循环包括98°C 10秒，58°C 1分钟和72°C 3分钟。 将获得的扩增片段插入到实施例1获得的PSH(6穿梭载体的SmaI位点，获得可以在棒状细菌中自主复制的质粒PWR。
为了研究argR基因在产L-精氨酸棒状细菌中的扩增效应，将pWR引入产L-精氨酸黄色短杆菌，AJ11345菌株(FERM BP-6894)。质粒的引入采用了电脉冲法(日本专利公
14开号2-207791)。在含有25ug/ml卡那霉素的CM2G琼脂培养基中(在IL纯水中含有5g葡萄糖，5g NaCl和15g琼脂，pH 7. 2)筛选具有卡那霉素耐药性的转化菌株，获得AJ11345/ pWR。作为对照，将pSH(6也导入AJl 1345菌株，获得转化株AJli;345/pSn(6。
将上述每种菌株接种于琼脂培养基，所述培养基含有0. 5g/dl葡萄糖，lg/dl聚蛋白胨，lg/dl酵母提取物和0.5g/dl NaCl，在31.5°C培养20小时。将一接种环获得的细胞接种于培养基，所述培养基含有4g/dl葡萄糖，6. 5g/dl硫酸铵，0. lg/dl KH2PO4,0. 04g/dl MgSO4,0. 001g/dlFeS04,0 . 001g/dl MnSO4, 5ug/dl 维生素Bi，5ug/dl 生物素以及大豆蛋白水解产物(以N量计45mg/dl)，在烧瓶中31.5°C振荡培养50小时。测定每一培养肉汤中积累的L-精氨酸(浓度，g/dl)。结果如表1所示。结果发现，argR扩增菌株几乎不能积累 L-精氨酸。这表明，argR基因产物可以作为精氨酸阻遏物发挥作用。
表 1
权利要求
1.一种细菌，所述细菌具有产L-精氨酸的能力，并经过修饰，使IysE基因的表达得到增强，所述增强是通过增加所述IysE基因的拷贝数或用强启动子替代所述IysE基因的启动子，其中所述IysE基因编码序列沈的IysE蛋白。
2.权利要求
1的细菌，其中该细菌还经过进一步修饰，使得argR基因被破坏，其中所述 argR基因由序列17的1852-2364号核苷酸组成。
3.权利要求
1的细菌，该细菌经过进一步修饰，使细胞内L-精氨酸生物合成途径中的酶活性得到增强，其中所述酶包括argCJBDFGH产物。
4.权利要求
2的细菌，该细菌经过进一步修饰，使细胞内L-精氨酸生物合成途径中的酶活性得到增强，其中所述酶包括argCJBDFGH产物。
5.权利要求
1的细菌，其中所述细菌是棒状细菌。
6.权利要求
2的细菌，其中所述细菌是棒状细菌。
7.权利要求
3的细菌，其中所述细菌是棒状细菌。
8.权利要求
4的细菌，其中所述细菌是棒状细菌。
9.权利要求
1的细菌，其中所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
10.权利要求
2的细菌，其中所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
11.权利要求
3的细菌，其中所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
12.权利要求
4的细菌，其中所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
13.制备L-精氨酸的方法，包括以下步骤，在培养基中培养权利要求
1-12的任意一种细菌，并在培养基中产生、积累L-精氨酸，然后从培养基中收获L-精氨酸。
专利摘要
制备L-精氨酸的方法；通过在培养基中培养具有生产L-精氨酸能力的微生物制备L-精氨酸，所述微生物经过修饰，使lysE基因的表达增强，该微生物还可进一步修饰，使精氨酸阻遏物不能发挥正常功能，或者该微生物经过进一步修饰，使L-精氨酸生物合成途径的酶细胞内活性增强，这样，在培养基中可以生产、积累L-精氨酸，并可从培养基中收获L-精氨酸。
文档编号C07K14/34GKCN1398964 B发布类型授权 专利申请号CN 02126904
公开日2012年3月21日 申请日期2002年7月25日
发明者伊藤久生, 安枝寿, 山口美喜子, 郡司义哉 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (3),