专利名称:一种新的str等位基因阶梯的制备技术以及具有这种等位基因阶梯的分型试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及法医学、遗传学、分子生物学、人类学、临床医学、基因组学、基因诊断、基因工程等技术领域：
，具体地说涉及一种新的STR等位基因阶梯的制备技术以及具有这种等位基因阶梯的分型试剂盒。该技术可用于法医学、人类学、遗传学和肿瘤学等领域的个体识别、亲权鉴定以及遗传和肿瘤的诊断等方面。
背景技术：
人类基因组DNA有3×109bp，其中10％是串联重复序列，被称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-7bp组成的微卫星，所以又称为短串联重复序列(short tanden repeat，STR)。不同人体基因组的卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，近几年在法医学、考古学、遗传学和肿瘤学等领域建立了一种崭新的对人体进行个体识别、亲权鉴定以及对遗传和肿瘤进行诊断的STR-PCR(短串联重复序列聚合酶链反应)技术，从而给这些领域的发展带来了新的革命性变化。在这一技术中，为了准确地给各等位基因进行定位和识别，必须设置与各等位基因相对应的等位基因阶梯(Allele ladder，AL)为标准参照物(Markers)。因等位基因阶梯中的每一基因片段的长度均是已知的，将它与各待测样品的扩增产物在相同电泳条件下的相邻泳道上进行电泳分离，染色后进行对比，就很容易判断待测样品的基因型，所以，等位基因阶梯在STR-PCR的结果判断中至关重要。
目前国内制备各STR位点等位基因阶梯的方法有两种一种是从人基因组的每个位点上筛选能代表各等位基因片段的几种扩增产物，混合后直接用于Allele Ladder；另一种方法是将能代表某位点上所有等位基因的扩增产物混合物，稀释后再次扩增，将再次扩增的产物用作等位基因阶梯。
按上述方法制备的等位基因阶梯有很多不足之处(1)、直接选择人基因组作为扩增模板时，由于各等位基因的长度不同，易出现优势扩增现象，即长度较短的等位基因容易被扩增，而长度较长的等位基因则不易被扩增，使扩增产物的量不同，由此制备的等位基因阶梯的各等位基因的量不一，甚至出现不扩增，即无扩增产物，无法检测到的现象。
(2)、要批量生产，必须要经常去挑选和制备能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的纯度及含量等均有出入，使其扩增条件难以标准化。
(3)、人基因组DNA的分子量大，结构极其复杂，极容易出现非特异扩增，需反复对产物进行纯化对产物的纯化较严重，不适合批量生产。
(4)、若用人基因DNA扩增产物混合后再次进行扩增，其非特异扩增更加严重，此法更不适合批量生产。
(5)、将扩增产物的混合物直接用于等位基因阶梯时，在短时间内可能出现降解，使其各条带模糊不清，或者构型有所改变，使其电泳迁移发生变化。由于这些原因引起的质量变化均不能作为标准参照物使用。
为了解决上述方法制备的等位基因阶梯存在的诸多不足之处，珠海黑马医学仪器有限公司于1999年6月4日申请了“短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术”的中国发明专利，其公开号为CN1276427。这种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术包括以下步骤1、从人的有核细胞中提取DNA；2、按现有的各STR位点PCR方法进行扩增，以寻求各位点的等位基因型；3、快速纯化PCR产物；4、将纯化的PCR产物连接到T载体上；5、按分子克隆的方法提取质粒DNA，并进行纯度和定量测试；6、用STR-PCR技术分别制备各等位基因片段，然后对扩增产物进行纯化和定量测定；7、将各位点的等位基因片段进行序列分析，以测定各片段的减基数及串联重复单位数；8、将各片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量分装；9、出厂前再次进行电泳检测。
