专利名称：治疗性结合分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机化合物，例如与CD45抗原同种型结合的分子，例如单克隆抗体(mAb)。
背景技术：
治疗各种疾病的一个方法是，去除或灭活病原白细胞和获得诱导耐受的潜能以灭活病理免疫反应。
据认为，器官、细胞和组织移植排斥和各种自身免疫疾病主要是由被辅助T细胞触发的T细胞介导的免疫反应引起的；辅助T细胞能识别特异抗原(这些抗原被抗原呈递细胞(APC，例如巨噬细胞和树突细胞)俘获、加工并以抗原-MHC复合体的形式呈递给辅助T细胞)，即识别特异抗原后辅助T细胞受刺激将产生细胞因子(例如IL-2)并表达或上调一些细胞因子受体和其他活化分子并进行扩增。这些活化的辅助T细胞中的一些可以直接或间接地起作用，即辅助效应细胞，细胞毒性T细胞或B细胞，以破坏表达选择抗原的细胞或组织。免疫反应终止后，一些成熟的克隆选择细胞以记忆性辅助细胞和记忆性细胞毒性T细胞的形式保存下来，在体内循环，当抗原再次出现时能迅速将其识别。如果触发这个反应的抗原是无毒的环境抗原，结果就是过敏症；如果抗原不是外来抗原而是自身抗原，结果就是自身免疫疾病；如果抗原是来自移植器官的抗原，结果是移植排斥。
免疫系统已经发展成能识别自己和异己。这个特性使得生物体能暴露于病原体的每天威胁在环境中存活。在胸腺中T细胞库的发育过程中，通过正选择和负选择的过程(这也包括自身反应性T细胞的识别和去除)，形成了对异己的特异性和对自身的耐受性。这类耐受被称作中枢耐受。可是，这些自身反应性细胞中的一些可以逃脱这种选择机制并造成自身免疫疾病发生的潜在危险。为了控制逃离到外周的自身反应性T细胞，免疫系统具有防止自身免疫的外周调节机制。这些机制是外周耐受的基础。
被特定单克隆抗体识别的细胞表面抗原通常通过CD(分化簇)号命名，CD号是由连续的国际白细胞分型研讨会指定的，此处用的术语CD45是指细胞表面白细胞共同抗原CD45；识别此抗原的单克隆抗体此处称为“抗-CD45”。
白细胞共同抗原(LCA)或CD45是抗淋巴细胞球蛋白(ALG)的主要成分。CD45属于跨膜酪氨酸磷酸酶家族，是细胞活化的正和负调节物(这取决于与受体的相互作用)。CD45的磷酸酶活性似乎是活化与B和T淋巴细胞的抗原受体有关的Src-激酶家族所必需的(Trowbridge IS等，AnnuRev Immunol.1994；第12卷第85-116页)。因此，在T细胞活化中，CD45是信号1所必需的，CD45缺陷细胞在TCR介导的活化事件中有严重缺陷。
CD45抗原有不同同种型，包括一个跨膜糖蛋白家族。不同的CD45同种型区别在于它们的胞外域结构，这起因于编码部分CD45胞外区域的3个可变外显子的选择性拼接。(Streuli MF.等，J.Exp.Med.1987；第166卷第1548-1566页)。各种CD45同种型有不同的胞外结构域；但有相同的跨膜和胞质片段，有两个同源的、大约有300个残基的高度保守磷酸酶结构域。T和B淋巴细胞亚群上区别性地表达不同的同种型组合(Thomas ML.等，Immunol.Today 1988；第9卷第320-325页)。有些单克隆抗体识别所有这些不同同种型所共有的表位，而其他单克隆抗体有受限的(CD45R)特异性，这依赖于它们识别哪个选择性拼接的外显子(A，B或C)。例如，识别外显子A产物的单克隆抗体因此标明为CD45RA，识别包含外显子B的各种同种型的单克隆抗体被标明为CD45RB(Beverley PCL等，Immunol.Supp.1988；第1卷第3-5页)。抗体例如UCHL1选择地与180kDa同种型CD45RO(没有可变外显子A、B或C的任一个)结合，此CD45RO限于出现在活化T细胞、记忆细胞和皮质胸腺细胞亚群上，在B细胞上没有检测到(Terry LA et al，Immunol.1988；第64卷第331-336页)。
附图简述
图1显示“候选单克隆抗体”对初次MLR的抑制是剂量依赖的，范围是0.001到10μg/ml。“浓度”是“候选单克隆抗体”的浓度。
图2显示表达载体HCMV-G1 HuAb-VHQ的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO15中包括具有核酸序列SEQ ID NO12(3921-4274)的重链。
图3显示表达载体HCMV-G1 HuAb-VHE的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO16中包括具有核酸序列SEQ ID NO11(3921-4274)的重链。
图4显示表达载体HCMV-K HuAb-humV1的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO17中包括具有核酸序列SEQ ID NO14(3964-4284)的轻链。
图5显示表达载体HCMV-K HuAb-humV2的质粒图，在完全表达载体核酸序列SEQ ID NO18中包括具有核酸序列SEQ ID NO13(3926-4246)的轻链。
发明详述目前，我们已经发现含有结合CD45RO和CD45RB的多肽序列的结合分子，此后也称为“CD45RO/RB结合分子”。根据本发明这些结合分子可以诱导免疫抑制、抑制初级T细胞反应和诱导T细胞耐受。而且，本发明的结合分子抑制初级混合淋巴细胞反应(MLR)。来自CD45RO/RB结合分子处理的培养物的细胞也优选地在次级MLR中有削弱的增殖反应，即使在次级MLR中缺乏CD45RO/RB结合分子。这些在次级MLR中的削弱的增殖反应表明本发明的结合分子有诱导耐受的能力。另外，与对照处理小鼠相比，在注射人源PBMC后给遭受异种移植物抗宿主病(X-GVHD)的重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)体内用药CD45RO/RB结合分子，可以延长小鼠的存活时间，尽管在CD45RO/RB结合分子处理的小鼠体内仍能检测到循环人源T细胞。
“CD45RO/RB结合分子”是指任何，单独或与其他分子关联时，能特异地结合CD45抗原的CD45RB和CD45RO同种型的分子。可以用标准方法(定性分析)来显示结合反应，标准方法包括例如任何类型的结合试验，例如与荧光显微镜或细胞荧光测定分析(FACS)联合的直接或间接免疫荧光法、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定，其中可以显现分子与表达特殊CD45同种型的细胞的结合。另外，这种分子的结合可以导致表达这些同种型的细胞的功能改变。例如可以测定对初级或次级混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制，例如用于测定在CD45RO/RB结合分子存在和缺乏情况下对初级或次级MLR的抑制和测定初级MLR抑制差异的体外试验或生物试验。
可选择地，也可以例如在MLR中细胞活化后、或者用特定抗原(例如破伤风毒素或其他抗原)刺激后、或者用多克隆刺激物(例如植物凝集素(PHA)或抗-CD3和抗-CD28抗体或佛波酯和Ca2+离子载体)刺激后，通过测量PBMC或T细胞或CD4+T细胞的增殖、细胞因子的产生、细胞表面分子表达的改变来确定体外功能调节作用。培养的设置与所述用于MLR的类似，不同的是代替同种异体细胞作为刺激物而使用可溶性抗原或多克隆刺激物(例如上面提到的)。优选地用上述方法通过掺入3H-胸苷来测量T细胞增殖。优选地用夹心ELISA来测量细胞因子产生，其中将细胞因子俘获抗体涂在96-孔板的表面，加入来自培养物的上清液并在室温下孵育1小时，加入对特定细胞因子具特异性的检测抗体，然后在加入连接有酶(例如辣根过氧化物酶)的二抗之后加入相应的底物，并在平板阅读器上测量吸光度。优选地，用对特定细胞表面分子特异的抗体染色靶细胞后，用直接或间接免疫荧光法测量细胞表面分子的改变。抗体可以直接用荧光染料标记或者可以使用对一抗特异的荧光标记的二抗，并用细胞荧光测定仪分析细胞。
本发明的结合分子对CD45RO和CD45RB都有结合特异性(“CD45RO/RB结合分子”)。
优选地，结合分子与CD45RO同种型结合的解离常数(Kd)＜20nM，优选地Kd＜15nM或＜10nM，更优选地Kd＜5nM。优选地，结合分子与CD45RB同种型结合的Kd＜50nM，优选地Kd＜15nM或＜10nM，更优选地Kd＜5nM。
在另一优选实施方案中，本发明的结合分子结合这样的CD45同种型，其(1)包括CD45分子的A和B表位，但没有C表位；和/或(2)包括CD45分子的B表位，但没有A和C表位；和/或(3)不包括CD45分子的A、B或C表位的任一个。
在再一优选实施方案中，本发明的结合分子不结合这样的CD45同种型，其包括(1)CD45分子的A、B和C表位的所有；和/或(2)CD45分子的B和C表位，但没有A表位。
在其它优选实施方案中，本发明的结合分子还可以(1)识别记忆T细胞和体内自身反应性T细胞；和/或(2)在人T细胞，例如PEER细胞上结合它的靶对象；其中优选地所述结合的Kd＜15nM，更优选Kd＜10nM，最优选Kd＜5nM；和/或(3)体外抑制自身反应性T细胞的功能，优选IC50约为5nM，更优选IC50约为1nM，最优选IC50约为0.5nM或者甚至0.1nM；和/或(4)诱导体外同种抗原特异性T细胞出现耐受；和/或(5)阻止由注射有效剂量人PBMC在SCID小鼠体内诱导的致死性异种移植物抗宿主疾病(GvHD)。
在再一优选实施方案中，本发明的结合分子与单克隆抗体“A6”结合相同的表位，抗体“A6”的描述如Aversa等，Cellular Immunology第158卷，第314-328页(1994)所述。
由于上述的结合特性和生物活性，本发明的这些结合分子在医学上对治疗和/或预防特别有用。本发明结合分子特别可用于的疾病包括自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症，以下将作进一步陈述。
我们发现，含有多肽SEQ ID NO1和多肽SEQ ID NO2的分子是CD45RO/RB结合分子。我们也查明了具SEQ ID NO1的CD45RO/RB结合分子中的CDR1′、CDR2′和CDR3′高变区，其中CDR1′具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2′具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
我们也查明了具SEQ ID NO2的CD45RO/RB结合分子中的CDR1、CDR2和CDR3高变区，其中CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
CDR是3个特异的互补决定区，也称作高变区，它在本质上决定抗原结合特征。这些CDR分别是例如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的可变区的部分，其中这些CDR与构架区(FR)(例如恒定区)交替出现。在根据本发明的嵌合抗体中，SEQ ID NO1是轻链例如SEQ ID NO3的部分，SEQ ID NO2是重链例如SEQ ID NO4的部分。重链的CDR与相关轻链的CDR一起基本上组成了本发明分子的抗原结合位点。已知，与相关重链可变区对结合热力学的贡献相比，轻链可变区的贡献较小；且分离的重链可变区自身有抗原结合活性。这些分子通常称作单域抗体。
本发明一方面提供含有至少一个抗原结合位点的分子，例如CD45RO/RB结合分子及其直接等价物，其中所述分子顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
本发明另一方面提供含有至少一个抗原结合位点的分子，例如CD45RO/RB结合分子及其直接等价物，其中所述分子包含a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)；以及b)顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二结构域，CDR1′具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2′具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
在优选实施方案中，顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域是免疫球蛋白重链，顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二结构域是免疫球蛋白轻链。
本发明另一方面提供含有SEQ ID NO1多肽和/或SEQ ID NO2多肽的分子，例如CD45RO/RB结合分子，优选地在一个结构域中含有SEQID NO1多肽而在另一个结构域中含有SEQ ID NO2多肽，例如嵌合单克隆抗体；本发明另一方面还提供含有SEQ ID NO3多肽和/或SEQ IDNO4多肽的分子，例如CD45RO/RB结合分子，优选地在一个结构域中含有SEQ ID NO3多肽而在另一个结构域中含有SEQ ID NO4多肽，例如嵌合单克隆抗体。
当抗原结合位点含有第一和第二结构域、或者相应地含有SEQ ID NO1多肽或SEQ ID NO3多肽和SEQ ID NO2多肽或SEQ ID NO4多肽时，这些结构域可以定位于相同的多肽分子上，或者，优选地每个结构域位于不同链上，例如第一结构域是重链(例如免疫球蛋白重链)或其片段的一部分，而第二结构域是轻链(例如免疫球蛋白轻链)或其片段的一部分。
我们进一步发现，根据本发明的CD45RO/RB结合分子是哺乳动物(例如人)体内环境中的CD45RO/RB结合分子。因此，根据本发明的CD45RO/RB结合分子可被认为是单克隆抗体(mAb)，其中结合活性主要通过如上所述的CDR区确定，例如所述CDR区可以与没有结合特异性的基本上来源于人的其他分子(例如构架，比如恒定区)相连。
本发明另一方面提供了不是如Aversa等，Cellular Immunology第158卷，第314-328页(1994)(鉴于表征A6的段落将其以参考文献的形式并入)所描述的单克隆抗体″A6″的CD45RO/RB结合分子。
本发明另一方面提供根据本发明的CD45RO/RB结合分子，它是嵌合的、人源化的或完全人的单克隆抗体。
CD45RO/RB结合分子的实例包括嵌合抗体或人源化抗体(例如可衍生自B细胞或杂交瘤产生的抗体)和/或其任何片段如F(ab′)2和Fab片段、以及单链或单域抗体。单链抗体由抗体重链和轻链的可变区通过肽接头共价连接组成，肽接头通常由10到30个氨基酸，优选15到25个氨基酸组成。因此，这样的结构不包括重链和轻链的恒定部分，并且据认为，小的肽间隔应当比整个恒定部分有更小的抗原性。嵌合抗体是指重链或轻链的恒定区或者两者都是人源的，而重链和轻链的可变区都是非人(例如鼠)源的抗体。人源化抗体是指高变区(CDR)是非人(例如鼠)源的，而全部或实质上全部其他部分(例如恒定区和可变区的高度保守部分)是人源的抗体。可是人源化抗体可以在邻近高变区的可变区部分中保留鼠源序列的几个氨基酸。
高变区，即根据本发明的CDR，可以和任何类型的构架区(例如人源的重链和轻链的恒定区)相连。合适的构架区例如可参见“具有免疫学意义的蛋白质的序列”，Kabat，E.A.等，US Department of Health and HumanServices，Public Health Service，National Institute of Health。优选地，人重链的恒定部分可以属于IgG1类，包括亚类；优选地，人轻链的恒定部分可以属于κ或λ类，更优选κ类。重链的优选恒定部分是多肽SEQ ID NO4(没有上述所述CDR1′、CDR2′和CDR3′序列部分)；轻链的优选恒定部分是多肽SEQ ID NO3(没有上述所述CDR1、CDR2和CDR3序列部分)。
我们也发明了如下人源化抗体，其包含含有根据本发明的CDR1′、CDR2′和CDR3′的具氨基酸SEQ ID NO7或氨基酸SEQ ID NO8的轻链可变区；以及含有根据本发明的CDR1、CDR2和CDR3的具氨基酸SEQID NO9或氨基酸SEQ ID NO10的重链可变区。
本发明另一方面提供含有多肽SEQ ID NO9或SEQ ID NO10和多肽SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的人源化抗体。
本发明另一方面提供人源化抗体，其含有-多肽SEQ ID NO9和多肽SEQ ID NO7，-多肽SEQ ID NO9和多肽SEQ ID NO8，-多肽SEQ ID NO10和多肽SEQ ID NO7，或者-多肽SEQ ID NO10和多肽SEQ ID NO8。
根据本发明的多肽，例如具本文中指出的序列的多肽，例如多肽CDR1，CDR2，CDR3，CDR1′，CDR2′，CDR3′，或SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的多肽，包括所述(多)肽(序列)的直接等价物；例如包括所述多肽的功能衍生物。所述功能衍生物可包括指定序列的共价修饰，和/或所述功能衍生物可包括指定序列的氨基酸序列变体。
除非另行指明，否则“多肽”包括含有通过肽键彼此连接在一起的氨基酸的任何肽或蛋白，其氨基酸序列起始于N末端并终止于C末端。优选地，本发明的多肽是单克隆抗体，更优选是嵌合(V-嫁接)单克隆抗体或人源化(CDR-嫁接)单克隆抗体。人源化(CDR-嫁接)单克隆抗体可以包括或不包括引入受体抗体构架(FR)序列中的进一步突变。
本文中所用的功能衍生物包括具有与本发明多肽相同的定性生物学活性的分子，例如具有与CD45RO和CD45RB结合的能力。功能衍生物包括本发明多肽的片段和肽类似物。片段包括本发明多肽(例如所述序列)的序列内的区域，术语“衍生物”用来限定本发明多肽(例如所述序列)的氨基酸序列变体和共价修饰。本发明多肽(例如所述序列)的功能衍生物优选具有与本发明多肽(例如所述序列)的氨基酸序列至少约65％、更优选至少约75％、甚至更优选至少约85％、最优选至少约95％的全序列同源性，并实质上保留与CD45RO和CD45RB结合的能力。
术语“共价修饰”包括用有机蛋白质性(proteinaceous)或非蛋白质性衍生剂对本发明多肽(例如所述序列)或者其片段的修饰、与异源多肽序列的融合以及翻译后修饰。共价修饰的多肽(例如所述序列)仍有通过交联与CD45RO和CD45RB结合的能力。通过靶氨基酸残基与能和选定侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或者通过在所选重组宿主细胞内起作用的翻译后修饰机制，可以常规地引入共价修饰。有些翻译后修饰是重组宿主细胞对已表达多肽作用的结果。谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基经常在翻译后脱氨基形成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。作为备选方案，这些残基可以在微酸性条件下脱氨基。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸的α-氨基基团和组氨酸侧链的甲基化，参见例如T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，第79-86页(1983)。例如，共价修饰包括含有本发明多肽(例如所述序列)的融合蛋白和它们的氨基酸序列变体，例如免疫粘附素和与异源信号序列的N-端融合物。
本文中，涉及天然多肽与其功能衍生物的术语“同源”被定义为通过序列比对和引入间隔(gap)(如果需要的话)以取得最大的同源百分数后，在不将保守替换考虑为序列同一性的部分时，候选序列的氨基酸残基与相应天然多肽的残基相同的百分数。不应将N-或C-端的延伸和插入理解为降低同一性或同源性的因素。比对的方法和计算机程序是已知的。“氨基酸”是指所有天然的L-α-氨基酸并包括D-氨基酸。用已知的单字母或三字母名称标识氨基酸。
术语“氨基酸序列变体”是指与本发明的多肽(例如所述序列)相比，在其氨基酸序列中有某些差别的分子。根据本发明的多肽(例如所述序列)的氨基酸序列变体仍有与CD45RO和CD45RB结合的能力。替换变体是指在本发明多肽(例如所述序列)中有至少一个氨基酸被去除并在相同位置上插入了不同氨基酸的变体。这些替换可以是单个的，其中在分子内部只有一个氨基酸被替换；或者可以是多重的，其中在同一分子内部有两个或多个氨基酸被替换。
插入变体是指在本发明多肽(例如所述序列)的特别位置处紧邻一个氨基酸插入一个或多个氨基酸的变体。与氨基酸紧邻是指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。缺失变体是指在本发明多肽(例如所述序列)中有一个或多个氨基酸被去除的变体。通常，缺失变体在分子的特殊区域有一个或两个氨基酸缺失。
我们还发现了如下多核苷酸序列，-GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG，编码CDR1的氨基酸序列，-TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG；编码CDR2的氨基酸序列，-ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT，编码CDR3的氨基酸序列，-TTATATTATCCACTG，编码CDR1′的氨基酸序列，-TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG，编码CDR2′的氨基酸序列，-AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG，编码CDR3′的氨基酸序列，-SEQ ID NO5，编码多肽SEQ ID NO1，即根据本发明的单克隆抗体的轻链可变区；-SEQ ID NO6，编码多肽SEQ ID NO2，即根据本发明的单克隆抗体的重链可变区；-SEQ ID NO11，编码多肽SEQ ID NO9，即含有本发明CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；-SEQ ID NO12，编码多肽SEQ ID NO10，即含有本发明CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区；-SEQ ID NO13，编码多肽SEQ ID NO7，即含有本发明CDR1′、CDR2′和CDR3′的轻链可变区；和-SEQ ID NO14，编码多肽SEQ ID NO8，即含有本发明CDR1′、CDR2′和CDR3′的轻链可变区。
本发明另一方面提供分离的多核苷酸，其含有编码CD45RO/RB结合分子的多核苷酸，例如编码本发明CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的多核苷酸和/或，优选地和编码本发明CDR1′、CDR2′和CDR3′的氨基酸序列的多核苷酸；多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO5和/或，优选地和多核苷酸SEQ ID NO6的；以及多核苷酸，其含有编码多肽SEQ ID NO7或SEQ ID NO8和多肽SEQID NO9或SEQ ID NO10的多核苷酸，例如编码-多肽SEQ ID NO7和多肽SEQ ID NO9，-多肽SEQ ID NO7和多肽SEQ ID NO10，-多肽SEQ ID NO8和多肽SEQ ID NO9，或-多肽SEQ ID NO8和多肽SEQ ID NO10的多核苷酸；以及多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO11或SEQ ID NO12和多核苷酸SEQ ID NO13或多核苷酸SEQ ID NO14，优选地含有-多核苷酸SEQ ID NO11和多核苷酸SEQ ID NO13，-多核苷酸SEQ ID NO11和多核苷酸SEQ ID NO14，-多核苷酸SEQ ID NO12和多核苷酸SEQ ID NO13，或-多核苷酸SEQ ID NO12和多核苷酸SEQ ID NO14。
除非另行指明，否则“多核苷酸”包括任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，它可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA，包括但不限于单和双链RNA以及作为单和双链区域的混合物的RNA。
根据本发明的多核苷酸，例如分别编码CDR1，CDR2，CDR3，CDR1′，CDR2′，CDR3′的氨基酸序列，或SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQID NO10氨基酸序列的多核苷酸，例如分别地多核苷酸SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13或SEQ IDNO14，包括其等位基因变体和/或其互补物；例如包括这样的多核苷酸，其可以相应地与核苷酸序列SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13或SEQ ID NO14杂交；例如相应地编码与SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10有至少80％一致的多肽，例如包括所述多肽的功能衍生物，例如所述功能衍生物可相应地与SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO7，SEQ IDNO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10有至少65％的同源性，例如所述功能衍生物可相应地包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的共价修饰，例如所述功能衍生物可相应地包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氨基酸序列变体；例如SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13或SEQ ID NO14分别包括这样的序列，其作为遗传密码丰余性(简并性)的结果相应地也编码多肽SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，或者相应地编码具有与氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10至少有80％一致的氨基酸序列的多肽。
CD45RO/RB结合分子，例如嵌合或人源化抗体，可以由重组DNA技术产生。因此，可以构建编码CD45RO/RB的一个或多个DNA分子，置于合适的控制序列之下，用合适的载体转入适宜的宿主(生物体)中进行表达。
本发明另一方面提供编码本发明CD45RO/RB结合分子的单个重链和/或轻链的多核苷酸；也提供本发明的多核苷酸的用途，用于通过重组方式产生根据本发明的CD45RO/RB结合分子。
