专利名称:血管内皮细胞抑制素的生产方法
技术领域：
本发明总的涉及了血管内皮细胞抑制素(Endostatin)的一种表达、生产方法，特别是通过发酵条件的探索和工艺的改进，提高了其在毕赤酵母(PichiaPastoris)酵母中的稳定性和表达得率，产品产率在国内外均处于领先水平，使血管内皮细胞抑制素的产业化生产价值得到提高。
背景技术：
二十年代八十年代后期至九十年代初，大量的研究发现，血管形成对于实体瘤及其转移瘤的生长与维持是必需的(Induction of angiogenesis duringthe transition from hyperplasia to neplasia.Nature，1989，339(6219)58)。为了刺激血管生成，肿瘤会产生一系列血管形成因子，血管形成的表现是正和负的新生血管调节物网状平衡的结果(The diagnostic andprognostic value of tumor angiogenesis.Eur J Surg Suppl 1998，(582)99-103)。
目前已分离和纯化了20多种血管生成因子和相关因子，至少15种血管生成抑制因子。血管生成因子包括血管内皮细胞生长因子(VPF/VEGF)、酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、血管生成素(angiogenin)、胎盘生长因子(PIGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-8、肿瘤坏死因子α(TNFα)等(Angiogenesis Inhibitors in Cancer Research.NIH Press Release，Revised April 2，1999)。
就肿瘤的治疗而言，以手术切除及放化疗和免疫生物防治治疗为主，但疗效不尽如人意；其原因是药物的非特异导向性，使肿瘤的杀灭力有限，并挑剔靶细胞种类，引起毒性副反应；长期化疗还易发生肿瘤基因的变异，导致肿瘤耐药性的产生。有研究表明肿瘤在生长至0.2-0.3mm时无血管供应营养，肿瘤细胞将停止生长或自行消失，因而针对血管新生的肿瘤抑制疗法，简称休眠疗法(dormancy therapy)应运而生(Angiogenesis Inhibitors in CancerResearch.NIH Press Release，Revised April 2，1999)。
近年来能直接抑制血管增生的因子备受人们关注，内源性的血管生成抑制剂主要包括血管抑制素(angiostatin)、血管内皮细胞抑制素(endostatin)、肌原蛋白1(troponin I)、转化生长因子b(TGF-b)、血小板反应素(thrombospondin)、血小板因子4(PF4)、干扰素α、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)、催乳素16kd片断等。其中血管抑制因子-血管抑制素与血管内皮细胞抑制因子-血管内皮细胞抑制素更是人们研究的热点(AngiogenesisPotentials for Pharmacologic Intervention in the Treatment of Cancer，Cardiovascular Diseases，and Chronic Inflammation.Pharmacol Rev 2000，52(2)237-268)。目前动物试验和临床研究均证实这两个因子有明显的抑制血管增生进而抑制肿瘤生长和转移的作用。
1997年，继1994年从小鼠Lewis肿瘤细胞中分离出的38KD具有肿瘤血管内皮细胞生长抑制作用的angiostatin后，O′Reilly等发现一种小鼠血管内皮瘤细胞系EOMA的培养基具有血管内皮细胞抑制作用。将该培养基过赖氨酸葡聚柱后，其抑制活性并不存在于结合物质，而在流穿部分中，表明该抑制活性不是由angiostatin引起。但如许多具有血管抑制剂的物质一样，具有该抑制活性对肝素sepharose有亲和力。经肝素亲和层析及S200凝胶过滤及几轮C4柱反相HPLC后，该活性物质纯化到单一电泳纯，从10L含500mg纯蛋白的培养基中纯化到2μg的活性物质，抑制活性提高5000倍，活性回收率为2％。该物质分子量为20kD左右，在(100～600)ng/ml浓度对血管内皮细胞有剂量依赖的特异抑制生长作用，对其它细胞无作用。N端氨基酸序列测定结果表明，该物质为胶原XVIIIC未端片段，被命名为血管内皮细胞抑制素。该物质在小鼠中对肿瘤诱导的血管生成具有几乎完全的抑制作用，显示出很强的抗肿瘤活性。(EhdostatinAnendogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell，1997，88(2)277)血管内皮细胞抑制素为分子量20kD左右的胶原XVIIIC球形未端部分片段。人与小鼠的血管内皮细胞抑制素有86％的序列完全相同，其中都包含了4个保守的半胱氨酸，说明它们的结构可能非常相似。小鼠的血管内皮细胞抑制素一级结构有184个氨基酸，分子量为20-22KD，其中酸性氨基酸29个，疏水性氨基酸占42％。人血管内皮细胞抑制素一级结构有183个氨基酸，分子量为18-20KD。
血管内皮细胞抑制素与angiostatin一样，是一个大分子蛋白质的酶解物，而大蛋白的分子不具血管抑制活性。血管内皮细胞抑制素天然结构中的折叠结构是血管内皮细胞抑制素功能发挥所必须的结构。用大肠杆菌生产的重组血管内皮细胞抑制素没有天然折叠结构，可溶性差，为沉淀蛋白，但皮下注射后能转变成有活性的折叠结构血管内皮细胞抑制素，重新抑制血管内皮增生。(《生命的化学》，1999，1)血管内皮细胞抑制素具有以下生物学活性1)血管生长抑制作用。Blezinger等证实，直接肌肉内注射血管内皮细胞抑制素表达质粒可以降低肿瘤血管形成3倍以上，可以抑制65％的实验性角膜新生血管诱导生长(Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastasesby intramuscular administration of the endostatin gene.NatBiotechnol，1999，17(4)-343)；O′Reilly证实大肠杆菌生产的复性、未复性的血管内皮细胞抑制素及杆状病毒产生的重组血管内皮细胞抑制素均有抑制鸡胚血管生成的作用(chick chorioallantoic membrane，CAM)。同样，酵母产生的血管内皮细胞抑制素也证实存在同样的作用(血管生成抑制素血管内皮细胞抑制素研究新进展，《中国肿瘤生物治疗杂志》2000，7(1)76-78)；血管内皮细胞抑制素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成有明显抑制作用，但不干扰正常的血管组织功能。
血管内皮细胞抑制素对牛毛细血管内皮细胞、牛肺主动脉内皮细胞有特异的抑制增殖作用，而对非血管内皮细胞系细胞如NIH3T3，Al0平滑肌细胞等则无增殖抑制作用。这种抑制作用在含血管形成促进因子bFGF(3ng/ml)时更为明显。该生长抑制作用与细胞的凋亡相伴随。牛肺主动脉内皮细胞经血管内皮细胞抑制素(10μg/ml)作用后，细胞变圆，并与基质相脱离。细胞凋亡的早期表现为12h后annexinV-FLFC结合试验中磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内侧面转位至细胞膜外侧，24h后细胞内的半胱天冬酶活性明显增加。TUNEL法也测到核内DNA的降解，同时细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL含量也下降。(Endostatininduces endothelial cell apoptosis.J Biol Chem，1999，274(17)ll721)2)抗肿瘤作用。血管内皮细胞抑制素对动物移植瘤显示出良好的控制效应，O′Reilly证实了血管内皮细胞抑制素对肿瘤的转移和原发性种植肿瘤具有抑制作用。当给予小鼠0.3mg/kg/d皮下注射时，小鼠Lewis肺癌的转移几乎完全被抑制。重组的复性或非复性的血管内皮细胞抑制素在小鼠中几乎完全抑制种植已达100～200mm3大小的Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、Eoma血管内皮细胞瘤、B16F10黑色素瘤的生长，原发性肿瘤消退至显微镜可见的休眠期。免疫组化证实肿瘤血管形成被阻断，肿瘤细胞的凋亡指数提高7倍。在血管内皮细胞抑制素的治疗中没有发现任何毒副作用。(血管生成抑制素血管内皮细胞抑制素研究新进展，《中国肿瘤生物治疗杂志》2000，7(1)76-78)Folkman实验室用血管内皮细胞抑制素治疗小鼠Lewis肺癌后(20mg/kg)，肿瘤缩小，停止给药后，肿瘤又回复到原来大小；再用血管内皮细胞抑制素治疗，肿瘤再次缩小，这样持续6轮循环治疗后，血管内皮细胞抑制素治疗仍然有效，而且肿瘤在被观察的5个月内未再复发，肿瘤细胞不再重新增殖而处于休眠状态。解剖后发现，所有的肿瘤都退化到无需血管也能存活的微小状态。在所有的实验中，均无肿瘤转移发生。这一实验表明血管内皮细胞抑制素没有引发肿瘤产生抗药性。除了直接注射重组血管内皮细胞抑制素引起肿瘤抑制外，Blezinger P直接肌肉注射血管内皮细胞抑制素的表达质粒也形成了对原发性肿瘤及肿瘤转移的抑制。他们给小鼠肌肉注射240μg的表达质粒，注射后第3天，血循环中的血管内皮细胞抑制素水平达3μg/ml，第7天最高达8μg/ml，至14d后降至4μg/ml。接种的BALB/c小鼠肾细胞癌(Renca)和C57BL CLC在注射后第13天与对照相比，肿瘤被抑制40％，二者有统计学的差别。肺部肿瘤有6倍转移数的抑制，肺重量减少32％。用angiostatin和endostatin联合治疗取得了更好的疗效，治疗25天后，肿瘤完全退化，停止治疗后，所有的小鼠都保持健康，没有肿瘤重新生长。
美国EntreMed公司2000年6月在美国癌症研究协会(AACR)会议上报告了该药物的研究情况。美国ENTREMED公司2000年11月宣布开始血管内皮细胞抑制素的I期临床试验，结果证明其是一种安全、良好耐受的药物。共61例病人(20种不同的实体肿瘤)参与试验。试验在三处分别进行马撒诸塞州波士顿的Dana-Farber/Partners肿瘤监护中心、休斯顿国家癌症学院(NCI)的癌症中心(主办单位)以及威斯康星癌症中心。试验中未见病人出现严重的不良反应，而部分进展性癌症患者有临床应答。一位恶性肉瘤患者下巴病灶处缩小了60％，另一位神经瘤患者的肿瘤缩小了20％，另有5例病人病情趋于稳定，肿瘤不再发展。ENTREMED公司发现血管内皮细胞抑制素用药并未干扰例如伤口愈合等正常血管组织的生长。ENTREMED公司在2001年一季度开始血管内皮细胞抑制素在所有实体肿瘤以及一些特殊肿瘤进行II期临床试验。
欧洲肿瘤学研究所(European Institute of Oncology)经过体外和活性研究，证明血管内皮细胞抑制素有抗癌症血管生成的作用，可促使内皮细胞凋亡并导致癌瘤萎缩。将安度司它汀和化疗联合使用，发现可以抑制移植到老鼠体内的非霍奇金淋巴瘤的生长，而且安度司它汀可以降低化疗药物的毒副作用。
中国专利申请公开号CN1177005(1998年03月25日申请)公开了一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗肿瘤血管再生治疗中的应用。
目前表达重组血管内皮细胞抑制素最多的且有产业价值的方式有二种大肠杆菌表达和酵母表达。
中国专利申请公开号CN1224759(1999年08月04日)公开了一种在大肠杆菌中生产内皮细胞抑制素的方法，其中经PCR方法合成人内皮细胞抑制素基因，并构建了含有该基因的载体和重组菌株。然而，血管内皮细胞抑制素产物需要复性，因此工艺较为复杂。
大肠杆菌表达的重组血管内皮细胞抑制素为不溶性蛋白，虽然动物试验证实直接注射这种不溶性蛋白可被机体缓慢吸收并产生抑瘤活性，但作为治疗药品能否被批准将是一个很大的问题。虽然也有报道通过体外复性得到可溶性蛋白，但复性过程中蛋白浓度需要维持在很低的水平，如80pg/ml(POMPLIANODAVID L，et al.，SOLUBLE RECOMBINANT ENDOSTATIN，W00058498)，不适合产业化生产。
