专利名称：组织工程支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物降解类医用材料，更详细地是涉及到生物可降解交联剂与N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟乙酯及其共聚物制备组织工程支架材料的方法。
本发明还涉及所述方法制备的组织工程支架材料组织工程支架材料。
背景技术：
组织工程支架材料是组织工程的关键，是组织工程化必不可少的物质条件，也是生物材料研究的重点。其重要性是显而易见的。支架材料为细胞提供了一个生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行营养交换，并且排除废物，使细胞按照预制设计的三维支架上生长。由于细胞必须依赖于细胞外基质的存在才能发挥其功能，因此在组织工程中，细胞外基质替代物即种植基质支架的选择是一个重要方面。支架材料不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好的适用，结合和修复的效果，是限制其在临床上应用的一个瓶颈。支架材料作为一个新兴领域是继惰性生物材料阶段(替代修复)、生物材料生物化阶段之后的新型生物材料。目前研究的支架材料包括天然和合成的两大类，无论那一类均有其优点和不足之处，很少单独使用，一般要进行改性或几种材料复合，使其物理化学性质及生物学性质达到最合理、最优化。
组织工程支架材料除了应具有良好生物相容性，还应该在植入体内后，细胞在其表面粘附、增殖形成组织的同时，在体液、酶、细胞等的作用下发生降解，变成小分子物质被吸收或通过新陈代谢排出体外。现有生物降解材料有天然材料，如胶原、天然珊瑚、纤维蛋白、甲壳素及其衍生物，还包括高分子材料、陶瓷材料和复合材料等。应用较多的天然材料有甲壳素及其衍生物、胶原及其它蛋白质类物质，前者由于溶解性差加工困难，而后者的强度又难以达到理想要求。陶瓷材料中应用较多的是羟基磷灰石、磷酸三钙及其它生物医学多孔陶瓷材料，羟基磷灰石强度较好但降解性能较差，而磷酸三钙降解性能较好但力学性能又很差，特别是在张力方面表现出脆性，所以陶瓷材料作为生物降解材料使用还有较大的困难。具有生物降解和吸收性能的生物医用材料主要是高分子材料及其与其它材料形成的复合材料。生物降解高分子材料主要是脂肪族聚酯类如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA/PGA共聚物等。但在临床过程中发现上述材料的降解速度过快，而且患者出现非特异性无菌性炎症反应率较高，目前认为出现无菌性炎症的原因是材料降解成小分子碎片，引起体内巨嗜细胞聚集吞噬的结果。
现有生物降解材料存在如下缺点1、生物降解材料的降解速率与细胞组织的生长不相匹配。
2、生物降解材料本身及其降解产物的毒副作用，其中包括化学毒性和生物毒性。
3、有些材料虽然有较好的生物相容性，但由于它们的水溶性和普通交联后不能降解很难适应实际需要，例如PVP，PEG，PVA，PEO等。
4、作为组织工程用支架材料，聚乳酸和甲壳素最大的缺点是降解产物的酸碱性会对细胞有一定的毒性，同时材料的降解速率与组织的形成速率难以匹配也是此两类材料的最明显的不足。
简而言之，到目前为止生物降解材料的最明显的缺点就是降解速率难以控制，降解产物的副作用难以消除。
一般而言，作为细胞外支架的理想生物降解材料，应具备下列条件(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性，材料可最终被受植床组织完全替代；(3)易加工成型，并具一定的强度，移植后在一定时间内能保持原状；(4)材料表面易于细胞粘附且不影响或促进其增殖分化；(5)可与其它活性分子如骨形态发生蛋白(BMP)等复合，共同诱导组织的形成等；(6)材料应能提供最大限度的空间和面积以利于容纳最大限度的细胞贴附，这就需要材料有高度的多孔率，应达到90％以上，同时又保证材料的强度。此外，新生组织的血管化问题也与材料的孔径、多孔率相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够使细胞贴附生长，植入后不引发炎症反应而且材料的降解可调且与组织的生长速率相匹配的组织工程支架材料。
本发明的另一目的在于提供上述组织工程支架材料的制备方法。
本发明借助新型生物可降解交联剂，利用一些具有良好生物相容性但又水溶的高分子材料，如N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)及其共聚物，交联反应制备出组织工程支架材料。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)由NVP均聚而成的高分子化合物，它的应用领域非常广泛，其商品遍及许多领域。如化妆品、表面活性剂、造纸、纺织、玻璃工业、医学等。此外由于其具有优良的生物相容性、生理惰性、成膜性、交联性、胶体保护能力等性质，它在生物材料领域逐渐被重视，并进行了研究和应用。PVP极易溶于水，即使像K-90这样高分子量的PVP在水中仍可溶解，其溶液粘度随PVP的分子量和溶液的浓度增加而增大，除少量非极性溶剂外，还可溶于多种醇、胺、卤代烃、硝基烷烃及低分子量脂肪酸。PVP在稀酸、稀碱溶液中的溶解状态是稳定的。另外，PVP和阴离子及阳离子物质都相容，使它具有广泛的相容性，能与许多高分子物质互溶，如糊精、纤维素及其衍生物、阿拉伯树胶、聚乙烯醇、海藻酸钠、PVC等，且成膜均匀。PVP能够和许多物质形成络合物，它既可以与不溶于水的物质形成可溶性的络合物，如碘伏；也可以与溶于水的物质形成不溶于水的络合物，如沉淀剂的应用，这种特性使PVP可以作为一种非常有效的络合剂。PVP及其溶液在通常使用条件下的储藏性稳定，PVP还广泛用作药物赋形剂，片剂、糖衣的成膜剂，某些药物溶液的稳定剂和悬浮剂。PVP最早的医学应用是在二战时期用作血浆代用品。PVP是第一个被用于玻璃体替代物的合成高聚物。九十年代Goldberg制得PVP水凝胶作为玻璃体替代物，作为眼科手术中粘弹性物质以及人工玻璃体材料，获得了美国专利。PVP在人体内不能降解，但由于它是水溶性的，小分子量可经肾小管过滤排出体外，大分子也可以被巨噬细胞吞噬。
本发明的组织工程支架材料的制备方法包括如下步骤(1)利用多羟基小分子为基体，将可降解的片段通过化学反应连接到多羟基小分子上，形成末端有羟基的可降解的星形分子，最后将末端羟基活化引入双键，最终得到具有各种分子量可控的可降解的交联剂分子；其中所述的多羟基小分子是乙二醇、甘油、季戊四醇或它们的缩聚物；可降解的片段是聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟丁酸或聚己内酯及其二元、三元共聚物；(2)将(1)的可降解交联剂分子溶解在有机溶剂中，配成质量浓度为0.02-5g/ml的溶液，其中活性基团乙烯基摩尔浓度为1×10-4-1×10-1mol/ml；所述有机溶剂是丙酮或无水乙醇；(3)将(2)的交联剂溶液与摩尔比为0-100的N-乙烯基吡咯烷酮单体和摩尔比为0-100的甲基丙烯酸羟乙酯单体按质量比100-1∶1-100比例混合，加入占反应物质量的0-1％的引发剂，加入占反应物质量0-1％的光敏剂，在60℃-150℃加热1分钟至6小时进行交联反应，加入致孔剂，倒入各种成型模具得支架材料；所用的引发剂为偶氮二异丁氰(AIBN)或过氧化二苯甲酰(BPO)；所用的光敏剂是2，2-二甲基-2-苯基苯乙酮；(4)将所得的支架材料用有机溶剂抽提3-6小时。
第(3)步加入致孔剂致孔的方法是采用水溶性致孔方法致孔，使用钠盐或钙盐或镁盐作致孔剂，粒径范围是40-80目，重量是反应物质量的1.5-2.5倍，反应后将致孔剂用无菌蒸馏水浸出，真空干燥后得多孔支架材料。该多孔支架材料空隙率80-100％，孔径大小100-300微米。对于水凝胶类的支架材料，其吸水率的范围可以从50-500％，膨胀范围1-5倍。
第(3)步进行交联反应的除了加热交联反应外，还可以红外灯照射、紫外灯照射、60Co辐射、微波辐射、超声波辐射、超临界流体反应；在功率40-200瓦，电压范围150-250伏的红外灯照射1分钟至6小时反应，或者在功率20-120瓦的紫外灯照射10分钟至6小时反应。
上述交联反应方程式如下交联剂的结构式如下图 N-乙烯基吡咯烷酮的结构式甲基丙烯酸羟乙酯结构式 本发明方法所得的组织工程支架材料是一种交联的网状的大分子，在水中和各种常见有机溶剂均不溶解，加热也不熔融。根据交联密度的不同和交联剂分子的不同，支架材料的物理状态也是可以从强度较差但吸水率很高的水凝胶到强度很大的塑料态转变。吸水率范围50％-500％；体积膨胀范围可以从1-5倍；强度范围从几个Mpa到200Mpa。
本发明与现有研究相比，具有如下的优点1、用可降解交联剂对一些生物相容性好的水溶性高分子(NVP，HEMA)进行了交联，改变了原先的交联后不降解或交联后脆性大的缺点，扩大了NVP和HEMA的应用领域，为组织工程支架材料的应用开辟了一条新路。
2、通过交联剂本身可降解酯类片段的长短和交联剂与NVP，HEMA的比例及交联密度的不同，可以很容易地对支架材料的降解速率进行调整，可以和各种组织的生长速率相匹配；解决了组织工程支架材料应用中的一大缺点。
3、合成的材料本身具有良好的生物相容性，吸水性很强，利于组织的培养和细胞的粘附。
4、支架材料中的PVP片段具有较强的络合性，可以和各种细胞生长因子结合，调节细胞的生长、分化和增殖，是组织工程支架材料研究中的关键。
5、方法简单易行，可以制备各种不同形状的支架材料，由上述方法制备的支架材料的强度范围从很差(水凝胶)到很强(塑料)的一系列组织工程支架材料，适合不同组织细胞生长的需要。
6、本支架材料的降解产物是聚酯类水解成单分子的羟基酸，PVP和HEMA可以通过控制其分子量来使其变成水溶性的片段，最终羟基酸被机体代谢成二氧化碳和水排出体外，而PVP和HEMA的水溶性的片段通过肾小管的过滤排出体外。
具体实施例方式
实施例1选择的交联剂是用乙二醇2000为基体，两端接的是可降解聚乳酸片段，乳酸单元为3，末端是双键。配成重量百分含量为20％的四氢呋喃溶液。将1ml的交联剂溶液和1ml NVP加在干净的5ml小烧杯中，再加入0.003g AIBN，搅拌均匀，在通风橱中挥发溶剂5分钟，倒入直径3cm的培养皿中，放入真空干燥箱中的热台上加热，温度为80C，反应3小时，再抽真空，除去溶剂，在索氏提取器中用无水乙醇抽提，除去NVP的小分子均聚物和其它小分子物质，用无菌生理盐水浸泡洗涤3次，得到的是一定形状，有较好强度的水凝胶状的材料。这种材料的体外降解时间为7天。这种材料可以与生长因子(碱性成纤维细胞生长因子b FGF，骨形成蛋白BNP)复合制备缓释材料，用于骨缺损替代材料。
实施例2选择的交联剂是用甘油为基体，两端接的是可降解聚乳酸片段，乳酸单元为6，末端是双键。配成重量百分含量为20％的四氢呋喃溶液。将1.5ml的交联剂溶液和1ml NVP加在干净的5ml小烧杯中，再加入0.003g AIBN，搅拌均匀，在通风橱中挥发溶剂5分钟，倒在平整的PET胶片上流延成膜，用红外灯(40W，220V)照射5分钟，在80℃再反应3小时，得到无色透明的，厚度为0.8mm的膜，再抽真空，除去溶剂，测得接触角为32度，吸水率为72％，体外降解时间为30天。这种材料可用于角膜支架材料，初步的动物实验表明，这种材料具有较好的组织相容性。
实施例3选择的交联剂是用甘油为基体，两端接的是可降解聚乳酸片段，乳酸单元为6，末端是双键。配成重量百分含量为20％的四氢呋喃溶液。将3ml的交联剂溶液和1ml NVP加在干净的5ml小烧杯中，再加入0.005g AIBN，加入6g40-60目NaCl颗粒，在通风橱中挥发溶剂5分钟，搅拌均匀，倒入圆形白瓷盘中，用红外灯(40W，220V)照射10分钟，在80℃再反应3小时，再抽真空，除去溶剂，投入蒸馏水中，搅拌，浸出NaCl，在索氏提取器中用无水乙醇抽提，除去NVP的小分子均聚物和其它的小分子物质，得到孔隙率为91％的支架材料，体外降解时间为60天。这种材料可用于软骨骨组织工程支架材料，可以诱导骨细胞较好的黏附，生长，形成新的软骨组织。
实施例4选择的交联剂是用乙二醇2000为基体，两端接的是可降解聚乳酸和聚乙醇酸共聚物(1∶1聚合度为6)片段，末端是双键。配成重量百分含量为20％的四氢呋喃溶液。将2ml的交联剂溶液和0.5ml NVP和0.5ml HEMA加在干净的5ml小烧杯中，再加入0.005g AIBN，搅拌均匀。在通风橱中挥发溶剂5分钟，倒在平整的PET胶片上流延成膜，用红外灯(40W，220V)照射15分钟，在80℃再反应3小时，再抽真空，除去溶剂，得到无色透明的，厚度为0.8mm的膜，测得接触角为54度，吸水率为50％，体外降解时间为90天。这种膜状材料可以与b FGF复合，制备新型皮肤敷料，刺激新的皮肤组织生成。
实施例5选择的交联剂是用甘油为基体，两端接的是可降解聚乳酸和聚乙醇酸共聚物(1∶1聚合度为6)片段，末端是双键。配成重量百分含量为20％的四氢呋喃溶液。将3ml的交联剂溶液和0.5ml NVP和0.5ml HEMA加在干净的5ml小烧杯中，再加入0.005g BPO，加入6g 40--60目NaCl颗粒，在通风橱中挥发溶剂5分钟，搅拌均匀，倒入圆形白瓷盘中，放入真空干燥箱中的热台上加热，温度为120℃，反应3小时，再抽真空，除去溶剂，投入蒸馏水中，搅拌，浸出NaCl，在索氏提取器中用无水乙醇抽提，除去NVP的小分子均聚物和其它的小分子物质，得到孔隙率为91％的支架材料，体外降解时间为120天。这种材料较大，可用于骨组织工程支架材料。
权利要求
1.本发明的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)利用多羟基小分子为基体，将可降解的片段通过化学反应连接到多羟基小分子上，形成末端有羟基的可降解的星形分子，最后将末端羟基活化引入双键，最终得到具有各种分子量可控的可降解的交联剂分子；其中所述的多羟基小分子是乙二醇、甘油、季戊四醇或它们的缩聚物；可降解的片段是聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟丁酸或聚己内酯及其二元、三元共聚物；(2)将(1)的可降解交联剂分子溶解在有机溶剂中，配成质量浓度为0.02-5g/ml的溶液，其中活性基团乙烯基摩尔浓度为1×10-4×10-1mol/ml；所述有机溶剂是丙酮或无水乙醇；(3)将(2)的交联剂溶液与摩尔比为0-100的N-乙烯基吡咯烷酮单体和摩尔比为0-100的甲基丙烯酸羟乙酯单体按质量比100-1∶1-100比例混合，加入占反应物质量的0-1％的引发剂，加入占反应物质量0-1％的光敏剂，在60℃-150℃加热1分钟至6小时进行交联反应，加入致孔剂，倒入各种成型模具得支架材料；所用的引发剂为偶氮二异丁氰(AIBN)或过氧化二苯甲酰(BPO)；所用的光敏剂是2，2-二甲基-2-苯基苯乙酮；(4)将所得的支架材料用有机溶剂抽提3-6小时。
2.根据权利要求1所述的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于第(3)步加入致孔剂致孔的方法是采用水溶性致孔方法致孔，使用钠盐或钙盐或镁盐作致孔剂，粒径范围是40-80目，重量是反应物质量的1.5-2.5倍，反应后将致孔剂用无菌蒸馏水浸出，真空干燥后得多孔支架材料。该多孔支架材料空隙率80-100％，孔径大小100-300微米。对于水凝胶类的支架材料，其吸水率的范围可以从50-500％，膨胀范围1-5倍。
3.根据权利要求1或2所述的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于第(3)步进行交联反应是通过红外灯照射、紫外灯照射、60Co辐射、微波辐射、超声波辐射、或超临界流体反应。
4.根据权利要求3所述的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于所述交联反应是在功率40-200瓦，电压范围150-250伏的红外灯照射1分钟至6小时反应。
5.根据权利要求3所述的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于所述交联反应是在功率20-120瓦的紫外灯照射10分钟至6小时反应。
6.权利要求1所述的方法制备的组织工程支架材料。
全文摘要
本发明涉及生物降解类医用材料；是借助新型生物可降解交联剂，利用一些具有良好生物相容性但又水溶的高分子材料，如N－乙烯基吡咯烷酮(NVP)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)及其共聚物，交联反应制备出组织工程支架材料；该材料能够使细胞贴附生长，植入后不引发炎症反应而且材料的降解可调且与组织的生长速率相匹配。
文档编号A61L27/00GK1424115SQ0215216
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月6日 优先权日2002年12月6日
发明者周长忍, 焦延鹏 申请人:暨南大学