这种制备技术具有的特点是1、用于扩增各等位基因的模板是通过分子克隆技术制备的，该模板的DNA序列与人基因组DNA上同一位点的序列完全相同，因此用这两种不同模板得到的扩增产物的DNA序列及构型完全一致，从而确保了这两种扩增产物的电泳迁移率保持不变。
2、通过分子克隆技术得到的模板的长度远小于人基因组DNA的长度，容易线性化和解链，在相同条件下，得到的扩增产物远高于用人基因组DNA扩增的量，而且非特异性扩增产物也远少于人基因组DNA的扩增产物，所以容易批量生产。
3、各等位基因片段是一条一条的制备。然后分别测定其含量，再等量混合后制成等位基因阶梯，这样就确保了每条带颜色的深浅是均一的。
4、用分子克隆技术制备的模板更容易作到定性定量测定，一次标准化的模板可用好几年，这不但大大地减化了反复从人的有核细胞中去寻找和提取各等位基因模板的烦琐工作，更主要的是尽可能地避免了因为每批模板质量的差异，给生产的标准化和产品质量的稳定性带来的负面影响。
5、在批量生产等位基因阶梯时，所用引物之一的5’端标上荧光素后，便可得到可供荧光检测的等位基因阶梯。
但是上述的这种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术也存在着如下缺点1、因其步骤多而繁杂，制备过程耗时长，因而出错几率高；2、虽然通过分子克隆技术得到的模板其非特异性扩增产物远少于人基因组DNA扩增产物，但仍存在非特异性DNA片段(如质粒DNA)的干扰，从而造成制备的等位基因阶梯纯度欠佳。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的STR等位基因阶梯的制备技术，该技术能批量生产出稳定性能好、高纯度的，既可用于银染法，也可用于荧光法的等位基因阶梯试剂，以及具有利用这种制备技术制备的等位基因阶梯的分型试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种新的STR等位基因阶梯的制备技术，它包括以下步骤从人有核细胞中提取DNA；合成各位点的引物；利用提取的DNA和合成的引物对各STR位点进行PCR反应；电泳检测扩增片段；将PCR产物用HPLC纯化并将各等位基因(包括正链和负链)分离，分离后继续分别进行PCR扩增，以此类推，经过多轮PCR反应-HPLC分离纯化，制取具有不同基因型的各等位基因；
将各等位基因经电泳结合荧光自动检测法检测后，按等比例混合即成各位点的等位基因阶梯，出产前再次进行电泳检测。
上述电泳系统可采用聚丙稀酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳，及对等形式的电泳。
上述STR位点涉及人类46条染色体上的所有STR位点，即包括常染色体、X染色体及Y染色体上的STR位点。
上述引物可为荧光染料标记的引物或非荧光染料标记的引物，这些引物的长度为10～60碱基对。
在本发明的另一方面，还提供了一种具有利用上述技术制备的等位基因阶梯的分型试剂盒，它含有容器；一组或多组等位基因阶梯；与各STR位点对应的引物；DNA分子量参照标准；PCR反应各组份；阳性对照DNA；试剂盒使用说明书。
本发明除具有现有技术的优点外，还具有如下优点1、无须反复收集具有不同基因型个体的血标本，仅需一次性收集即可，省时省力；2、制作流程简便，周期短，操作简单；3、制作成本低，经济实用；4、适用面广，所有能经凝胶电泳分离的DNA片段本技术均实用；5、试剂盒能批量生产，稳定性好，即可用银染法，也可用荧光法进行检测。
图1是本发明实施例1所述荧光引物TH01 AL检测结果图；图中从左至右显示TH01位点的6、7、8、9、9.3、10等位基因，共六个其分子量见图下表格。
图2是本发明实施例1所述非荧光引物TH01 AL检测结果图；图中7、8、9、10泳道分别为第一、第二、三、四轮(PCR反应-HPLC分离纯化)所制备的等位基因阶梯。由上至下显示TH01位点的6、7、8、9、9.3、10等位基因，其中等位基因9.3和10因差一个碱基对，未充分分离，部分重叠，仅显示5条泳带。
图3是本发明实施例2所述一种非荧光引物试剂盒容器分布图；图中1～7为DYS19、DYS388、DYS389、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393位点AL。8～14为DYS19、DYS388、DYS389、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393位点引物对。15为dNTPs，16为Taq Ploymerase，17为10×buffer，18为deoionizeddouble-distilled water，19为DNA分子量参照标准，20为阳性对照DNA。