可以根据常规方法，例如类似方法，联合本文提供的信息获得CD45RO/RB结合分子，这些信息例如高变区和可变区的氨基酸序列以及编码这些区的多核苷酸序列。构建可变区基因的方法参见例如EP 239 400中的描述，可以简要地概括如下可以克隆编码具任何特异性的单克隆抗体可变区的基因。确定编码构架区和高变区的DNA片段并去除编码高变区的DNA片段。根据本文中指出的CDR和CDR′序列通过DNA合成制备双链合成的CDR盒。使这些盒带有粘性末端，这样在连接处它们可以与期望的人源构架区连接。根据常规的方法例如类似方法，也可以制备编码单链抗体的多核苷酸。由此制备的本发明多核苷酸可以方便地转入合适的表达载体中。
可以根据常规方法如类似方法，发现合适的细胞系。表达载体，例如含有适宜的启动子和编码重链和轻链恒定区的基因的表达载体，是已知的，例如可商业上获得。合适的宿主是已知的或者可以据常规方法例如类似方法发现，包括细胞培养物或转基因动物。
本发明另一方面提供含有编码本发明CD45RO/RB结合分子的多核苷酸的表达载体，例如，具SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18序列的表达载体。
本发明另一方面提供-含有根据本发明的多核苷酸的表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能产生本发明的CD45RO/RB结合分子；和-含有以上限定的表达系统的分离的宿主细胞。
我们进一步发现，按照体外MLR的测定，根据本发明的CD45RO/RB结合分子以剂量依赖的方式抑制初级同种异体免疫反应。此结果表明，在本发明CD45RO/RB结合分子存在下被异源活化(alloactivate)的细胞对同种抗原(alloantigen)的反应被削弱。这证实了根据本发明的CD45RO/RB结合分子能直接地作用于同种异体反应性效应T细胞并调节它们的功能。另外，我们在次级MLR的再刺激实验中进一步研究了来自初级MLR的T细胞的功能特性，其中用特异细胞刺激物或第三方刺激物来评估所观察的功能效应的特异性。我们发现来自初级MLR(其中存在根据本发明的CD45RO/RB结合分子)的细胞对特异细胞刺激物的随后最佳刺激做出反应的能力被削弱，尽管在第二次培养中没有加入抗体。由于本发明CD45RO/RB结合分子所处理的细胞对来自无关第三方供体的细胞刺激物有正常反应的能力，证实所述抑制作用具特异性。因此，使用来自初级MLR培养物的T细胞的再刺激实验表明，在本发明CD45RO/RB结合分子存在时被异源活化的细胞对最初的同种抗原具低反应性，即耐受性。在实施例7中描述了其它的生物学活性。
我们还发现，在本发明CD45RO/RB结合分子预处理的细胞中细胞增殖可以通过外源IL-2拯救。这表明用本发明CD45RO/RB结合分子处理同种异体反应性T细胞可诱导耐受状态。事实上，在本发明CD45RO/RB结合分子处理的细胞中观察到的减弱增殖反应是由于T细胞功能受损所致；这些细胞能对外源IL-2做出反应，这表明这些细胞无细胞免疫反应性，即处于真实的无应答状态。由于本发明CD45RO/RB结合分子处理的细胞有响应无关供体细胞正常增殖到对照处理细胞的水平的能力，这证实了这个反应具特异性。
此外，实验表明，根据本发明的CD45RO/RB结合分子与CD45RO和CD45RB的结合可以抑制外周血单核细胞(PBMC)对特异回忆抗原的记忆反应，其中此外周血单核细胞来自经免疫的供体。因此根据本发明的CD45RO/RB结合分子与CD45RO和CD45RB的结合也可有效地抑制对可溶性Ag的记忆反应。由于根据本发明的CD45RO/RB结合分子能够抑制PBMC(来自被免疫的供体)中对破伤风的回忆反应，这表明根据本发明的CD45RO/RB结合分子能靶向并调节记忆T细胞的活化。例如，这些数据表明，除了能识别同种异体反应性活化T细胞之外，根据本发明的CD45RO/RB结合分子还能调节它们的功能，诱导T细胞的无细胞免疫反应性。这个特性对于治疗正在发生的针对自身抗原、过敏原及可能地同种抗原的免疫反应可能是重要的，这些免疫反应可见于自身免疫疾病、过敏症和慢性排斥以及例如牛皮癣、炎症性肠病等疾病，其中记忆反应在维持疾病的状态方面扮演角色。在对自身抗原的记忆反应可能在疾病维持方面有着重要作用的疾病状态中，例如在自身免疫疾病中，这被认为是一个重要特征。
我们也发现根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以调节体内混合淋巴细胞反应(MLR)中的T细胞增殖反应，即实验发现在体内根据本发明的CD45RO/RB结合分子有相应的抑制特性。
因此，根据本发明的CD45RO/RB结合分子有免疫抑制和耐受原特性，并可以用于体内和离体诱导对同种抗原，自身抗原，过敏原和细菌菌群抗原的耐受，例如根据本发明的CD45RO/RB结合分子可以在疾病治疗和预防中使用，所述疾病例如包括自身免疫疾病，例如但不限于类风湿性关节炎，自身免疫性甲状腺炎、葛雷夫斯氏病、I型和II型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、自身免疫性胃炎、肾小球肾炎；移植排斥，例如器官和组织同种异体移植和异种移植排斥以及移植物抗宿主疾病(GVHD)，还有牛皮癣、炎症性肠病和过敏症。
本发明另一方面提供根据本发明的CD45RO/RB结合分子用作药物的用途，例如在治疗和/或预防自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症中应用。
本发明另一方面提供根据本发明的CD45RO/RB结合分子，其用于生产治疗和预防与自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症有关的疾病的药物。
本发明另一方面提供含有根据本发明的CD45RO/RB结合分子的药物组合物，该组合物还含有至少一个可药用载体或稀释剂。
药物组合物还可以包含例如活性成分，例如其他免疫调节抗体(例如但不限于抗-ICOS，抗-CD154，抗-CD134L)或重组蛋白(例如但不限于rCTLA-4(CD152)，rOX40(CD134))或者免疫调节化合物(例如但不限于环孢菌素A，FTY720，RAD，纳巴霉素，FK506，15-脱氧精胍菌素，类固醇)。
本发明另一方面提供与自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症有关的疾病的治疗和/或预防方法，包括给需要此治疗和/或预防的对象施用有效量的根据本发明的CD45RO/RB结合分子，例如以根据本发明的药物组合物的形式。
可以用本发明的结合分子治疗的自身免疫疾病还包括，但不限于，类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺炎、葛雷夫斯氏病、I型和II型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、硬皮病、自身免疫性胃炎、肾小球肾炎；移植排斥，例如器官和组织同种异体移植和异种移植排斥以及移植物抗宿主疾病(GVHD)。
实施例参考以下实施例，可以更全面地理解本发明。可是，不能将其理解为限制本发明的范围。以下实施例中，所有温度都以摄氏度表示。
“候选单克隆抗体”或“嵌合抗体”是根据本发明的CD45RO/RB结合分子，它含有SEQ ID NO3的轻链和SEQ ID NO4的重链。
使用以下缩写ELISA 酶联免疫吸附测定FACS 荧光激活细胞分类术FITC 异硫氰酸荧光素FBS胎牛血清GVHD 移植物抗宿主疾病HCMV 人巨细胞病毒启动子IgE免疫球蛋白同种型EIgG免疫球蛋白同种型GPBS磷酸缓冲盐溶液PCR聚合酶链式反应xGVHD 异种移植物抗宿主疾病实施例1初级淋巴细胞反应(MLR)细胞血液样品来自健康的人捐献者。通过在Ficoll-Hypaque(PharmaciaLKB)上离心从白细胞中分离外周血单核细胞(PBMC)，所述白细胞来自整个外周血、白细胞去除术或者白细胞层，具有已知的血型但未知的HLA型。在一些MLR实验中，受40Gy辐射后，PBMC直接用作细胞刺激物。在另外的实验中，用CD2或CD3 Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)从PBMC中耗竭T细胞。用磁场去除小珠和污染细胞。在辐射后，将耗竭了T细胞的PBMC用作细胞刺激物。
在MLR中，PBMC、CD3+T或CD4+T细胞用作效应细胞。将来自不同供体的细胞制备为细胞刺激物。使用抗-CD16单克隆抗体(Zymed，CA)，山羊抗鼠IgG Dynabeads，抗-CD14 Dynabeads，CD19 Dynabeads通过负选择来纯化CD3+T细胞。另外抗-CD8 Dynabeads用来纯化CD4+T细胞。获得的细胞用FACScan或FACSCalibur(Becton Dickinson & Co.，CA)分析，获得的细胞的纯度＞75％。细胞在补充有10％热灭活FBS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中悬浮。
试剂还制备嵌合抗-CD45RO/RB单克隆抗体“候选单克隆抗体”和同种型匹配的对照嵌合抗体。对KLH(匙孔血蓝蛋白)特异的鼠(人)对照IgG1抗体和重组人IL-10购自BD Pharmingen(San Diego，CA)。抗-人CD154单克隆抗体5c8是根据Lederman等1992的描述。
初级混合淋巴细胞反应(MLR)在有所述单克隆抗体存在或抗体缺乏的情况下，在96孔培养板(Costar，Cambridge，MA)的每个孔中，将等分试样1×105个PBMC或5×104个CD3+或CD4+细胞与辐射过的1×105个PBMC或5×104个耗竭了T细胞并辐射(50Gy)过的PBMC混合。在一些实验中，除了候选单克隆抗体之外，还加入10μg/ml的对Fc部分特异的羊抗鼠Ig或羊抗人Ig的F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，以保证与靶CD45分子的最佳体外交联。在37℃于5％CO2中培养混合细胞4或5天，在培养的最后16-20个小时用3H-胸苷脉冲细胞以测定增殖。其他实验与上述类似，但有以下例外1)使用的培养基是含有10％FBS和1％人血浆的EX-VIVO(Bio-Whittaker)；2)抗鼠完全IgG(5μg/ml)用作第二交联步骤；3)细胞刺激物所受的辐射为60Gy。
在有“候选单克隆抗体”或对照嵌合IgG1(10μg/ml)存在下进行初级MLR，两种情况下都有第二步骤试剂，即对Fc部分特异的羊抗人Ig的F(ab’)2片段(10μg/ml)。与对照IgG1存在下的细胞增殖相比，可以计算出“候选单克隆抗体”的抑制百分数。结果见于如下表1表110μg/ml根据本发明的候选单克隆抗体对初级MLR的抑制
*与对照值有显著差异(P＜0.001)从表1中可以看出根据本发明的候选单克隆抗体对初级MLR有抑制作用。在来自四个不同供体的CD4+T细胞中平均抑制效应是60.83±6.83％，具有统计学显著性。
如图1所示，在0.001到10μg/ml范围内“候选单克隆抗体”对初级MLR的抑制作用显示为剂量依赖的。从使用一个供体PBMC作为效应细胞的三个独立的MLR实验的结果可以测定“候选单克隆抗体”对初级MLR抑制的IC50。因此，在有“候选单克隆抗体”或对照嵌合抗体及10μg/ml羊抗人Ig的F(ab’)2片段存在下，将来自供体#229和#219的效应CD4+T细胞与作为刺激物的耗竭了T细胞并受过辐射的PBMC混合。实验重复3次，与对照抗体存在下的T细胞增殖相比，计算“候选单克隆抗体”存在下增殖的百分数。用Origin(V.6.0)确定IC50值。计算的细胞活性IC50值是0.87±0.35nM(0.13±0.052μg/ml)。
实施例2次级MLR为了评估“候选单克隆抗体”是否诱导CD4+T细胞对特异同种抗原的无应答性，在初级MLC后在无任何抗体存在下进行次级MLR。在有所述抗体存在下，在96孔培养板中将CD4+T细胞与辐射过的同种异型细胞刺激物(T细胞耗竭的PBMC)一起培养10天。然后，收集细胞，在Ficoll-Hypaque梯度上分层以去除死亡的细胞，用RPMI洗两次，然后用相同刺激物、第三方细胞刺激物或IL-2(50U/ml)再次刺激。细胞培养3天，通过用3H-胸苷在培养的最后16-20个小时脉冲细胞来测定增殖反应。
具体地，在10μg/ml“候选单克隆抗体”、对照IgG1嵌合抗体和羊抗人Ig的F(ab’)2片段存在下，将CD4+T细胞与受过辐射的同种异型细胞刺激物(来自其他供体的T细胞耗竭的PBMC)一起培养。在第5天测定初级MLR增殖。对于次级MLR，在有“候选单克隆抗体”存在下培养效应细胞和细胞刺激物10天；然后收获细胞，用RPMI1640洗两次，并在无任何抗体存在下用特异刺激物、第三方刺激物或IL-2(50U/ml)再次刺激。在第3天测定细胞增殖，结果列于表2表2
*与对照值有显著差异(p＝＜0.001，用t-检验测定，SigmaStat V.2.03).#p＝＜0.046为了检验削弱的增殖是否是由于作为“候选单克隆抗体”处理结果的无应答性引起的，在有IL-2(50U/ml)存在下培养来自初级MLR的细胞。添加IL-2导致在初级MLR中经“候选单克隆抗体”处理过的T细胞的增殖反应得以恢复，达到与IgG1对照抗体存在时所观察到的反应相似的水平。这些数据表明，“候选单克隆抗体”处理过的T细胞所具有的削弱的次级反应是由于效应T细胞的功能改变所致，该T细胞对特异细胞刺激物变得无应答性。
抑制百分数是根据以下公式计算出的 用SigmaStat(Vers.2.03)进行统计分析。
用双向ANOVA之后用Dunnett方法分析数据。在所有检验过程中把概率＜0.05看作具有显著性。在一些实验中使用t-检验(SigmaStat V.2.03)。
实施例3SCID小鼠的体内存活研究hu-PBL植入SCID小鼠向SCID小鼠C.B17/GbmsTac-PrkdcscidLystbg小鼠(Taconic，Germantown，NY)腹膜内注射人外周血单核细胞(PBMC)，其剂量足以在细胞植入后4周内在＞90％小鼠体内诱导致死性异种移植物抗宿主疾病(xGvHD)。此处理的SCID小鼠在此后称作hu-PBL-SCID小鼠。
hu-PBL-SCID小鼠的单克隆抗体处理在第0天，即PBMC注射之后立即，第3天、第7天和此后每隔一周，用“候选单克隆抗体”或鼠的或嵌合的同种型匹配的单克隆抗体对照处理hu-PBL-SCID小鼠。皮下给予在100μl PBS中的单克隆抗体至终浓度为5mg/kg体重。当所有对照小鼠死亡之后终止处理。
处理结果的评价本研究中评价“候选单克隆抗体”效力的主要标准是hu-PBL-SCID小鼠的存活。通过统计学存活分析方法在Systat v9.01软件的帮助下用log-rank检验(Mantel法)来评价结果的显著性。存活分析方法是非参数检验，它不但考虑某一特定小鼠是否仍然存活，也考虑如果它被处死则原因是否与处理/疾病无关，例如对其器官/细胞进行体外分析的需要。从死亡小鼠获得肝脏、肺、肾和脾的活检物用于进一步评价。另外，在实验开始(细胞转移之前)和实验中(每2天)称重hu-PBL-SCID小鼠用作其健康状况的间接评价。用来自每个小鼠的体重对PBMC转移后的天数值产生线性回归线，之后用非参数Mann-Whitney检验比较它们的斜率(对照相对于抗-CD45处理的小鼠)。
结果鼠单克隆抗体对照处理过的所有hu-PBL-SCID小鼠的肺、肝和脾内已经渗入了人白细胞，并在细胞转移后约2到3周内小鼠死去(4/4)。死亡可能由xGvHD引起。对照单克隆抗体处理的小鼠还以线性方式减重，约10％且在3周内更多。
用“候选单克隆抗体”处理过的所有hu-PBL-SCID小鼠都存活(4/4)并且超过四周无任何疾病的明显征兆，即使3周后停止“候选单克隆抗体”处理亦如此。“候选单克隆抗体”处理的小鼠以线性方式增加体重，在4周内高达约5％。
实施例4本发明抗体的表达含有SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的人源化抗体的表达根据质粒图(显示在图2到5)构建表达载体，分别含有编码人源化轻链可变区humV1(SEQ ID NO7)、人源化轻链可变区humV2(SEQ IDNO8)、人源化重链可变区VHE(SEQ ID NO9)或人源化重链可变区VHQ(SEQ ID NO10)的氨基酸序列的相应核苷酸。这些表达载体分别具有SEQID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17或SEQ ID NO 18的DNA(核苷酸)序列。
人源化抗体重链和轻链表达载体的构建用于VLh和VLm版本的人κ轻链表达载体为了构建编码人κ同种型的完整人源化轻链的最终表达载体，用HindIII和BglII从含有VLh和VLm的PCR-Script克隆载体(Stratagene)(VLm区)切下编码完整轻链可变区(VLh和VLm)的DNA片段。然后将经过凝胶纯化的片段亚克隆入C21-HCMV K表达载体的HindIII和BamHI位点中，此载体是在构建人源化抗-IgE抗体TESC-21时产生的(Kolbinger等1993)并且最初从M.Bendig(MRC Collaborative Centre，London，英国)外得到(Maeda等1991)。用酚/氯仿抽提来纯化连接产物，并通过电穿孔导入电穿孔-感受态Epicurian ColiXL1-Blue菌株(Cat.N°#200228，Stratagene)。铺在LB/amp琼脂平板上后，37℃过夜，各挑出12个菌落，用BioRobot 9600(Qiagen)从3ml培养物中制备质粒DNA。这分别产生人源化抗体版本VLh和VLm的轻链表达载体，在图中有进一步描述。
用于VHQ的人γ-1重链表达载体为了构建VHQ表达载体，采用分步法。首先根据如Kolbinger等1993(Protein Eng.1993 Nov；6(8)971-80)描述的方法通过PCR组装VHQ的完整可变区，然后亚克隆入C21-HCMV-γ-1表达载体中，此载体中已用相同的酶去除了C21插入。把含有完整可变区的PCRScript克隆VHQ的HindIII/BamHI片段亚克隆入用同样的酶切割的表达载体C21-HCMV-γ-1中。这产生了人源化抗体版本VHQ的最终表达载体。
用于VHE的人γ-1重链表达载体构建编码人γ-1同种型的完整人源化重链的最终VHE表达载体的方式如下直接把编码此可变区的HindIII和BamHI限制性PCR片段连接入C21-HCMVγ-1表达载体的HindIII和BamHI位点中，C21-HCMVγ-1表达载体是在构建人源化抗-IgE抗体TESC-21时创造的(Kolbinger等1993)并且也最初由M.Bendig(MRC Collaborative Centre，London，英国)提供(Maeda等1991)。
COS细胞内的瞬时表达对于150ml细胞培养盘中的粘附COS细胞，适应性修改以下转染方案，其中使用SuperFectTM转染试剂(Cat.N°301305，Qiagen)。上述的四种不同的表达载体用于瞬时转染细胞。为了表达人源化抗体，将含有重链插入片段(分别地，VHE或VHQ)的两个克隆中的一个与编码轻链(分别地，humV1或humV2)的两个克隆中的一个共转染入细胞，这样重链和轻链表达载体总共有4种不同的组合(VHE/humV1，VHE/humV2，VHQ/humV1和VHQ/humV2)。转染之前，用限制性内切酶PvuI线性化质粒，PvuI在编码氨苄青霉素抗性基因的区域内切割。转染前一天，在150ml细胞培养盘中将4×106个COS细胞接种在30ml新鲜培养基内。在这个细胞浓度，接种24小时后通常产生80％的汇合。转染当天，在没有血清和抗生素的总体积900μl的新鲜培养基中稀释线性化重链和轻链DNA表达载体的4种不同组合(每个15μg)。然后把180μl SuperFect转染试剂与DNA溶液彻底混合。室温温育DNA混合物10分钟以允许复合体的形成。复合体形成后，从COS细胞培养物中去除生长培养基，用PBS洗细胞一次。然后在含有转染混合物的每个反应管中加入9ml新鲜培养基(含有10％FBS和抗生素)并充分混合。37℃及5％CO2下细胞培养物与DNA复合体温育3小时。温育后，去除含有转染复合体的培养基，用30ml新鲜培养基代替。转染后48小时，收获培养物上清液。
培养物上清液的浓缩为了ELISA和FACS分析，从转染了重链和轻链质粒的COS细胞收集的培养物上清液按如下浓缩。如制造商所描述的把10ml每种上清液加入Centriprep YM-50离心过滤装置(Cat.N°4310，Millipore)。室温3000rpm离心Centriprep过滤器10分钟。然后用剩余的20ml上清液再次重复此离心步骤，其中仅离心5分钟并监督浓度的进展。回收中间500μl浓缩的上清液，转移至新Microcon离心过滤装置(Cat.N°42412，Microcon)，并依照制造商的方案进一步浓缩。室温3000rpm离心浓缩的上清液4次24分钟，6000rpm离心一次10分钟，然后3次5分钟，此过程中总是监督浓度的进展。得到的浓缩条件培养基的终体积为100-120μl，相应于最初培养基浓缩了250到300倍，将其在4℃保存直至使用前。为了对比和对照，用上述相同的离心方案，类似地浓缩来自未转染细胞的培养基。
实施例5用ELISA测定重组人IgG的表达为了测定在培养物上清液中表达的重组人抗体的IgG浓度，用人IgG作为标准发展和优化了夹心ELISA方法。用100μl在PBS中终浓度为0.5μg/ml的羊抗人IgG(整个分子，Cat.N°I1011，SIGMA)包被平底96孔微量滴定板(Cat.N°4-39454，Nunc Immunoplate Maxisorp)，4℃过夜。然后用漂洗缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗孔3次，并37℃用封闭缓冲液(0.5％BSA在PBS中)封闭1.5小时。漂洗3个循环后，通过在封闭缓冲液中以1.5倍系列稀释制备抗体样品和标准人IgG(Cat.No.I4506，SIGMA)。一式两份地将100μl稀释样品或标准转移至包被的平板中，并室温温育1小时。温育后用漂洗缓冲液洗板3次，之后与在封闭缓冲液中1/4000稀释的与辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG κ-轻链(Cat.N°A-7164，SIGMA)100μl温育1小时。对照孔加入100μl封闭缓冲液或浓缩的正常培养基。漂洗之后，根据制造商的说明书用TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(Cat.N°172-1067，Bio-Rad)，在样品和标准孔中进行结合的过氧化物酶的比色定量测定。在每个孔中加入100μl此过氧化物酶混合物，在室温暗处温育30分钟。通过加入100μl的1M硫酸终止显色反应。用ELISA板阅读器(3350-UV型，BioRad)在450nm读取每个孔的吸光度。
IgG标准曲线的相关系数是0.998，测定到的4种不同培养物浓缩液的浓度如下(约250-300倍浓缩)VHE/humV1上清液＝8.26μg/mlVHE/humV2上清液＝6.27μg/mlVHQ/humV1上清液＝5.3μg/mlVHQ/humV2上清液＝5.56μg/ml
实施例6FACS竞争分析(结合亲和力)将人T细胞系PEER选作FACS分析的靶细胞，因为它在其细胞表面表达CD45抗原。为了分析人源化抗体上清液的结合亲和力，进行用FITC-标记的嵌合抗体作为参考的竞争实验，并与纯化的鼠抗体和嵌合抗体的抑制作用相比较。3000rpm离心PEER细胞培养物10秒，并去除培养基。细胞在FACS缓冲液(含有1％PBS和0.1％叠氮化钠的PBS)中重悬，并在96孔圆底微量滴定板中以细胞密度为每孔1×105个进行接种。离心滴定板并弃上清液。为了进行封闭研究，首先按文中指出的浓度在每个孔中加入25μl浓缩的未转染培养基或同种型匹配的对照抗体(阴性对照)、未标记的鼠抗体或嵌合抗体(阳性对照)以及含有不同人源化抗体组合的浓缩上清液(样品)。4℃温育1小时后，通过离心用200μl FACS缓冲液洗PEER细胞。之后在4℃细胞与在FACS缓冲液中的与FITC偶联的嵌合抗体温育1小时，抗体终浓度为20μg/ml。洗涤细胞，将其在含有2μg/ml碘化丙锭(允许门控活细胞)的300μl FACS缓冲液中重悬。在流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson)上分析细胞制品。
FACS分析表明浓缩的人源化抗体培养物上清液对荧光染料标记的嵌合抗体的封闭是剂量依赖的。使用同种型匹配的对照抗体时没有看到对嵌合抗体的剂量依赖封闭，这表明由这些不同人源化抗体组合产生的封闭效应是表位特异的；并且在人源化处理之后似乎仍保留了此表位特异性。
实施例7CD45RB/RO结合分子的生物学活性在本研究中，我们分析了，当存在于多克隆活化的原代人T细胞培养物中时，CD45RB/RO结合嵌合抗体是否(1)支持有特征性Treg表型的T细胞分化；(2)阻止或加强T细胞活化后的细胞凋亡；和(3)影响在再次刺激后特异抗原亚群和受体的表达。
在多克隆活化的T细胞中CD45RB/RO结合嵌合抗体加强细胞死亡在CD45RB/RO结合嵌合抗体存在或缺乏(对照)的条件下，用抗-CD3加上抗-CD28单克隆抗体把原代T细胞(CD4+和CD8+T亚群的混合物)活化。在第2天通过洗涤去除多余的抗体。可被凋亡和坏死细胞吸收的7-氨基放线菌素D(7-AAD)作为DNA染料用于测定活化后的细胞死亡。结果显示，CD45RB/RO结合嵌合抗体存在下的T细胞活化增加了7-AAD阳性细胞部分，比活化后第2天多2倍。第7天，在CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的培养物和对照培养物中7-AAD阳性细胞部分再次相似。
CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的而非对照单克隆抗体处理的T细胞显示出T调节细胞(Treg)表型Treg细胞的标志是CD25以及负调节蛋白CTLA-4(CD152)的表达增加。CD45RB/RO结合嵌合抗体对初级和次级T细胞反应的功能抑制可能是由于诱导了Treg细胞所致。为了解决这个问题，用抗-CD3+CD28单克隆抗体活化T细胞并在CD45RB/RO结合嵌合抗体或抗-LPS对照单克隆抗体存在下培养。CTLA-4和CD25表达的时程显示，对照与CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞在第二次刺激后的第1天和第3天有显著差异，指示为Treg表型。
在CD45RB/RO结合嵌合抗体存在下胞内CTLA-4持继表达已报道，在胞内存在相当大量的CTLA-4。因此，与表面CTLA-4染色平行，分析胞内CTLA-4表达。在刺激后的第4天看到T细胞培养物之间有适度差异。但是，经过延长的培养之后，只有在CD45RB/RO结合嵌合抗体处理过的T细胞中维持高水平的胞内CTLA-4，而对照T细胞没有。
CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞变成CD4和CD8双阳性刺激之后，T细胞诱导和上调几种表面受体，例如CD25、CD152(CTLA-4)、CD154(CD40配体)等的表达。与之相比，CD4或CD8的表达水平被认为相对稳定。我们能重复地观察到活化后CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞的表面CD4和CD8抗原都有强烈的上升，而对照抗体处理的T细胞中则没有。CD4/CD8双阳性T细胞群的出现似乎是由于CD8+亚群上的CD4，和相反地CD4+亚群上的CD8的上调引起的。与之不同的是，对照培养物中有适度低百分数的双阳性T细胞。
CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞中IL-2受体α链有高表达但β链的表达非常低已知Treg细胞为CD25、IL-2受体α链组成型阳性。Treg细胞上三聚体IL-2受体的其他亚基的调节还不知道。近来我们对比了在如下T细胞表面上IL-2受体的β链，如CD122，的表达；所述T细胞在CD45RB/RO结合嵌合抗体存在或缺失下活化和增殖。结果显示，与对照培养物中T细胞相比，CD45RB/RO结合嵌合抗体处理的T细胞有低约10倍的CD122表达。这个差异可能表明Treg细胞需要非IL-2的其他因子来增殖。
Example 8本发明的序列(本发明的CDR序列以下划线显示)SEQ ID NO1嵌合轻链氨基酸序列的部分DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIRSSSESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNTWPFTFGSGTKLEIKSEQ ID NO2嵌合重链氨基酸序列的部分EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYIIHWVKQEPGQGLEWIGYFNPYNHGTKYNEKFKGRATLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCARSGPYAWFDTWGQGTTVTVSSSEQ ID NO3嵌合轻链氨基酸序列DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQNIGTSIQWYQQRTNGSPRLLIRSSSESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNTWPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO4嵌合重链氨基酸序列
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYIIHWVKQEPGQGLEWIGYFNPYNHGTKYNEKFKGRATLTADKSSNTAYMDLSSLTSEDSAIYYCARSGPYAWFDTWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO5编码多肽SEQ ID NO1的核苷酸序列GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTTGAAATCAAASEQ ID NO6编码多肽SEQ ID NO2的核苷酸序列GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGGACCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGATCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO7称作humV2(humV2＝VLm)的人源化轻链氨基酸序列的部分DILLTQSPAT LSLSPGERAT FSCRASQNIG TSIQWYQQKT NGAPRLLIRS SSESISGIPS RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SNTWPFTFGQ GTKLEIKSEQ ID NO8称作humV1(humV1＝VLh)的人源化轻链氨基酸序列的部分
DILLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQNIG TSIQWYQQKP GQAPRLLIRS SSESISGIPS RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SNTWPFTFGQ GTKLEIKSEQ ID NO9称作VHE的人源化重链氨基酸序列的部分EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFTNYIIHWVKQE PGQGLEWIGY FNPYNHGTKYNEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSG PYAWFDTWGQ GTTVTVSSSEQ ID NO10称作VHQ的人源化重链氨基酸序列的部分QVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFTNYIIHWVKQE PGQGLEWIGY FNPYNHGTKYNEKFKGRATL TANKSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSG PYAWFDTWGQ GTTVTVSSSEQ ID NO11编码氨基酸序列SEQ ID NO9的核苷酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO12编码氨基酸序列SEQ ID NO10的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGAGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACATTCACTAATTATATTATCCACTGGGTGAAGCAGGAGCCTGGTCAGGGCCTTGAATGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTAACTGCAAACAAATCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACTGCGGTCTACTACTGTGCAAGATCAGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO13编码氨基酸序列SEQ ID NO7的核苷酸序列GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCACTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAAACAAATGGTGCTCCAA
GGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ ID NO14编码氨基酸序列SEQ ID NO8的核苷酸序列GACATTCTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTCTGAGTCCAGGAGAAAGAGCCACTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTGGTATCAACAAAAACCAGGTCAGGCTCCAAGGCTTCTCATAAGGTCTTCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ ID NO15表达载体HCMV-G1 HuAb-VHQ的核苷酸序列(在3921-4274含有SEQ ID NO12(VHQ)的人源化重链表达载体的完整DNA序列)1 AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG51 GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA101 TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC151 GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG201 CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG251 AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC301 ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG351 ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT401 CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG451 TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG501 GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG551 TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC601 CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT651 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT701 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC751 CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA801 TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA851 GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA901 AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT951 GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT1001 GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG1051 CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG1101 TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA1151 CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC
1201 TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT1251 CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT1301 GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG1351 CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT1401 TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT1451 TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA1501 AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA1551 CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT1601 TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA1651 CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC1701 ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG1751 CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT1801 AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG1851 CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG1901 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA1951 TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT2001 TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC2051 TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT2101 GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG2151 TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA2201 CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA2251 AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC2301 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA2351 AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA2401 TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA2451 GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA2501 AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC2551 TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC2601 GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCAGCTT GGCTGCAGTG AATAATAAAA2651 TGTGTGTTTG TCCGAAATAC GCGTTTTGAG ATTTCTGTCG CCGACTAAAT2701 TCATGTCGCG CGATAGTGGT GTTTATCGCC GATAGAGATG GCGATATTGG2751 AAAAATCGAT ATTTGAAAAT ATGGCATATT GAAAATGTCG CCGATGTGAG2801 TTTCTGTGTA ACTGATATCG CCATTTTTCC AAAAGTGATT TTTGGGCATA2851 CGCGATATCT GGCGATAGCG CTTATATCGT TTACGGGGGA TGGCGATAGA2901 CGACTTTGGT GACTTGGGCG ATTCTGTGTG TCGCAAATAT CGCAGTTTCG2951 ATATAGGTGA CAGACGATAT GAGGCTATAT CGCCGATAGA GGCGACATCA3001 AGCTGGCACA TGGCCAATGC ATATCGATCT ATACATTGAA TCAATATTGG3051 CCATTAGCCA TATTATTCAT TGGTTATATA GCATAAATCA ATATTGGCTA3101 TTGGCCATTG CATACGTTGT ATCCATATCA TAATATGTAC ATTTATATTG3151 GCTCATGTCC AACATTACCG CCATGTTGAC ATTGATTATT GACTAGTTAT3201 TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT3251 CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG3301 ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA3351 ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC3401 CCACTTGGCA GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG
3451 ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC3501 TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG TCATCGCTAT3551 TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT GGATAGCGGT3601 TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT3651 TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC3701 CGCCCCATTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA3751 TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA3801 CGCTGTTTTG ACCTCCATAG AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCAA3851 GCTTGCCGCC ACCATGGACT GGACCTGGAG GGTGTTCTGC CTGCTGGCCG3901 TGGCCCCCGG CGCCCACAGC CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC AGGAGCCGAA3951 GTGAAAAAGC CTGGGGCTTC AGTGAAGGTG TCCTGCAAGG CCTCTGGATA4001 CACATTCACT AATTATATTA TCCACTGGGT GAAGCAGGAG CCTGGTCAGG4051 GCCTTGAATG GATTGGATAT TTTAATCCTT ACAATCATGG TACTAAGTAC4101 AATGAGAAGT TCAAAGGCAG GGCCACACTA ACTGCAAACA AATCCATCAG4151 CACAGCCTAC ATGGAGCTCA GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACTGCGGTCT4201 ACTACTGTGC AAGATCAGGA CCCTATGCCT GGTTTGACAC CTGGGGCCAA4251 GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCAGGTGAG TTCTAGAAGG ATCCCAAGCT4301 AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG4351 GCTAAGGTGA GGCAGGTGGC GCCAGCCAGG TGCACACCCA ATGCCCATGA4401 GCCCAGACAC TGGACGCTGA ACCTCGCGGA CAGTTAAGAA CCCAGGGGCC4451 TCTGCGCCCT GGGCCCAGCT CTGTCCCACA CCGCGGTCAC ATGGCACCAC4501 CTCTCTTGCA GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT4551 CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG4601 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC4651 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT4701 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC4751 TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAA4801 AGTTGGTGAG AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG4851 CTCAGCGCTC CTGCCTGGAC GCATCCCGGC TATGCAGCCC CAGTCCAGGG4901 CAGCAAGGCA GGCCCCGTCT GCCTCTTCAC CCGGAGGCCT CTGCCCGCCC4951 CACTCATGCT CAGGGAGAGG GTCTTCTGGC TTTTTCCCCA GGCTCTGGGC5001 AGGCACAGGC TAGGTGCCCC TAACCCAGGC CCTGCACACA AAGGGGCAGG5051 TGCTGGGCTC AGACCTGCCA AGAGCCATAT CCGGGAGGAC CCTGCCCCTG5101 ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC CACTCCCTCA GCTCGGACAC5151 CTTCTCTCCT CCCAGATTCC AGTAACTCCC AATCTTCTCT CTGCAGAGCC5201 CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GGTAAGCCAG5251 CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC5301 TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT5351 CTTCCTCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC5401 CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG5451 CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT5501 ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG5551 CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA5601 GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC5651 TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG TGGGACCCGT
5701 GGGGTGCGAG GGCCACATGG ACAGAGGCCG GCTCGGCCCA CCCTCTGCCC5751 TGAGAGTGAC CGCTGTACCA ACCTCTGTCC CTACAGGGCA GCCCCGAGAA5801 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA5851 GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG5901 TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT5951 CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT6001 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC6051 ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG6101 GGTAAATGAG TGCGACGGCC GGCAAGCCCC CGCTCCCCGG GCTCTCGCGG6151 TCGCACGAGG ATGCTTGGCA CGTACCCCCT GTACATACTT CCCGGGCGCC6201 CAGCATGGAA ATAAAGCACC CAGCGCTGCC CTGGGCCCCT GCGAGACTGT6251 GATGGTTCTT TCCACGGGTC AGGCCGAGTC TGAGGCCTGA GTGGCATGAG6301 ATCTGATATC ATCGATGAAT TCGAGCTCGG TACCCGGGGA TCGATCCAGA6351 CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT6401 GAAAAAAATG CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA6451 ACCATTATAA GCTGCAATAA ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT6501 TATGTTTCAG GTTCAGGGGG AGGTGTGGGA GGTTTTTTAA AGCAAGTAAA6551 ACCTCTACAA ATGTGGTATG GCTGATTATG ATCTCTAGTC AAGGCACTAT6601 ACATCAAATA TTCCTTATTA ACCCCTTTAC AAATTAAAAA GCTAAAGGTA6651 CACAATTTTT GAGCATAGTT ATTAATAGCA GACACTCTAT GCCTGTGTGG6701 AGTAAGAAAA AACAGTATGT TATGATTATA ACTGTTATGC CTACTTATAA6751 AGGTTACAGA ATATTTTTCC ATAATTTTCT TGTATAGCAG TGCAGCTTTT6801 TCCTTTGTGG TGTAAATAGC AAAGCAAGCA AGAGTTCTAT TACTAAACAC6851 AGCATGACTC AAAAAACTTA GCAATTCTGA AGGAAAGTCC TTGGGGTCTT6901 CTACCTTTCT CTTCTTTTTT GGAGGAGTAG AATGTTGAGA GTCAGCAGTA6951 GCCTCATCAT CACTAGATGG CATTTCTTCT GAGCAAAACA GGTTTTCCTC7001 ATTAAAGGCA TTCCACCACT GCTCCCATTC ATCAGTTCCA TAGGTTGGAA7051 TCTAAAATAC ACAAACAATT AGAATCAGTA GTTTAACACA TTATACACTT7101 AAAAATTTTA TATTTACCTT AGAGCTTTAA ATCTCTGTAG GTAGTTTGTC7151 CAATTATGTC ACACCACAGA AGTAAGGTTC CTTCACAAAG ATCCGGGACC7201 AAAGCGGCCA TCGTGCCTCC CCACTCCTGC AGTTCGGGGG CATGGATGCG7251 CGGATAGCCG CTGCTGGTTT CCTGGATGCC GACGGATTTG CACTGCCGGT7301 AGAACTCCGC GAGGTCGTCC AGCCTCAGGC AGCAGCTGAA CCAACTCGCG7351 AGGGGATCGA GCCCGGGGTG GGCGAAGAAC TCCAGCATGA GATCCCCGCG7401 CTGGAGGATC ATCCAGCCGG CGTCCCGGAA AACGATTCCG AAGCCCAACC7451 TTTCATAGAA GGCGGCGGTG GAATCGAAAT CTCGTGATGG CAGGTTGGGC7501 GTCGCTTGGT CGGTCATTTC GAACCCCAGA GTCCCGCTCA GAAGAACTCG7551 TCAAGAAGGC GATAGAAGGC GATGCGCTGC GAATCGGGAG CGGCGATACC7601 GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC TCTTCAGCAA7651 TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTCCTGAT AGCGGTCCGC CACACCCAGC7701 CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA CCATGATATT7751 CGGCAAGCAG GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG CCGTCGGGCA7801 TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG AACAGTTCGG CTGGCGCGAG CCCCTGATGC7851 TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA CCGGCTTCCA TCCGAGTACG7901 TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG CAGGTAGCCG
7951 GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT GGATACTTTC8001 TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG GCACTTCGCC8051 CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG AGCACAGCTG8101 CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC TGCCTCGTCC8151 TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA AAAGAACCGG8201 GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG CAGCCGATTG8251 TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA AGCGGCCGGA8301 GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATC ATGCGAAACG ATCCTCATCC8351 TGTCTCTTGA TCAGATCTTG ATCCCCTGCG CCATCAGATC CTTGGCGGCA8401 AGAAAGCCAT CCAGTTTACT TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC8451 GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT GTCCATAAAA CCGCCCAGTC8501 TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT CTCTTTGCGC8551 TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT8601 CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA8651 GCCCTTGCGC CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCTSEQ ID NO16表达载体HCMV-G1 HuAb-VHE的核苷酸序列(在3921-4274含有SEQ ID NO11(VHE)的人源化重链表达载体的完整DNA序列)1 AGCTTTTTGC AAAAGCCTAG GCCTCCAAAA AAGCCTCCTC ACTACTTCTG51 GAATAGCTCA GAGGCCGAGG CGGCCTCGGC CTCTGCATAA ATAAAAAAAA101 TTAGTCAGCC ATGGGGCGGA GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC151 GGGATGGGCG GAGTTAGGGG CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG201 CATGCTTTGC ATACTTCTGC CTGCTGGGGA GCCTGGTTGC TGACTAATTG251 AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT GGGGAGCCTG GGGACTTTCC301 ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG351 ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT401 CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG451 TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG501 GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG551 TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC601 CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT651 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT701 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC751 CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA801 TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA851 GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA901 AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT951 GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT1001 GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG1051 CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG1101 TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA
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4901 CAAAGAGCTT CAACAGGGGA GAGTGTTAGA GGGAGAAGTG CCCCCACCTG4951 CTCCTCAGTT CCAGCCTGAC CCCCTCCCAT CCTTTGGCCT CTGACCCTTT5001 TTCCACAGGG GACCTACCCC TATTGCGGTC CTCCAGCTCA TCTTTCACCT5051 CACCCCCCTC CTCCTCCTTG GCTTTAATTA TGCTAATGTT GGAGGAGAAT5101 GAATAAATAA AGTGAATCTT TGCACCTGTG GTTTCTCTCT TTCCTCATTT5151 AATAATTATT ATCTGTTGTT TACCAACTAC TCAATTTCTC TTATAAGGGA5201 CTAAATATGT AGTCATCCTA AGGCGCATAA CCATTTATAA AAATCATCCT5251 TCATTCTATT TTACCCTATC ATCCTCTGCA AGACAGTCCT CCCTCAAACC5301 CACAAGCCTT CTGTCCTCAC AGTCCCCTGG GCCATGGTAG GAGAGACTTG5351 CTTCCTTGTT TTCCCCTCCT CAGCAAGCCC TCATAGTCCT TTTTAAGGGT5401 GACAGGTCTT ACAGTCATAT ATCCTTTGAT TCAATTCCCT GAGAATCAAC5451 CAAAGCAAAT TTTTCAAAAG AAGAAACCTG CTATAAAGAG AATCATTCAT5501 TGCAACATGA TATAAAATAA CAACACAATA AAAGCAATTA AATAAACAAA5551 CAATAGGGAA ATGTTTAAGT TCATCATGGT ACTTAGACTT AATGGAATGT5601 CATGCCTTAT TTACATTTTT AAACAGGTAC TGAGGGACTC CTGTCTGCCA5651 AGGGCCGTAT TGAGTACTTT CCACAACCTA ATTTAATCCA CACTATACTG5701 TGAGATTAAA AACATTCATT AAAATGTTGC AAAGGTTCTA TAAAGCTGAG5751 AGACAAATAT ATTCTATAAC TCAGCAATCC CACTTCTAGA TGACTGAGTG5801 TCCCCACCCA CCAAAAAACT ATGCAAGAAT GTTCAAAGCA GCTTTATTTA5851 CAAAAGCCAA AAATTGGAAA TAGCCCGATT GTCCAACAAT AGAATGAGTT5901 ATTAAACTGT GGTATGTTTA TACATTAGAA TACCCAATGA GGAGAATTAA5951 CAAGCTACAA CTATACCTAC TCACACAGAT GAATCTCATA AAAATAATGT6001 TACATAAGAG AAACTCAATG CAAAAGATAT GTTCTGTATG TTTTCATCCA6051 TATAAAGTTC AAAACCAGGT AAAAATAAAG TTAGAAATTT GGATGGAAAT6101 TACTCTTAGC TGGGGGTGGG CGAGTTAGTG CCTGGGAGAA GACAAGAAGG6151 GGCTTCTGGG GTCTTGGTAA TGTTCTGTTC CTCGTGTGGG GTTGTGCAGT6201 TATGATCTGT GCACTGTTCT GTATACACAT TATGCTTCAA AATAACTTCA6251 CATAAAGAAC ATCTTATACC CAGTTAATAG ATAGAAGAGG AATAAGTAAT6301 AGGTCAAGAC CACGCAGCTG GTAAGTGGGG GGGCCTGGGA TCAAATAGCT6351 ACCTGCCTAA TCCTGCCCTC TTGAGCCCTG AATGAGTCTG CCTTCCAGGG6401 CTCAAGGTGC TCAACAAAAC AACAGGCCTG CTATTTTCCT GGCATCTGTG6451 CCCTGTTTGG CTAGCTAGGA GCACACATAC ATAGAAATTA AATGAAACAG6501 ACCTTCAGCA AGGGGACAGA GGACAGAATT AACCTTGCCC AGACACTGGA6551 AACCCATGTA TGAACACTCA CATGTTTGGG AAGGGGGAAG GGCACATGTA6601 AATGAGGACT CTTCCTCATT CTATGGGGCA CTCTGGCCCT GCCCCTCTCA6651 GCTACTCATC CATCCAACAC ACCTTTCTAA GTACCTCTCT CTGCCTACAC6701 TCTGAAGGGG TTCAGGAGTA ACTAACACAG CATCCCTTCC CTCAAATGAC6751 TGACAATCCC TTTGTCCTGC TTTGTTTTTC TTTCCAGTCA GTACTGGGAA6801 AGTGGGGAAG GACAGTCATG GAGAAACTAC ATAAGGAAGC ACCTTGCCCT6851 TCTGCCTCTT GAGAATGTTG ATGAGTATCA AATCTTTCAA ACTTTGGAGG6901 TTTGAGTAGG GGTGAGACTC AGTAATGTCC CTTCCAATGA CATGAACTTG6951 CTCACTCATC CCTGGGGGCC AAATTGAACA ATCAAAGGCA GGCATAATCC7001 AGCTATGAAT TCTAGGATCG ATCCAGACAT GATAAGATAC ATTGATGAGT7051 TTGGACAAAC CACAACTAGA ATGCAGTGAA AAAAATGCTT TATTTGTGAA7101 ATTTGTGATG CTATTGCTTT ATTTGTAACC ATTATAAGCT GCAATAAACA
7151 AGTTAACAAC AACAATTGCA TTCATTTTAT GTTTCAGGTT CAGGGGGAGG7201 TGTGGGAGGT TTTTTAAAGC AAGTAAAACC TCTACAAATG TGGTATGGCT7251 GATTATGATC TCTAGTCAAG GCACTATACA TCAAATATTC CTTATTAACC7301 CCTTTACAAA TTAAAAAGCT AAAGGTACAC AATTTTTGAG CATAGTTATT7351 AATAGCAGAC ACTCTATGCC TGTGTGGAGT AAGAAAAAAC AGTATGTTAT7401 GATTATAACT GTTATGCCTA CTTATAAAGG TTACAGAATA TTTTTCCATA7451 ATTTTCTTGT ATAGCAGTGC AGCTTTTTCC TTTGTGGTGT AAATAGCAAA7501 GCAAGCAAGA GTTCTATTAC TAAACACAGC ATGACTCAAA AAACTTAGCA7551 ATTCTGAAGG AAAGTCCTTG GGGTCTTCTA CCTTTCTCTT CTTTTTTGGA7601 GGAGTAGAAT GTTGAGAGTC AGCAGTAGCC TCATCATCAC TAGATGGCAT7651 TTCTTCTGAG CAAAACAGGT TTTCCTCATT AAAGGCATTC CACCACTGCT7701 CCCATTCATC AGTTCCATAG GTTGGAATCT AAAATACACA AACAATTAGA7751 ATCAGTAGTT TAACACATTA TACACTTAAA AATTTTATAT TTACCTTAGA7801 GCTTTAAATC TCTGTAGGTA GTTTGTCCAA TTATGTCACA CCACAGAAGT7851 AAGGTTCCTT CACAAAGATC CGGGACCAAA GCGGCCATCG TGCCTCCCCA7901 CTCCTGCAGT TCGGGGGCAT GGATGCGCGG ATAGCCGCTG CTGGTTTCCT7951 GGATGCCGAC GGATTTGCAC TGCCGGTAGA ACTCCGCGAG GTCGTCCAGC8001 CTCAGGCAGC AGCTGAACCA ACTCGCGAGG GGATCGAGCC CGGGGTGGGC8051 GAAGAACTCC AGCATGAGAT CCCCGCGCTG GAGGATCATC CAGCCGGCGT8101 CCCGGAAAAC GATTCCGAAG CCCAACCTTT CATAGAAGGC GGCGGTGGAA8151 TCGAAATCTC GTGATGGCAG GTTGGGCGTC GCTTGGTCGG TCATTTCGAA8201 CCCCAGAGTC CCGCTCAGAA GAACTCGTCA AGAAGGCGAT AGAAGGCGAT8251 GCGCTGCGAA TCGGGAGCGG CGATACCGTA AAGCACGAGG AAGCGGTCAG8301 CCCATTCGCC GCCAAGCTCT TCAGCAATAT CACGGGTAGC CAACGCTATG8351 TCCTGATAGC GGTCCGCCAC ACCCAGCCGG CCACAGTCGA TGAATCCAGA8401 AAAGCGGCCA TTTTCCACCA TGATATTCGG CAAGCAGGCA TCGCCATGGG8451 TCACGACGAG ATCCTCGCCG TCGGGCATGC GCGCCTTGAG CCTGGCGAAC8501 AGTTCGGCTG GCGCGAGCCC CTGATGCTCT TCGTCCAGAT CATCCTGATC8551 GACAAGACCG GCTTCCATCC GAGTACGTGC TCGCTCGATG CGATGTTTCG8601 CTTGGTGGTC GAATGGGCAG GTAGCCGGAT CAAGCGTATG CAGCCGCCGC8651 ATTGCATCAG CCATGATGGA TACTTTCTCG GCAGGAGCAA GGTGAGATGA8701 CAGGAGATCC TGCCCCGGCA CTTCGCCCAA TAGCAGCCAG TCCCTTCCCG8751 CTTCAGTGAC AACGTCGAGC ACAGCTGCGC AAGGAACGCC CGTCGTGGCC8801 AGCCACGATA GCCGCGCTGC CTCGTCCTGC AGTTCATTCA GGGCACCGGA8851 CAGGTCGGTC TTGACAAAAA GAACCGGGCG CCCCTGCGCT GACAGCCGGA8901 ACACGGCGGC ATCAGAGCAG CCGATTGTCT GTTGTGCCCA GTCATAGCCG8951 AATAGCCTCT CCACCCAAGC GGCCGGAGAA CCTGCGTGCA ATCCATCTTG9001 TTCAATCATG CGAAACGATC CTCATCCTGT CTCTTGATCA GATCTTGATC9051 CCCTGCGCCA TCAGATCCTT GGCGGCAAGA AAGCCATCCA GTTTACTTTG9101 CAGGGCTTCC CAACCTTACC AGAGGGCGCC CCAGCTGGCA ATTCCGGTTC9151 GCTTGCTGTC CATAAAACCG CCCAGTCTAG CTATCGCCAT GTAAGCCCAC9201 TGCAAGCTAC CTGCTTTCTC TTTGCGCTTG CGTTTTCCCT TGTCCAGATA9251 GCCCAGTAGC TGACATTCAT CCGGGGTCAG CACCGTTTCT GCGGACTGGC9301 TTTCTACGTG TTCCGCTTCC TTTAGCAGCC CTTGCGCCCT GAGTGCTTGC9351 GGCAGCGTGA AG
权利要求
1.含有至少一个抗原结合位点的结合分子，其顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)。
2.根据权利要求1的结合分子，其含有a)顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列Asn-Tyr-Ile-Ile-His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr(SGPYAWFDT)；以及b)顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二结构域，CDR1′具有氨基酸序列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln(RASQNIGTSIQ)，CDR2′具有氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr(QQSNTWPFT)。
3.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其是嵌合或人源化单克隆抗体。
4.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其含有多肽SEQ ID NO1和/或多肽SEQ ID NO2。
5.根据权利要求1或2任一项的结合分子，其含有多肽SEQ ID NO3和/或多肽SEQ ID NO4。
6.根据权利要求4或5任一项的结合分子，其是嵌合单克隆抗体。
7.结合分子，其是含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的多肽和SEQID NO7或SEQ ID NO8的多肽的人源化抗体。
8.结合分子，其是人源化抗体，含有-多肽SEQ ID NO9和多肽SEQ ID NO7，-多肽SEQ ID NO9和多肽SEQ ID NO8，-多肽SEQ ID NO10和多肽SEQ ID NO7，或-多肽SEQ ID NO10和多肽SEQ ID NO8。
9.分离的多核苷酸，其含有编码根据权利要求1到8任一项的结合分子的多核苷酸。
10.根据权利要求9的多核苷酸，其编码根据权利要求2的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；和/或编码根据权利要求2的CDR1′、CDR2′和CDR3′的氨基酸序列。
11.多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO5和/或多核苷酸SEQ IDNO6。
12.多核苷酸，其含有编码多肽SEQ ID NO7或SEQ ID NO8和多肽SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的多核苷酸。
13.多核苷酸，其含有多核苷酸SEQ ID NO11或SEQ ID NO12和多核苷酸SEQ ID NO13或多核苷酸SEQ ID NO14。
14.含有根据权利要求9到13任一项的多核苷酸的表达载体。
15.含有根据权利要求9到13任一项的多核苷酸的表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能产生权利要求1到8任一项的多肽。
16.含有根据权利要求15的表达系统的分离的宿主细胞。
17.根据权利要求1到8任一项的分子或人源化抗体作为药物的用途。
18.根据权利要求17的用途，用于治疗和/或预防自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症。
19.药物组合物，其含有根据权利要求1到8任一项的分子或人源化抗体以及至少一个可药用载体或稀释剂。
20.与自身免疫疾病、移植排斥、牛皮癣、炎症性肠病和过敏症有关的疾病的治疗和/或预防方法，包括给需要此治疗和/或预防的对象施用有效量的根据权利要求1到8任一项的分子或人源化抗体。
21.对CD45RO和CD45RB两者有结合特异性的结合分子在医药中的用途。
22.根据权利要求21的用途，其中结合分子是嵌合的、人源化的或完全人的单克隆抗体。
23.根据权利要求21或22的用途，其中结合分子与CD45RO同种型结合，解离常数(Kd)＜15nM。
24.根据权利要求21到23任一项的用途，其中结合分子与CD45RB同种型结合，解离常数(Kd)＜15nM。
25.根据权利要求21到24任一项的用途，其中结合分子结合如下CD45同种型，所述CD45同种型-包括CD45分子的A和B表位，但不包括C表位；和/或-包括CD45分子的B表位，但不包括A和C表位；和/或-不包括CD45分子的A、B和C表位的任一个。
26.根据权利要求21到25任一项的用途，其中结合分子不结合如下CD45同种型，所述CD45同种型-包括CD45分子的A、B和C表位的所有；和/或-包括CD45分子的B和C表位，但不包括A表位。
27.根据权利要求21到26任一项的用途，其中结合分子可以与PEER细胞上其靶表位结合，其中所述结合的Kd＜15nM。
全文摘要
本发明公开了含有至少一个抗原结合位点的分子，其顺次含有高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列Asn－Tyr－Ile－Ile－His(NYIIH)，所述CDR2具有氨基酸序列Tyr－Phe－Asn－Pro－Tyr－Asn－His－Gly－Thr－Lys－Tyr－Asn－Glu－Lys－Phe－Lys－Gly(YFNPYNHGTKYNEKFKG)，所述CDR3具有氨基酸序列Ser－Gly－Pro－Tyr－Ala－Trp－Phe－Asp－Thr(SGPYAWFDT);例如还顺次含有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′,CDR1′具有氨基酸序列Arg－Ala－Ser－Gln－Asn－Ile－Gly－Thr－Ser－Ile－Gln(RASQNIGTSIQ),CDR2′具有氨基酸序列Ser－Ser－Ser－Glu－Ser－Ile－Ser(SSSESIS)，CDR3′具有氨基酸序列Gln－Gln－Ser－Asn－Thr－Trp－Pro－Phe－Thr(QQSNTWPFT)；所述分子为例如嵌合或人源化抗体并可以用作药物。
文档编号A61P17/00GK1551919SQ02804785
公开日2004年12月1日 申请日期2002年2月11日 优先权日2001年2月12日
发明者G·阿韦尔萨, F·科尔宾格, J·M·卡瓦利多埃雷拉, A·奥索迪, J·W·塞尔丹哈, B·M·哈尔, G 阿韦尔萨, 卡瓦利多埃雷拉, 哈尔, 塞尔丹哈, 鞯, 龈 申请人:诺瓦提斯公司