专利名称：猫人参注射液及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是用猫人参提取物为君药制备的注射液及其抗癌用途。
本发明的制备方法可有两种，一是用水煎煮提取，再用乙醇沉淀纯化，简称水提醇沉法；二是用乙醇浸渍提取，再用水沉淀纯化，简称醇提水沉法。
方法一、水提醇沉法制备猫人参注射液，包括如下步骤1、制备猫人参提取液将中草药猫人参按常规用水煎煮60-180分钟，煎煮三次，合并滤液后浓缩，得猫人参提取液。
2、纯化猫人参提取液在猫人参提取液中加乙醇使含醇量为45-85％，置0-12℃冰库(下同)冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，再加乙醇使含醇量为55-90％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，再加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。
3、制备猫人参注射液将上述纯化的猫人参提取液按所需浓度加入注射用水，用10％氢氧化钠调pH4-10，冷藏12-48小时，滤去沉淀，加活性炭适量，搅拌，加热，放置30分钟，滤去沉淀、分装灌封，灭菌，即为猫人参注射液。
方法二、醇提水沉法制备猫人参注射液，包括如下步骤1、制备猫人参提取液猫人参用45-95％乙醇适量浸渍72小时，滤过，滤液备用。药渣用适量乙醇，置水浴上回流提取两次，每次1-3小时，滤过药渣用60-95％乙醇分次洗涤，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏静置数小时，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味。
2、纯化猫人参提取液在上述提取液中加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，加适量注射用水，用10％氢氧化钠溶液调pH6-8，冷藏24小时以上，滤过得纯化的猫人参提取液。
3、制备猫人参注射液将上述纯化的猫人参提取液按所需浓度加注射用水，用10％氢氧化钠溶液调pH4-10，加活性炭适量，搅拌，加热，放置30分钟，滤去沉淀，分装灌封，灭菌，即为猫人参注射液。
经体外细胞实验和动物试验，本发明猫人参注射液具有良好的抗肿瘤作用，而对细胞免疫无明显抑制作用。
本发明猫人参注射液制备工艺简单，成本低廉，抗癌效果确切，副作用小，可用作抗癌药物。
具体实施例方式实施例1制备猫人参注射液(5g/ml生药，表示每毫升注射液含5克生药的提取液，下同)1、制备猫人参提取液取猫人参5000g用水浸泡，充分润湿后，加水过药面，煎煮三次，每次煮沸90分钟，滤去沉淀、合并三次滤液并浓缩，得提取液约5000ml。
2、纯化猫人参提取液在上述提取液中加95％乙醇使含醇量达65％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为80％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为90％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。
3、制备猫人参注射液上述纯化的猫人参提取液中加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调pH为6.8，冷藏48小时，滤去沉淀，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，分装灌封(10ml/支，下同)，流通蒸汽灭菌，即为猫人参注射液。
实施例2、制备猫人参注射液(5g/ml生药)1、制备猫人参提取液猫人参5000g用水浸泡，充分润湿后，加水过药面，煎煮三次，每次煮沸60分钟，滤去沉淀、合并三次滤液并浓缩，得提取液约5000ml。
2、纯化猫人参提取液在上述提取液中加95％乙醇使含醇量达60％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为75％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为85％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。
3、制备猫人参注射液上述纯化的猫人参提取液中加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠调pH为7.0，冷藏48小时，滤去沉淀，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，灌封，流通蒸汽灭菌。
实施例3、制备猫人参注射液(5g/ml生药)1、制备猫人参提取液猫人参5000g用95％乙醇浸泡，充分润湿后加95％乙醇过药面浸渍72小时，滤过，滤液备用。药渣用95％乙醇过药面，置水浴上回流提取两次，每次2小时，滤过药渣用95％乙醇1000ml分次洗涤，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏，静置12小时，滤去沉淀，滤液减压回收乙醇至无醇味。
2、纯化猫人参提取液在上述提取液中加注射用水至约1000ml，加热煮沸30分钟，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.3，冷藏48小时以上，滤过得纯化的猫人参提取液。
3、制备猫人参注射液将以上猫人参提取液加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.1，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，灌封，流通蒸汽灭菌。
实施例4、制备猫人参注射液(5g/ml生药)1、制备猫人参提取液猫人参5000g加65％乙醇过药面浸渍72小时，滤过，滤液备用。药渣用65％乙醇过药面，置水浴上回流提取两次，每次2小时，滤过药渣用65％乙醇1000ml分次洗涤，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味。
2、纯化猫人参提取液在上述提取液中再加乙醇使含醇量为85％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，加水至1000ml，加热煮沸30分钟，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.5，冷藏48小时，滤过得纯化的猫人参提取液。
3、制备猫人参注射液将以上猫人参提取液加入注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.6，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，灌封(10ml/支)，流通蒸汽灭菌，即为猫人参注射液。
猫人参注射液抗肝癌作用动物实验一、猫人参注射液对小鼠肝癌体内抑瘤实验1、猫人参注射液对小鼠实体型肝癌H22和HepS的作用1.1小鼠移植性肝癌造模用小鼠肝癌细胞株H22和HepS分别进行小鼠肝癌移植瘤造模，是常规的成熟技术。选取已腹腔接种小鼠肝癌细胞后8日健康状况较好的小鼠，颈椎脱臼处死，抽取腹腔积液(乳白色腹水)，细胞分类计数，根据活细胞计数，用生理盐水稀释成含细胞数为2×107/ml备用，每只小鼠于右腋皮下接种0.2ml细胞。凡腋下接种了H22或HepS细胞的小鼠致病率达100％。
1.2抑瘤实验抑瘤实验按常规进行，分别将上述接种H22和HepS细胞的小鼠于接种后次日随机分为五组，每组10只，尾静脉注射给药，每次给药体积为0.2ml/10g，(10克体重注射0.2ml)。
(1)阴性对照组尾静脉注射等容积生理盐水注射液，每天两次，间隔7小时，连续10天；(2)阳性对照组尾静脉注射环磷酰胺(CTX)，剂量为30mg/kg/次，隔日一次，共注射3次；(3)猫人参注射液高剂量组，简称高剂量组每天剂量为每公斤体重200g生药提取液(用200g/kg表示，下同)，尾静脉注射猫人参注射液100g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天；(4)猫人参注射液中剂量组，简称中剂量组每天剂量为100g/kg，尾静脉注射猫人参注射液50g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天；(5)猫人参注射液小剂量组，简称小剂量组每天剂量为50g/kg，尾静脉注射猫人参注射液25g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天。
末次给药后次日处死动物，解剖并完整分离肿瘤，称瘤重量，计算肿瘤抑制率(IR)。剥取小鼠胸腺、脾脏并称重，计算脾脏和胸腺指数。以上实验重复三次。
2、对小鼠腹水型肝癌H22的生存期的影响2.1腹水型肝癌H22造模选取已腹腔接种小鼠H22肝癌细胞后8日健康状况较好的小鼠，颈椎脱臼处死，抽取腹腔积液(乳白色腹水)，生理盐水洗涤，稀释成含细胞数为2×107/ml备用，每只小鼠于腹腔内注射0.2ml。凡腹腔接种了H22细胞的小鼠均会得腹水型肝癌。
2.2抑瘤试验接种后次日将小鼠随机分为五组分组与给药方法同实体型肝癌模型实验，逐日观察并记录小鼠的死亡情况，观察小鼠生存期，计算生命延长率(％)。以上实验重复三次。
3、疗效评价实体瘤疗效以肿瘤生长抑制率(抑瘤率)表示，按下列公式计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率(IR)＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。
免疫器官指数脾脏(胸腺)指数＝脾脏(胸腺)重(g)/体重(g)；腹水型疗效评价以生命延长率表示，按下列公式计算生命延长率。
生命延长率＝(实验组平均存活天数/对照组平均存活天数-1)×100％
4、结果(各项指标取三次重复实验的平均值)(1)猫人参注射液对小鼠实体型肝癌的抑制作用(见表1)表1猫人参注射液对小鼠实体型肝癌的抑制作用(n＝30，x±s)肿瘤类型 组别 平均瘤重(g) 平均抑瘤率(％)1、阴性对照组 2.37±0.97 02、阳性对照组 0.79±0.88 64.73HepS 3、高剂量组 0.92±0.51 57.694、中剂量组 1.63±0.10 44.245、小剂量组 1.96±0.04 33.111、阴性对照组 2.01±0.85 02、阳性对照组 0.79±0.36 54.86H223、高剂量组 0.80±.2457.624、中剂量组 1.3±0.4841.425、小剂量组 1.47±0.33 34.15由表1看出，不同剂量的猫人参注射液对小鼠肝癌HepS、H22均有一定的抑制作用，抑瘤率达30％以上，且有较明显的剂量依赖性，随着剂量的增加，作用增强，猫人参注射高剂量组抑瘤率达到50％以上，与阳性对照组比较接近。
2.猫人参注射液对腹水型肝癌H22小鼠生存期的影响(见表2)
表2猫人参注射液对腹水型肝癌H22小鼠生存期的影响(n＝30，x±s)肿瘤 分组 平均生存期(天) 平均生命延长率(％)H221、阴性对照组 11.2±0.352、阳性对照组 13.50±1.61 20.533、高剂量组 13.43±0.67 19.904、中剂量组 12.8±0.28 13.405、小剂量组 11.55±0.64 2.18表2表明，猫人参注射液高剂量治疗组腹水型肝癌H22小鼠的生存期明显提高，生命延长率为19.90％，与阳性对照组比较接近，提示高剂量的猫人参注射液可延长腹水型肝癌H22小鼠的生存期。
(3)猫人参注射液对小鼠免疫器官的影响(见表3)。
表3猫人参注射液对小鼠脾和胸腺指数(n＝30，x±s)肿瘤类型 组别 脾指数(g/100g)胸腺指数(g/100g)1、阴性对照组0.838±0.325 0.274±0.0872、阳性对照组0.587±0.706 0.222±0.267H223、高剂量组 0.961±0.114 0.294±0.1074、中剂量组 0.984±0.192 0.339±0.0705、小剂量组 1.079±0.302 0.319±0.2661、阴性对照组0.702±0.193 0.317±0.1042、阳性对照组0.751±0.147 0.277±0.113HepS 3、高剂量组 0.613±0.240 0.264±0.0864、中剂量组 0.709±0.242 0.275±0.0595、小剂量组 0.713±0.326 0.280±0.176
由表3显示猫人参注射液对荷瘤小鼠脾脏或胸腺指数均无明显的增强作用，接近于阴性对照组。阳性对照组脾脏或胸腺指数均下降，但无显著性。
二.高剂量猫人参注射液对小鼠免疫功能的影响1、脾淋巴细胞的制备将荷瘤小鼠30只，按常规抑瘤实验进行，实体型肝癌H22造模同前。接种后次日将H22实体型肝癌小鼠随机分为三组，每组10只，次日起给药，给药体积为0.2ml/10g。
阴性对照组尾静脉注射等容积生理盐水注射液，每天两次，间隔7小时，连续10天；阳性对照组尾静脉注射环磷酰胺(CTX)30mg/kg/次，隔日一次，共3次；猫人参注射液高剂量组(200g生药/kg/天)尾静脉注射猫人参注射液100g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天；停药后次日，颈椎脱臼处死，在无菌条件下取脾。尼龙网捻碎，加Hanks液2ml冲洗细胞，用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml。
2、小鼠脾T淋巴细胞转化功能测定(采用ConA诱导3H-TdR掺入法检测cpm值)常规用10％NBS-RPMI-1640培养液制备4×106/ml脾淋巴细胞悬液，每组随机取4个脾细胞标本，每个标本设三个复孔，小鼠脾淋巴细胞悬液接种96孔板，每孔加入100μl小鼠脾淋巴细胞悬液(细胞的终浓度为5×105/孔)，加入55μg/mlConA20μl/孔(终浓度为5 mg/L)，设空白对照(不加ConA)，置37℃，5％CO2培养箱内培养48小时后加3H-TdR0.5uCi/孔，继续培养6小时，收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，烤干，加入液闪液，液闪烁仪检测cpm，计算刺激指数(Stimulation Index，SI)。刺激指数(SI)＝ConA刺激管cpm均值/对照管cpm均值。
3、小鼠T细胞亚群检测流式细胞术分析每组随机取4个脾细胞标本，取小鼠脾淋巴细胞悬液约1×106/ml，分别加入荧光标记的CD3+，CD4+，CD8+单抗各100μl。用流式细胞仪检测在荧光直方图上分别计算出CD3+，CD4+，CD8+的阳性峰的百分率4、自然杀伤细胞(NK)活性的检测用同位素3H-TdR标记YAC-1(人白血病细胞)靶细胞，配成2×105/ml细胞悬液，每组随机取4个脾细胞标本，取小鼠脾淋巴细胞悬液约1×106/ml。脾淋巴细胞与靶细胞之比为50∶1。两种细胞悬液分别取100μl加到96孔板中，同时设对照孔(只加YAC-1靶细胞)，在37℃，5％CO2培养箱内培养24小时，收集细胞，加入液闪液，液闪烁仪检测cpm。NK活性用特异性抑制率Pi表示。Pi(％)＝(1-实验组cpm值/靶细胞自然掺入cpm)×100％5、结果各免疫指标如下(1)猫人参注射液对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(见表4)表4猫人参注射液对小鼠淋巴细胞转化功能的影响(n＝4，x±s)组别 刺激指数(SI)阴性对照组 0.98±0.59阳性对照组 0.76±0.45高剂量组 1.21±0.92由表4看出，高剂量猫人参注射液有轻度促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化作用，但与生理盐水组无明显的差异，而CTX阳性对照组有抑制作用。
(2)猫人参注射液对荷瘤小鼠T细胞亚群的影响(见表5)表5猫人参注射液对T细胞亚群的影响(n＝4，x±s)分组 CD4+CD8+CD3+CD4+/CD8+阴性对照组21.75±0.92 3.62±1.5125.37±2.41 6.82±2.60阳性对照组17.36±3.41 4.96±1.5722.31±3.78 3.76±1.27高剂量组19.65±3.75 3.58±0.2522.75±3.74 6.48±1.37由表5中看出，阳性对照组与高剂量组的小鼠的CD3+、CD4+、CD8+细胞、CD4+/CD8+的比值与阴性对照组相比略有下降，但未达到显著的水平，其中阳性对照组的CD4+/CD8+的比值明显的下降，而高剂量组下降不明显，接近于阴性对照组，与阳性对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，说明猫人参注射液对免疫细胞无抑制作用，而CTX则有明显的抑制作用。
(3)猫人参注射液对荷瘤小鼠NK活性的影响(见表6)表6猫人参注射液对荷瘤小鼠NK活性的影响(n＝4，x±s)组别cpm 特异性抑制率Pi(％)阴性对照组627.20±47.2120.67阳性对照组775.90±303.65 1.87高剂量组 698.46±99.5311.66YAC-1 790.66±99.52由表6看出，猫人参注射液对荷瘤小鼠NK细胞活性无明显的抑制作用，而阳性对照组小鼠脾NK细胞活性明显地低于阴性对照组。
以上实验结果表明，猫人参注射液具有良好抗肿瘤作用。小、中、高三个剂量组对小鼠肝癌的抑瘤率均达到30％以上，特别是高剂量组达到50％以上，接近阳性对照组CTX。本发明注射液对荷瘤小鼠ConA诱导的脾细胞增殖反应有一定的作用，对T细胞亚群及NK细胞活性均无明显作用。说明猫人参注射液对机体的细胞免疫无明显的抑制作用。因而本发明注射液可用作抗癌药物。
权利要求
1.一种猫人参注射液的制备方法，操作步骤包括提取、纯化、分装灭菌，其特征在于具体方法为(1)采用水提取法或醇提取法制备猫人参提取液；(2)用醇沉淀法纯化水提取液或用水沉淀法纯化乙醇提取液；(3)用注射用水配制成注射液。
2.按权利要求1所述的猫人参注射液的制备方法，其特征在于所说的水提取法制备猫人参提取液是指，将猫人参用水分次煎煮60-180分钟，合并煎煮的滤液浓缩即可；所说的醇沉淀法纯化水提取液是指，将上述猫人参提取液作如下处理加乙醇使含醇量为45-85％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味；加乙醇使含醇量为55-90％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味；再加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。
3.按权利要求1所述的猫人参注射液的制备方法，其特征在于所说的醇提取法制备猫人参提取液是指，猫人参用45-95％乙醇浸渍72小时，滤液备用，药渣用适量乙醇置水浴上回流提取两次，每次1-3小时，再用60-95％乙醇分次洗涤药渣，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏放置12-48小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；所说的水沉淀法纯化乙醇提取液是指在上述提取液中加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，加适量注射用水，调PH至6-8，冷藏24小时以上，滤过得纯化的猫人参提取液。
4.按权利要求1、2、3所述的猫人参注射液制备方法，其特征在于用注射用水配制成注射液时，用10％NaOH调PH4-10，加活性炭适量，加热、放置30分钟，滤去沉淀，再分装灌封灭菌。
5.权利要求1、2、3所述猫人参注射液制备方法所制得的猫人参注射液。
6.权利要求4所述猫人参注射液制备方法所制得的猫人参注射液。
7.权利要求5所述猫人参注射液用作抗癌药物的用途。
8.权利要求6所述猫人参注射液用作抗癌药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是用猫人参提取液作为君药制备的注射液及其用作抗癌药物的用途。其制备方法为(1)采用水提取法或醇提取法制备猫人参提取液；(2)用醇沉淀法纯化水提取液或用水沉淀法纯化乙醇提取液；(3)用注射用水配制成注射液，灌封、灭菌即可。本发明制备工艺简单，成本低廉，抗癌效果确切，副作用小。
文档编号A61P35/00GK1442188SQ0311631
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月10日 优先权日2003年4月10日
发明者凌昌全, 郑晓梅 申请人:凌昌全, 郑晓梅