专利名称：传染性和减毒的牛病毒性腹泻病毒克隆,其产生方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于动物健康的领域特别是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)领域。本发明提供传染性BVDV克隆和产生所述BVDV克隆的方法。本发明还涉及使所述克隆减毒的方法、减毒BVDV克隆和包括所述减毒克隆的疫苗。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛中BVD和粘膜病的病原体(Baker，1987；Moennig和Plagemann，1992；Thiel等人，1996)。妊娠期的胎牛感染可导致胎牛重吸收、流产以及持续感染BVDV的免疫耐受性小牛的出生。这些小牛缺乏或具有非常低的中和抗体滴度，并不断泄出大量病毒。仅次于急性感染牛，这些小牛是主要的病毒传播源，因此在这种疾病流行病学上非常重要。BVD的主要经济影响来自高流产率、死产、胎牛重吸收、干尸化、先天性畸形和虚弱并小于通常的小牛的出生。至于发病机理的详细评论，可参考Moennig和Liess 1995年的论文。
已描述了二种主要的BVDV抗原组(1和2型)(Becher等人，1999)，它们表现出有限的交叉中和抗体反应(Ridpath等人，1994)。用于BVDV感染预防和治疗的现有疫苗还存在不足(Oirschot等人，1999)。抗典型BVDV 1型的疫苗只对2型感染提供部分保护，而且接种疫苗的母畜可能生产持久感染有毒性的BVDV 2型的小牛(Bolin等人，1991，Ridpath等人，1994)。这个问题可能是由于1型和2型株间的巨大抗原差异性造成的，其主要体现在糖蛋白E2主要抗原中(Tijssen等人，1996)大多数抗1型株的单克隆抗体不能与2型病毒结合(Ridpath等人，1994)。
灭活疫苗(全部病毒失活)或亚单位疫苗(按常规纯化或异种表达的纯化病毒蛋白)在其产生全面保护免疫应答的效力上总是次于活疫苗，即使在有佐剂的情况下。
活BVDV疫苗，即使减毒的，也总是存在安全问题。如上述，它们穿过怀孕母牛的胎盘并导致胎牛临床症状和/或诱发持续感染的小牛。因此，它们不能用于包括怀孕母牛的繁殖畜群。必须使怀孕母牛同接种疫苗的牛分开以保护胎牛，并且它们自身不能接种疫苗。此外，减毒的活BVDV的回复体对牛造成严重威胁。对其中通过常规的多次传代而获得减毒的常规衍生的减毒病毒，减毒的分子源和基因稳定性仍是未知的，并且回复到有毒性的野生型也是不可预测的。
具有特定突变作为减毒基础的活疫苗将克服目前这代减毒疫苗的缺陷。所述减毒突变的另一个优点在于其特定分子唯一性，可使用其作为减毒瘟疫病毒的区别标记以将其和本领域的瘟疫病毒区分。
在现有技术中，很难了解类似于野生型病毒的特定遗传同一性的BVDV，特别是2型BVDV。在现有技术中，一直需要产生这种BVDV的方法。因此，本发明下面的技术问题是提供具有特定遗传同一性的BVDV，特别是BVDV 2型。
图1.感染性cDNA克隆的构建。上部显示了BVDV基因组(kB)和编码的多蛋白。中部显示了用于设计感染性cDNA克隆的cDNA克隆(白)、RT-PCR产物(淡灰)和PCR产物(暗灰)，下部描绘了基因组cDNA序列端(加下划线)和在5′与3′端增加的体外转录用序列。
图2重组病毒XIKE-A和野生型BVDV分离物VLS#399的生长曲线。用0.1m.o.i病毒感染MDBK细胞，并通过在指示时间点冷冻和解冻来收获。新MDBK细胞在感染后72小时通过免疫荧光染色测定滴度。
图3重组病毒XIKE-A和Erns突变体XIKE-B(H349Δ)和XIKE-C(H300L)的生长曲线。用0.1m.o.i病毒感染MDBK细胞，并通过在指示时间点冷冻和解冻来收获。新MDBK细胞感染72小时后通过免疫荧光染色测定滴度。
图4重组病毒XIKE-A(野生型序列)、XIKE-B(H349Δ)和XIKE-C(H300L)的RNAse活性的测定，并与各种病毒感染的MDBK细胞的粗细胞提取物中的野生型株new York‘93/C的比较。未被感染的MDBK细胞作为阴性对照(n.i.)。通过测量作为小RNA片段释放到上清液的标记的OD260来测定聚(U)的酶解。
图5.用New York‘93/C(动物#275、#612和#1610，虚线)或XIKE-A(动物#615、#377和#091，实线)感染的动物的体温。
图6.用New York‘93/C(动物#275、#612和#1610，虚线)或XIKE-A(动物#615、#377和#091，实线)感染的动物的白细胞(WBC)计数。
图7.用XIKE-A(动物#387、#388和#418，虚线)或XIKE-B(动物#415、#417和#419，实线)感染的动物的体温。
图8.用XIKE-A(动物#387、#388和#418，虚线)或XIKE-B(动物#415、#417和#419，实线)感染的动物的白细胞(WBC)计数。
发明内容
说明书中使用术语的定义在本发明实施前，必须说明这里和所附权利要求中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用，除非文中另外清楚指明。因此，例如，引用“aBVDV病毒”包括多个这种BVDV病毒，引用“细胞”是指一个或多个细胞和本领域那些熟练技术人员已知的其等同物，等等。除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的意义相同。尽管与这里描述的类似或等同的任何方法和材料都可在本发明的实践或实验中可使用，但现在描述优选的方法、设备和材料。这里提及的所有出版物以引用方式结合于本文，用于描述和揭示出版物中所报道的可与本发明结合使用的细胞系、载体和方法。这里的任何东西都不应被认为是承认本发明没有权利根据已有发明提前进行这种公开。
这里使用的术语“BVDV”是指属于黄病毒科瘟病毒属中BVDV 1和BVDV 2种的所有病毒(Becher等人，1999)。较典型的BVDV 1型株和最近认识的BVDV 2型株在核苷酸和氨基酸序列中表现出某些有限但明显的差异。
“克隆”为DNA载体或已引入这种载体的宿主细胞株。优选地，DNA载体为质粒。
“感染性克隆”为能用作转录为RNA的模板的DNA载体，其中当RNA被引入到易感染细胞时能诱导病毒的产生。优选通过体外转录产生RNA，并通过熟练技术人员已知的转染技术将其引入细胞内。
这里使用的“BVDV粒子”或“病毒粒子”是指通过RNA由“感染性克隆”产生的BVD病毒，其中当RNA被引入到易感染细胞时能诱导所述BVDV粒子的产生。
这里使用的“减毒BVDV粒子”或“减毒病毒粒子”是指通过根据本发明的方法(见下文)减毒的BVDV粒子。
“感染性”为病毒或病毒粒子在噬斑试验中诱导一定量噬斑的能力或在终点试验中诱导一定TClD50数(score)的能力。
全长RNA为包括至少98％RNA序列出现于野生型分离物中的RNA。全长互补DNA为包括序列与至少98％出现于野生型分离物中的RNA互补的DNA。
这里所使用的“小牛”是指六月龄或更小的牛属动物。
毒性这里使用的“真实毒性(authentic virulence)”是指对于至少一种主要临床参数，在根据本发明的感染性BVDV粒子和野生型BVDV分离物的毒性间没有统计上的显著差异，其中由分离物得到的包含核苷酸序列与BVDV RNA优选2型RNA互补的所述DNA分子。这些主要临床参数的例子为腹泻、发热和/或致死率。
减毒这里使用的“减毒BVDV粒子”是指对于用同样剂量优选6×106TCID50感染的动物中的主要临床参数腹泻、发热和致死率，在根据本发明的减毒BVDV粒子和衍生所述减毒BVDV粒子的野生型BVDV分离物的毒性间有统计上的显著差异，所述减毒BVDV粒子通过根据本发明的方法减毒。因此，所述减毒BVDV粒子不会引起腹泻、发热和致命性，并因此可用于疫苗。
这里使用的“RACE”是指cDNA末端快速扩增，正如现有技术中已知的(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1988，858998-9002)。
这里使用的“易感染细胞”为可用BVD病毒感染或用BVDV RNA转染的细胞，其中当将所述病毒或RNA引入所述易感染细胞时，能诱发感染性BVDV的产生。
根据本发明的“片段”为根据本发明的DNA分子或感染性BVDV克隆的任何亚单位，即任何子集，特征在于它是通过比公开的仍能转录成RNA的核酸分子更短的核酸分子编码而成。
根据本发明的DNA分子或感染性BVDV克隆的“功能性变异体”为具有与根据本发明的DNA分子或感染性BVDV克隆基本类似的生物活性(功能或结构上)的DNA分子或感染性BVDV克隆。术语“功能性变异体”还包括“片段”、“功能性变异体”、“基于退化核酸密码的变异体”或“化学衍生物”。这类“功能性变异体”例如可带有一个或几个核酸交换、缺失或插入。所述交换、缺失或插入可占整个序列的10％。所述功能性变异体至少部分保留其生物活性，如起感染性克隆或疫苗株的作用，或甚至呈现提高的生物活性。
“基于遗传密码的退化特性的变异体”为源于这样事实的变异体，即可通过几个不同核苷酸三联体(triplett)编码特定氨基酸。所述变异体至少部分保留其生物活性，或甚至呈现提高的生物活性。
“融合分子”(fusion molecule)可为根据本发明的融合到例如指导分子(reporter)如放射性标记、化学分子如荧光标记或现有技术中已知任何其它分子中的DNA分子或感染性BVDV克隆。
这里所使用的根据本发明的“化学衍生物”为根据本发明的经化学修饰或包含通常不是分子一部分的另外化学单元的DNA分子或感染性BVDV克隆。这种部分可提高分子可溶性、吸收性、生物半衰期等。
如果二个分子具有基本类似的核苷酸序列或生物活性，则称一个分子为“基本类似”于另一个分子。因此，所提出的二个分子具有类似活性，如果其核苷酸序列不同，则认为它们是变异体，其含义同这里所用术语，即使它们的生物活性不同而二个具有类似核苷酸序列的分子则认为为变异体，其含义同这里所用术语。
这里使用的术语“疫苗”是指包括至少一种能诱导动物免疫应答的免疫活性组分和可能但不一定必需的一种或多种能提高所述活性组分免疫活性的另外组分的药物组合物。疫苗可另外包括更多的典型组分到药物组合物中。疫苗中的免疫活性组分可包括原始形式的或作为所谓修饰活疫苗(MLV)中减毒粒子的完整病毒粒子，或在所谓灭活疫苗(KV)中通过适当方法灭活的粒子。在另外形式中，疫苗的免疫活性组分可包括所述有机体(亚单位疫苗)的适当成分，从而可通过破坏整个粒子或包含这些粒子的生长培养液和可任选的产生所需结构的后续纯化步骤来产生这些成分，或通过包括利用基于如细菌、昆虫、哺乳动物或其它物种的合适的系统的适宜操作加上可任选的后续分离和纯化步骤的合成过程，或通过使用合适药物组合物(聚核苷酸接种疫苗)直接结合遗传物质在需要疫苗的动物中诱导所述合成过程而产生这些成分。疫苗可包括一种或同时超过一种的上述成分。
这里理解的术语“疫苗”为包括抗原物质的兽医用疫苗，其施用是为了诱导对抗因BVDV引起疾病的特异性和主动免疫。根据本发明的BVDV克隆提供主动免疫，其可通过对抗它包含的免疫原和有时还对抗抗原性相关的生物体的母体抗体而被动转移。
提高免疫应答的另外组分为通常提到的佐剂成分，例如氢氧化铝、矿物或其它油，或加入到疫苗中的辅助分子，或通过因这些附加组分，类似的但不限制于干扰素、白细胞间介素或生长因子而分别诱导后的躯体所产生的辅助分子。
“药物组合物”基本由一种或多种能生理学修饰的组分如接受给药的生物体、生活在生物体中或生活在生物体上的生物体的免疫功能的组分。这个术语包括但不限于抗生素或抗寄虫药，以及其它常用成分，以达到特定的其它目的如，但不限于，处理特性(processing traits)，不育症，稳定性，通过肠或肠道外途径如口、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内或其它适当途径施用组合物的可行性，用药后的耐受性，受控制的释放特性。
发明内容
通过说明书和以权利要求为特征的实施方案实现了上述技术问题的解决。
已克服了现有技术中长久以来对具有与毒性相关的所定义的序列和特异性的活BVDV(牛病毒性腹泻病毒)长期持久的需要。它可用于产生如疫苗中的特异性减毒BVDV。发明人首次提供一种产生具有定义的遗传同一性并同时具有类似于野生型病毒病原性的感染性克隆及由其衍生的感染性BVDV粒子的方法。此外，发明人首次公开感染性2型克隆及其衍生的感染性2型BVDV粒子。第三，发明了具有所定义序列的活感染性BVDV粒子，发明人还发明了产生具有遗传同一性的减毒BVDV粒子的方法，它可通过只在一个特定遗传标记位点修饰来减毒。本发明可在基因组修饰和减毒间产生因果联系，这对理解减毒功能机理是必需的，并因此有助于评价用作疫苗的质量。
在第一个重要实施方案中，本发明涉及包含与BVDV RNA互补的核苷酸序列的DNA分子，其中当将所述RNA引入易感染宿主细胞时，能诱导产生感染性BVDV粒子a)当用6×106TCID50剂量感染时，具有诱发小牛病毒血症和白血球减少症持续至少一天时间和下列包括腹泻和/或发热中的至少一种临床症状持续至少一天的能力。
b)与衍生这种DNA分子的野生型BVDV分离物相比，具有上述的真实毒性；和/或c)当用这种粒子以6×106TCID50剂量感染BVDV首次用于实验(naive)的小牛时，在21天时间内使这些小牛中至少30％致死；和/或d)具有不少于90％的包含一个与SEQ ID NO.1互补的序列的RNA的BVDV粒子毒性；和/或e)包括与SEQ ID NO.1互补的序列。
阶段a)中的所述剂量6×106TCID50优选按照2×106肌内(臀肌)、2×106鼻内(intranaseally)和2×106皮下(肩胛骨上)施用得到总剂量6×106。优选应在至少三分之二的所有被感染动物中观察到阶段a)中的所述临床症状。阶段a)中的所述白血球减少症优选在至少连续两天内减少到低于基准至少35％，其中“基准”是指感染前10天所有动物的平均值。腹泻是BVDV感染的典型症状。
优选地，在根据本发明的上述DNA分子中，阶段a)中的发热为至少40℃。
在第二种重要实施方式中，本发明涉及能用作模板转录为RNA的感染性BVDV克隆，其中当将所述RNA引入易感染宿主细胞时，能诱导产生感染性BVDV粒子f)当用6×106TCID50剂量感染时，具有诱发小牛病毒血症和白血球减少症持续至少一天时间和下列包括腹泻和/或发热中的至少一种临床症状持续至少一天的能力；和/或g)与衍生这种DNA分子的野生型BVDV分离物相比，具有真实毒性；和/或h)当用这种粒子以6×106TCID50剂量感染3-6月龄BVDV首次用于试验的小牛时，在感染后21天时间内这些小牛中的至少30％致死；和/或i)具有不少于90％包含一个与SEQ ID NO.1互补序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或j)包括与SEQ ID NO.1互补的序列。
阶段f)中的所述剂量6×106TCID50优选按照2×106肌内(臀肌)、2×106鼻内和2×106皮下(肩胛骨上)施用得到总剂量6×106。优选应在至少三分之二的所有被感染动物中观察到阶段a)中的所述临床症状。阶段f)中的所述白血球减少症优选在至少连续两天内减少到低于基准至少35％，其中“基准”是指感染前10天所有动物的平均值。
所述感染性BVDV克隆优选为1型或2型克隆。
重要的是所述感染性BVDV克隆具有真实毒性，用于构建这种克隆的病毒源优选直接从现场(field)分离而获得，或将其再转移到动物，然后从临床症状最严重的动物上再分离，并随后在细胞培养中传代不超过二次，优选一次或没有。实施例(实施例1)举例说明了这些。实施例说明了病毒NY93/C的cDNA克隆，即在几次细胞培养传代后将NY93/C再转移到牛属动物，再次分离，并在再次分离病毒不超过二次细胞培养传代后用于RNA制备和cDNA克隆。
本发明另一个重要的实施方式为，通过使用根据本发明的DNA分子或BVDV克隆转录、使用所述RNA转染合适细胞或细胞系和收集由所述细胞产生得到的BVDV粒子来产生BVDV粒子。还有另一个实施方式为，通过克隆根据本发明的DNA分子或BVDV克隆成为适当DNA病毒基因组、然后感染适当细胞导致产生由所述细胞产生的BVDV粒子，其中这些DNA病毒为熟练技术人员所知。也优选的是，可将根据本发明的DNA或感染性克隆转染到随后能制造RNA的适当细胞，如van Gennip等人(1999)揭示的能稳定表达T7聚合酶典型猪发热病毒(CSFV)的细胞。也优选的是可在真核细胞中在真核启动子的控制下表达根据本发明的DNA或感染性克隆，导致产生能从细胞中分泌的感染性BVDV粒子(如V.Racaniello和D.Baltimore证实的脊髓灰质炎病毒(1981))。
本发明一个非常重要的实施方式为感染性BVDV 2型克隆。
优选地，所述感染性BVDV 2型克隆能作为转录成RNA的模板，其中当将所述RNA引入易感染宿主细胞时，它能诱导产生感染性BVDV粒子k)当用6×106TCID50剂量感染时，具有诱发小牛病毒血症和白血球减少症持续至少一天时间和下列包括腹泻和/或发热中的至少一种临床症状持续至少一天的能力；和/或l)与衍生这种DNA分子的野生型BVDV分离物相比，具有真实毒性；和/或m)当用这种粒子以6×106TCID50剂量感染3-6月龄BVDV首次用于试验的小牛时，在感染后21天时间内这些小牛中的至少30％致死；和/或n)具有不少于90％包含与SEQ ID NO.1互补的序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或o)包括与SEQ ID NO.1互补的序列。
优选地，本发明涉及可通过以下列步骤为特征的方法获得的BVDV 2型克隆。
aaa)分离野生型BVDV 2型株；bbb)在细胞培养中传代所述野生型BVDV 2型株；ccc)用所述细胞培养传代的BVDV 2型株感染牛属动物，并从感染最严重的动物中再分离出BVDV株；ddd)在细胞培养中，使所述再分离BVDV 2型株传代不超过2次，优选1次；eee)反转录并克隆所述再分离BVDV 2型株，产生全长cDNA克隆，优选使用RACE方法克隆5′和3′端。
然后在适当条件下将所述感染性DNA克隆转录成RNA，将所述RNA引入到合适细胞或细胞系，并收集得到的BVDV 2型粒子。
在非限制性实施例1中举例说明了这种克隆，特征为cDNA序列SEQ IDNO.1。因此，优选实施方式涉及根据本发明的特征为DNA序列SEQ ID NO.1的感染性BVDV 2型克隆或其片段、功能性变异体、基于退化核酸密码的变异体、融合分子或其化学衍生物。实施例1提供了非限制性实施例。
本发明还涉及通过根据本发明的BVDV克隆的体外转录成RNA、用所述RNA转染合适细胞或细胞系并收集由所述细胞产生得到的BVDV粒子而产生的BVDV 2型粒子。也优选地，可将根据本发明的DNA或感染性克隆转染到随后能产生RNA的适当细胞，如van Gennip等人(1999)公开的典型猪发热病毒(CSFV)，因为这些细胞能稳定表达T7聚合酶。也优选地可在真核细胞中在真核启动子的控制下表达根据本发明的DNA或感染性克隆，导致产生能从细胞中分泌的感染性BVDV粒子(如V.Racaniello和D.Baltimore证实的脊髓灰质炎病毒(1981))。
本发明另一个非常重要的方面为包含与全长BVDV 2型RNA互补的核苷酸序列的DNA分子。优选地，所述DNA分子的特征为序列SEQ ID NO.1。因此，本发明还涉及根据本发明的特征为SEQ ID NO.1的DNA分子或其片段、功能性变异体、基于退化核酸密码的变异体，融合分子或其化学衍生物。
实施例1提供了非限制性实施例。
更优选地，本发明涉及根据本发明、包括特征为SEQ ID NO.1的序列组成的DNA分子。
本发明还涉及与根据本发明上述DNA分子或根据本发明上述BVDV克隆互补的RNA分子。
本发明还涉及可通过根据本发明上述DNA分子或根据本发明上述BVDV克隆转录得到的RNA分子。
本发明另一个重要的方面为由野生型BVDV分离物制备感染性BVDV克隆的方法，与所述野生型分离物相比，与RNA互补的所述BVDV克隆具有真实毒性，该方法包括步骤p)从感染动物中分离病毒粒子；优选在合适细胞培养细胞中传代不超过2次；q)由病毒粒子制备RNA；r)在RNA反转录后产生全长互补DNA；其中反转录包括在足够的高温下切断或减少RNA二级结构的步骤，并在这个步骤中使用热稳定酶，所述酶在这些高温下具有活性；s)在合适细胞感染时将互补DNA(cDNA)结合到质粒载体上或结合到能引导BVDV cDNA转录成RNA的DNA病毒上。
优选在病毒血症(阶段k))期间分离所述病毒粒子。可优选通过组装重叠部分cDNA片段产生步骤m)中的全长互补DNA(cDNA)(也参见实施例1)。
另一优选实施方式涉及由野生型BVDV分离物制备感染性BVDV克隆的方法，与所述野生型分离物相比，与RNA互补的所述感染性BVDV克隆具有真实毒性，该方法包括步骤ppp)从病毒血症期间的感染动物细胞中或可任选地在杀死所述动物后从其器官中分离RNA；qqq)优选由RNA反转录后的DNA片段组装产生全长互补BVDVDNA；其中反转录包括在足够的高温下切断或减少RNA二级结构的步骤，并在这个步骤中使用热稳定酶，所述酶在这些高温下具有活性；rrr)在合适细胞感染时将互补DNA(cDNA)结合到质粒载体上或结合到能引导BVDV cDNA转录成RNA的DNA病毒上。
合适的细胞培养用细胞为Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、RD(牛睾丸)细胞或牛鼻甲骨(BT)细胞。还有本领域技术人员所知的合适细胞。
通过根据本发明方法制备的感染性克隆为1型克隆或优选2型克隆。
本发明另一个重要方面为由野生型BVDV分离物制备感染性BVDV克隆的方法，与RNA互补的所述感染性BVDV克隆具有不少于所述野生型分离物90％的毒性，该方法包括步骤t)从感染动物中分离病毒粒子；u)在合适细胞培养细胞中传代不超过2次；优选1次或没有；v)由病毒粒子制备RNA；w)在RNA反转录后产生全长互补DNA；其中反转录包括在足够的高温下切断或减少RNA二级结构的步骤，并在这个步骤中使用热稳定酶，所述酶在这些高温下具有活性；x)在合适细胞感染时将互补DNA(cDNA)结合到质粒载体上或结合到能引导BVDV cDNA转录成RNA的DNA病毒上。
优选在病毒血症(步骤t))期间分离所述病毒粒子。可优选通过组装重叠部分cDNA片段而产生步骤x)中的全长互补DNA(cDNA)(也参见实施例1)。
在现有技术中，克隆感染性BVDV的5′和3′区存在特殊困难。本发明人开发了创造性的方法以获得真实的5′和3′区。令人惊奇地是，通过应用RACE方法是可能的。但是，只是由本发明人对这方法的改进才导致令人惊奇和预料不到的产生真实毒性的BVDV克隆。优选地，本发明涉及根据本发明的方法，其中使用RACE产生RNA的5′端。令人惊奇地是，只有通过使用结合热稳定聚合酶的RACE方法才可能成功地溶解基因组的二级结构。
标准分子生物学方法为熟练技术人员所已知，并也可在如Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York和Bertram，S.和Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)中找到。
优选地，本发明涉及根据本发明的方法，其中在具有允许反应温度至少为48℃、优选为50-55℃、还优选56-60℃的热稳定聚合酶存在的情况下实施RACE。
在发明了具有所定义序列的活感染性BVDV粒子的同时，本发明人还发明了产生具有所定义遗传同一性并优选只在一个特定遗传标记位点减毒的减毒BVDV粒子的方法。这能令人惊奇地允许简单确定回复体或成功的减毒，因为只有存在遗传标记位点需要通过熟练技术人员已知的分子生物学方法进行测定。实施例1中的XIKE-B和XI4KE-C是用于这种具有所定义序列的减毒BVDV粒子的非限制性实例。
本发明的另一个重要方面为通过向本发明上述DNA分子或上述的感染性BVDV克隆中引入一个或多个突变而实现BVD病毒减毒的方法，其中所述一个突变或多个突变导致或增加复原BVD病毒的减毒表型。
本发明的再一个重要方面为BVDV株的减毒方法，该方法包括步骤y)向根据本发明的上述DNA分子中或根据本发明的上述感染性BVDV克隆中引入一个或多个突变；z)将突变DNA引入易感染宿主细胞，其中所述DNA被转录成RNA，或将从所述DNA转录的RNA引入所述细胞；和aa)收集由这些细胞产生的病毒粒子；其中所述一个突变或多个突变引起减毒。
本发明的一个优选方面为根据本发明上述的减毒方法，其中一个突变或多个突变为核苷酸替换、缺失、插入、增加或其组合。
根据本发明，“突变”是指由另外一个核苷酸取代一个核苷酸(如C替换T)即所谓“替换”或任何其它突变如“缺失”或“插入”。“缺失”是指除去一个或几个核苷酸或氨基酸。
由于根据本发明的这些感染性BVDV克隆为非常类似于野生型病毒的真实毒性并同时具有所定义基因型的病毒，所以在动物实验中必须使用所述病毒作为阳性对照。所述感染性克隆是用于产生用于如疫苗的特异性减毒BVDV克隆的极好工具。本发明包括其中存在于糖蛋白ERNS中的RNase活性失活的BVDV克隆。优选地，通过缺失或和/或其它突变如替换使所述RNAse活性失活。优选地，所述失活和/或其它突变位于在295-307位置和/或在338-357位置的氨基酸。
因此，本发明更优选的方面为根据本发明的减毒方法，其中一个突变或多个突变是在糖蛋白Erns中，并导致突变蛋白功能损害或丧失。
本发明更优选的方面为根据本发明的减毒方法，其中突变包括bb)全部或部分糖蛋白Erns的缺失；和/或
cc)SEQ ID NO.1中在300位置的组氨酸的缺失或替换；和/或dd)SEQ ID NO.1中在349位置的组氨酸的缺失或替换。
最优选地，还有一个重要实施方式是用于BVDV的减毒方法，包括根据本发明的BVDV克隆在300位置和/或349位置的组氨酸的突变，其中编码三联体缺失或被替换。
还一个重要实施方式为用于根据本发明的BVDV的减毒方法，其中亮氨酸密码子取代了组氨酸300的密码子。
还一个重要实施方式为用于根据本发明的BVDV的减毒方法，其中组氨酸349密码子缺失。
本发明另一个重要实施方式为通过本发明方法可得到的减毒BVDV克隆或BVDV株。
本发明另一个重要实施方式为包含根据本发明的减毒BVDV克隆或株的疫苗，可任选地与药物可接受载体或赋形剂组合。
本发明还涉及根据本发明的减毒BVDV克隆或株在预防和治疗BVDV感染用疫苗生产中的应用。
优选地，本发明的疫苗是指如上面所定义的疫苗，其中一种免疫活性组分为活BVDV，其中其蛋白质ERNS中的RNase活性是失活的。术语“活疫苗”是指包括能复制尤其是复制活性病毒组分的粒子的疫苗。
优选地，根据本发明的疫苗包括根据本发明的减毒BVD病毒1型、并结合根据本发明的减毒BVD病毒2型或任何其它抗原组和药物可接受载体或赋形剂。所述疫苗可作为联合疫苗施用。更优选地，可首先施用根据本发明的所述减毒BVD病毒1型，然后在3-4周后施用根据本发明的减毒BVD病毒2型。
优选地，根据本发明的疫苗包括根据本发明的其中蛋白质ERNS中的RNase活性是失活的减毒BVD病毒1型，并结合根据本发明的其中蛋白质ERNS中的RNase活性是失活的减毒BVD病毒2型，或任何其它其中蛋白质ERNS中的RNase活性是失活的抗原组，和药物可接受载体或赋形剂。所述疫苗作为联合疫苗施用。更优选地，可首先施用根据本发明上述的所述减毒BVD病毒1型，然后在3-4周后施用根据本发明上述的减毒BVD病毒2型。
本发明优选涉及使用一种用于根据本发明上述的减毒BVDV来治疗BVDV感染牛属动物的方法，其中对牛属动物按其需要以熟练技术人员所熟悉的剂量施用所述减毒BVDV或上面公开的疫苗组合物，并监控BVDV症状如病毒血症和白血球减少症和/或发热和/或腹泻的减少。优选重复所述治疗。
以下实施例用于进一步说明本发明；但不应认为这些实施例限制这里公开的本发明的范围。
实施例1材料和方法细胞和病毒。MDBK细胞获自American Type Culture Collection(Rockville，Md.)。在补充有10％胎牛血清(FCS；检验不存在瘟病毒和抗瘟病毒的抗体)和非必需氨基酸的Dulbecco′s改性Eagle′s培养基中培养细胞。
牛病毒性腹泻株New York′93(就地分离物VLS#399)由E.J.Dubovi(NewYork State College of Veterinary Medicine，Cornell University，lthaca)提供。病毒经历1次动物传代并在后文中称为“New York′93/C”。
细胞感染、免疫荧光分析和病毒过氧化物酶分析。由于瘟病毒与其宿主细胞高度有关，所以将感染细胞的溶菌产物用于培养细胞的再感染。感染3-5天后，通过冷冻和解冻细胞而制备溶菌产物，并在-70℃下保存。除文中另外指明外，使用0.1的多倍感染(m.o.i.)用于培养细胞的感染。对于免疫荧光和过氧化物酶分析，在-20℃下用冰冷的丙酮∶甲醇(1∶1)固定感染细胞15分钟，风干并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)再水化。用直接对抗E2的抗BVDV单特异性抗体(Weiland等人，1989)的混合物培育细胞。用PBS洗涤三次后，在免疫荧光分析中用结合荧光素异硫氰酸酯(FITC)的兔抗鼠抗体(Dianova，Hamburg，Germany)检测细胞结合性抗体。对于过氧化物酶分析，使用结合过氧化物酶的羊抗鼠抗体(Dianova)作为第二抗体。室温培育1小时后，用由PBS洗涤细胞三次。用50mM醋酸钠缓冲液pH5.0、1μM氨基乙基咔唑和0.1％H2O2所组成的溶液检测细胞结合性抗体。
Northern(RNA)杂交。感染48小时后，通过以前描述的铯密度梯度离心法(Rümenapf等人，1989)制备RNA。按以前所述(Rümenapf等人，1989)进行凝胶电泳、探针放射性标记、杂交和杂交后洗涤。使用来自株New York 93/C的放射性标记PCR产物(核苷酸4301-5302)作为探针。
PCR和RT-PCR。按照厂商建议用Tfl-聚合酶(Promega，Mannheim，Germany)或用Taq-聚合酶(Appligene，Heidelberg，Germany)，并使用约50-100ng DNA模板和25pmol各种引物进行PCR。用于基因组5′端扩增的引物序列为上游T25V引物(Display Systems Biotech，Copenhagen，Denmark)；和下游，CM79CTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG用于第一轮和CM86CTCGTCCACATGGCATCTCGAGAC用于嵌套(nested)PCR。用于基因组3′端扩增的引物为上游CM46GCACTGGTGTCACTCTGTTG用于第一轮和CM80GAGAAGGCTGAGGGTGATGCTGATG用于嵌套PCR和下游nls-GACTTTCCGCTTCTTTTTAGG。采用TitanTM单管RT-PCR系统(BoehringerMannheim，Germany)，使用2μg总RNA作为模板并按照厂商指示进行反转录PCR(RT-PCR)。Erns编码区扩增用引物为上游CM28GGAGAGAATATCACCCAGTG；和下游CM21CTCCACTCCGCAGTATGGACTTGC。
通过制备的琼脂凝胶电泳纯化扩增的RT-PCR产物，并按照厂商建议用Nucleotrap试剂盒(Macherey-Nagel，Düren，Germany)洗脱。
将DNA寡核苷酸进行磷酸化并连接到RNA 3′端。为将DNA引物连接到病毒基因组3′端，磷酸化引物。在30μl激酶混合物(2mM ATP、50mMTris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、25μg/ml牛血清白蛋白)中用5单位T4聚核苷酸激酶(New England Biolabs，Schwalbach，Germany)37℃下培育10μg寡核苷酸nls+CCTAAAAAGAAGCGGAAAGTC 40分钟。使引物通过交联葡聚糖凝胶(sephadex)G-15自旋柱(Sambrook等人，1989)，并进一步通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化。
在50μl连接酶混合物(50mM Tris-HCl pH7.8、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP、40％聚乙二醇和50单位RNA保护剂(guard)(Amersham，Freiburg，Germany))中使用5μg由被感染的培养细胞制备的总RNA和150pmol具有20单位T4-RNA连接酶(New Enland Biolabs，Schwalbach，Germany)的磷酸化寡核苷酸在17℃下连接16小时。用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化产物。
单链DNA的合成和加尾。使用2μg来自感染细胞的总RNA和100pmol引物CM79(见“PCR和RT-PCR“)，并按照厂商指示(反应65℃10分钟；42℃40分钟；65℃15分钟)，借助显示Thermo-RT反转录酶(Display SystemsBiotech，Copenhagen，Denmark)产生来自病毒基因组5′端的单链(-)DNA。使用1/4vol的10M醋酸氨通过二次连续的苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化DNA(Schaefer 1995)。
按照厂商建议，在50μl TdT缓冲液中使用50％的“第一链”产物、50单位末端转移酶、6.25μM dATP和1.5mM CoCl2，借助末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)向第一个cDNA链中加入聚-dA尾。37℃培育30分钟后，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化产物。
cDNA文库的构建和核苷酸测序。通常按照前人所述进行cDNA合成、克隆和文库筛选(Meyers等人，1991)。使用寡(oligos)BVD13、BVD14和BVD15(Meyers等人，1991)以及B22.1R(GTTGACATGGCATTTTTCGTG)、B12.1R(CCTCTTATACGTTCTCACAACG)、BVD33(GCATCCATCATXCCRTGATGAT)、N7-3-7(CAAATCTCTGATCAGTTGTTCCAC)、B23-RII(TTGCACACGGCAGGTCC)和B-3′(GTCCCCCGGGGGCTGTTAAGGGTTTTCCTAGTCCA)引发cDNA合成。用于筛选文库的探针为来自BVDV株cp7(GenBank登录号U63479，Meyers等人，1996b)的cDNA克隆的XhoI/AatII插入物；在52℃下进行杂交。
使用外切核酸酶III和核酸酶S1建立cDNA克隆的缺失文库(Henikoff1987)。使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(PE Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)进行双链DNA的核苷酸测序。通常，cDNA克隆的二个DNA链都进行测序；至少在二个克隆上对独立cDNA克隆间的重叠进行测序。总之，分析了约47000个核苷酸，全面覆盖整个基因组的～3.8。使用Genetics Computer Group软件(Devereux等人，1984)进行序列分析和排列。
全长cDNA克隆的构建。通常按照其它地方描述的(Sambrook等人，1989)进行限制、克隆和其它标准过程。限制和修饰酶获自New England Biolabs(Schwalbach，Germany)、Pharmacia(Freiburg，Germany)、GibcoBRL(Eggenstein，Germany)和Boehringer Mannheim(Germany)。
使用来自文库的五个cDNA克隆以构建全长cDNA克隆质粒C3/8(核苷酸35-2411)、质粒C5/11(核苷酸22-2400)、质粒8/11(核苷酸3400-7814)、质粒13/27(核苷酸4783-9910)和质粒C4/24(核苷酸8658-12322)。使用就地分离物VLS#399感染的MDBK细胞中的总RNA作为模板，通过利用引物CM29(GATGTAGACACATGCGACAAGAACC)和CM51(GCTTCCACTCTTATGCCTTG)的RT-PCR得到自核苷酸位2144延伸到位4447的片段“RT-E2”。在下面描述中，对在病毒cDNA插入物两侧的质粒限制位点加下划线。
首先，用AatII和HindIII切割克隆C3/8，并将cDNA插入片段转移到用同样酶切的pACYC177。得到的质粒命名为pKANE5。在用同样酶限制后，将RT-PCR产物“RT-E2”插入到这个质粒的NdelI/HindIIII位点；得到的质粒为pKANE8。然后，将来自克隆C5/11的AatII片段转移到pKANE8的AatII位点，产生质粒pKANE14。
使用引入第一个cDNA核苷酸T7启动子序列上游的引物CM87(GCTCTAGACGGCCGTAATACGACTCACTATAGGTATACGAGATTAGCTAAAGAACTCGTATATGGATTGGACGTCAAC)和CM79(见“PCR和RT-PCR”)通过PCR产生重组cDNA克隆的5′端；使用质粒C5/11作为PCR模板。将PCR产物连接进cDNA克隆C5/9的XbaI和BsrGI位点，产生质粒pKANE22。后来发现寡CM87包含错误的核苷酸，并用寡(oligos)CM88(GACGGCCGTAATACGACTCACTATAGTATACG)和CM79通过PCR修补pKANE22。用E.coil DNA聚合酶I(Klenow片段)处理PCR产物以产生平端，然后用BsrGI限制。将其克隆进pKANE22的SpeI平/BsrGI位点，产生质粒pKANE22A。
用XhoI和BamHI切割cDNA克隆8/11的插入片段，并克隆到用同样酶切的pACYC177；得到的质粒命名为pKANE6。将cDNA克隆13/27的AvrII/BamHI片段转移到pKANE6，产生质粒pKANE15。然后，将来自pKANE14中的EcoRV/MfeI片段插入用同样酶消化的pKANE15。得到的质粒为pKANE21。用SacII和EcoRV消化pKANE21，并将来自pKANE14的相应片段克隆进这些位点，产生质粒pKANE24。然后将来自pKANE22A的SacII/SacII片段克隆进用同样酶切的pKANE24。得到的质粒为pKANE28AII。
通过使用引物B2-11500(CCTAACCATGATATATGCCTTCTG)和向基因组3′端添加SrfI位点的CM81(CGGAATTCGCCCGGGCTGTTAGAGGTCTTCCCTAGT)的PCR产生基因组3′端。用BamHI和EcoRI切割PCR产物，并克隆到pACYC177，产生质粒pKANE17。然后，将cDNA克隆C4/24的SacI/Kpn2I片段转移到pKANE17；质粒称为pKANE20。将StuI/EcoRI片段从pKANE20切除并克隆到用EcoRI消化和用StuI部分消化的质粒pKANE21上。得到的质粒为pKANE23。最后，将来自pKANE28AII的XbaI/PshAI片段插入到用同样酶切割的质粒pKANE23中，产生全长cDNA克隆pKANE40。
位点定向诱变。按照厂商指示通过使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)的PCR产生所有突变体。用于向Erns编码区引入突变的质粒为C5/9，一种获自初始cDNA文库(核苷酸50-2411)的克隆。用于产生突变体H“346”Δ的寡核苷酸为CM126(GAGTGGAATAAAGGTTGGTGTAAC)和CM127(GTTACACCAACCTTTATTCCACTC)，用于突变体H“297”L的寡体(oligos)为CM128(AACAGGAGTCTATTAGGAATTTGGCCA)和CM129(TGGCCAAATTCCTAATAGACTCCTGTT)。通过核苷酸测序证实了要求突变的存在和没有第二位点突变。
体外转录和RNA转染基本按照以前的描述(Meyers等人，1996a)进行RNA转录和MDBK细胞转染。简短地说，用SrfI使2ug相应cDNA构建进行线性化，并通过苯酚提取和乙醇沉淀纯化。在有15单位RNA保护剂(Pharmacia，Freiburg，Germany)存在情况下，在总体积为50ul的转录混合物(40mM Tris-HCI，pH7.5；6mMMgCl2；2mM亚精胺；10mM NaCl；ATP、GTP、CTP和UTP各0.5mM；10mM二硫苏糖醇；100ug/ml牛血清白蛋白)中用50单位T7 RNA聚合酶进行T7RNA聚合酶(NEB，Schwalbach，Germany)转录。37℃培育1小时后，将反应混合物通过Sephadex G-50旋转柱，并进一步通过苯酚提取和乙醇沉淀纯化。
如果不另外指明，使用大约3×106MDBK细胞的悬浮液和约0.5μg结合于DEAE葡聚糖(Pharmacia，Freiburg，Germany)的体外转录RNA进行转染。通过将溶于100μl HBSS(每升中含5g Hepes、8g NaCl、0.37g KCl、0.125gNa2HPO4.2H2O和1g葡萄糖；pH7.05)的RNA与100μl DEAE葡聚糖(在HBSS中1mg/ml)混合而建立RNA/DEAE葡聚糖复合体，并在冰上培育30分钟。用不含FCS的DMEM洗涤沉淀细胞一次，离心，然后再悬浮在RNA/DEAE葡聚糖混合物中。37℃培育30分钟后，加入20μl二甲基亚砜，并在室温下培育混合物2分钟。加入2ml HBSS后，将细胞制成粒，并用HBSS洗涤一次，和用不含FCS的培养基洗涤一次。将细胞再悬浮在有FCS的DMEM中，并接种到10.0cm直径的盘上。将经过48h-72h转染的细胞割裂并接种以适于后续分析。
使用电穿孔测定RNA的特异性感染。将0.5ml不含镁和钙的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3×106个MDBK细胞与适量RNA混合，并转移到2mm电穿孔皿中。在Hoefer PG 200 Progenetor II上用960μF、180伏的一次脉冲进行电穿孔。然后，将细胞接种到3.5cm盘上，并在约20h后用免疫荧光进行分析。
RNAse活性测定。用重组病毒感染MDBK细胞，并生长48小时。用野生型病毒感染的细胞作为阳性对照，未感染细胞作为阴性对照。按照以前描述的(Meyers等人，1999)进行细胞制备和RNAse活性测定，除了37℃下探针的培育为30分钟而不是1小时，因为较长的培育导致MDBK细胞中大量本底放射性。
动物实验。进行两组动物实验以检测重组病毒。在第一组实验中，以每只动物以105TCID50鼻内接种二组每组3只花斑母牛(8-10月龄)。在第二组实验中，以每只动物5×105TCID50鼻内感染6只雄Holstein和Holstein杂交小牛(7-10周龄)。在攻击实验中，以5×106TCID50接种动物。感染前检测所有动物都没有BVDV特异性抗原和抗体。在分开的隔离区内安置不同的组。每天记录临床参数，如结果部分所示。在结果部分所示时间点从颈外静脉中抽取血液，并用肝素(大约35I.U./ml)稳定血液，除了将其用于制备血清。
为了确定血液中存在病毒，从所有血液样品制备血沉棕黄层(buffy coat)。向肝素稳定的血液(包含约107白细胞)等分试样中加入5ml冰冷溶菌缓冲液，并在冰上培育10分钟，然后离心。在将其重悬浮于2ml PBS前，用溶菌缓冲液洗涤沉淀一次，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤二次。用200μl血沉棕黄层制备物培育接种在24孔板中的MDBK细胞5天。通过使用BVDV E2 mAb混合物的免疫荧光显微镜检测病毒抗原(见上面)。
在通过56℃培育30分钟而失活的血清样品中检测到病毒中和抗体的存在。在96孔微滴度板上以1∶2为一级来稀释血清，并在37℃下用株NewYork′93/C的悬浮液(每孔100TCID50)接种1小时。向每孔中加入101.75个MDBK细胞并培育5天。通过免疫荧光而分析感染，通过Kaerber方法(Mayr等人，1974)计算，并以中和了约100 TCID50的50％终点稀度表示。
为检测鼻涕中病毒，在结果部分所示时间点取出鼻内药签，在2ml输送缓冲液(补充有5％FCS、100I.U./ml青霉素G、0.1mg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素B的PBS)中稀释并通过0.2μm过滤器。在24孔板上用100μl这种制备物接种MDBK细胞，并在5天后通过间接免疫荧光显微术分析。
结果基因组分析。株NY′93/C为第二种已被完全测序的BVDV 2型基因组。Northern印迹分析显示，与株890(Ridpath和Bolin 1995)相反，NY′93/C的基因组不包含大的插入或缺失(未显示数据)。核苷酸序列分析显示，基因组为12332个核苷酸长，并包含一个编码3913个氨基酸的聚蛋白的可读框。
通过RACE方法测定5′未翻译区域(位1-385)，并发现除了位21外，其与Topliff和Kelling(1998)公布的New York′93序列相同。与其它已知2型基因组(Ridpath 1995；Topliff和Kelling 1998)相比，株NY′93/C在这个位置具有腺嘌呤而不是胸腺激素。
用于NY′93/C感染性cDNA克隆的构建和分析。尽管已为CSFV和BVDV 1型建立了大量感染性cDNA克隆(Mendez等人1998；Meyers等人1996a和1996b；Moormann等人1996；Vassilev等人1997；Kümmerer和Meyers 2000)，但这是由BVDV 2型株感染性克隆的首次报道。设计克隆用于借助T7 RNA聚合酶的失控转录(runoff transcription)，产生了类基因组的RNA而没有任何异种附加物。由四种选自初始噬菌体文库的cDNA质粒和一种包括位2265和4301之间区域的RT-PCR产物构成全长克隆。在5′端，加入T7启动子序列以用于体外转录，并向3′端加入SrfI位点以用于质粒线性化(图1)。全长克隆命名为pKANE40A。
使用通过体外转录而由线性化pKANE40A模板产生的RNA转染MDBK细胞。在NS5B编码区上游终止19个密码子的质粒pKANE28AII的失控转录产物用作阴性对照。转染后3天，在使用来自pKANE40A的RNA转染的细胞中，免疫荧光染色后检测到BVDV特异性信号，但在对照中没有。产生于感染性克隆pKANE40A的病毒命名为XIKE-A。转染细胞传代二次，并把第二次传代后的原液(stock)用于所有进一步的实验。通过RT-PCR测序分析病毒，并取在位1630处从C交换到T的核苷酸作为XIKE-A身份的证据。
测定源于pKANE40A的RNA的特异性感染，与由野生型病毒NY93′/C感染的细胞中制备的RNA作比较。为此，使用磷成象仪(phosphoimager)测定MDBK细胞转染用样品中的病毒RNA的浓度，与Northern印迹和杂交后体外转录RNA的一定数量作比较。用同样量的两种RNA转染MDBK细胞，并在转染3天后计算噬斑。按平均数计算，源于pKANE40A的RNA的感染性为4.32×102pfu/μg，而野生型RNA产生4×102pfu/μg。
通过生长曲线分析重组病毒的生长特性，在同一实验中使用原始就地分离物VLS#399作为对照(图2)。以0.1m.o.i.感染MDBK细胞，并在感染后2小时-96小时内的7个时间点取样。重组XIKE-A的生长曲线比VLS#399的稍平滑，但两种病毒都在96小时后达到106.39的滴度。因此认为XIKE-A适合进一步的实验。
Erns突变体的构建和分析。以前关于CSFV(Meyers等人，1999)的实验已表明，通过用亮氨酸或细胞溶素替换组氨酸297或346(数字代表在CSFV株Alfort/Tübingen中的残基位置)或通过密码子“H346”的缺失而可破坏糖蛋白Erns中的RNAse活性。突变体病毒是活的，但在临床上减毒。在BVDV株NY′93/C中，二种组氨酸残基分别位于位300和349。为检测突变在这些位置的影响是否与BVDV 2型基因组中的CSFV类似，用密码子“H349”的缺失或用亮氨酸替换密码子“H300”来设计二种感染性克隆。得到的重组病毒突变体称为XIKE-B(H349Δ)和XIKE-C(H300L)。
通过对包括Erns编码区的RT-PCR产物的核苷酸测序进行测定时，在至少5次传代内，两种突变体在MDBK细胞中都是稳定的。比较二种突变病毒与源于野生型感染性克隆XIKE-A的病毒的生长特性(图3)。
对使用相同m.o.i.的任何一种病毒感染的细胞，在感染2天后，在细胞的粗细胞提取物中测定XIKE-A、XIKE-B和XIKE-C的RNAse活性。检测制备物等分试样的降解聚(U)的能力；用野生型株NY′93/C感染的细胞作为阳性对照，未感染细胞作为阴性对照。培育30分钟后，沉淀出残余高分子量RNA，上清液的OD260测试结果显示了小的降解RNA片段的存在(Meyers等人1999)。在NY′93/C和XIKE-A样品中发现了高的RNAse活性，而二个突变体XIKE-B和XIKE-C在与阴性对照相同的范围内(图4)。
关于XIKE-A和NY′93/C的动物实验。第一个动物实验的目的是比较源于感染性cDNA克隆的重组病毒XIKE-A与野生型株NY′93/C的毒性和致病性。用105TCID50的XIKE-A(动物#615、#377、#901)或NY′93/C(动物#275、#612、#1610)各感染二组每组三个动物(8-9月龄)中的每一个。每组安置在分开的隔离单元内。每天记录体温和临床征象；在感染后第0、2-16和21天采取血液样品，以得到白细胞计数并检测病毒血症。在感染后第0、7、14、21、29和35天采集所有小牛的血清，用于检测对抗NY′93/C的中和抗体。在感染后第0、2-16和21天取出病毒分离用的鼻内药签。
表1来自NY′93/C或XIKE-A感染动物的血沉棕黄层制剂和鼻内药签的病毒分离物。+检测到病毒，-未检测到病毒，bac＝细菌，*在感染后第13天对动物实施安乐死二组中的所有动物逐渐表现出发热(图5)和广谱临床征象包括呼吸症状和胃肠疾病。出于公益原因，在感染后第13天杀死动物#091。二组中的所有小牛从感染后第3天开始表现出白血球减少症，并持续直到感染后第15天(图6)。在来自NY′93/C感染动物持续5天的血沉棕黄层制备物中检测到病毒，XIKE-A则为7天。持续1或2天发现流鼻涕(表1)。
通过源于由所有动物血沉棕黄层制备物制备的RNA的RT-PCR产物的核苷酸测序，而检查病毒同一性。整个Erns编码区(位1140-1780)进行测序，发现分别与NY′93/C或XIKE-A的已知序列一致。从感染后第14天开始，在所有小牛的血清中发现中和抗体(表2)。
*在第13天对动物实施安乐死表2用New York′93/C或XIKE-A实验性感染后，在所有小牛的血清样品中测定的中和抗体滴度。结果以抗New York′93/C(102.07TCID50)的血清BVDV特异性中和抗体滴度的倒数表示。
这项研究的结果表明，对于在天然宿主中的致病性和免疫应答的诱导，重组病毒XIKE-A高度类似于野生型病毒New York′93/C。因此，似乎可假定对于可在基于感染性克隆pKANE40A产生的病毒突变体中观察到的这种临床表现，任何偏离都确实由期望的突变造成。
关于XIKE-B和XIKE-A的动物实验。在第二个动物实验中，分析RNAse阴性突变体XIKE-B的临床和免疫特性，并与XIKE-A比较。比H300L突变体优先给出H349Δ突变体，以使基因返组到野生型的危险最小。
二组每组三只小牛(7-10周龄)，各自接种5×105TCID50剂量的XIKE-A(动物#387、#388、#418)或XIKE-B病毒(动物#415、#417、#419)。这些组安置在分开的隔离单元内。每天监视直肠温度和临床症状；在第-8、0、2-14、17和21天取鼻内药签和血液样品。在第0、8、12/14、21、28和38/40天采集血清样品。
感染后9-10天，XIKE-A感染的小牛开始发热并持续高达3天；另外，动物#387在感染后第3天发热(图7)伴有腹泻和呼吸症状。小牛#388表现出痉挛。出于公益原因，在感染后第12天，对处于明显抑郁和厌食状态下的组实施安乐死。XIKE-B感染的小牛没有高体温(图7)。只在持续高达6天内观察到温和的呼吸症状。在所有动物中发现白血球减少症；但是，在野生型XIKE-A感染的小牛中的白细胞数量减少比在XIKE-B组中的更明显(图8)。
从感染后第4天开始，在所有动物的血沉棕黄层制备物中发现病毒；但是，Erns突变体的病毒血症(φ4天)比具有野生型序列的病毒(φ8天)的时间短。对于用XIKE-A的动物，可在持续高达8天内观察到病毒的鼻泄出(φ4.7)，但对于XIKE-B动物，最高只有1天(φ0.7)(表3)。
来自棕黄层制备物的病毒分离物 来自鼻内药签的病毒分感染后#415#417#419#387#388#418#415#417#419#387#388#418天数-8-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --0 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --2 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --3 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --4 +- +- -- ++ ++ ++ -- -- -- -- -- --5 ++ +- +- ++ ++ ++ -- -- -- -- -- +-6 ++ +- ++ ++ ++ ++ -- +- -- ------ +-7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- +- +- -- +-8 -- +- -- ++ ++ ++ -- -- -- -- -- +-9 -- -- -- ++ +- ++ -- -- -- ++ ++ +-10-- -- -- ++ +- +- -- -- -- +- +- ++11-- -- -- ++ +- ++ -- -- -- +- -- +-12-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- ++13-- -- -- * * * -- -- -- * * *14-- -- -- * * * -- -- -- * * *17-- -- -- * * * -- -- -- * * *21* * * -- -- -- * * *总4 5 3 8 8 8 0 1 1 4 2 8φ 4 8 0.7 4.7表3来自血沉棕黄层制备物和重组病毒XIKE-A(动物#387、#388和#418)或Erns突变体XIKE-B(动物#415、#417和#419)感染动物用的鼻内药签的病毒分离物。+检测到病毒，-未检测到病毒，*在感染后第12天对动物实施安乐死此外，对包括整个Erns编码区的RT-PCR产物的核苷酸测序，用于血沉棕黄层制备物中的病毒识别。正如所料，来自动物#387、#388和#418的分离物为野生型。证实了动物#415、#417和#419缺失“H349”密码子。有趣地是，从来自这二只动物(#415和#419)的RT-PCR产物中发现另外的位点突变核苷酸位1246由鸟嘌呤变为胸腺激素，导致氨基酸替换Q287H。在感染后第12天，首次在以XIKE-A感染小牛的血清中检测到中和抗体，并于感染后第14天在Erns突变体感染小牛的血清中也检测到(表4)。
*在第12天对动物实施安乐死。
表4在用XIKE-A(野生型序列)或XIKE-B(H346？)实验性感染后，在所有小牛血清样品中测定的中和抗体滴度。结果以抗New York‘93/C(101.7TCID50)的血清BVDV特异性中和抗体滴度的倒数表示。
实施例2实验设计从BVDV阴性畜群中选出12只怀孕小母牛。实验中包括5/7只小母牛的下列组。
No. 接种 病毒组15 一次鼻内施用，每个鼻孔3mlXIKE-A组25 一次鼻内施用，每个鼻孔3mlNY-93在接种前8天，将小母牛迁移到研究实验室中。转入到研究实验室后，确认妊娠状态。在接种日，小母牛处于60-90天妊娠期内。在一个时间点，以在6ml组织培养上清液中加入2.5×104TCID50/ml的各种病毒对所有动物接种。
在观察期内监视小母牛出现的BVDV感染临床征象包括流产。感染后9周结束实验。宰杀未流产母牛，检查并采集子宫。在常规尸体剖检中采集胎体器官样品，并检查BVDV感染。
出现胎儿感染是主要评价参数，由BVDV相关的母牛死亡数字、BVDV相关的流产数和结束时BVD阳性胎牛数所构成。
结果组1动物号结论526 BVD流产598 BVD流产615 BVD流产618 BVD流产626 小母牛死于BVD组2动物号结论184 小母牛死于BVD203 BVD流产232 小母牛死于BVD233 胎儿BVD阳性(病毒血症(viremic))252 BVD流产267 小母牛死于BVD306 BVD流产实施例3本研究旨在评估BVDV分离物抗胎儿感染的效力。调查了E(RNS)蛋白XIKE-B(H349Δ)中具有Rnase功能缺失的NY93感染性拷贝衍生物BVDV重组子(II型)对在异种I型攻击后预防胎儿感染的效力。
对暴露于BVDV的胎牛来说，60到90天之间为最敏感期。因此在这个实验中，通过单个接触XIKE B(肌内)使来自没有BVDV农场(并确认BVDV血清反应阴性)的小母牛免疫。此后，使小母牛受孕，并当动物在60-90天时，假定动物对BVDV胎牛感染高度敏感，用野生型就地病毒进行攻击感染。选择鼻内攻击途径，因为这是模拟野外感染的常规的最佳途径。
实验设计从BVDV阴性畜群中选择小母牛。从血清和病毒上检测这些小母牛，BVDV呈阴性。实验中包括以下小母牛组。
直到攻击，畜群源中的组1保持未进行预防。接种疫苗后采集血液样品，用于血沉棕黄层制备和血清学。
对所有组免疫处理4周后开始授精。攻击前将组1转移到研究实验室内。
在接种疫苗4个月零10天后攻击小母牛。在接种日，妊娠状况为60-90天怀孕期间。
胎牛感染的预防为主要评价参数。
过程顺序和时间表
BVDV攻击病毒在不含BVDV的合适培养基中生长病毒，等分试样并在-70℃[±10℃]下冷冻。
接种疫苗在实验设计部分描述了接种疫苗表
结果直肠温度除一例外，温度值均低于39℃，并且在观察期内未发现异常波动。小母牛N°1249(组1)在14DPI(＝感染后天数)出现39.1℃的温度，次日恢复到正常值。
白细胞计数将0DPI值看作比较的单个基准。在本研究原始记录中未限定白细胞计数的下限。但是，白细胞计数减少40％或更多，即值达到基准值(攻击日建立)的60％或更少，可认为在生物学上显著。
个体平均白细胞计数列于下面表1中。
表1个体平均白细胞计数组1
组2
*在感染前一天采集0天样品所有组中的基准白细胞计数近似。组1中的二只小母牛(I型株感染)在攻击后经历了白细胞计数(以灰色高亮显示值)的生物学显著减少(最大下降记录于4-8DPI)，而相应接种疫苗的小母牛(组2)在白细胞上没有明显降低。唯一的例外是小母牛N°1197，其在单日即感染后第14天表现出明显降低。次日，白细胞计数恢复到被认为是正常水平的值(偏离基准小于40％)。
病毒分离数据前面的实施例中已详细描述了病毒分离研究所用的方法。
来自血沉棕黄层的病毒分离数据(描述为用候选疫苗(XIKE B)感染后天数(＝DPI)进行描述
来自胎牛器官的病毒分离物
在接种XIKE B后，所有小母牛都未表现出任何BVDV感染的典型临床症状。攻击后，1组小母牛具有至少一天的病毒血症，而在2组中，未在攻击后的任何一天内检测到病毒血症。来自1组小母牛的所有胎牛均为BVDV阳性(用病毒分离测试BVDV，所有下列器官均为阳性)(肠系膜淋巴结；小肠，脾，胸腺，肾，胸骨，骨髓，小脑)；来自组2小母牛的胎牛均为BVDV阴性(在所有共同测试的器官中肠系膜淋巴结；小肠，脾，胸腺，肾，胸骨，骨髓，小脑)。
因此，对感染性拷贝衍生病毒是成功减毒，并表明可作为疫苗病毒以预防胎牛感染的潜在应用。
XIKE B病毒在抗原上属于BVDV II型病毒，并在用属于BVDV I型抗原组的异种攻击病毒攻击后对胎牛感染预防方面有效。
参考文献Baker，J.C.1987.牛病毒性腹泻病毒综评，J.Am.Vet.Med.Assoc.1901449-1458。
Becher，P.，Orlich，M.，Kosmidou A.，Konig，M.，Baroth M.，Thiel H.J.1999.瘟疫的基因多样性新组的确定及分类使用Classification.Virology 26264-71。
Bolin，S.R.，Littledile，E.T.and Ridpath，J.F.(1991)在接种疫苗畜群中牛病毒性腹泻病毒中的血清检测和抗原多样性的结果。Am.J.Vet.Res.521033-1037。
Devereux，J.，Haeberli，P.and Smithies，O.(1984)对VAX序列分析程序的综评Nucleic Acids Res.12387-395。
Flores，E.F.，Gil，L.H.，Botton，S.A.，Weiblen，R.，Ridpath，J.F.，Kreutz，L.C.，Pilati，C.，Driemeyer，D.，Moojen，V.and Wendelstein，A.C.(2000)在巴西确定牛病毒性腹泻病毒(BVDV)2型分离物的临床，生理和抗原。Vet.Microbiol.77175-83Henikoff，S.(1987)在DNA序列分析中用外切核酸酶III不直接的消化。Methods Enzymol.155156-165Hulst，M.M.，Panoto，F.E.，Hoekman，A.，van Gennip，H.G.and Moormann，R.J.(1998)豕不发热病毒的糖蛋白(rns)的RNase活性的失活导致细胞病变病毒。J.Virol.72151-7Kummerer，B.M.，Tautz，N.，Becher，P.，Thiel，H.and Meyers，G.(2000)瘟疫细胞病变的基因基础。Vet.Microbiol.77117-28Mayr，A.，Bachmann，P.A.，Bibrack，B.and Wittmann，G.(1974)病毒学工作方法手册Band I.Gustav Fischer Verlag，Stuttgart.
Mendez，E.，Ruggli，N.，Collett，M.S.and Rice，C.M.(1998)由稳定cDNA克隆的RNA感染牛腹泻病毒(NADL株)的细胞插入物测定NSA产物和细胞病变性。
Meyers，G.，Tautz，N.，Dubovi，E.J.and H.-J.Thiel(1991)与遍在蛋白-编码序列有关的细胞病变性。
Meyers，G.，Thiel，H.J.and Rumenapf，T.(1996a)猪发热病毒由cDNA构建发现感染并产生重组细胞病变缺失干扰粒子。J.Virol.701588-95Meryers，G.，Tautz，N.，Becher，P.，Thiel，H.-J.，Kummerer，B.M.(1996b)由cDNA构建回收细胞病变和非细胞病变的牛病毒性腹泻病毒。J.Virol.708606-13(erratum J.Virol.1997，71173)Meryers，G.，Saalmuller，A.and Buttner，M.(1999)在猪发热病毒的糖蛋白Erns中突变消除Rnase活性导致病毒降低。J.Virol.7310224-10235Moenning，V.and Liess，B.1995.用牛病毒性腹泻病毒感染子宫的病理学11(3)，477-487.
Moenning，V.and Plagemann，J.1992.瘟疫病毒。Adv Virus Res.4153-91.
Moormann，R.J.，van Gennip，H.G.，Miedema，G.K.，Hulst，M.M.and van Rijn，P.A.(1996)由瘟疫基因的工程全长cDNA模板转录的感染RNA。J.Virol.70763-70Oirschot van，J.T.，Bruschke，C.J.M.，Rijn van，P.A.，1999.对小牛接种抗牛病毒性腹泻疫苗。Veterinary Microbiology，64169-183.
Racaniello，V.R.and Baltimore，D.，1981.克隆的脊髓灰质炎病毒互补DNA是在人类细胞中感染的。Science 214916-919.
Ridpath，J.F.，Bolin，S.R.and Dubovi，E.J.(1994)分离牛病毒性腹泻病毒为基因型。Virology 20566-74Ridpath，J.F.and Bolin，S.R.(1995)由2型基因型的毒性牛病毒性腹泻病毒(BDVD)的基因序列大基因插入无细胞病变的BVDV中的检测。Virology21239-46Ridpath，J.F.，Neill，J.D.(2000)在细胞病变型2牛病毒性腹泻病毒中基因重组的检测和特征。J.Virol.748771-4Ridpath，J.F.，Neill，J.D.，Frey，M.，Landgraf，J.G.(2000)由北美型IBVDV的系统发育、抗原、临床的特性。Vet.Microbiol.77145-55Rumenapf，T.，Meyers，G.，Stark，R.and Thiel，H.-J.(1989)特异抗血清的猪霍乱病毒特性和cDNA克隆的检定。Virology 17118-27Sambrook，S.E.，Fritsch，F.and Maniatis，T.(1989).分子克隆实验室手册，2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.Schaefer，B.C.(1995)cDNA端迅速扩增的转换用于全长cDNA端的聚合酶链反应克隆的新策略。Anal.Biochem.227255-273Thiel，H.-J.，Stark，R.，Weiland，E.，Rumenapf，T.and Meyers，G.(1991)猪霍乱病毒由瘟疫病毒的病毒体的分子组成。J.Virol.654705-4712Thiel，H.-J.，Plagemann，G.W.，& Moenning，V.1996.瘟疫病毒。In FieldsVirology，eds，Fields，B.N.Knipe，D.M. & Howley，P.M.(Lippincott-Raven，Philadelphia)，pp.1059-1073.
Tijssen，P.，Pellerin，C.，Lecomte，J(1996)高毒性病毒性牛腹泻病毒组II病毒的免疫显性E2(gp53)序列表明近似于边缘疾病病毒。Virology 217356-361Topliff，C.L.and Kelling，G.L.(1998)在基因型2牛病毒性腹泻病毒分离物的5′未翻译区中的有毒标志。Virology 250164-72Van Gennip H.G.，van Rijin，P.A.，Widjojoatmodjo M.N.，Moormann R.J.(1999)通过表达噬菌体T7RNA聚合酶的猪肾细胞系由全长基因cDNA克隆回收感染猪发热病毒(CSFV)。J.Virol.Methods 78117-128.
Vassilev，V.B.，Collett，M.S.and Donis，R.O.(1997)产生感染转录物的牛病毒性腹泻病毒的真实和嵌入的全长基因cDNA克隆。J.Virol.71471-8Weiland，E.，Thiel，H.-J.，Hess，G.and Weiland，F.(1989)用正常牛细胞和环磷酰胺预处理鼠后，抗牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体的发育。J.Virol.Methods24237-244
序列表<110>贝林格尔.英格海姆维特梅卡迪有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)<120>感染性牛病毒性腹泻病毒克隆<130>尚未分配<150>DE10143813.3<151>2001-09-06<160>28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12332<212>DNA<213>牛病毒性腹泻病毒(BVDV)<400>1gtatacgaga ttagctaaag aactcgtata tggattggac gtcaacaaat ttttaattgg60caacgtaggg aaccttcccc tcagcgaagg ccgaaaagag gctagccatg cccttagtag120gactagcaaa agtaggggac tagcggtagc agtgagttcg ttggatggcc gaacccctga180gtacagggga gtcgtcaatg gttcgacact ccattagtcg aggagtctcg agatgccatg240tggacgaggg catgcccacg gcacatctta acccatgcgg gggttgcatg ggtgaaagcg300ctattcgtgg cgttatggac acagcctgat agggtgtagc agagacctgc tattccgcta360gtaaaaactc tgctgtacat ggcacatgga gttgttttca aatgaacttt tatacaaaac420atataaacaa aaaccagcag gcgtcgtgga acctgtttac gacgtcaacg ggcgcccact480gtttggagag agcagtgact tgcacccgca gtcaacacta aaactaccac accaacgagg540cagcgccaac atcctgacca atgctaggtc cctaccgcgg aaaggtgact gccggagagg600
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1.包含与BVDV RNA互补的核苷酸序列的DNA分子，其中所述RNA在引入易感染宿主细胞时，能诱导产生感染性BVDV粒子a)当用6×106TCID50剂量感染时，具有诱发小牛病毒血症和白血球减少症持续至少一天时间和下列包括腹泻和/或发热中的至少一种临床症状持续至少一天的能力；和/或b)与衍生这种DNA分子的野生型BVDV分离物相比，具有真实毒性；和/或c)当用这种粒子以6×106TCID50剂量感染BVDV首次使用的小牛时，在21天时间内这些小牛中的至少30％致死；和/或d)具有不少于90％的包括一个与SEQ ID NO.1互补的序列RNA的BVDV粒子的毒性；和/或e)包括与SEQ ID NO.1互补的序列。
2.能用作模板转录为RNA的感染性BVDV克隆，其中所述RNA在引入易感染宿主细胞时，能诱导产生感染性BVDV粒子f)当用6×106TCID50剂量感染时，具有诱发小牛病毒血症和白血球减少症持续至少一天时间和下列腹泻和/或发热中的至少一种临床症状持续至少一天的能力；和/或g)与衍生这种DNA分子的野生型BVDV分离物相比，具有真实毒性；和/或h)当用这种粒子以6×106TCID50剂量感染3-6月龄BVDV首次试验的小牛时，在感染后21天时间内这些小牛中的至少30％致死；和/或i)具有不少于90％的包括一个与SEQ ID NO.1互补的序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或j)包括与SEQ ID NO.1互补的序列。
3.根据权利要求1的DNA分子，其中阶段a)中的发热为至少40℃。
4.一种通过以下步骤产生的BVDV粒子使用根据权利要求1或3的DNA分子或根据权利要求2的BVDV克隆进行转录、用所述RNA转染合适细胞或细胞系并收集由所述细胞产生得到的BVDV粒子。
5.感染性BVDV 2型克隆。
6.感染性BVDV 2型克隆，能用作转录为RNA的模板，其中所述RNA在引入易感染宿主细胞时，能诱导产生感染性BVDV粒子k)当用6×106TCID50剂量感染时，具有诱发小牛病毒血症和白血球减少症持续至少一天时间和下列包括腹泻和/或发热中的至少一种临床症状持续至少一天的能力；和/或l)与衍生这种DNA分子的野生型BVDV分离物相比，具有真实毒性；和/或m)当用这种粒子以6×106TCID50剂量感染3-6月龄BVDV首次试验用小牛时，在感染后21天时间内这些小牛中至少30％致死；和/或n)具有不少于90％的包括一个与SEQ ID NO.1互补的序列的RNA的BVDV粒子的毒性；和/或o)包括与SEQ ID NO.1互补的序列。
7.根据权利要求5或6的感染性BVDV 2型克隆，特征为DNA序列SEQID NO.1或其片段、功能变异体、基于退化核酸密码的变异体，融合分子或其化学衍生物。
8.一种通过以下步骤产生BVDV2型粒子，根据权利要求5-7任一权利要求的BVDV克隆的体外转录成RNA、用所述RNA转染合适细胞或细胞系并收集由所述细胞产生得到的BVDV粒子。
9.包含与全长BVDV 2型RNA互补的核苷酸序列的DNA分子。
10.根据权利要求9的DNA分子，特征为SEQ ID NO.1或其片段、功能变异体、基于退化核酸密码的变异体，融合分子或其化学衍生物。
11.根据权利要求9或10的DNA分子，由特征为SEQ ID NO.1的序列组成。
12.与权利要求1或权利要求3或权利要求9-11中任一权利要求的DNA分子、或与权利要求2或权利要求4或权利要求5-7的BVDV克隆互补的RNA分子。
13.一种RNA分子，它通过权利要求1或权利要求3或权利要求9-11中任一权利要求的DNA分子、或权利要求2或权利要求4或权利要求5-7的BVDV克隆转录而得到。
14.由野生型BVDV分离物制备感染性BVDV克隆的方法，与所述野生型分离物相比，与RNA互补的所述BVDV克隆具有真实毒性，该方法包括步骤p)从感染动物中分离病毒粒子；q)在合适细胞培养细胞中传代不超过2次；r)由病毒粒子制备RNA；s)在RNA反转录后产生全长互补DNA；其中反转录包括在足够高的温度下切断或降低RNA二级结构的步骤，并在这个步骤中使用热稳定酶，所述酶在这些高温下具有活性；t)在合适细胞感染时将互补DNA(cDNA)结合到质粒载体上或结合进能引导BVDV cDNA转录成RNA的DNA病毒中。
15.由野生型BVDV分离物制备感染性BVDV克隆的方法，与RNA互补的所述感染性BVDV克隆具有不少于90％的所述野生型分离物的毒性，该方法包括步骤u)从感染动物中分离病毒粒子；v)由病毒粒子制备RNA；w)在RNA反转录后产生全长互补DNA；其中反转录包括在足够高的温度下切断或降低RNA二级结构的步骤，并在这个步骤中使用热稳定酶，所述酶在这些高温下具有活性；x)在合适细胞感染时将互补DNA(cDNA)结合到质粒载体上或结合到能引导BVDV cDNA转录成RNA的DNA病毒中。
16.权利要求14或15的方法，其中应用RACE转录RNA 5′端。
17.权利要求16的方法，其中使用允许反应温度至少为42℃的热稳定酶进行RACE。
18.BVDV减毒方法，或包括将一个或多个突变体引入权利要求1或权利要求3或权利要求9-11中任一权利要求的DNA分子中、或引入权利要求2或权利要求4或权利要求5-7的感染性BVDV克隆中，其中所述一个突变或多个突变导致或增加了复原BVD病毒的减毒表型。
19.BVDV株的减毒方法，该方法包括步骤y)将一个或多个突变引入权利要求1或权利要求3或权利要求9-11中任一权利要求的DNA分子中或引入权利要求2或权利要求4或权利要求5-7的感染性BVDV克隆中；z)将突变DNA引入易感染宿主细胞，其中所述DNA被转录成RNA，或将由所述DNA转录的RNA引入所述细胞；和aa)收集由这些细胞产生的病毒粒子；其中所述一个突变或多个突变引起减毒。
20.权利要求18或19的方法，其中一个突变或多个突变为替换、缺失、插入、增加或其合并。
21.权利要求18-20中任一权利要求的方法，其中一个突变或多个突变是在糖蛋白Erns中并导致突变蛋白功能损伤或丧失。
22.权利要求21的方法，其中突变包括bb)全部或部分糖蛋白Erns的缺失；和/或cc)SEQ ID NO.1中位300处的组氨酸的缺失或替换；和/或dd)SEQ ID NO.1中位349处的组氨酸的缺失或替换。
23.通过根据权利18-22中任一权利要求的方法得到的减毒BVDV克隆或BVDV株。
24.包括根据权利23的减毒BVDV克隆或株的疫苗，可任选地结合药物可接受载体或赋形剂。
25.根据权利23的减毒BVDV克隆或株在BVDV感染的预防和治疗用疫苗生产中的应用。
全文摘要
本发明属于动物卫生特别是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)领域。本发明提供感染性BVDV克隆和产生所述BVDV克隆的方法。本发明还涉及使所述克隆减毒的方法、减毒BVDV克隆和包括所述减毒克隆的疫苗。
文档编号A61P31/14GK1551913SQ02817511
公开日2004年12月1日 申请日期2002年9月5日 优先权日2001年9月6日
发明者克努特·埃尔伯斯, 克里斯蒂安·迈耶, 马蒂纳·冯弗赖伯格, 格雷戈尔·迈耶斯, 冯弗赖伯格, 克努特 埃尔伯斯, 尔 迈耶斯, 蒂安 迈耶 申请人:贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司, 贝林格尔 英格海姆维特梅迪卡有限公