专利名称：溶菌酶及相关衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖中疾病的预防和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种溶菌酶及相关衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类疾病的预防和治疗。
背景技术：
近年来，我国海水养殖业发展非常迅猛。估计全国海水养殖鱼水面积在100万亩以上。根据国家农业部统计，我国海水养殖鱼1995年的产量为15万吨。但是海水鱼病的发生已成为海水养殖鱼发展的巨大障碍，养殖鱼一旦发生感染流行，其死亡率一般在50～80％，甚至绝收。而且养殖鱼场受病菌污染后，一段时间内不能再用。另外，一些海水养殖鱼的病原菌是人畜共患病菌，如我国东南沿海以创伤弧菌最常见。创伤弧菌广泛分布在河口与海水中，主要感染软体动物贝类如牡蛎，及鱼中鳗鲡等。人食入带菌的生牡蛎、病鱼或擦伤而感染，免疫力低下者可引起败血症。所以海水养殖鱼病的防治是海水养殖鱼进一步发展的保证。目前对我国海水养殖鱼业危害最大的病源菌是弧菌，其中包括创伤弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、鳗弧菌等，此外还有海洋曲桡菌、链球菌、爱德华菌等。迄今国际上已有8项鱼类弧菌灭活疫苗及其制备方法获得日本、美国专利，但是还未见广谱性海鱼弧菌疫苗问世。在国内，1995年成功制备了创伤海鱼灭活疫苗，其免疫保护率仅达40％左右。由此可见，灭活疫苗的免疫保护率不高，荚膜多糖与蛋白偶联疫苗虽然免疫效果较好，但提取困难，难以大批量生产推广应用。而且，由于引起海水养殖鱼病的病原菌种类较多，免疫预防困难，因此目前对鱼病的预防与治疗还是主要采用化学药物防治。其中最常用的方法是在鱼饲料中添加抗生素，该方法虽有效，但存在以下弊病。首先抗生素在鱼体内残留，对食入者体内正常菌群构成影响，微量的抗生素易诱导耐药菌产生，因此许多国家明令禁止进口、销售残留抗生素的鱼及肉类等；其次抗生素的长期使用，可在鱼体内诱生具有耐药菌的致病菌，随食物链进入人体造成感染性疾病，抗生素难以治疗；最后抗生素还会对周围环境造成影响。溶菌酶对人体和动物细胞无毒性作用，并且广泛存在于自然界动物、植物和微生物中。利用酵母系统表达人溶菌酶该方法已申请专利(专利申请号00 1 10463.2)。构建表达氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶，其成本低，生产量大，可实现工业化生产。而且生产基因工程表达人溶菌酶过程中形成的富含人溶菌酶的酵母细胞裂解物不仅具有杀菌活性，而且本身也是饲料中良好的氮源添加剂。溶菌酶除可以直接裂解细菌，还可以作为免疫调节剂调节中性粒细胞的作用，保护炎症部位的正常组织，在调节炎症反应中起负反馈作用(Leo IG，etal.J.Clin.Invist.1979；64222)。它可能通过与多形核粒细胞膜表面的多糖部分结合，抑制多形核粒细胞向炎症部位移动，并可衰减炎症部位由多形核粒细胞所产生的超氧化物的作用，保护机体在炎症反应时由于免疫应答过度而发生的组织损伤。溶菌酶还可与其他生物活性蛋白共同作用，充分发挥抗菌作用，如补体、乳转铁蛋白等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶菌酶及相关衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类疾病的预防和治疗，溶菌酶是人、动物，包括鱼类细胞产生的一种抗菌物质，因溶菌酶在鱼体内本身即具有，所以使用溶菌酶代替常用的抗生素即解决了鱼病的预防与治疗问题又避免了抗生素在鱼体内的残留问题和使用抗生素带来的耐药菌诱生的问题。人溶菌酶在体内、外均具有明显的杀灭细菌的活性，可单独使用，用于细菌感染的预防和治疗；也可以与抗生素合用，能明显降低抗生素的最低杀菌浓度，从而治疗细菌感染时与溶菌酶合用也可减低抗生素的用量，减低抗生素在动物体内的残留量。海水养殖鱼细菌性疾病的症状多样，有皮肤红斑溃烂、皮肤粘膜出血水肿、鱼腮出血、肠道水肿充血等等，病菌在鱼体内分布广泛，可从鱼腮、肠、脾、肾及粘液中分离得到。研究表明病菌可经口、腮、皮肤粘膜等多途径感染鱼，也可经多种途径预防和治疗。
本发明的技术方案是溶菌酶及其衍生物纯品或原液按如下重量份数比加入饲料中，用于海水、淡水养殖鱼、螃蟹类、虾类疾病的预防和治疗是以饲料经口途径或全身浸泡的方式给药；将溶菌酶及其衍生物纯品0.1克～5克加入1000公斤重量饲料中经口服给药，将0.1～5份重量溶菌酶及其衍生物发酵液加入100份重量饲料中经口服给药；将0.1～5份溶菌酶及其衍生物纯品和0.0001～0.05份抗生素加入100份重量饲料中经口服给药，溶菌酶100毫克～500毫克/吨水的比例进行浸泡法预防和治疗疾病。用于海水、淡水养殖业的常见疫病弧菌包括创伤弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、鳗弧菌等、海洋曲桡菌、链球菌、爱德华菌引起的疾病预防和治疗；溶菌酶包括鸡溶菌酶、基因工程表达的人溶菌酶、基因工程表达的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体人溶菌酶和生产溶菌酶过程中形成的富含溶菌酶的酵母细胞或大肠杆菌细胞裂解物原液。
本发明的积极效果是解决了海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类疾病的预防和治疗中抗生素在鱼体内的残留和使用抗生素带来的耐药菌诱生的问题，减少海水、淡水鱼类、螃蟹类、虾类养殖过程中的病原菌感染率，降低抗生素在海水、淡水鱼类、螃蟹类、虾类养殖中的存溜，增强海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类的品质，提高海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类的经济效益。
具体实施例方式实验例1溶菌酶体内杀菌实验一、材料1.菌株溶藻弧菌2.动物BALB/c小鼠二、方法溶藻弧菌感染BALB/c小鼠实验将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的溶藻弧菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
溶菌酶保护活性的鉴定将1×109对数生长期的溶藻弧菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，溶菌酶保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的溶菌酶，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。三、结果溶藻弧菌感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU溶藻弧菌进行溶菌酶抗溶藻弧菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量溶菌酶对BALB/c小鼠进行溶藻弧菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量溶菌酶均具有被动保护抵抗溶藻弧菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表2.抗创伤弧菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against V. alginolyticusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0实验例2溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染实验一、材料1.菌株创伤弧菌2.动物牙鮃鱼二、方法溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染实验 用溶菌酶作为添加剂制成饲料喂养牙鲆鱼苗，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的创伤弧菌腹腔分别接种于保护组和对照组牙鲆鱼苗。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染保护实验结果表明用创伤弧菌感染牙鲆鱼苗后，用溶菌酶作为添加剂制成饲料喂养牙鲆鱼苗组保护率可达65％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
实施例3溶菌酶与抗生素的协同抗菌作用一、材料1.菌株临床分离株400余株，由成都抗生素工业研究所提供。2.缓冲液pH7.2 10mMTris-Cl缓冲液3.LB培养基4.克拉霉素，罗红霉素二、方法溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，方法一(试管法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液将金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)配成107-108CFU/mL左右浓度的菌液，并分别将其加入到不同华试管中，每管2mL不同华试管中分别加入不同剂量的人溶菌酶(100μg-1mg)37℃过夜；其中一管取20μL以10倍稀释法稀释后，取100μL涂于LB培养基，经37℃培养过夜，并观察结果，计算原始管中细菌总数。另一管加入100μL 10％SDS(终浓度0.5％)后，摇匀并经肉眼观察浊度变化或用分光度计进行比浊(640)。溶菌酶溶菌效果＝(对照管中细菌总数-实验管中细菌总数)/对照管中细菌总数× 100％方法二(平板法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液配制1％的琼脂糖高压灭菌后，冷却至40℃，加入细菌至106倾倒平板，用打孔器在平板上打孔，在孔中加入不同浓度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)，经37℃孵箱孵育4-6小时后，在LB营养琼脂高压灭菌后，冷却至40℃，覆盖于上述琼脂糖平板上，将该平板至于紫外灯下照射20分钟。(LB营养琼脂覆盖于含菌的琼脂糖平板过程中，琼脂糖表面的游离细菌会混入营养琼脂中，其中冲到营养琼脂表面的细菌，由于氧气的作用，生长速度非常快，形成菌膜，影响琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况的观察，故用紫外灯照射杀死营养琼脂表面的细菌)37℃孵箱培养过夜。观察琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况，测量不同浓度溶菌酶形成的抑菌圈的直径，抑菌圈的直径》加样孔直径4mm者为最低有效杀菌浓度。(对于有鞭毛，运动活跃的细菌，会影响抑菌圈的形成，可考虑加入0.01％石炭酸抑制其运动。)三、结果溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，可使克拉霉素、罗红霉素对其抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。
本研究所用的临床分离耐药株共30株，分别为金黄色葡萄球菌8株、肺炎克雷伯氏菌6株、绿脓假单胞杆菌3株、大肠杆菌7株、鲍鳗杆菌1株、粘质沙雷氏菌1株、变形杆菌3株、甲型链球菌1株。抑菌实验结果表明本研究所用的30株临床分离耐药菌，均对基因工程表达的人溶菌酶敏感，基因工程表达的人溶菌酶对实验菌株的最低抑菌浓度针对不同菌存在差异，有效抑菌浓度范围在50μg-1mg/ml之间。同时发现基因工程表达的人溶菌酶对不同菌的最低抑菌浓度之间的差异主要存在于相同菌的不同菌株之间，而对不同菌之间以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间，由于实验菌株数量较少，未发现存在明显差异。
实验例4.溶菌酶体内杀菌实验(一)一、材料1.菌株溶藻弧菌2.动物BALB/c小鼠二、方法溶藻弧菌感染BALB/c小鼠实验将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的溶藻弧菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
溶菌酶保护活性的鉴定将1×109对数生长期的溶藻弧菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，溶菌酶保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的溶菌酶，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。三、结果溶藻弧菌感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU溶藻弧菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU溶藻弧菌进行溶菌酶抗溶藻弧菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量溶菌酶对BALB/c小鼠进行溶藻弧菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量溶菌酶均具有被动保护抵抗溶藻弧菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表1.抗溶藻弧菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against V.alginolyticusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0实验例5溶菌酶体内杀菌实验(二)一、材料1.菌株链球菌2.动物BALB/c小鼠二、方法链球菌感染BALB/c小鼠实验将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的溶藻弧菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
溶菌酶保护活性的鉴定 将2×108对数生长期的链球菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，溶菌酶保护组在接种链球菌同时，注入不同剂量的溶菌酶，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。三、结果链球菌感染BALB/c小鼠的致死实验用105～109CFU链球菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中5×107～5×108CFU链球菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU链球菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用2×108CFU链球菌进行溶菌酶抗链球菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量溶菌酶对BALB/c小鼠进行链球菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠3天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在3-5天。5天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量溶菌酶均具有被动保护抵抗链球菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达85％。
表2.抗链球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StreptococcusDose(u/kg) NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 3 8515×10420 5 757.5×1042010 503.75×1042011 450 1515 0实验例6溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染实验(一)一、材料1.菌株创伤弧菌2.动物牙鮃鱼二、方法溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染实验用溶菌酶作为添加剂制成饲料喂养牙鲆鱼苗，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的创伤弧菌腹腔分别接种于保护组和对照组牙鲆鱼苗。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染保护实验结果表明用创伤弧菌感染牙鲆鱼苗后，用溶菌酶作为添加剂制成饲料喂养牙鲆鱼苗组保护率可达65％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
实验例7溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染实验(二)一、材料1.菌株爱德华菌2.动物牙鮃鱼二、方法溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染实验用溶菌酶作为添加剂制成饲料喂养牙鲆鱼苗，正常饲料喂养作对照组。将5×108对数生长期的爱德华菌腹腔分别接种于保护组和对照组牙鲆鱼苗。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％三、结果溶菌酶保护牙鲆鱼的抗感染保护实验结果表明用爱德华菌感染牙鲆鱼苗后，用溶菌酶作为添加剂制成饲料喂养牙鲆鱼苗组保护率可达80％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
权利要求
1.溶菌酶及其衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖中的弧菌的预防和治疗。
2.溶菌酶及其衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖中海洋曲桡菌预防和治疗。
3.溶菌酶及其衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖中链球菌预防和治疗。
4.溶菌酶及其衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖中爱德华菌预防和治疗。
5.溶菌酶及其衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖中疾病的预防和治疗是以饲料经口途径或全身浸泡的方式给药；将溶菌酶及其衍生物纯品0.1克～5克加入1000公斤重量饲料中经口服给药，将0.1～5份重量溶菌酶及其衍生物发酵液加入100份重量饲料中经口服给药；将0.1～5份溶菌酶及其衍生物纯品和0.0001～0.05份抗生素加入100份重量饲料中经口服给药，溶菌酶100毫克～500毫克/吨水的比例进行浸泡法预防和治疗疾病。
6.根据权利要求5所述的溶菌酶用于预防治疗细菌感染引起海水、淡水养殖类疾病的药用组合物。
7.根据权利要求6所述的溶菌酶可以协同一种有效剂量的抗生素用于预防治疗细菌感染引起海水、淡水养殖类疾病的药用组合物。
8.根据权利要求1、2、3、4所述的溶菌酶包括鸡溶菌酶、基因工程表达的人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体人溶菌酶和生产溶菌酶过程中形成的富含溶菌酶和酵母细胞或大肠杆菌细胞裂解物原液。
9.根据权利要求6中所述的药用组合物中的抗生素包括氨基糖苷类、大环内酯类、头胞菌素类。
全文摘要
本发明涉及一种溶菌酶及相关衍生物纯品或原液用于海水、淡水养殖类疾病的预防和治疗。溶菌酶或溶菌酶与抗生素合用，用于治疗海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类，由弧菌、海洋曲桡菌、链球菌、爱德华菌引起的疾病。减少海水、淡水鱼类、螃蟹类、虾类养殖过程中的病原菌感染率，降低抗生素在海水、淡水鱼类、螃蟹类、虾类养殖中的存畄，增强海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类的品质，提高海水、淡水养殖鱼类、螃蟹类、虾类的经济效益。
文档编号A61K38/43GK1451436SQ0311131
公开日2003年10月29日 申请日期2003年3月26日 优先权日2003年3月26日
发明者张华 , 安米, 安献禄, 李元 申请人:长春奇龙生物技术研究所