图4是本发明实施例2所述另一种非荧光引物试剂盒容器分布图。图中1为7个位点AL混合物，2为各位点引物对混合物，3为阳性对照DNA，4为dNTPs，5为Taq Ploymerase，6为10×buffer，7为deoionized double-distilled water，8为分子量参照物(ROX标记)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步地阐述本发明，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1以制备TH01位点等位基因阶梯为例。
(1)、模板DNA的选择及制备。本例选择具有6/10、7/9、8/9.3基因型的个体各一个。这些个体的基因型均事先经变性聚丙稀酰胺凝胶电泳结合荧光自动检测法检测基因型，并经DNA测序验证无误。取静脉血5～10ml，以常规有机溶剂法提取基因组DNA，具体方法详见《法医学杂志》1997；13(2)68-70页公开的“扩增X-Y同源Amelogenin基因内含子在性别鉴定中的应用研究”文章。
(2)、模板DNA浓度的调定。用紫外分光光度计检测DNA OD值，并将所有模板DNA浓度加适量TE液，调至5ng/ul。
(3)、PCR反应。PCR引物序列见表1，取步骤(2)中模板各1ul(约5ng)分别置于不同扩增管中，进行PCR反应。PCR反应各组份见表2，PCR循环参数为95℃ 5min，93℃ 0.5min，62℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃5min。
表1 TH01位点引物序列
表2 PCR反应各组份
(4)、电泳取PCR扩增产物1ul～3ul，具体方法详见《中华医学遗传学杂志》2000；17(1)42～46页公开的“中国广州汉族人六个STR位点的调查”文章；《法医学杂志》1999；15(3)141～3页公开的“运用变性PAGE荧光检测技术对广州汉族人群六个STR位点的研究”文章；《法医学杂志》1997；13(2)68-70页公开的“扩增X-Y同源Amelogenin基因内含子在性别鉴定中的应用研究”文章。
(5)、单个等位基因的制备。电泳检测扩增片段，再次复核各模板DNA的基因型，确认无误后，进行大规模PCR扩增反应，用高效液相色谱仪(HPLC)，分离并纯化PCR产物，将分离纯化的各个等位基因分装于不同试管中，分别做好标记，待用。
(6)、第一轮(PCR反应-HPLC分离纯化)。取步骤(4)中各等位基因约1ul，按步骤(3)、(4)进行。
(7)、第二轮、第三轮、......、第n轮(PCR反应-HPLC分离纯化)。重复步骤(3)、(4)。在每一轮(PCR反应-HPLC分离纯化)中，均取部分分离纯化的单个等位基因进行下一轮的(PCR反应-HPLC分离纯化)，取部分分离纯化的单个等位基因等体积混合做成等位基因阶梯。
(8)、TH01 AL。将各等位基因等体积混合，取1ul～5ul混合物电泳检测，检查复核等位基因阶梯包含各等位基因并确认无误，即成TH01位点的等位基因阶梯，本例所做的TH01等位基因阶梯包含有等位基因6、7、8、9、9.3、10共6个等位基因，见图1和图2。
实施例2以制作Y染色体STR分型试剂盒为例，本试剂盒包括7个Y染色体STR位点DYS19、DYS388、DYS389(I、II)、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393。这7个位点的PCR扩增产物、非荧光引物PCR循环参数、等位基因、扩增片段长度等情况见表3，非荧光引物PCR扩增反应见表2，荧光引物PCR循环为94℃ 8min，(94℃ 60sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec)*35个循环，72℃ 2min，荧光引物PCR扩增反应见表4。
表3 7个Y-STR位点的PCR扩增引物、等位基因、扩增片段长度、PCR循环参数
表4 复合PCR反应各组份
**注各引物浓度分别为DYS19 0.25uM、DYS388 0.5uM、DYS389 0.2uM、DYS390 0.25uM、DYS391 0.3uM、DYS392 0.3uM、DYS 0.5uM。
本试剂盒包括以下组成成分(1)、容器分布见图3及图4；(2)、STR等位基因阶梯；按实施例1分别制作各位点等位基因，一组或多组STR等位基因阶梯(荧光染料标记的混合物为一管，非荧光染料标记分别设置为若干为管)；(3)、DNA分子量参照标准使用非荧光引物的试剂盒使用50bp marker，使用荧光引物的试剂盒使用ROX荧光染料标记的分子量参照物。
(4)、PCR反应各组分。①各STR位点引物(荧光染料标记的或非荧光染料标记，若为前者可按一定比例混合)参照表3，②dNTPs，③Taq Polymerase，④10×buffer100mM Tris-HCl，pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、10％Triton-X-100；⑤deoionized double-distilled water；(5)、阳性对照DNA；(6)、试剂盒使用说明书，包括各引物序列、PCR反应条件、电泳系统等，并配有相应的软件。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用参考一样。此外，应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求
书所限定的范围。
权利要求
1.一种新的STR等位基因阶梯的制备技术，其特征是它包括以下步骤从人有核细胞中提取DNA；合成各位点的引物；利用提取的DNA和合成的引物对各STR位点进行PCR反应；电泳检测扩增片段；将PCR产物用HPLC纯化并将各等位基因(包括正链和负链)分离，分离后继续分别进行PCR扩增，以此类推，经过多轮PCR反应-HPLC分离纯化，制取具有不同基因型的各等位基因；将各等位基因经电泳结合荧光自动检测法检测后，按等比例混合即成各位点的等位基因阶梯，出产前再次进行电泳检测。
2.根据权利要求
1所述的一种新的STR等位基因阶梯的制备技术，其特征是所述电泳系统可采用聚丙稀酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳，及对等形式的电泳。
3.根据权利要求
1所述的一种新的STR等位基因阶梯的制备技术，其特征是STR位点涉及人类46条染色体上的所有STR位点，即包括常染色体、X染色体及Y染色体上的STR位点。
4.根据权利要求
1所述的一种新的STR等位基因阶梯的制备技术，其特征是引物可为荧光染料标记的引物或非荧光染料标记的引物，这些引物的长度为10～60碱基对。
5.一种具有利用根据权利要求
1所述的一种新的STR等位基因阶梯的制备技术制备的等位基因阶梯的分型试剂盒，其特征是它含有容器；一组或多组等位基因阶梯；与各STR位点对应的引物；DNA分子量参照标准；PCR反应各组份；阳性对照DNA；试剂盒使用说明书。
专利摘要
本发明提供了一种新的STR(短串联重复序列，short tandem repeat，)等位基因阶梯(allele ladder，AL)的制备技术，它包括从人有核细胞中提取DNA，合成对应于这些STR位点的引物，选择具有不同等位基因个体的DNA，利用PCR技术特异地扩增出对应的扩增产物，采用HPLC技术纯化分离扩增产物，并多次循环地进行PCR扩增→纯化→PCR扩增→纯化，最后将各STR位点具有不同等位基因的纯化产物按等比例混合，即成各STR AL。本发明还提供了一种具有利用这种技术制备的等位基因阶梯的分型试剂盒。本发明所述的制备技术和分型试剂盒可用于法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面。
文档编号C12N15/10GKCN1446921SQ02114017
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月25日
发明者江斌 申请人:江斌导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan