治疗运动神经元疾病的疫苗和方法

专利名称：治疗运动神经元疾病的疫苗和方法
技术领域：
和背景本发明涉及用于治疗运动神经元病(MND)，特别是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的疫苗和方法。
运动神经元病(MND)是一组侵犯脑(上级运动神经元)和脊髓(下级运动神经元)运动神经元的相关疾病。运动神经元是神经细胞，脑沿着它以电冲动的形式向肌肉发出指令。运动神经元的变性导致肌肉无力和消瘦。这通常最初发生在手或腿，一些肌肉群受到的影响多于其它的肌肉群。
有几种MND的分类。在MND最多的病例中，上级和下级运动神经元都发生变性。这种情况被称为肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也被称为Lou Gehrig’s病，其特点是肌无力、僵硬和(肌纤维)自发性收缩(肌束颤动)。也有不常见的类型，其中观察到更有选择性的上级运动神经元(如原发性侧索硬化，PLS)变性或者下级运动神经元(如进行性肌萎缩，PMA)变性。进行性延髓麻痹(PBP或延髓发病)是一种以下咽、咀嚼和构音困难开始的ALS，并且侵犯大约25％的ALS患者。
在这些MND的类型之间有相当多的重叠。患PMA的人最后累及上级运动神经元，在PMA和ALS两者中一些人可能最终经历不同程度的构音和下咽困难(延髓发作的ALS或PMA)。
ALS是以中枢神经系统(CNS)中控制随意肌肉运动的神经细胞的逐渐变性为特点的慢性、进行性的神经变性疾病。通常在疾病开始的2-3年到10年内，运动神经元的进行性丧失导致渐进性的骨骼肌萎缩和不可逆的死亡。起初最常见在手部观察到肌无力和萎缩以及前角细胞功能障碍的体征，而在脚部较少观察到。开始发病的部分是随机的，并且进展是不对称的。仅在美国当前有30,000人患有ALS，并且每年诊断到大约8,000个新发病例。
ALS以散发性(SALS)和家族性(FALS)的类型发生(Mulder等，1986；Munsat，1989)。原发性危险因子多半还不知道，然而所有ALS患者中5-10％是家族性的(FALS)。已经发现大约所有家族性类型中的20％患者在21号染色体上编码Cu/Zn超氧化物歧化酶的1型基因中有突变(Rosen等，1993；Brown，1995)。SOD是催化超氧阴离子转化成过氧化氢的酶，因此SOD能够保护细胞不受这些有毒自由基的有害影响。由于没有发现在酶活性、多肽的半衰期和抗蛋白酶解与开始发病的年龄和人疾病进展的速度之间的相关性(见Julien，2001的综述)，因此似乎不同SOD突变体的毒性不应归于自由基清除活性的降低。表达各种SOD1突变体的转基因小鼠发展了运动神经元疾病，因而构成公认的用于检验ALS和其它运动神经元治疗的动物模型。
最近，两个独立的科学家小组已经鉴定了一种新的ALS基因(Hadano等，2001；Yang等，2001)。这种被称为ALS2的新基因定位在2号染色体上，编码名为alsin的蛋白。在患有青少年型肌萎缩性侧索硬化(JALS)，也称为ALS2的人和患有青少年型原发性侧索硬化(JPLS)的人中新的ALS2基因都发生了突变。染色体不同区域的突变与不同的运动神经元疾病有关。具体地，在患有ALS的人中发现了一个区域中的突变，而在患有JPLS的人中发现了在两个其它区域中有突变。将来，带有这些突变的转基因小鼠必将构成检验ALS治疗的进一步模型。
在最近的10年中已经进行了许多用来理解该病的病因学、预后和进展的研究。除了承认在导致其进展的环境方面它是一种多因素疾病外，还没有取得一致的意见，而病因学仍然不清楚。
很显然，现在在许多其它慢性和急性神经变性疾病中发现了有助于ALS进展的许多因素。这些因素包括氧化应激、兴奋性毒性、营养支持的丧失和离子的不平衡。这些年来试图象在其它慢性和急性神经变性疾病中那样，通过阻断细胞毒性的不同介体来终止ALS的进展。这些临床试验中的大部分得到了否定的结果(Turner等，2001)。
氧化应激是以能够导致运动神经元死亡的自由基的积聚为特征的。自由基通过“氧化”而损伤细胞膜的组分、蛋白质或遗传物质。当SOD酶功能有障碍时可能会产生这些自由基，或者由于如在一些家族性ALS患者中发生遗传变异，或者由于神经细胞的化学环境的原因，或者由于谷氨酸兴奋性毒性或其它原因可能产生这些自由基。许多ALS患者服用辅酶Z Q10和维生素E以中和自由基。
谷氨酸是象癫痫持续状态、脑缺血、创伤性脑损伤、ALS、亨廷顿舞蹈病、山黧豆中毒和阿耳茨海默病(Alzheimer’s disease)等急性和慢性变性疾病中最常见的毒性介质之一(Pitt等，2000)。谷氨酸是人CNS中主要的兴奋性神经递质。L-谷氨酸存在于大多数突触中，并且能够表现出双重活性在正常的功能中作为必需的神经递质起关键作用，但是当超过其生理水平时就变得有毒了。
对于脊髓运动神经元，通过星形细胞中存在的谷氨酸转运蛋白EAAT2在突触活动之后迅速清除谷氨酸。在ALS患者的脑组织中发现了EAAT2活性和蛋白水平的降低(Rothstein等，1992)。这会导致细胞外谷氨酸浓度的升高以及运动神经元的死亡。临床上，谷氨酸释放抑制剂利鲁唑对人和转基因小鼠两者疾病病程的有益影响而导致成为公认的ALS的药物治疗。然而，在中和毒性影响方面，它可能干扰作为普遍存在的CNS神经递质的谷氨酸的生理功能。
这些年来一直争论ALS中免疫因子、细胞和分子的作用。如在许多其它神经变性病中一样，一直争论炎症是否与疾病传播有关以及免疫抑制药物在ALS中建议使用的量。而且，在许多ALS患者中观察到ALS与抗神经节苷脂抗体存在的相关性，这使一些研究者建议ALS是一种自体免疫性疾病。然而，还没有提供结论性的证据来支持这种假说。
在本发明者的实验室中，最近观察到在由于机械(轴突切开术)或生物化学(谷氨酸、氧化性应激)损害所导致的神经变性的情况下，免疫系统起着关键性的作用。因而，已经发现识别神经系统(NS)抗原的活化的T细胞促进神经再生或提供神经保护。参考PCT公开号No.WO 99/60021的申请，其全部内容在此引入作为参考。更具体地，在部分挤压破碎的视神经大鼠模型(Moalem等，1999)和在脊髓损伤的大鼠模型(Hauben等，2000)中显示MBP反应性T细胞具有神经保护作用。直到最近，一直认为免疫系统排斥免疫细胞参与神经系统的修复。非常令人惊奇的是，发现NS特异的活化T细胞可用于促进神经再生或保护神经系统组织避免由于CNS或周围神经系统(PNS)损伤或疾病所导致的损害之后可能发生的第二次变性。
本发明者进而观察到在CNS中，应激状态利用适应性的免疫反应来处理应激，并且这种反应受遗传控制。因而，在视神经的挤压损伤或者向玻璃体内注射毒性剂量的谷氨酸之后，显示在抗中枢神经系统(CNS)自身免疫病的成年小鼠或大鼠品系中视网膜神经节细胞的存活率高于易感品系的两倍以上。发现这种差异可归因于有益的自身免疫T细胞反应，中枢神经系统损伤后该反应在抗性品系中被自发地诱发，但不在易感品系中诱发。因而，假如调控得好的话，当引起抗其自身的T细胞反应时由于这种损伤而导致的神经元的存活率将会较高。换句话说，已经证实，引起保护性的自身免疫反应来对抗应激状态以便保护动物避免损伤的后果。进一步观察到，在调控这种反应的能力被损害的动物或在缺乏成熟T细胞的动物(由于在出生时进行了胸腺切除)中，处理应激状态的能力降低了。结果，在这些动物中CNS损伤后神经元的存活率显著低于具有设置了保护性自身免疫T细胞介导反应的有效机制的动物中神经元的存活率(Kipnis等，2001)。
本发明人进一步发现，在创伤性CNS损伤后用与自身蛋白相像的非致病性合成共聚物，如共聚物1(Cop 1或格拉默)，一种由四种氨基酸酪氨酸-谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸构成的无规共聚物(在下文称作“Cop 1”)，和聚(谷氨酸、酪氨酸)(在下文称作“PoluYE”)以及通过由此活化的T细胞的免疫能够用于提高保护性自身免疫，由此进一步减少创伤导致的损害，而且能够进一步保护CNS避免受谷氨酸的毒性作用。参考相应于WO 01/93893，都是2001年1月22日申请的我们在先的美国专利申请Nos.09/756,301和09/765,644，就好像这里已经完全公开了一样，其以整体形式在此引入作为参考，其公开了Cop 1、Cop 1-相关肽和多肽以及由此活化的T细胞保护CNS细胞避免受谷氨酸的毒性作用(USSN 09/756,301)以及防止或抑制CNS或PNS中神经元的变性或者促进神经的再生(USSN 09/765,644)。进一步参考我们于2001年6月28日申请的在先的美国专利申请No.09/893,344，就好像这里已经完全公开了一样，其整体在此引入作为参考，其公开了以前称为polyGT，也称为PolyYE的聚-Glu50Tyr50共聚物以及由此活化的T细胞，保护CNS细胞避免谷氨酸毒性，而且也防止或抑制CNS或PNS中神经元的变性或促进神经的再生。具体地，在所述的申请中显示，用Cop-1免疫或用聚(谷氨酸、酪氨酸)免疫的小鼠视神经纤维中，存活的视网膜神经节细胞的数量显著高于用PBS注射的小鼠。
公认的并且目前可以有效用于ALS治疗的唯一药物是利鲁唑(2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并噻唑)，一种被认为是谷氨酸释放的阻断剂，其似乎在这种情况下可能通过抑制CNS中谷氨酸的传递而具有一些减少痉挛的效果。其以片剂形式口服。利鲁唑不能治愈疾病或者改善症状。其通过延长患者约3个月的生命而在ALS患者中产生中等至显著的效果，但是不改善肌肉的强度或神经功能。
非常理想的是进一步提供治疗包括ALS在内的运动神经元病的药物。
本申请的本部分或任意其它部分中对任何参考文献的引用或确认都不应认为是承认该文献是对本发明有用的现有技术。
发明概述根据本发明，现已发现用Cop 1免疫能够保护用作ALS模型的过度表达的人SOD 1的转基因小鼠和面神经轴突切开术后的小鼠都避免运动神经元变性。这个发现以及Cop 1和PolyYE都能够有效地保护视网膜神经节细胞避免受谷氨酸毒性作用的事实表明，这些共聚物适合于治疗运动神经元病，特别是ALS。
申请在一个方面中，本发明涉及用于减少患运动神经元病(MND)患者疾病进展、用于防止运动神经元变性和/或防止受谷氨酸毒性作用的方法，包括用含有活性试剂的疫苗免疫所述的患者，其中该活性试剂从由Cop 1、与Cpo1相关的肽、与Cop 1-相关的多肽和PolyYE构成的组中选出。
运动神经元病(MND)是任何侵犯脑和脊髓中运动神经元的疾病，包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、家族性(FALS)和散发性(SALS)ALS、原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、进行性延髓麻痹(PBP或延髓开始发病)及其结合的形式，如延髓开始发病的ALS和延髓开始发病的PMA。
在一个实施方案中，本发明的方法包括也用利鲁唑或任何其它适合于治疗MND，特别是ALS的药物进行治疗。
在另一个方面中，本发明提供用于减少运动神经元病(MND)，特别是ALS中的疾病进展、防止在运动神经元变性和/或防止受谷氨酸毒性作用的疫苗，包括从由Cop 1、与Cpo1相关的肽、与Cop 1-相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出的活性试剂。
在进一步的方面中，本发明涉及从由Cop 1、与Cpo1相关的肽、与Cop 1-相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出的活性试剂用于制备用于减少运动神经元病(MND)，特别是ALS中的疾病进展、防止运动神经元变性和/或防止受谷氨酸毒性作用的疫苗中的用途。
活性试剂可以不用任何佐剂施用，或者其可以在适合人临床使用的佐剂中被乳化。适合人临床使用的佐剂选自氢氧化铝、氢氧化铝凝胶和羟基磷酸铝。在优选的实施方案中，疫苗助剂是具有酸性等电点和Al∶P之比为1∶1(这里称作铝-磷酸)的无定形羟基磷酸铝。
在一个优选的实施方案中，本发明疫苗的活性试剂是Cop 1。在另一个优选的实施方案中，活性试剂是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
另外，疫苗可以以包括施用利鲁唑或任何其它适合治疗ALS的药物的药方使用。
附图的简要说明

图1显示用不含佐剂的Cop 1或PolyYE进行免疫来保护小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)避免受谷氨酸的毒性作用。
图2A-B显示用含Cop1(2A)或PolyYE(2B)的佐剂(CFA)进行免疫来保护小鼠RGCs避免受谷氨酸的毒性作用。
图3A-B显示用PolyYE(图3A)或Cop 1(图3B)进行的免疫对青光眼眼内压(IOP)模型中RGCs存活率的影响。
图4A-4B描绘了过度表达人SOD 1突变体的转基因小鼠(在下文中称“ALS小鼠”)进行肌肉强度测试的结果。图4A显示用乳化于铝-磷酸中的Cop 1免疫的ALS小鼠(1、2和4号小鼠)和非免疫的转基因小鼠(3、5和6号小鼠)每周在旋转的垂直杆上的平均悬挂时间(秒)。图4B描绘了3只用含Cop 1的铝-磷酸免疫的ALS小鼠(黑色柱)与3只非免疫的转基因小鼠(对照，灰色柱)平均悬挂时间(基线的百分率％)的比较。为了比较疾病进展率，使所有动物肌肉无力开始的时间(时间为0)一致，使每个动物悬挂时间到其疾病开始发作前的自身基线时间标准化(基线时间-100％)。该附图描绘了在疾病进展后的几周里每组的悬挂时间的平均值±SEM。
图5显示用含Cop 1的铝-磷酸免疫的ALS小鼠(黑色正方形)保存的体重与非免疫小鼠(灰色菱形)的比较。
图6是显示用含Cop 1的CFA免疫的ALS小鼠的期望寿命的曲线图。脊髓运动神经元的进行性丧失导致麻痹。没有接种的对照(n＝15)在一个或更多的肢体中出现麻痹，并且在211±7(平均值±SD)天龄时死亡。经Cop 1处理的小鼠存活了263±8天。
图7显示用含Cop 1的CFA免疫的ALS小鼠和用利鲁唑处理的ALS小鼠的期望寿命。利鲁唑处理的和用Cop 1免疫的ALS小鼠显示分别比没有接种的对照小鼠高9％和25％。
图8显示在Cop 1处理的和未处理的ALS小鼠中在指定的时间点所测量的平均旋转活动。允许小鼠抓紧和握住下端带有小环的垂直金属线(直径2mm)。通过计算机化的系统分别记录它们的活动并且每日进行评价。为了统计学的评价，将旋转活动归一化到每只小鼠在从第40天到第60天的平均活动。以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示数据。在下列时间段观察到处理的和未处理的小鼠之间有显著的差异第12天和第20天之间(P＜0.058)、第21天和第24天之间(P＜0.0079)以及第25天和第28天之间(P＜0.0017)。
图9A-D显示在面神经轴突切开术之后通过给小鼠施用Cop 1来挽救运动神经元。轴突切开术后8周，用Cop-1免疫接种的小鼠的脑干中荧光金标记的运动神经元的数量(图9D)显著多于在用含PBS的CFA注射的组中所获得的数量(图9B)。用Cop-1处理没有影响未受到损伤的面神经核中的运动神经元的数量(图9A，9C)。用含PBS的CFA免疫的对照没有保护性效果。
本发明的详述本发明提供用于减少患有MND，特别是ALS的患者疾病进展、防止运动神经变性、延长生命和改善生命质量、和/或避免受谷氨酸毒性作用的疫苗和方法，其包括用含有活性试剂的疫苗免疫所述的患者，其中该活性试剂从由Cop 1、Cpo1相关肽、Cop 1相关多肽或PolyYE构成的组中选出，不使用佐剂或者在适合人临床使用的佐剂中乳化。
正如这里使用的，术语“运动神经元”(“motor neurons”和“motonneurons”)、术语“PolyYE”和“聚(谷氨酸、酪氨酸)”以及术语“Cop1”和“共聚物1”，每对都是可以互换使用的。
为了本发明的目的，“Cop 1或者与Cop 1相关的肽或多肽”意味着包括任何肽或多肽，包括无规共聚物，它们与髓鞘碱性蛋白(MBP)有功能性交叉反应并能在抗原呈递中与MBP竞争MHC-II类。
本发明的疫苗可能含有作为活性试剂的无规共聚物，该共聚物含合适量的带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸，与带负电荷的氨基酸(优选较少量)如谷氨酸或天冬氨酸的组合，可任选地与作为填充物的不带电的中性氨基酸如丙氨酸或甘氨酸组合，并可任选地与适于赋予共聚物免疫原性的氨基酸如像酪氨酸或色氨酸之类的芳香族氨基酸组合。这种疫苗可包括公开于WO 00/05250中的那些共聚物中的任何一种，其全部内容在此引入作为参考。
更具体地，用于本发明的疫苗含有至少一种共聚物，它选自含有一种氨基酸的无规共聚物，该氨基酸选自以下各组中至少三组中的每一种(a)赖氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；和(d)酪氨酸和色氨酸。
用于本发明的共聚物可由L-或D-氨基酸或者其混合物组成。本领域技术人员已知，L-氨基酸存在于大多数的天然蛋白中。然而，D-氨基酸有商业供应并可取代用于制备本发明中使用的三元共聚物和其它共聚物的一些或所有氨基酸。本发明考虑使用同时含D-和L-氨基酸的共聚物，以及基本上由L-或由D-氨基酸组成的共聚物。
在本发明的一个实施方案中，共聚物含有四种不同的氨基酸，每种氨基酸来自(a)到(d)组中不同的组。根据该实施方案，优选的共聚物包含丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸的组合，其带有净总正电荷且分子量为约2,000-40,000Da，优选约2,000-13,000Da，最优选地是平均分子量为约4,700-13,000Da的共聚物1。优选的分子量范围和制备优选形式Cop 1的方法描述于美国专利No.5,800,808中，其全部内容以整体形式在此引作参考。显而易见这只是以实例的方式给出，并且如果与以上一般标准一致，那么疫苗的成分及成分的相对比例都可以变化。因而，共聚物可以是约15到约100个氨基酸长度的多肽，优选约40到约80，优选具有属名格拉默乙酸盐的共聚物。
在另一个实施方案中，共聚物含有三种不同的氨基酸，每种来自(a)到(d)组的三组中的不同组。这些共聚物在此称为三元共聚物。
在一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸，以下称为YAK。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数可以变化。例如，酪氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.250；丙氨酸的摩尔分数可以是约0.3-0.6；以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0.1-0.5。平均分子量为2,000-40,000Da，优选为约3,000-35,000Da。在更优选的实施方案中，平均分子量为约5,000-25,000Da。可以用精氨酸取代赖氨酸、用甘氨酸取代丙氨酸、和/或用色氨酸取代酪氨酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸，以下称为YEK。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数可以变化谷氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.300，酪氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.250，以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0.3-0.7。平均分子量为2,000-40,000Da，优选为约3,000-35,000Da。在一个更优选的实施方案中，平均分子量为约5,000-25,000Da。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、用精氨酸取代赖氨酸，和/或用色氨酸取代酪氨酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有赖氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下称为KEA。这些多肽中氨基酸的平均摩尔分数也可以变化。例如，谷氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.300，丙氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.600，以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0.2-0.7。平均分子量是2,000-40,000Da，优选为约3,000-35,000Da。在一个更优选的实施方案中，平均分子量是约5,000-25,000Da。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、用甘氨酸取代丙氨酸、和/或用精氨酸取代赖氨酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物含有酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下称为YEA。这些多肽中氨基酸的平均摩尔分数可以变化。例如，酪氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.250，谷氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.300，以及丙氨酸的摩尔分数可以是约0.005-0.800。平均分子量在2,000-40,000Da之间，优选在约3,000-35,000Da之间。在一个更优选的实施方案中，平均分子量是约5,000-25,000Da。可以用色氨酸取代酪氨酸、用天冬氨酸取代谷氨酸、和/或用甘氨酸取代丙氨酸。
在更优选的实施方案中，这些三元共聚物中氨基酸的摩尔分数大约是共聚物1优选的摩尔分数。共聚物1中氨基酸的摩尔分数是谷氨酸约0.14，丙氨酸约0.43，酪氨酸约0.10以及赖氨酸约0.34。最优选的共聚物1的平均分子量为约5,000-9,000Da。如果进行一个或多个下面的取代，此处公开的疫苗中共聚物1的活性预期仍保留天冬氨酸取代谷氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、精氨酸取代赖氨酸和色氨酸取代酪氨酸。
更优选的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的三元共聚物或YEA，其单体摩尔比是约0.21比约0.65比约0.14。
更优选的谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸的三元共聚物或KEA，其单体摩尔比是约0.15比约0.48比约0.36。
更优选的谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸的三元共聚物或YEK，其单体摩尔比是约0.26比约0.16比约0.58。
更优选的酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸的三元共聚物或YAK，其单体摩尔比是约0.10比约0.54比约0.35。
可通过本领域技术人员可用的任何方法制备三元共聚物。例如，可在缩合条件下用期望摩尔比的氨基酸溶液制备三元共聚物，或者通过固相合成方法制造。缩合条件包括合适的温度、pH和溶剂条件，供一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合形成肽键。缩合剂，例如二环己基碳化二亚胺，可用于促进肽键的形成。封闭基团可用于保护官能团，如侧链部分以及一些氨基或羧基，避免不期望的副反应。
例如，可使用在美国专利3,849,650中公开的方法，其中酪氨酸、丙氨酸、γ-苄基谷氨酸以及N-ε-三氟乙酰赖氨酸的N-羧基酐在室温下无水二氧六环中用二乙胺作为引发剂进行聚合。用含溴化氢的冰醋酸可使谷氨酸的γ-羧基去封闭。用1摩尔哌啶除去赖氨酸的三氟乙酰基。本领域技术人员容易理解，通过选择性去除与谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或赖氨酸中任何一项有关的反应，可对方法进行调整以制造含期望氨基酸，也即共聚物1中四个氨基酸中的三个的肽和多肽。对此应用目的，术语“环境温度”和“室温”意指约20到约26℃的温度范围。
多肽合成期间或制造出三元共聚物以后，可调节三元共聚物的分子量。在多肽合成期间调节分子量，要调节合成条件或氨基酸的量，使多肽达到期望的大致长度时停止合成。合成之后，期望分子量的多肽可通过任何可用的大小选择方法，如在分子量选择柱或凝胶上的多肽层析，然后收集期望的分子量范围。本发明的多肽也可被部分水解以除去高分子量的部分，例如通过酸或酶的水解，然后纯化以除去酸或酶。
在一个实施方案中，可用以下方法制备期望分子量的三元共聚物，其中包括将受保护的多肽与氢溴酸反应以形成具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽。通过一次或多次试验反应确定反应的持续时间和反应温度。试验反应期间，改变时间和温度并测定给定批次试验多肽的分子量范围。将提供最佳分子量范围的多肽批次所使用的试验条件用于批量生产。因而，可通过以下方法制造具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，其中包括按试验反应已确定的反应时间和温度将受保护的多肽与氢溴酸反应。接着用哌啶水溶液进一步处理具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，以形成具有期望分子量的低毒性多肽。
在优选的实施方案中，使给定批次的受保护的多肽测试样品在温度约20-28℃下与氢溴酸持续反应约10-50小时。通过进行几次试验反应确定该批次的最佳条件。例如，在一个实施方案中，使保护多肽在温度约26℃下与氢溴酸持续反应约17小时。
因为Cop 1与跟MS-缔合的HLA-DR分子的结合基序是已知的(Fridkis-Hareli等，1999)，很容易制备确定序列的多肽并按Fridkis-Hareli等(1999)所述的方法测试其与HLA-DR分子的肽结合沟的结合。这种肽的实例公开于WO 005249，其全部内容在此引作参考。在所述申请中具体公开的肽中的32个在下表1中列出。预期这种肽和其它类似肽具有类似Cop 1的活性。这种肽和其它类似肽也被认为在与Cop 1相关的肽或多肽的定义范围内，并且其用途被认为是本发明的一部分。
根据本发明的“与Cop 1相关的多肽”的定义被解释为包括其它合成的氨基酸共聚物，例如Fridkis-Hareli等2002描述的无规的四种氨基酸的共聚物，作为多发性硬化治疗的候选共聚物，即含有苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸(聚FEAK)或酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和赖氨酸(聚YFAK)的共聚物(14-，35-和50-聚体)，以及任何其它发现可被认为类似于Cop1和PolyYE的通用抗原的类似共聚物。
表1
根据本发明，优选用于本发明疫苗的共聚物是共聚物1，此处也称为Cop 1，最优选其属名为格拉默乙酸盐的乙酸盐形式。格拉默乙酸盐已经在几个国家被批准用于治疗多发性硬化(MS)，商品名为COPAXON_(Teva Pharmaceutical Ltd.，Petah Tikva，Israel的商标)。几个临床试验表明Cop 1的耐受性良好，只有很少的副反应且大多是在注射部位的轻度反应(Johnson等，1995)。
如前面提到的，SOD 1基因中的突变是家族性ALS的一种遗传学原因(Rosen等，1993；Brown，1995)。几个表达突变SOD 1基因的小鼠模型产生了类似于人的运动神经元变性(Gurney等，1994；Ripps等，1995；Kong和Xu，1998)。这些小鼠品系的原始特性已经证明由突变酶引起的有害特性的显著增加导致运动神经元变性(见Bruijn和Cleveland，1996的综述)。另外，这些分析确证了已经在人类中观察到的众多病理特征(Hirano，1991；Chou，1992)。为了理解这种被称为SOD 1改变的突变，产生了一种公认的测试家族性ALS治疗的动物模型(ALS小鼠)。由于与SOD 1相关的家族性ALS和散发性ALS(占所有ALS病例的90％)有相似的症状和病理特征，因此带有突变SOD 1基因的转基因小鼠是公认的测试家族性和散发性两种ALS类型治疗的动物模型，并且是被ALS治疗定展基金(ALS-TDF)使用的模型。ALS小鼠产生了近似ALS的运动原病。运动功能障碍最终导致其死亡。
根据本发明，尽管SOD过度表达产生了氧化应激条件，但是用在CFA或适合人使用的佐剂中乳化的Cop 1的疫苗免疫的ALS小鼠显示避免了运动神经的变性。因而，用含有“普遍的”弱自身反应抗原Cop1的CFA接种的ALS小鼠(平均值±标准偏差，263±8天，n＝14)与未处理的相匹配的对照(211±7天；n＝15；P＜0.0001)相比，生命延长了52天。接种显著地改善了临床和临床前期中的运动活性。另外，用Cop 1接种也预防了面神经轴突切开术之后的急性运动神经元变性接种小鼠中存活的运动神经元几乎比轴突切开术对照的高200％(P＜0.05)。这些结果暗示自身免疫保护的观念可以扩展到包括运动神经元病。其也可能有戏剧性的临床意义。
根据本发明的免疫使用的佐剂是基于铝的佐剂。含有病毒来源的抗原如乙肝病毒表面抗原或b型流感嗜血杆菌荚膜多糖疫苗是更常使用的佐剂，这些佐剂第一次与合成共聚物，特别是Cop 1一起使用。
尽管本发明包含任何其它合适的剂量，但是Cop 1或PolyYE的给药剂量将由医师根据病人的年龄和疾病的阶段决定并且可以在从10-80mg的范围内选择。至少每月给药一次或者至少每2或3个月给药一次，或者以更少的频率给药，但是根据患者的情况，本发明预见了免疫之间的任何其它合适的间隔。
本发明的疫苗可以通过任何合适的方式给药，包括口服、肌肉内、皮下和皮内给药，使用或不使用佐剂。
当与利鲁唑或任何其它适合治疗MND，特别是ALS的药物一起给药时，根据制造商的说明书，在免疫接种的同一天和此后的每天给予附加的药物，与疫苗处方无关。例如，利鲁唑的每日剂量是100mg。
以下实施例举例说明了本发明的某些特征，但不是对本发明范围的限定。
实施例材料和方法动物8-13周龄的C57BL/6J系小鼠由魏兹曼科学研究所动物繁殖中心提供(Rehovot，Israel)。在用于实验之前，通过腹膜内给予80mg/kg氯胺酮和16mg/kg赛拉嗪麻醉小鼠。过度表达含有甘氨酸93→丙氨酸(G93A)基因的缺陷型人突变体SOD 1等位基因的转基因小鼠(B6SJL-TgN(SOD 1-G93A)1Gur(即这里的“ALS小鼠”)购自杰克逊实验室(Bar Harbor，ME，USA)。根据实验动物管理和使用委员会(IACUC)制定的规则来使用动物。
材料Cop 1(中值分子量7,200道尔顿)来自TevaPharmaceuticals Ltd.(Petah Tikva，Israel)。羟基磷酸铝凝胶(REHYDRAPHOSTM疫苗佐剂，即这里的铝-磷酸)购自Reheis(NJ，USA)。如果没有其它说明，含有0.5mg/ml结核杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)购自Difco(Detroit，Michigan，USA)。
免疫用在CFA或Cop 1-铝-磷酸中乳化的Cop 1(100μl总体积中含有100μg)免疫小鼠。将铝-磷酸与Cop 1以1∶4的比例剧烈混合。在小鼠胁腹的一个位置皮下(SC)注射每种疫苗。给对照小鼠注射含有甘露醇的CFA或者铝-磷酸。
谷氨酸注射用27号针头在巩膜的上部刺穿麻醉的C57B BL/6J小鼠的右眼，用带30号针头的10μl Hamilton注射器插入玻璃体。向小鼠注射溶于盐水中总体积为1μl的L-谷氨酸(200nmol)。
标记小鼠视网膜神经节细胞(RGC)在实验结束前标记RCGs72小时。将小鼠麻醉并置于立体定位装置中。暴露颅骨并且保持干燥和清洁。确认前囟并作标记。将注射点指定在位于离脑表面2mm深、在前后轴中在前囟后2.92mm，以及距中线0.5mm的侧向。在左右半球中指定的坐标轴上的头皮中钻一个窗口。然后用Hamilton注射器施用神经示踪物染料荧光金(5％盐水溶液；Fluorochrome，Denver，CO)，(1μl，在每个半球中的速率为0.5μl/min)，接着缝合伤口上的皮肤。染料的逆向摄入提供了活细胞的标记。
评估小鼠RGC的存活率给予小鼠致死量的戊巴比妥(170mg/kg)。摘除眼球，分离视网膜，并在低聚甲醛(4％PBS)中制成平展的完整标本。在4-6个选定的相同大小的视野中(0.7mm2)计数标记的细胞。选定的视野位于距视神经盘(0.3mm)大致相同的距离处，以克服作为离视神经盘距离函数的RGC密度的变化。由不了解小鼠所受处理的观察者在荧光显微镜(放大800倍)下对视野进行计数。计算每个视网膜中每个视野RGC的平均数。
肌萎缩性侧索硬化模型用在铝-磷酸中乳化的Cop-1(100μl总体积中含100μg，在每只小鼠的侧腹皮下注射)接种3只75天龄的ALS小鼠。一周后和此后每月给予小鼠强化注射。另外3只转基因小鼠不进行免疫，用作为疾病自发性进展的对照。通过盲试每只小鼠在旋转的垂直杆上悬挂的时间来评价肌肉强度。由于大多数动物能够在转杆上悬挂的最大时间是5分钟，因此每个实验持续到5分钟。
肌肉强度试验根据以前描述的方法(Kong和Xu，1998)进行试验。让小鼠抓紧和握住下端带有小环的垂直金属线(直径2mm)。垂直金属线允许小鼠使用前腿和后腿抓住金属线。金属线在垂直方向以24rpm进行圆周运动(圆半径是10cm)。用计时器记录小鼠能够在金属线上悬挂的时间。因为大多数小鼠在5分钟内跌落，因此试验在5分钟时中断。通常每周试验小鼠一次并且持续试验直到小鼠不再能在金属线上悬挂为止。
数据分析通过Mantel-Cox检验和Cox’s正比危险回归分析的方法分析存活率数据。使用SPSS-PC软件程序(SPSS，Chicago，IL)通过单因素方差分析，然后通过两两比较Student-Neuman-Keuls方法检验统计学意义。
实施例1.通过用乳化于铝-磷酸的Cop 1进行主动接种来保护神经元避免受谷氨酸的毒性作用第一次检验是否可以通过用乳化于CFA或铝-磷酸中的Cop 1的主动接种来阻断谷氨酸诱导的毒性。CFA是不允许用于人的佐剂，经常仅在实验室动物实验中使用。铝-磷酸和其它基于氢氧化铝的佐剂得到FDA和其它权威机构的允许，广泛地在兽用以及人疫苗中使用。
在C57BL/6J小鼠胁腹的一个部位皮下注射在CFA或在铝-磷酸中乳化的Cop 1(在100μl总体积中含100μg)，并且7天后将谷氨酸(200nmol)注射到小鼠的玻璃体中。7天后计数存活的RGC。将没有进行任何预先免疫随后受谷氨酸毒性作用的小鼠RGC的存活率作为100％。
如表2中所示，在注射谷氨酸前用含有Cop 1的CFA或铝-磷酸预先免疫7天的小鼠产生了显著的保护视网膜神经节细胞避免受谷氨酸毒性作用的保护作用，但是乳化于铝-磷酸中的Cop 1的保护作用显著高于CFA。
表2通过用含Cop 1的CFA或铝-磷酸主动接种来保护神经元避免受谷氨酸的毒性作用
*P＜0.05；双尾Student’s t检验.
实施例2通过用含或不含佐剂的Cop 1或者PolyYE接种来保护神经元避免受谷氨酸的毒性作用谷氨酸毒性是ALS神经变性的危险因素之一。为了检查用不含佐剂的Cop 1和PolyYE进行的免疫对保护神经元避免受谷氨酸毒性作用的效率，将C57BL小鼠的视网膜暴露到过量的谷氨酸中。将C57BL小鼠分成4个实验组1.没有免疫的动物-阴性对照，n＝92.每只小鼠用25μg PolyYE免疫的动物，n＝103.每只小鼠用225μg PolyYE免疫的动物，n＝104.每只小鼠用75μg Cop 1免疫的动物，n＝7在眼内注射谷氨酸7天前，用溶于100μl PBS的PolyYE或Cop 1免疫处理组。对暴露于增高水平的谷氨酸7天后存活的RGC数量进行计数，并且计算占正常眼的百分数。结果显示于图1。所有处理组(2-4组)中RGC的存活率显著高于阴性对照组(p＜0.001，t检验)。
在另外的实验中，在眼内注射谷氨酸前7天，用乳化于铝-磷酸中的Cop 1(100μg)(n＝8)或仅用铝-磷酸(n＝8)或用乳化于CFA的PolyYE(100μg)(n＝24)或仅用佐剂(阴性对照)(n＝27)(100μl)处理C57B1小鼠。对暴露于增高水平的谷氨酸7天后存活的RGCs数量进行计数。计算存活的RGC占未处理组中全部RGC丧失的百分率作为保护率。结果显示于图2A-B中。在Cop 1处理组(图2A)和PolyYE处理组(图2B)中RGC的存活率显著高于仅接受佐剂的阴性对照组。
在谷氨酸毒性模型中检验高分子量尺寸(中值分子量12,600，15,500和22,000道尔顿)的Cop 1。如上面描述的，在急性谷氨酸毒性模型中测定在RGC中诱发的特异性神经保护性反应的效能。在眼内注射谷氨酸(200nmol)以前14天，免疫C57BL/6小鼠(每个实验共5组，每组10只动物)，在谷氨酸注射后7天检查RGC的存活率。检验每种分子量Cop 1的3种剂量，并且与阴性对照(仅谷氨酸)和阳性对照(谷氨酸毒性前7天，注射75μg分子量为7,200道尔顿的Cop 1)进行比较。
实施例3.青光眼模型中用Cop 1和PolyYE接种的神经保护效果青光眼是一种进行性的视神经元丧失的慢性神经变性疾病，最终导致失明。逐渐增高的眼内压(IOP)被认为是主要危险因素，并且相信是神经元死亡的主要原因。因此，生化试剂或设计用于降低IOP的手术是当今标准的治疗方法。然而，降低IOP并不总是足以停止神经元的丧失。而且，视神经变性有时发生在缺乏IOP增高的青光眼中，一种称为正常压力的青光眼疾病(约在三分之一的青光眼患者中发生)。因而，神经保护性治疗被认为是合适的。我们使用了大鼠IOP慢性增高的模型来检查Cop 1或PolyYE接种在减少神经元死亡方面的能力，神经元死亡发生在持续应激的情况下，如同其可能在ALS患者中发生的那样。由于青光眼是如ALS一样的慢性神经变性疾病，因此在青光眼模型中提供的神经保护可能指示在ALS中有类似的神经保护作用。
按如下方法诱导高IOP使用发射蓝-绿氩激光辐照的Haag-Streit狭缝灯，直接向麻醉的成年雄性Lewis大鼠的右眼巩膜外层的4个静脉中的3个以及针对270度的边缘丛静脉应用80-120次。使用1瓦的激光束持续0.2秒，在巩膜外层静脉产生100mm大小的斑点，在边缘丛静脉产生50mm大小的斑点。1周后在第2次使用激光时，除了对所有的应用斑点大小都是100mm外，使用相同的参数。直接对所有的4条巩膜外层静脉和360度的边缘丛静脉辐照24小时。
为了测量IOP的提高，向大鼠腹膜内注射10mg/ml马来酸乙酰丙嗪，一种不减少IOP的镇静药，将Localin应用到角膜，5分钟以后用Tono-Pen XL眼压计(自动化的眼科仪器，Ellicott City，MD，USA)测量两眼中的压力。计算每只眼10次测量的平均值。如在下表3所示，在第一次激光处理后一周，IOP的水平达到大约30mmHg，直到实验结束(第一次激光处理后3周)也没有任何显著性的改变。
为了测定RGC的存活率，第一次激光处理后3周，直接将亲水性的神经示踪物染料葡聚糖四甲基罗丹明(罗丹明葡聚糖)(分子探针，Oregon，USA)应用到眼神经的眶内部分。只有幸免于高IOP的仍然具有功能并且其细胞体仍然存活的轴突，才能摄入染料并且证明为标记的RGC。24小时后处死大鼠，摘除视网膜，完整地固定，在Zeiss荧光显微镜中放大800倍计数标记的RGC。计数每个视网膜的4个视野，所有的都具有相同的直径(0.076mm2)并且距视盘相同的距离。由不了解视网膜身分的观察者计数RGC。
表3总结了3周后具有正常IOP的大鼠和用激光诱导的IOP增加的大鼠中RGC的存活率表3
3a.在青光眼IOP模型中PolyYE接种对RGC存活率的影响在第一次激光处理后1小时，用在CFA中乳化的PolyEY(500μg)免疫SPD大鼠(n＝9)。一个对照组用无抗原的CFA免疫(n＝7)，第二个对照组仅注射PBS(n＝5)。如图3A所示，尽管在整个实验期间IOP仍然是升高的，PolyEY免疫的大鼠，但不是PBS免疫的大鼠与未免疫的大鼠相比显示其RGC的存活率显著增加。计算在接受处理的组中存活的细胞占非免疫组中丧失的全部细胞的百分率作为RGC的保护率。
3b.在青光眼IOP模型中Cop 1的接种对RGC存活率的影响使用IOP增高的大鼠模型时，当在IOP开始增高时或者一周后给予Cop 1(含500μg的CFA)显示能够减少神经元的损失(见图3B)，尽管IOP仍然很高并且神经变性已经开始。另外，与降低IOP的药物溴莫尼定(brimonodine)一起给予Cop 1的接种导致RGC的保护率高于仅使用溴莫尼定(见图3B，插图)。
实施例4.Cop 1免疫防止转基因SOD 1突变体小鼠(ALS小鼠)中运动神经的变性为了检验Cop 1免疫是否能够避免运动神经元变性的进展，当ALS小鼠SOD 1(n＝3)75天时，用含Cop 1的铝-磷酸免疫小鼠，一周后给予强化。接着每30天免疫一次。ALS小鼠的对照组不用Cop 1免疫。然后通过盲性检测在旋转垂直杆上悬挂的时间每周测试几次小鼠的肌肉强度。每个实验持续5分钟。
图4A-B中描述了小鼠肌肉无力的发展情况。图4A描述了每周每个动物的平均悬挂时间(结果是平均值±SEM)。如图显示的，Cop 1免疫动物中的两只动物显示悬挂时间长于非免疫的小鼠。
在单个小鼠中肌肉强度降低开始发生的情况不同。为了评估接种对每只小鼠下降速率的影响，将任何特定时间的肌肉强度与下降开始前一周的强度进行比较。
图4B显示单个转基因小鼠中肌肉强度下降的同步图。显而易见，不管在免疫当天其强度如何，用Cop-1免疫的小鼠显示显著低的肌肉强度下降率。因而，与未免疫的动物相比，它们保持较长时间运动的能力。
Cop 1免疫的有益影响也反映在小鼠体重方面。如图5所示，随着疾病的进展，Cop 1免疫的转基因小鼠也显示了较缓慢的体重降低。在86-111天龄之间，所有未免疫的转基因小鼠体重降低了2克。相反，在Cop 1免疫组中有1只小鼠体重没有变化，2只小鼠体重增加2克。
Cop 1的免疫也影响转基因小鼠的死亡率。随着疾病的进展，小鼠变得麻痹和死亡。Cop 1的免疫显著延长了转基因小鼠的生命而未处理的小鼠在疾病开始发作后的2、3和4周时死亡，有1只Cop 1免疫的小鼠在疾病开始发作后存活了4周，其它两只存活了7周(表4)。在死亡的时间上，Cop 1免疫的转基因小鼠平均是3周，长于未免疫的小鼠。
表4.Cop 1的免疫延长了过度表达人SOD-1的突变体转基因小鼠的生命
实施例5.Cop-1的处理增加了ALS小鼠的期望寿命用在含有5mg/ml结核杆菌的CFA(Difco Laboratories，Heidelberg，Germany)乳化的Cop 1(75μg)接种14只60天龄的ALS小鼠。将乳剂(总体积200μl)注射到后足垫，随后每日在饮用水中给予小鼠口服的Cop 1(12.5mg/kg/天)。每日观察并且每周称重在60天龄用Cop-1免疫的小鼠和未处理的对照小鼠。监测小鼠的运动活性和死亡率。以第一次出现震颤和/或肢体颤动，或者当抓住尾巴将小鼠悬在空中时后肢垂下(而不是展开)时的年龄(以天数表示)确定症状开始发作的年龄。正反射的丧失被认为是预示疾病的末期。脊髓运动神经元的逐渐丧失导致麻痹。如图6所示，非接种对照组(n＝14)的一个或更多的肢体变得麻痹并在211±7天龄(平均值±标准偏差)前死亡。Cop-1处理的小鼠存活了263±8天。因而，用Cop-1接种显著地增加了ALS小鼠的期望寿命(图6)。
作为阳性对照，给予15只ALS小鼠日剂量(30mg/kg)的利鲁唑，其是当前给予ALS患者的唯一药物。如图7显示，利鲁唑处理的小鼠显示存活率相对于对照增加了9％，而Cop 1处理的小鼠显示相对于对照增加了25％。
除了生命周期几乎增加25％外，疾病发作(通过运动完成情况表现出来)被延迟，预示有益之处也表现在临床前期和临床期的生命质量中(图8)。让小鼠抓紧和握住下端带有小环的垂直金属线(直径2mm)。使用转杆装置(LMTB，Berlin)评估在40天和60天龄之间的夜间运动活动(从晚上8点到早上8点)获得每只小鼠的正常值。通过计算机化的系统分别记录每只小鼠的活动并且每日评估。为了进行统计学评价，将转杆活动归一化为每只小鼠从第40天到第60天的平均活动。将数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。通过方差分析(ANOVA)比较转杆测试和体重。利用SPSS-PC软件程序(SPSS，Chicago，IL)通过单因素方差分析然后通过两两比较Student-Neuman-Keuls方法检验统计学意义。在下列时间阶段观察到在Cop-1处理的小鼠和未处理的小鼠之间的显著性差异第12天和第20天之间(p＜0.058)，第21天和第24天之间(p＜0.0079)以及第25天和第28天之间(p＜0.0017)。
实施例6.用无佐剂的Copl处理ALS小鼠将ALS小鼠分成11个实验组(每组15只动物)1.未处理的小鼠-阴性对照组。
2.利鲁唑处理的小鼠-30mg/kg/天3.用含Cop 1的CFA免疫的小鼠-初始接种75μg，随后每日口服Cop 1(12.5mg/kg-阳性对照组。
4.两次注射75μg Cop 1免疫的小鼠第一次注射在第45天，第二次注射在第59天。
5.如#4组的方法免疫的小鼠，随后在第87天时单次注射100μg Cop 1。
6.两次注射150μg Cop 1免疫的小鼠第一次注射在第45天，第二次注射在第59天。
7.两次注射75μg Cop 1免疫的小鼠第一次注射在第83天，第二次注射在第97天。
8.同#4组，用利鲁唑30mg/kg/天免疫。
9.同#5组，用利鲁唑30mg/kg/天免疫。
10.同#6组，用利鲁唑30mg/kg/天免疫。
11.同#7组，用利鲁唑30mg/kg/天免疫。
在处理开始前两周，开始每周监测一次小鼠的运动和体重。将动物死亡的末期标准定义为当被放置在平坦表面上的任何一边时在30秒内不能自己翻身。根据动物试验方案的要求由一名独立的兽医作出决定。
实施例7.面神经轴突切开术后给予Cop-1保护运动神经元免受变性已知成年大鼠面神经的横切导致易见的20％到35％轴突切开的运动神经元的晚期变性。因此，面神经的轴突切开术提供了一种ALS模型，其是以进行性运动神经元丧失为特征的疾病。在面神经轴突切开术模型中免疫对神经元的存活率和功能的影响预示减少ALS患者运动神经元丧失的治疗潜能。
在这个实验中使用34只C57BL/6JO1 aHsd系(HarlanWinkelmann，Borchen，Germany)成年雌性小鼠(12周，20-25克)。将对照动物进行单侧面神经轴突切开术，并且不处理或者注射乳化于CFA的PBS。将实验组中的小鼠(n＝10)用Cop 1(总计100μg)或者注射PBS(n＝9)进行免疫，两者都乳化于CFA，7天后进行面神经轴突切开术。第三组小鼠(n＝8)在轴突切开术前不进行免疫，第四组小鼠(n＝7)保持原样。
7天后在麻醉的小鼠(每公斤体重100mg氯胺酮_加5mg甲苯噻嗪_)中进行面-面吻合(FFA)，用两根11-0神经弓上的缝合线(Ethicon EH 7438G，Norderstedt，Germany)通过显微外科将残余面神经的近端重新连接到远端。用3根4-0的皮肤缝合线将伤口封闭。为了对恢复进行评估，将30μl荧光逆行标记物荧光金的1％水溶液加2％二甲基亚砜(DMSO)注射到每个须垫的肌肉中，来逆行标记供应须垫肌肉的面部运动神经元。7天以后，将小鼠重新麻醉并用0.9％氯化钠穿心灌注，随后用含4％低聚甲醛的pH7.4，0.1M的磷酸缓冲液固定20分钟。切除大脑并用振动切片机经脑干切成50μm厚的冠状切片。用Zeiss Axioskop 50落射荧光显微镜通过为荧光金定制的HQ-Schmalband-滤色镜(AHF Analysentechnik，Tubingen，Germany)观察切片。
如图9A-D和表5所示，在轴突切开术后8周，在Cop-1接种的小鼠中荧光金标记的运动神经元的平均数量显著高于注射了含PBS的CFA组或未处理的对照组(P＜0.05)。用Cop 1处理不影响未损伤的面神经核中运动神经元的数量。用含PBS的CFA免疫的对照没有保护效果。
在将荧光金注射到须垫后的逆行神经元标记显示，在用含Cop-1的CFA免疫的小鼠(图9A)和注射含PBS的CFA的小鼠(图9C)之间，在完整的面神经核中运动神经元的定位或数量没有差异。相反，在用含Cop 1的CFA预处理小鼠之后(图9B)，受损的面神经核含有的标记运动神经元显著多于用含PBS的CFA预处理的对照动物中的受损面神经核中(图9D)。数据以平均值±标准偏差(SD)表示。通过应用单因素方差分析(ANOVA)和用Bonferroni-Holm校正的非配对数据的两两比较t检验来检测不同实验组之间的差异。认为P值小于0.05具有统计学意义。
实施例8.在急性轴突切开术后给予Cop-1保留运动神经元的活性为了确定在Cop-1处理的经轴突切开的小鼠中发现的大量多于对照的运动神经元是否与功能改善相关，对拂动(whisking)行为进行了生物统计学分析。在完整的对照小鼠中记录拂动(whisking)行为的基线参数。在正常生理情况下，mystacial触须向前竖起。其同时扫动，称为“拂动(whisking)”或“嗅”，每秒发生5-11次。这种运动活动的主要运动是通过竖毛肌进行须毛的伸展和缩回，其受面神经的颊分支支配。当横切面神经时，触须呈向尾部方向并保持不动。
使用这个模型，评价了下列参数(i)前突(须毛的向前运动)，通过中间矢状面和毛体之间向嘴侧开放的角度(小角度代表大的前突)而测得；(ii)拂动频率，用每秒前突和缩回(被动的向后运动)的周期来代表；(iii)幅度-最大缩回和最大前突之间度数上的差别；(iv)前突过程中的角速度，以度数/秒表示；以及(v)前突过程中的角加速度，以度数/秒表示。
接受面神经轴突切开术和Cop-1接种的小鼠证明其拂动活性显著好于其它组的小鼠。这通过幅度、前突过程中的角速度以及前突过程中的角加速度更好地得到了证明(表6)。
表5用Cop-1接种对运动神经元存活率的影响组 未受损的面神经核受损的面神经核A保持原样的小鼠(n＝7)1559±1351707±90*B，C，DB仅进行FFA(n＝8) 1434±106670±178*A，DC在PBS/CFA注射后进行FFA(n＝9)1605±142766±104*A，DD用含Cop-1的CFA接种后进行FFA 1640±1861172±152*A，B，C(n＝10)图9中显示结果的数值。通过向保持原样的小鼠(A组)和仅接受FFA处理的小鼠(B组)、注射含PBS的CFA后进行FFA处理的小鼠(C组)以及用含Cop 1的CFA接种后进行FFA处理(D组)的小鼠中注射1％荧光金(30μl)进行逆行标记的面神经核周体的数量(平均值±SD)。上标字母表明有显著性差异值的组(*P＜0.05)。为了进行图象分析，使用与图象分析软件Optimas 6.5(Optimas，Bothell，WA)结合的CCD视频照相机系统(Optronics Engineering Model DEI-470，Goleta，CA)在计算机屏幕上手工计数逆行标记的面神经运动神经元(42)。应用分馏器原理(43)，通过对在经过手术的和未经过手术的两个侧面上的面神经核的50μm厚切片的每一个的第二个切面上，计数所有具有可见细胞核的逆行标记的运动神经元。由两名对大鼠所接受的处理不知晓的观察者进行计数。
表6.Cop-1接种对面神经轴突切开术后拂动行为恢复的影响
在保持原样的小鼠(A组)和仅接受FFA处理的小鼠(B组)、注射含PBS的CFA后接受FFA处理的小鼠(C组)以及注射含Cop-1的CFA后接受FFA处理的小鼠(D组)中，正常的和正在恢复的拂动行为的生物统计学。数值是平均值±SD。上标字母表明有显著差异值的组(*P＜0.05)。在脸的每一侧C-排的两根大毛用于生物统计学分析。在轻度乙醚麻醉下，用锋利的小剪刀剪去小鼠所有的其它触须。用可携式数字摄像机(Panasonic NV DX-110 EG)把生动的研究小鼠的活动录在录象磁带上3-5分钟。校准刻度后，在50HZ(每秒50个视野)下采集拂动行为的视频图象样品，视频照相机快门开放4毫秒。将图象记录在AY-DVM 60 EK袖珍暗盒上。缓慢回顾视频片段，选取每只小鼠1.5秒的片段部分用于拂动的生物统计学分析。使用的选择标准是头的位置稳定、拂动的频率以及触须的前突度数。通过2D/手动的高级的视频系统PEAK Motus 2000(PEAK PerformanceTechnologies，Englewood，CO)捕捉所选取的片段。空间模型由3个参考点(鼻尖和两眼的内角)构成。在空间模型中每个触须用两个点代表其底部和毛干上距底部0.5cm的点。
参考文献Brown R.H.(1995)“Amyotrophic lateral sclerosisrecentinsights from genetics and transgenic mice”Cell 80687-692Brui jn L.I.，Cleveland D.W.(1996)“Mechanisms of selectivemotor neuron death in ALSinsights from transgenic mouse modelsof motor neuron disease”Neuropathol Appl Neurobiol 22373-387Chou S.M.(1992)“Pathology-light microscopy of amyotropiclateral sclerosis”.InHandbook of Amyotrophic LateralSclerosis(Smith R.A.，ed.)，pp.131-181.New YorkMarcel DekkerFridkis-Hareli et al.(1999)“Binding motifs of copolymer1 to multiple sclerosis-and rheuma toid arthritis-associatedHLA-DR molecules”J Immunol.162(8)4697-4704Fridkis-Hareli et al.(2002)“Novel synthetic amino acidcopolymers that inhibit autoantigen-specific T cell responsesand suppress experimental autoimmune encephalomyelitis”J ClinInvest 109(12)1635-1643Gurnery M.E.et al.(1994)“Motor neuron degeneration inmice that express a human Cu1Zn superoxide dismutase”Science2641772-1775Hadano et al.(2001)“A gene encoding a putative GTPaseregulator is mutated in familial amyotrophic lateral sclerosis2”Nature Genetics 29166-73Hauben et al.(2000)“Autoimmune T cells as potentialneuroprotective therapy for spinal cord injury”Lancet355286-287Hirano A.(1991)“Cytopathology of amyotrophic lateralsclerosis”Adv Neurol 5691-101Johnson et al.(1995)“Copolymer l reduces relapse rate andimproves disability in relapsing-remitting multiple sclerosisresults of a phase III multicenter，double-blind placebo-controlled trial.The Copolymer l Multiple Sclerosis StudyGroup，”Neurology 165Julien J.P.(2001)“Amyotrophic lateral sclerosisunfolding the toxicity of the misfolded”.Cell 104581-591Kipnis et al.(2001)“Neuronal surival after CNS insult isdetermined by a genetically encoded autoimmune response”.JNeurosci.21(13)4564-71Kong，J.And Xu，Z.(1998)“Massive mitochondrialdegeneration in motor neurons triggers the onset of amyotrophiclateral sclerosis in mice expressing a mutant SOD 1”J.Neuroscierce 183241-3250Moalem G.et al.(1999)“Autoimmune T cells protect neuronsfrom secondary degeneration after central nervous systemaxotomy”，Nature Medicine 549-55Mulder D.W.et al.(1986)“Familial adult motor neurondiseaseamyotrophic lateral sclerosis”Neurology 36511-517Munsat T.L.et al.(1989)“Adult motor neuron disease”.InMerritt’s Textbook of Neurology(Rowland L.P.，ed.)，pp682-687.PhiladelphiaLea & FebigerPitt et al.(2000)“Glutamate excitotoxicity in a model ofmultiple sclerosis”Nature Medicine 667-70Ripps M.E.et al.(1995)“Transgenic mice expressing analtered murine superoxide dismutase gene provide an animal modelof amyotrophic lateral sclerosis”Proc Natl Acad Sci，USA92689-693Rosen D.R.et al.(1993)“Mutations in Cu1Zn superoxidedismutaso gene are associated with familial amyotrophic lateralsclerosis”Nature 36259-62Rothstein J.D.，et al.(1992)“Decreased glutamatetransporter by the brain and spinal cord in amyotrophic lateralsclerosis”.N.Eng.J.Med；3261464-68Turner et al.(2001)“Clinical trials in ALSAn overview.Seminars in Neurology”21167-175
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权利要求
1.一种用于减少患有运动神经元疾病(MND)的患者的疾病进展、和/或防止运动神经变性、和/或避免受谷氨酸毒性作用的方法，其包括用含有活性试剂的疫苗免疫所述的患者，该活性试剂从由Cop1、与Cop1相关的肽、与Cop1相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的运动神经元疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的运动神经元疾病是原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)或进行性延髓麻痹(PBP或延髓发病)。
4.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述的疫苗包括不含有佐剂的活性试剂。
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述的疫苗含有在适合人临床使用的佐剂中乳化的活性试剂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的佐剂从由氢氧化铝、氢氧化铝凝胶和羟基磷酸铝构成的组中选出。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的佐剂是具有酸性等电点并且Al∶P之比为1∶1的无定形的羟基磷酸铝。
8.根据权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述的活性试剂是Cop1。
9.根据权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述的活性试剂是与Cop1相关的肽、与Cop1相关的多肽。
10.根据权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述的活性试剂是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
11.根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中每月至少服用一次所述的疫苗。
12.根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中每2-3个月至少服用一次所述的疫苗。
13.根据权利要求1-12中任何一项的方法，其中所述的治疗包括服用另一种用于治疗MND的药物，如利鲁唑。
14.一种用于减少运动神经元疾病(MND)患者的疾病进展、和/或防止运动神经变性、和/或避免受谷氨酸毒性作用的疫苗，包括从由Cop1、与Cop1相关的肽、与Cop1相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出的活性试剂。
15.根据权利要求14的疫苗，其中所述的运动神经元疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
16.根据权利要求15的疫苗，其中所述的运动神经元疾病是原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)和进行性延髓麻痹(PBP或延髓发病)。
17.根据权利要求14-16中任何一项的方法，其中所述的疫苗包括不含有佐剂的活性试剂。
18.根据权利要求14-16中任何一项的方法，其中所述的疫苗含有在适合人临床使用的佐剂中乳化的活性试剂。
19.根据权利要求18的疫苗，其中所述的佐剂从由氢氧化铝、氢氧化铝凝胶和羟基磷酸铝构成的组中选出。
20.根据权利要求19的疫苗，其中所述的佐剂是具有酸性等电点并且Al∶P之比为1∶1的无定性羟基磷酸铝。
21.根据权利要求14-20中任何一项的疫苗，其中所述的活性试剂是Cop1。
22.根据权利要求14-20中任何一项的疫苗，其中所述的活性试剂是Cop1相关肽或Cop1相关多肽。
23.根据权利要求14-20中任何一项的疫苗，其中所述的活性试剂是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
24.根据权利要求14-23中任何一项的疫苗，其中每月至少服用一次所述的疫苗。
25.根据权利要求14-23中任何一项的疫苗，其中每2-3个月至少服用一次所述的疫苗。
26.根据权利要求14-25中任何一项的疫苗，用于与另一种用于治疗MND的药物，例如利鲁唑一起服用。
27.一种活性试剂在制备用于减少运动神经元疾病(MND)患者的疾病进展、和/或防止运动神经变性和/或避免受谷氨酸的毒性作用的疫苗中的用途，其中所述的活性试剂从由Cop1、与Cop1相关的肽、与Cop1相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出。
28.根据权利要求27的用途，其中所述的运动神经元疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
29.根据权利要求27的用途，其中所述的运动神经元疾病是原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)或进行性延髓麻痹(PBP或延髓发病)。
30.根据权利要求27-29中任何一项的用途，其中所述的疫苗包括不含有佐剂的活性试剂。
31.根据权利要求27-29中任何一项的用途，其中所述的疫苗含有在适合人临床使用的佐剂中乳化的活性试剂。
32.根据权利要求31的用途，其中所述的佐剂从由氢氧化铝、氢氧化铝凝胶和羟基磷酸铝构成的组中选出。
33.根据权利要求32的用途，其中所述的佐剂是具有酸性等电点并且Al∶P之比为1∶1的无定性羟基磷酸铝。
34.根据权利要求27-33中任何一项的用途，其中所述的活性试剂是Cop1。
35.根据权利要求27-33中任何一项的用途，其中所述的活性试剂是Cop1相关肽或Cop1相关多肽。
36.根据权利要求27-33中任何一项的用途，其中所述的活性试剂是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
37.根据权利要求27-36中任何一项的用途，其中每月至少服用一次所述的疫苗。
38.根据权利要求27-36中任何一项的疫苗，其中每2-3个月至少服用一次所述的疫苗。
39.根据权利要求27-38中任何一项的疫苗，其中所述的疫苗与另一种用于治疗MND的药物，例如利鲁唑一起给药。
全文摘要
一种用于减少运动神经元疾病(MND)，特别是肌萎缩性侧索硬化(ALS)患者的疾病进展、和/或防止运动神经变性、和/或避免受谷氨酸的毒性作用的疫苗，包括一种活性试剂，其中该活性试剂从由Cop1、与Cop－1相关的肽、与Cop－1相关的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)构成的组中选出。所述的活性试剂优选为Cop1或聚(谷氨酸、酪氨酸)，并且可以与或不与佐剂一起使用。
文档编号A61P25/28GK1617736SQ02827701
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月5日 优先权日2001年12月6日
发明者M·埃森巴赫·施瓦茨, E·约勒斯 申请人:耶达研究及发展有限公司