目前国外临床研究均采用酵母表达血管内皮细胞抑制素。毕赤酵母(PichiaPastoris)表达系统是近年来发展迅速，具有诸多优点的表达系统，在表达真核细胞外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、操作简便的特点，又具备哺乳类细胞的翻译后加工和修饰的功能，从而表达有生物活性的可溶蛋白。但目前国内外报道的用毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达血管内皮细胞抑制素水平还比较低低，中试摇瓶的表达水平15-30mg/L左右(Dhanabal M，Volk R，RamchandranR，Simons M，Sukhatme VP.，Cloning，expression，and in vitro activityof human endostatin.Biochem Biophys Res Commun 1999，258(2)345-52；Trinh L，Noronha SB，Fannon M，Shiloach J.，Recovery of mouseendostatin produced by Pichia pastoris using expanded bedadsorption，Bioseparation 2000；9(4)223-30)，发酵罐大生产水平达120mg/ml(BERMEJO LOURDES L，et al.，METHOD OF PRODUCING ANDPURIFYING ENDOSTATIN PROTEIN，Patent NumberW00119989)。
临床上血管内皮细胞抑制素用量很大，特别是用血管内皮细胞抑制素治疗实体瘤，剂量达100mg/m2左右，因此提高血管内皮细胞抑制素的表达水平成为当务之急，本领域迫切需要开发高效的生产血管内皮细胞抑制素的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效的生产血管内皮细胞抑制素的方法。
本发明提供了一种生产血管内皮细胞抑制素的方法，它包括步骤(a)在适合表达血管内皮细胞抑制素的条件且锌离子浓度为0.01-50mM下，培养携带编码血管内皮细胞抑制素的基因的质粒的宿主细胞或染色体中整合有编码血管内皮细胞抑制素的基因的宿主细胞，从而表达出血管内皮细胞抑制素；(b)从培养物中分离纯化出血管内皮细胞抑制素。
在一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌和酵母细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母。
在另一优选例中，所述的步骤(a)包括二个阶段(i)培养阶段，其中锌离子浓度为0.1-20mM；(ii)诱导阶段，其中锌离子浓度为0.1-20mM，pH为5-8。
在另一优选例中，在诱导阶段，锌离子浓度为0.5-5mM，pH为6-7。
在另一优选例中，所述的步骤(a)之前还包括步骤
制备种子液，其中锌离子浓度为0.1-1mM。
在另一优选例中，所述的血管内皮细胞抑制素包括人血管内皮细胞抑制素、鼠血管内皮细胞抑制素，及其保持血管内皮细胞抑制素生物活性的突变体。
在另一优选例中，所述的步骤(b)包括超滤、层析。
在另一优选例中，在诱导阶段还加入酪蛋白，以防止血管内皮细胞抑制素被降解。
在另一优选例中，所述的锌离子是以选自下组的锌盐形式加入氯化锌、硫酸锌、乙酸锌、或其混合物。
在另一优选例中，在纯化系统中加入1-100uM Zn2+，从而进一步提高纯化的回收率。
具体实施方式
对水溶性血管内皮细胞抑制素与Zn2+关系的研究很多。对于Zn2+的存在对血管内皮细胞抑制素最终的活性发挥是否有直接关系存在很多争议(Boehm T.O′reilly MS，Keough K，Shiloach J，Shapiro R，Folkman J.，Zinc-bindingof endostatin is essential for its antiangiogenic activity，BiochemBiophys Res Commun 1998，252(1)190-4；Hohenester E，Sasaki T，MannK，Timpl R.，Variable zinc coordination in endostatin，J Mol Biol2000，297(1)1-6)。在生理条件下，血管内皮细胞抑制素与Zn2+11结合。此结合受到pH、其它盐的的影响。
本发明人通过深入而广泛的研究，意外地发现在血管内皮细胞抑制素的生产过程中，通过提高锌离子浓度，可以大幅提高血管内皮细胞抑制素的产率。在此基础上完成了本发明。
适用于本发明的血管内皮细胞抑制素包括人血管内皮细胞抑制素(humanEndostatin)与鼠血管内皮细胞抑制素(murine Endostatin)，及其保持血管内皮细胞抑制素的生物学活性的突变体。突变体包括血管内皮细胞抑制素的N端缺失、增加或改变0-15个氨基酸，C端缺失、增加或改变0-15个氨基酸，分子内部变更部分氨基酸，但保持血管内皮细胞抑制素的生物学活性的突变蛋白。
适用于本发明的表达血管内皮细胞抑制素的宿主细胞，可以是现有的生产血管内皮细胞抑制素的工程菌，也可用常规方法构建。宿主细胞可以是原核(如大肠杆菌)或真核(如酵母)，较佳地是毕赤酵母。在构建时，可根据文献报道的血管内皮细胞抑制素的氨基酸序列，全基因合成或天然来源得到血管内皮细胞抑制素的cDNA。期间，可以根据Pichia酵母对不同密码子的偏爱性，选择性突变了天然血管内皮细胞抑制素的部分碱基(氨基酸序列不变)。用分子克隆的常规方法，在cDNA 5′端与3′端分别引进特异性酶切位点，克隆入表达质粒，转化P.Pastoris宿主菌，筛选鉴定，得到工程菌。 工程菌可能时快速利用甲醇型(Mut+)与慢速利用甲醇型(Muts)。
在获得了表达血管内皮细胞抑制素的宿主细胞后，便可在常规的适合表达血管内皮细胞抑制素的条件下培养，以表达血管内皮细胞抑制素。其中通过提高锌离子浓度便可大幅提高血管内皮细胞抑制素的产量。
在本发明中，锌离子可以来自锌盐，例如ZnCl2，ZnSO4，乙酸锌等锌盐，还可来自其他含锌离子的物质，或它们的混合物。
在本发明方法中，锌离子的浓度通常为0.01-50mM或更高，较佳地为0.1-20mM，更佳地为0.5-5mM。
用于本发明的培养基没有特别限制，可以是各种常规的培养基。例如对于毕赤酵母而已，可以选用(但并不限于)YPD、BMGY、MM培养液、低盐发酵培养基等。
YPD平板 酵母提取物 1％蛋白胨 2％葡萄糖 2％琼脂 1％BMGY 酵母提取物 1％蛋白胨 2％磷酸钾缓冲液，pH6.0 100mMYNB 1.34％
生物素 (4×10-5)％甘油 1％MM YNB 1.34％生物素 (4×10-5)％甲醇 0.5％低盐发酵培养基 H3PO4(85％原液) 26.7ml/LCaSO4·2H2O 0.93g/LK2SO418.2g/LMgSO47.27g/LKOH(固体) 4.13g/L橘盐酸钠·2H2O 1.47g/LPTM12ml/L甘油 4％(w/v)另一方面，本发明还对对发酵条件进行了进一步优化1.温度的控制血管内皮细胞抑制素的发酵及诱导温度保持在25-31℃。
2.诱导期的PH值控制诱导期pH，通常为pH5-8。pH在6-7更加有利于表达水平的提高。
3.溶氧的控制溶氧控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决。
4.补料的流加补料种类包括甘油、甲醇、葡萄糖等糖原，可单独补料或混合补料。
5.Zn2+加入。如上所述，Zn2+有利于血管内皮细胞抑制素N端的致密性，即有保护N端的作用。若血管内皮细胞抑制素的N-端失去保护，蛋白质的空间构象打开，很容易被蛋白水解酶作为底物而降解。可以在整个或部分培养、诱导过程中加入锌离子。例如加入Zn2+的方式有以下几种方法，这几种方法可以分开，也可以同时进行
(1).改变PTM1中锌盐的浓度。PTM1是微量元素混合物，其常规配方如下PTM1CuSO4·5H2O 6g/LKI 0.08g/LMgSO4·H2O 3g/L钼酸钠 0.2g/L硼酸 0.02g/LCaSO4·2H2O 0.5g/LZnCl220g/L氯化钴 0.5g/LFeSO465g/L生物素 0.2g/LH2SO45ml/L例如，将经典PTM1中ZnCl2的浓度从20g/L提高到30～60g/L。
(2).种子液中加入0.1-1mM Zn2+，使菌种在接入发酵罐时，更容易适应发酵罐中的锌离子浓度。
(3).培养、诱导过程中Zn2+的浓度0.1-20mM，特别是诱导过程，最好是0.5-5mM。
6.PTM1(混合微量基元素)的量，以下几种方法可以分开，也可以同时进行(1).在上罐前，加入的PTM1为2～20ml/L发酵液；(2).甘油补料或混合补料中的PTM1为2～20ml/L发酵液；(3).甲醇补料中的PTM1的为2～20ml/L发酵液。
7.加CA(酪蛋白水解物)的方法在诱导开始不同时间，间断性加入一定量的CA。
在本发明中，对于表达的血管内皮细胞抑制素，可以用常规方法进行纯化并制成药剂。一种优选方法是对发酵样品以离心、过滤等方式去除菌体，获得含目的蛋白质血管内皮细胞抑制素的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析。
1.凝胶过滤层析样品超滤浓缩后，可以用凝胶过滤层析去盐及纯化。
2.离子交换层析(阳离子交换层析、阴离子交换层析)样品的缓冲系统以稀释、超滤、沉淀后复溶、透稀或凝胶过滤层析等手段进行更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，且电导率小于4000uS/cm，直接上样，盐浓度梯度或pH梯度梯度洗脱。
此外，在纯化缓冲系统中可加入1-100uM Zn2+，以提高回收率。
经过2-3步纯化，得到血管内皮细胞抑制素纯品，纯化得率65％以上，纯度95％以上，纯品得率约200mg/L发酵液，其抑制内皮细胞增殖的EC50为100ng/ml。
在本发明的一个实例中，构建了血管内皮细胞抑制素的P.Pastoris酵母表达工程菌，甲醇诱导，表达的血管内皮细胞抑制素为胞外分泌型，不需复性，优于大肠杆菌表达系统。该工程菌属甲醇快速利用型，具有发酵时间短的优点。通过提高目的基因在酵母中的整合数及对发酵条件的优化，特别是增加培养基中的Zn2+水平及对pH进行优化，提高血管内皮细胞抑制素稳定性和最终表达量，使血管内皮细胞抑制素表达量达250-300mg/L，且表达产物稳定，这在国内外均处于领先水平(是国内外所报道水平的2-3倍)。
在本发明中，因表达蛋白属于胞外分泌型，发酵上清可直接进行层析纯化。经过二步纯化后，得到血管内皮细胞抑制素纯品，纯品得率约200mg/L发酵液，纯度95％以上，其抑制内皮细胞增殖的EC50为100ng/ml。
纯化后原液加入适当辅料，制成血管内皮细胞抑制素的注射用粉针剂。经稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人血管内皮细胞抑制素的Pichia酵母表达系统的构建1.目的基因的获得根据文献报道的人血管内皮细胞抑制素基因的碱基序列，合成20段互补的引物，并在5′、3′端分别引入特异性酶切位点EcoR I、Not I，按分子克隆的常规方法，首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min。磷酸化的各寡核苷酸片段以等mol数混合，94℃变性5min，立即变至65℃退火10min，然后加入T4连接酶，16℃反应过夜。
2.表达质粒pPIC9K-血管内皮细胞抑制素的构建与转化宿主菌pPIC9K质粒经EcoR I、Not I酶解后，回收大片断，与合成的血管内皮细胞抑制素cDNA片断连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，小量制备质粒，用限制性内切酶鉴定筛选出含血管内皮细胞抑制素全长cDNA序列的阳性克隆。用pPIC9K质粒的5′AOX1引物及3′AOX1引物进行正、逆向序列分析，证实克隆序列与设计序列完全一致。
把构建好的重组质粒pPIC9k-血管内皮细胞抑制素线性化，并用低熔点琼脂糖胶回收后，转入宿主菌毕赤酵母GS115，不同浓度G418(如2，4，6，8mg/L)的MD平板上选择，得到高效表达株(据其抗G418浓度，可判断其基因拷贝整合数大于等于20个)。诱导24小时后目的蛋白表达量占总蛋白10％左右。根据其消耗甲醇的速度，判断此工程菌株为Mut+。
实施例2中试发酵条件选择NBS BioFlo 3000发酵罐(5L)。
1.菌种与培养基挑取单克隆，BMGY中30℃振荡培养过夜，至OD6002-4，1∶10接入低盐培养基。
2.发酵培养阶段温度30℃PH5.0
甘油补料中PTM1量12ml/L甲醇诱导前湿菌重223g/L，共培养31小时3.发酵诱导阶段温度30℃PH6.5甲醇补料中PTM1量12ml/L甲醇诱导结束湿菌重474g/L，共诱导35小时4.结果诱导35hr后，血管内皮细胞抑制素表达量占发酵上清液总蛋白31％，表达量达250ug/ml(用改良Lowry法测)。
结果
实施例5血管内皮细胞抑制素纯化1岱13.鸵°4℃下5000rpm离心10min，得上清。
