专利名称:利用稀土元素提高南方红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种在南方红豆杉植物细胞培养液中添加稀土元素来提高紫杉醇产率的方法。
背景技术：
紫杉醇(taxol)是从红豆杉属植物中提取的一种萜类化合物，是当今公认的最有效的抗癌制剂之一。自1967年被首次分离以来，已证明其对白血病、转移性乳腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑癌、颈癌和肺癌均有疗效，对睾丸癌、膀胱癌和食道癌的治疗也有一定帮助。被美国国立癌症研究所誉为过去十五年内开发的“最好的抗癌制剂”。
现已对紫杉醇的抗癌作用机理有了较清晰的了解。经过近十年的一期、二期临床试验，1992年12月29日美国食品与药物管理局批准紫杉醇用于晚期卵巢癌；1994年4月批准用于乳腺癌。1993年7月瑞典在欧洲国家中第一个同意使用紫杉醇，同年10月欧盟的医药产品专卖委员会推荐在欧盟允许使用紫杉醇。在我国含紫杉醇的粗品制剂也获准使用。
癌症是威胁人类生命的最为严重的疾病，预计全球每年需要紫杉醇200-300Kg。然而，紫杉醇主要是从红豆杉类植物的树皮中制备，它在原植物中的含量非常之低，一般仅为干重的0.005％-0.07％；另外，红豆杉类植物多属珍稀物种，全世界现存红豆杉属植物的数量很少，加之其生长又十分缓慢，这就造成紫杉醇生产的原料供应极度匮乏。由于供不应求，目前紫杉醇的价格非常昂贵，售价高达4000美元/g。因此，建立新的获取紫杉醇的方法已成为受到高度重视的研究领域，也是当今各国在植物生物技术领域：
争夺的一个焦点。
目前应用细胞培养生产紫杉醇主要是采用两步法，即细胞株先在生长培养基中培养一段时间以积累生物量，再转入生产培养基促使细胞大量合成紫杉醇(专利公开号CN1096820)。另外，在植物细胞培养期间利用改变培养基温度大量生产紫杉醇，在培养基中于20至25OC下培养红豆杉属植物细胞，当植物细胞充分生长后，将培养基温度变为26至320C并继续培养(专利公开号CN1237210A)。两种方法存在着一定的缺陷，两步法在工业生产上应用不方便，更换培养基既费时，又容易造成培养基污染。改变培养基温度大量生产紫杉醇，必须严格培养温度、培养基及其它条件，否则细胞充分生长的时间就有变化，影响紫杉醇含量的增加。
南方红豆杉是分布在广东的阳春、乳源和连山的珍贵裸子植物。南方红豆杉各部位紫杉醇含量分别为根0.02351％、皮0.01777％、果实0.01409％、种子0.01406％、枝条0.01280％和叶0.00946％，比其他红豆杉属植物所含紫杉醇含量高，因而造成每年至少50吨的南方红豆杉树皮的流失和上万株南方红豆杉的毁灭。南方红豆杉的资源状况已岌岌可危，处于濒危状态，林业部于1992年将其列为一级珍贵保护树种。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高南方红豆杉细胞培养液中紫杉醇含量的方法，通过筛选合适的稀土元素作为诱导子加入到南方红豆杉细胞培养液中，使紫杉醇含量明显提高。
本发明的方法是将南方红豆杉细胞按常规方法培养15-18天，然后在培养液中加入稀土元素铽(Tb)或镱(Yb)，加入量为10-5-10-7mmol/L培养液(最好为10-5mmol/L)，于23-25℃黑暗振荡继续培养20-25天(振荡条件通常为摇床120-125r/min)。
所用的Tb或Yb一般为TbCl3或YbCl3。
所用的培养基为常规培养红豆杉细胞的培养基(例如B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培养基)。
本发明通过选用适当浓度的稀土铽(Tb)或镱(Yb)作为诱导子，刺激南方红豆杉悬浮培养细胞，使培养细胞中以及培养液中紫杉醇含量明显提高，其紫杉醇总含量分别可达到1.2418mg/L、1.3246mg/L，最高释放率分别为76.1％、78.5％。本发明方法既能提高细胞干重，又能增加紫杉醇的含量，而且操作方便，只需在南方红豆杉悬浮培养过程中加入一定量的稀土Tb或Yb，就可明显增加紫杉醇的含量，适合于工业上应用。所使用的稀土还能诱导细胞积累的紫杉醇分泌至胞外，有利于紫杉醇收集，这对工业化生产具重要价值。
具体实施方式
表3是本发明的实施例1至8所用的稀土及其用量，以及培养后南方红豆杉培养细胞的紫杉醇产量。各实施例及对照例的培养方法如下1.材料南方红豆杉细胞悬浮培养液。
2.培养基的配制培养基成分及配比如表1所示，按常规方法配制，得到B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培养基。
3.稀土的制备将稀土Tb2O3和Yb2O3在盐酸和盐酸羟胺中溶解后，加入过量草酸使其沉淀，再用蒸馏水洗涤至沉淀中不含Cl-。沉淀以浓硝酸溶解后，加热除去多余的硝酸，控制pH4.5，以二甲酚橙为指示剂，用EDTA溶液标定浓度。
4.培养方法各实施例分别在B5+NA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培养基中培养南方红豆杉细胞15天，再按表3所示加入稀土铽或镱，在25℃、摇床120r/min继续黑暗培养20天。分别测定干细胞重及紫杉醇的产量。结果如表3所示。
从表3的结果说明，用10-5-10-7mmol/L铽或10-5-10-7mmol/L镱作诱导子，可促进南方红豆杉细胞紫杉醇的合成，在1×10-5mmol/L时诱导效果最好，紫杉醇在细胞内的最大含量分别为0.1107mg/g、0.1126mg/g，在细胞外的最大含量分别为0.3518mg/g、0.4103mg/g，总含量分别为1.2418mg/L、1.3246mg/L，最高释放率分别为76.1％、78.5％，紫杉醇含量最高分别相对提高28.6％、37.2％。
5.含量测定(1)测量干细胞重将细胞培养液倒入120目不锈钢筛网中，过滤，收获细胞，蒸馏水清洗3次，用吸水纸充分吸干细胞表面的水份，称鲜重，将湿细胞置于60℃烘箱烘至恒重，得干细胞重。
(2)紫杉醇含量的测定取液体培养物，以4500×g离心20min，取沉淀物称鲜重，置于40℃下干燥至恒重。研碎后，加入150ml氯仿，于80℃以下索式抽提器提取4h，回收氯仿。提取物以甲醇定容至10ml，用HPLC测定紫杉醇的含量。另取上清液加入氯仿(1∶1)萃取，超声干燥后用HPLC测定紫杉醇的含量。两者相加，为紫杉醇的总含量。
采用表2中HPLC条件定量分析紫杉醇产量。
表1 南方红豆杉细胞培养基(B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5)
表2 紫杉醇的定量分析条件
表3 各实施例的稀土用量及培养后南方红豆杉细胞紫杉醇产量
权利要求
1.一种利用稀土元素提高南方红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量的方法，其特征是将南方红豆杉细胞按常规方法培养15-18天，然后在培养液中加入稀土元素铽或镱，加入量为10-510-7mmol/L，于23-25℃黑暗振荡继续培养20-25天。
2.按照权利要求
1所述的方法，其特征是稀土元素的加入量为10-5mmol/L。
3.按照权利要求
1或2所述的方法，其特征是所用的Tb或Yb为TbCl3或YbCl3。
4.按照权利要求
1或2所述的方法，其特征是所用培养基为B5+NAA1.0+2.4-D0.5+KT0.5培养基。
5.按照权利要求
1或2所述的方法，其特征是培养过程中的振荡条件为摇床120-125r/min。
专利摘要
本发明涉及一种利用稀土作诱导子提高南方红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量的方法。将南方红豆杉细胞按常规方法培养15－18天，然后在培养液中加入稀土元素铽(Tb)或镱(Yb)，加入量为10
文档编号C12N5/04GKCN1390944SQ02134214
公开日2003年1月15日 申请日期2002年6月21日
发明者王艇, 苏应娟, 吴惠勤, 葛发欢 申请人:中山大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan