专利名称：黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芩提取物的用途，特别是黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用。
食道癌的放疗不同于其它部位的肿瘤治疗，由于肿瘤始终与食管于一体，在规划靶区时，管腔和病变一起被划入，如果和照射其它部位的肿瘤一样，一次大剂量照射势必会引起食管粘膜的损伤，甚至穿孔，有发现在肺部肿瘤的定向放射时，食管接受24-30Gy量，即可出现放射性损伤，后期表现食管局部性狭窄。又由于食道癌患者就症时绝大多数已属晚期，不仅局部病变已广泛浸润，而且已有亚临床病灶的远处播散或淋巴结转移，尸检发现，许多临床认为局部早期的病例死亡时，已有半数以上伴远处转移，70％以上有广泛的淋巴结受侵，真正能根治性切除的病例不足1/3，常规放疗5年生存率仅为13％，局部复发也是食道癌手术和放疗失败的主要原因，占80％以上，由此可以看出，食道癌的治疗仅靠手术和放疗是远远不够的。
由于在化疗过程中，伴有极大的副反应及并发症，即使通过放疗结合化学治疗，其5年生存率也仅13％左右。生存5年以上者，对于后期的生活质量也大受影响，不能从根本上有效地来治疗食道癌，更不能做到防患于未然。
中药黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)首载于《神农本草经》，又名黄文、无芩等。根据现有文献的报道，黄芩的药理功效味苦，性寒，功能泄实火，除湿热，解毒，止血，安胎，对多种细菌均有抑制作用，对流感病毒，皮肤真菌也有抑制作用，并有除热，解毒，镇静，降压，利胆，利尿，解除平滑肌痉挛，抑制肠管蠕动等作用。黄芩的丙酮提取物还可望成为保存加工食品的天然抗氧化剂。黄芩的根、叶提取物有抗溃疡活性。
黄芩提取物中的黄芩素和黄芩甙，现有文献报道其药理作用为抗炎、抗变态反应作用；保肝利胆作用；降压、利尿、镇静、解热作用；醛糖还原酶抑制作用。临床应用主要用于传染性肝炎、急性胆道感染、铅中毒、清热解毒、胸闷呕恶、肺热咳嗽、胎动不安及疮毒等。就黄芩甙，也有局限于针对乳腺癌细胞的体外研究报告。但这些研究都还处在非常前期，对于黄芩提取物的抗癌作用机理也不甚明了。
为了达到上述目的，本发明提供一种黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，应用黄芩提取物所制备的药物用于治疗或预防食道癌。黄芩提取物特别指具有黄酮母体结构的提取物，可以是黄芩素，也可以是黄芩甙，还可以是两者的混合物，混合物中两者的配比可以是任意配比来进行混合。所述的黄芩提取物，可以是黄芩提取物制成的药学上可接受的盐，如用以下的酸马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、乙酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等类似酸加成盐；需要时可加合适的溶剂，如水、甲醇、乙醇、乙醚、四氢呋喃等类似物。黄芩提取物及药学上可接受的盐可以口服、注射给药，如粉剂、颗粒剂、片剂、小丸、胶囊、乳剂、糖浆剂、注射剂等。所述的制剂可用常规方法来制备。所述的具有黄酮母体结构的黄芩提取物，其黄酮母体结构如下图所示 所述黄芩素，又叫黄芩甙元，黄酮类化合物，是黄芩的主要活性成分之一。分子量270.25，可由黄芩甙水解得到。
黄芩素的结构黄酮母体结构上4′，5，6，7四个氢基-H被羟基-OH取代。
黄芩甙的结构是黄酮母体结构上4′，5，6三个氢基-H被羟基-OH取代，7位的羟基-OH与葡萄糖醛酸缩合，即黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸。
本发明所述的黄芩提取物在制备食道癌药物中的应用，公开了黄芩提取物在制药中的新用途。黄芩提取物，特别是黄芩素对食道癌细胞有明显的抑杀作用。
细胞凋亡是普遍存在于细胞生物体内的一种自发、主动的细胞死亡过程，是生物体维持细胞数量相对稳定的固有机制，这一机制若有障碍或发生异常，就有可能引发肿瘤或其它病变，肿瘤是一种细胞凋亡过慢而增殖过多的疾病，如能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，就能有效地控制肿瘤的发生和发展。另外，当肿瘤直径在1-2平方毫米大小时，由于瘤体中心部缺氧，肿瘤细胞会产生血管生成因子，这样，肿瘤可得到其自生生长所需的营养和氧气，通过对该新血管增殖的抑制，有助于抑制肿瘤细胞的继续生长，因此，抑制肿瘤细胞的生长，需要寻找能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡及其具有血管生成抑制活性的物质。
而本发明的研究发现，黄芩提取物中黄芩素，其特殊的作用机制是，直接抑制食道癌细胞的分裂和增生，并具有强烈诱导癌细胞凋亡的作用，而对正常细胞生长周期和凋亡无明显作用；另一主要作用是抑制食道癌内部血管生成，特别是在缺氧环境下的的血管再生，从而有效地切断肿瘤的血液供应使其变性坏死。特别是在离体细胞培养实验中，表现为对食道癌细胞释放血管生长因子的抑制及诱导血管内皮细胞的凋亡。此外，在活体动物(裸鼠)实验中，发现能够显著地抑杀移植肿瘤的生长，最高有效达95％，且无任何毒副作用。
本发明黄芩提取物在制药中的应用发掘了黄芩提取物，特别是黄芩素和黄芩甙在食道癌治疗和预防药物的生产领域中的新用途。本发明的黄芩提取物，特别是黄芩素、黄芩甙制备的药物毒性低，对人体无副作用。本发明的黄芩提取物、特别是黄芩素、黄芩甙原料来源广泛，成本较低。本发明对于食道癌治疗和预防这一难题的早日攻克具有深远的现实意义。
为了更好地理解本发明的实质，以下结合对比药理实验以及结果对本发明加以进一步的描述。实验结果1如图1所示，该图片是黄芩提取物中的黄芩素(baicalein)诱导癌细胞核裂解，细胞凋亡始于细胞核的裂解。图中显示食道癌细胞经黄芩素处理2天后出现明显的细胞核裂解(右图中箭头所指)。黄芩素对正常细胞无此作用(左图)。此实验采用DAPI免疫染色法(特殊细胞核染色法)。Control是未经处理的对照组细胞。实验结果2如图2所示，该照片是黄芩素诱导食道癌细胞的凋亡情况。该实验采用特殊的免疫组化染色方法(tunel Stain)。此方法是目前世界范围内公认的最佳细胞凋亡鉴定手段，凋亡或正在凋亡的细胞经染色后呈显黄色或橘黄色，而正常细胞则呈显红色。照片显示食道癌细胞经黄芩素(baicalein)处理3天后诱导了这些细胞的凋亡，而经同样处理的正常细胞则不受影响。实验结果3如图3所示，该照片是黄芩素诱导血管内皮细胞的凋亡情况。该实验采用特殊的免疫组化染色方法(tunel stain).凋亡或正在凋亡的细胞经染色后呈现黄色，而正常细胞则呈现红色。图片中显示了两种血管内皮，即人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人动脉内批皮细胞(HAEC)，经黄芩素(baicalein)处理3天后诱导了这些细胞的凋亡，control为未经处理的对照组细胞。实验结果4如图4所示，该表是黄芩素抑制食道癌细胞释放血管生长因子的实验状况。
实验方法1×105食道癌细胞被种植在直径为15mm的培养盘上，培养液含有10％小牛血清。24小时待细胞贴壁后，将培养液换成无血清培养液。换液后24小时开始加药。经不同时间处理后，将培养液收集起来，用ELISA测定培养液中血管生长因子的含量，所测得含量需经实际细胞数校正。食道癌细胞经黄芩素处理2天后，血管生长因子释放明显减少。在缺氧的环境中(1％O2)，黄芩素抑制作用尤其显著。实验结果5如图5所示，该照片显示黄芩素抑制裸鼠上移植食道癌内的血管生成状况。
实验方法先将食道癌细胞株接种在裸鼠皮下。自第2周开始，黄芩素经皮下给药，每周3次。实验持续至第12周，每周测量一次肿瘤的表面积。实验结束后，将肿瘤自裸鼠上分离下来，经化学固定和冰冻切片后，用八因子作抗体进行免疫组化染色。图片中棕色片段即为肿瘤血管断面。左图样本取自未用药组，右图样本取自用药组，用药剂量1mg/kg体重，可见血管数量明显减少。实验结果6如图6所示，该表是黄芩素(baicalein)抑制食道癌细胞的DNA分裂情况。图中可见食道癌细胞经黄芩素处理后，处于DNA合成期(S phase)的细胞数明显减少，而合成前期(G0/G1)的细胞数则明显增加。由于这些细胞在合成前期G0/G1积累，从而有效地抑制了该细胞的增生。实验方法食道癌细胞经黄芩素处理后，再经荧光标记，最后用细胞周期分析法对处于各个不同分裂期内的细胞数进行定量测定，对所测得的数值占总细胞数的比值进行比较而得到上图表。实验结果7如图7所示，该图表是黄芩素(baicalein)、黄芩甙(baicalin)和对照组用苡仁提取物(wogonin)抑杀食道癌细胞的疗效比较。在离体性别培养实验中，黄芩素、黄芩甙和苡仁提取物均有抑杀食道癌细胞的作用，但作用强度略有差异。相对强度黄芩素＞黄芩甙＞苡仁提取物。结果实验8如图8、图9所示，图表是黄芩素(baicalein)抑制了Cyclooxygenase(COX-2)的表达(图8)和前列腺素的合成(图9)。COX-2是一种催化前列腺素生成的酶，该酶以及它的产物前列腺素在肿瘤的发生和发展中起了非常重要的作用。黄芩素主要作用机制之一是通过它的这些抑制作用而起到抑杀癌细胞的作用。实验方法图8采用West Blot Analysia法测定COX-2蛋白质的表达水平，右边数字指出COX-2蛋白质的分子量。图9采用ELISA法测定由食道癌细胞释放至培养液中的前列腺素的含量，并用实际细胞数作校整后作统计学处理。实验结果9如图10所示，该表是黄芩素抑杀体外细胞培养实验中食道癌细胞生长的剂量曲线。曲线1表示正常细胞，曲线2表示乳腺癌细胞，曲线3表示食道癌细胞。
实验方法三种实验细胞株均采用相同的培养条件。1×105细胞被种植在直径为15mm的培养盘上，培养液含有10％小牛血清。24小时待细胞贴壁后，将培养液换成无血清培养液以避免血清中存在的生长因子对细胞生长的影响。换液后24小时开始加药。加药5天后作细胞计数。计数前先用台潘兰将细胞染色以排除已死亡细胞对实验结果的影响。曲线中每一点为3次实验的平均值。
从曲线中可见，用药浓度为0.1开始起效果(20％抑制)，浓度为0.5μg/ml时，食道癌细胞生长的抑制为50％。而当浓度达到10μg/ml时，抑制可达95％。黄芩素对正常细胞无明显作用。可见黄芩素可以有效地抑杀体外培养的食道癌细胞的生长。实验结果10如图11、图12所示，是黄芩素抑杀活体动物上移植食道癌的生长。实验方法先将食道癌细胞株接种在裸鼠皮下，经1-2周后肿瘤开始生长。黄芩素皮下注射自第二周开始，每周3次。实验动物被随机分成3个实验剂量组合一个对照组，每组10个裸鼠。实验持续至第12周，每周测量一次食道癌肿瘤的表面积。实验结束后，将食道癌肿瘤自裸鼠上分离下来，并做保存处理以备用作药理，免疫组化及生化检查。图11显示黄芩素抑杀移植肿瘤的计量曲线。图12显示黄芩素对移植肿瘤有明显抑杀效果。实验结果11下述实验是黄芩素(baicalein)和黄芩甙(baicalin)单独用药或混合用药时对离体培养的食道癌细胞和乳腺癌细胞的作用比较。
实验方法1×105食道癌细胞被种植在直径为15mm的培养盘上，培养液含有10％小牛血清。待细胞贴壁后(约24小时)，将培养液换成无血清培养液以避免血清中存在的生长因子对细胞生长的影响。换液后24小时开始加药。加药5天后作细胞计数。计数前先用台潘兰将细胞染色以排除已死亡细胞对实验结果的影响。如图13中每一点为三次实验的平均值。实验结果如图13、图14所示，单独用药时，黄芩素的作用强度高于黄芩甙。黄芩素和黄芩甙混合用药时(1∶1)，其对食道癌细胞生长的抑制作用在小剂量时有轻度增加，但剂量增大后，其作用大于黄芩甙(单独用药)，但小于黄芩素(单独用药)。对照组增加了离体培养的食道癌细胞的生长，无任何抑制作用。如图14显示，黄芩素(baicalein)和黄芩甙(baicalin)及其混合用药时对离体培养的食道癌细胞和乳腺癌细胞的作用。
上述实验结果可以看出黄芩提取物用于制备抗食道癌药物，可明显抑制食道癌细胞的分裂，并具有强烈诱导癌细胞凋亡的作用，而对正常细胞生长周期和凋亡无明显作用；并且还具抑制食道癌内部血管生成，特别是在缺氧环境下的血管再生，从而有效地切断肿瘤的血液供应使其变性坏死。特别是黄芩素用于制备治疗或预防食道癌的药物具有十分积极的现实意义。
图1是黄芩素(baicalein)诱导食道癌细胞核裂解实验照片；图2是黄芩素诱导食道癌细胞的凋亡情况实验照片；图3是黄芩素诱导血管内皮细胞的凋亡情况实验照片；图4是黄芩素抑制食道癌细胞释放血管生长因子的实验状况照片；图5是黄芩素抑制裸鼠上移植食道癌内的血管生成状况；图6是黄芩素(baicalein)抑制食道癌细胞的DNA分裂情况；图7是抑杀食道癌细胞的疗效比较；图8是黄芩素(baicalein)抑制了Cyclooxygenase(COX-2)的表达；图9是黄芩素(baicalein)抑制了前列腺素的合成情况；图10是黄芩素抑杀活体动物上移植食道癌的生长；图11是黄芩素抑杀移植肿瘤的计量曲线；图12是黄芩素对移植肿瘤的抑杀效果；图13是黄芩素(baicalein)和黄芩甙(baicalin)单独用药或混合用药时对离体培养的食道癌细胞的作用比较；图14是黄芩提取物对食道癌细胞和乳房癌细胞作用比较。
加入乳糖66g，预胶化淀粉64g，微晶纤维素66g，硬脂酸镁3g，按常规制片工艺制得片剂1000片，相当于每片含黄芩素100毫克，作为抗食道癌药。
权利要求
1.黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，其特征是所述的黄芩提取物具有黄酮类母体结构，所述母体结构如下所示
3.根据权利要求1所述的黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，其特征是所述的黄芩提取物为黄芩素。
4.根据权利要求1所述的黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，其特征是所述的黄芩提取物为黄芩甙。
5.根据权利要求1所述的黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，其特征是所述的黄芩提取物为黄芩素以及黄芩甙的混合物。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，其特征是所述的黄芩提取物是黄芩提取物制成的药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明公开了一种黄芩提取物在制备抗食道癌药物中的应用，黄芩提取物特别指具有黄酮母体结构的提取物，可以是黄芩素，也可以是黄芩甙，还可以是两者的混合物及其黄芩提取物制成的药学上可接受的盐。利用黄芩提取物制备的抗食道癌药，能直接抑制癌细胞的分裂，并具有强烈诱导癌细胞凋亡的作用，而对正常细胞生长周期和凋亡无明显作用；并且它还具有抑制食道癌内部血管生成，特别是在缺氧环境下的血管再生，从而有效地切断食道癌的血液供应，使其变性坏死，显著地抑杀移植食道癌的生长，且无任何毒副作用，它对治疗或预防食道癌的药物的制备具有十分积极的现实意义。
文档编号A61K31/7048GK1442134SQ0310993
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月8日 优先权日2003年4月8日
发明者刘新华, 潘福生, 胡祖耀 申请人:杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司