2岢伺ㄋ跫案 换撼逡海菏褂AMillipore超滤器，超滤膜截流分子量为3KD，超滤时留取浓缩液。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入以PB(PH7.4，20mM，含0.01％Tween80)，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和PB(PH7.4，20mM，含0.01％Tween80)缓冲液的电导水平接近。
3岵阉觯°层析介质SP Sepharose FF缓冲液溶液APB(PH7.4，20mM)+0.01％Tween80溶液BPB(PH7.4，20mM)+2M NaCl+0.01％Tween80上样将超滤浓缩的血管内皮细胞抑制素溶液(1L左右，电导为2000cm/s左右)上样。
清洗上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度清洗后用10CV将溶液B从0％-100％。
收集当溶液B在30％-40％时出现样品。
结果纯化得率65％以上，纯度95％以上，纯品得率约200mg/L发酵液，其抑制内皮细胞增殖的EC50为100ng/ml。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求
书所限定的范围。
权利要求
1.一种生产血管内皮细胞抑制素的方法，其特征在于，它包括步骤(a)在适合表达血管内皮细胞抑制素的条件且锌离子浓度为0.01-50mM下，培养携带编码血管内皮细胞抑制素的基因的质粒的宿主细胞或染色体中整合有编码血管内皮细胞抑制素的基因的宿主细胞，从而表达出血管内皮细胞抑制素；(b)从培养物中分离纯化出血管内皮细胞抑制素。
2.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌和酵母细胞。
3.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是毕赤酵母。
4.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)包括二个阶段(i)培养阶段，其中锌离子浓度为0.1-20mM；(ii)诱导阶段，其中锌离子浓度为0.1-20mM，pH为5-8。
5.如权利要求
4所述的方法，其特征在于，在诱导阶段，锌离子浓度为0.5-5mM，pH为6-7。
6.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)之前还包括步骤制备种子液，其中锌离子浓度为0.1-1mM。
7.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的血管内皮细胞抑制素包括人血管内皮细胞抑制素、鼠血管内皮细胞抑制素，及其保持血管内皮细胞抑制素生物活性的突变体。
8.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括超滤、层析。
9.如权利要求
4所述的方法，其特征在于，在诱导阶段还加入酪蛋白，以防止血管内皮细胞抑制素被降解。
10.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的锌离子是以选自下组的锌盐形式加入氯化锌、硫酸锌、乙酸锌、或其混合物。
专利摘要
本发明提供了一种生产血管内皮细胞抑制素的方法，它包括步骤(a)在适合表达血管内皮细胞抑制素的条件且锌离子浓度为0.01－50mM下，培养携带编码血管内皮细胞抑制素的基因的质粒的宿主细胞或染色体中整合有编码血管内皮细胞抑制素的基因的宿主细胞，从而表达从血管内皮细胞抑制素；(b)从培养物中分离纯化出血管内皮细胞抑制素。本发明方法可大幅提高血管内皮细胞抑制素的产量。
文档编号C12P21/02GKCN1436853SQ02110782
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月6日
发明者黄阳滨, 丰涛, 蒋剑 申请人:上海新生源医药研究有限责任公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan