专利名称：以聚α-羟基酸树脂为基材的微粒的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚α-羟基酸树脂微米颗粒的制备方法及其应用，属于树脂微粒制备技术。
背景技术：
以树脂为基材制备的载药微粒是一类具有广泛应用前景的药物新剂型。载药微粒通过微粒的吸水膨胀、树脂降解以及降解产物的消除产生协同作用，控制药物从微粒向释放介质的扩散，使药物在一定的时间范围内缓慢释放，实现药物的长效缓释与控制释放。
迄今为止，已有多种可降解高分子树脂在药物传递系统领域得到关注。但研究最为广泛并已有相关制剂产品上市的主要是聚α-羟基酸树脂，例如，聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。目前，由于以聚α-羟基酸树脂为基体的微粒制备技术的限制，应用于制备载药微粒的聚α-羟基酸树脂主要是高分子量的聚合物(Mw＞10,000)。在微粒制备时，通过选择合适的聚合物分子量或共聚物组成(例如PLGA中乳酸(LA)与乙醇酸(GA)链段的摩尔比)，可得到具有多种的药物释放特性的载药微粒。尽管如此，高分子量的聚α-羟基酸树脂载药微粒的药物释放性能离临床应用的要求还有较大差距，并且无法提供许多在临床投药中有重要应用价值的药物释放性能，表现在(1)高分子量的聚α-羟基酸树脂载药微粒的释药周期至少在一个月以上，无法实现释放周期较短(几天至几周)的药物控释在临床用药中，药物在几天至几周之内的控制释放在许多场合有很高的应用价值例如在手术后对患者注入止痛药物，根据具体情况，一般药物在几天至几周内释放完毕最为合理。高分子量的聚α-羟基酸树脂为基材的载药微粒的释放周期至少在一个月以上，这是由于聚α-羟基酸树脂制备的载药微粒，只有当树脂降解到一定的分子量致使微粒崩解，才能使微粒中包载的药物完全释放出来，而高分子量的树脂降解到足够低的分子量使微粒解体至少需要一个月左右的时间，因此，无法为药品提供较短释放周期的控制释放。
(2)包载于高分子量聚α-羟基酸树脂微粒中的药物，在释放周期内不能保持稳定的释放速率，特别是初期药物突释现象严重，释药性能无法满足临床用药的要求在临床投药时，为使药物能够正常发挥药效，药物在血液中的浓度必须保持在有效血药浓度范围内(高于最低有效浓度，低于中毒极限浓度)，这要求载药微粒必须保持相对稳定的释药速率。高分子量的聚α-羟基酸树脂载药微粒的药物释放一般包括三个阶段初期突释阶段、扩散控释阶段以及降解控释阶段，每个阶段的释放速率不同并且各阶段的释药速率也不能保持稳定，特别是初期药物突释往往使血药浓度在短期内大大超过中毒极限浓度，引起人体药物中毒。所以，此类载药系统无法实现药物在释放周期内的稳定释放，难于在临床投药中得到广泛的推广和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供以聚α-羟基酸树脂为基材的微粒的制备方法，以该方法制备的以聚α-羟基酸树脂为基材的微粒用作药物传递系统可实现释放周期较短、初期突释效应较弱的药物控释以及释放周期较长、释药速率保持稳定的药物控释。
为实现上述目的，本发明通过下述技术方案加以实现以包括聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物的聚α-羟基酸树脂为基材，通过树脂熔融载药法、盐析法、溶剂萃取法、溶剂挥发法或自乳化-溶剂挥发法制备微米级的颗粒，其特征在于以聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物中某一种的重均分子量Mw为900-10,000的树脂，或以上述某种树脂不同分子量的混合物为基材进行制备。
上述树脂微粒可用于包载亲水性或疏水性药物(化学药或中药提取物)以及生物活性大分子(如蛋白质和肽类)，也可以用于包载细胞和疫苗，还可以用于包载其他的化学物质(如化妆品、农药、涂料、染料)。
本发明提供的树脂微粒运用于药物控释领域具有突出的优点以重均分子量Mw为900-10,000的低分子量聚α-羟基酸树脂制备的载药微粒可使各类包载药物在较短的释放周期内逐渐从微粒内释放出来(释放周期为1周至1个月)，药物释放的初期突释效应小，可实现许多在临床中有重要应用价值的短释放周期的药物控制释放；采用不同分子量的聚α-羟基酸树脂混合物为基材制备的载药微粒可实现药物释放周期为1个月至1年的缓释，包载药物在释药周期内，初期突释效应小，前期和后期释放阶段释药速度保持稳定，无末期加速释放过程，可实现药物在整个释放周期内释药速率始终保持稳定的控制释放，满足临床应用的要求。某些特定的树脂混合物为基材的载药微粒还可实现一般的药物传递系统很难提供的药物零级释放，既实现释药速率在整个释放周期内始终保持恒定的控制释放。由于药物释放速率在释放周期内始终保持恒定，对于最大限度实现安全有效的投药，有着重要的意义，因此，实现药物零级释放的此类载药微粒为一类具有很高的技术水准，并且在临床投药中具有广泛的应用价值的新型药物传递系统。
附图1实施实例1制备的以低分子量PLA为基材的阿司匹林载药微粒的电镜照片；附图2实施实例1制备的以低分子量PLA为基材的阿司匹林载药微粒与相同条件下制备的高分子量的PLA的阿司匹林载药微粒的特征药物释放曲线；其中曲线1为低分子量的PLA载药微粒的药物释放曲线，曲线2为高分子量的PLA载药微粒的药物释放曲线；附图3实施实例2制备的以低分子量PLGA树脂为基材的阿司匹林载药微粒的特征药物释放曲线；附图4实施实例3制备的以不同分子量的PLGA树脂混合物为基材的牛血清蛋白载药微粒与相同条件下制备的高分子量的PLGA为基材的牛血清蛋白载药微粒的特征药物释放曲线；其中曲线1为不同分子量的PLGA混合物为基材的载药微粒的药物释放曲线，曲线2为高分子量的PLGA载药微粒的药物释放曲线；附图5实施实例4制备的以不同分子量的PGA树脂为基材的牛血清蛋白载药微粒的特征药物释放曲线。
具体实施例方式
实施实例1以低分子量PLA制备阿司匹林缓释微粒以溶剂挥发法制备低分子量PLA载药微粒称取低分子量PLA(重均分子量Mw7,755)30g溶解于50mL二氯甲烷中制成油相树脂溶液；将908.1mg B型明胶溶解在10mL高纯水中形成明胶水溶液，将1.5g阿司匹林在转速为200rpm的磁力搅拌下悬浮于明胶溶液中；所得的溶液与油相树脂溶液混合，采用超声发生器对混合物超声5次，每次超声时间为60s，超声输出功率为20W，以形成油包水乳液，所得乳液在冰箱中冷却至4℃，然后加入500mL 0.5％的聚乙烯醇水溶液中，将所得的混合物用针式匀质器在10,000rpm的转速下匀浆2min形成水包油包水复合乳液，将所得乳液在转速为230rpm的机械搅拌下，加入12.5L蒸馏水中，在室温下挥发油相溶剂(挥发时间3h)，得到含有载药微粒的悬浮体系；以90目筛子过滤悬浮液，将滤液转入离心管中，离心5min(离心力400×g力)，收集离心管底部的载药微粒，悬浮于75mL D-甘露糖醇的水溶液中(含甘露糖醇1050 mg)，冷冻干燥所得的悬浮体系，得到阿司匹林载药微粒冻干粉。
在相同条件下，按相同的原料投料比，制备高分子量PLA(Mw18,798)载药微粒冻干粉。
以扫描电子显微镜(SEM)观察低分子量PLA载药微粒的尺寸和形貌将载药微粒堆放于铝制样品台上喷金90秒，然后在SEM下观察，并显微拍照。由附图1可见，载药颗粒为30-50μm的微球，微粒间粘连较少。
分别称取20mg的以低分子量PLA与高分子量PLA为基材的载药颗粒溶解于1mL乙酸乙酯中，并加入1mL磷酸缓冲溶液(PBS，20mM，pH 7.4，含0.02％的重氮钠作为杀菌剂)和1mL无水乙醇，形成均相混合溶液；取出0.5mL，采用高效毛细管电泳仪(HPCE)测试溶液中的阿司匹林和水杨酸的含量，按下列公式计算载药量和包封率(采用44cm×50μm的开口型熔合硅毛细管，以磷酸缓冲溶液(40mM，pH 10.5)为流动相，在236nm的波长下测试，操作温度为25℃)。
微粒实际载药率(％)＝颗粒中阿司匹林的含量/颗粒的总重量×100(式中颗粒中阿司匹林的含量由测得阿司匹林与水杨酸的总量计算)微粒包封率(％)＝实际载药率/理论载药率×100(式中理论载药率由原料中阿司匹林与树脂的比例计算)计算得低分子量PLA为基材的载药微粒的载药率和包封率分别为1.18％和25.4％，高分子量PLA的载药率和包封率分别1.25％和26.9％。
称取所得的树脂载药颗粒50mg置于测试管中，加入2mL pH 7.4的磷酸缓冲溶液，将测试管置于37℃的恒温水浴震荡器中，每隔一定的时间，以700×g力的离心力离心测试样品混合物(离心时间为5分钟)，取出1.8mL离心上清液作为测试样本，并向测试管中加入相同量的磷酸缓冲溶液替换上清液；从样本中取出0.5mL，采用高效毛细管电泳仪测定药品中的阿司匹林和水杨酸的含量。测试条件与载药量的测定相同。累积药物释放速率计算如下累积药物释放速率(％)＝(Ma+Ms)t/Md×100(其中Ma和Ms分别为在t时刻释放的阿司匹林和水杨酸的量，Md为PLGA颗粒载药量)由附图2曲线1可见低分子量聚乳酸载药微粒可实现包载阿司匹林释放周期为19天、初期突释效应较弱的控制释放，与曲线2高分子量PLA为基材的载药微粒相比，释药周期明显缩短，突释效应不明显。
实施实例2以低分子量PLGA制备阿司匹林缓释微粒。
采用熔融载药法制备载药微粒称取2种不同的乳酸-乙醇酸低分子量的共聚物(PLGA72/28、PLGA46/54，乳酸与乙醇酸链段的摩尔比LA∶GA分别为72∶28、46∶54，重均分子量Mw分别为1368、990)。每种样品各称5g，在120℃硅油浴中逐步软化为液态，称取0.5g阿司匹林，在研钵中研碎，加入液态低聚物中，保持混合物的温度，用玻璃搅拌棒使药物与液态低聚物混合均匀，所得的混合物体系转移至一圆柱形模具，并冷却至-5℃，使载药的低聚物模塑成型，形成棒状；所得的棒状载阿司匹林的PLGA低聚物，用玻璃杵在研钵中磨碎，形成载药的低聚物颗粒；用滤筛筛选颗粒，得到粒径小于200μm的载药颗粒。
通过实施实例1的方法测定载药微粒的载药率、包封率和药物释放性能。
计算得PLGA72/28、PLGA46/54的载药率和包封率分别为8.54％、8.49％以及93.93％、93.34％。
由附图3的曲线1可见载药微粒可实现包载药物释放周期为9-12天、初期突释效应较弱的缓释，并且随树脂中亲水性GA链段所占比例的提高，释药速率加快。
实施实例3以不同分子量PLGA树脂的混合物制备牛血清蛋白控释微粒。
以溶剂挥发法制备载药微粒将两种乳酸-乙醇酸共聚物(PLGALA/GA75/25，Mw10,091，23.69g和PLGALA/GA75/25，Mw 1,715，7.14g)溶解于50mL二氯甲烷中制成油相树脂溶液；将908.1mg B型明胶溶解在10mL高纯水中形成明胶水溶液，将1g牛血清蛋白溶解于明胶溶液中；所得的溶液与油相树脂溶液混合，采用超声发生器对混合物超声5次，每次超声时间为60s，超声输出功率为20W，以形成油包水乳液；所得乳液在冰箱中冷却至0℃左右，然后加入500mL 0.5％的聚乙烯醇水溶液中，将所得的混合物用针式匀质器在10,000rpm的转速下匀浆2min形成水包油包水复合乳液，将所得乳液在转速为230rpm的机械搅拌下，加入12.5L蒸馏水中，在室温下挥发油相溶剂(挥发时间3h)，得到含有载药微粒的悬浮体系；以90目筛子过滤悬浮液，将滤液转入离心管中，离心5min(离心力400×g力)，收集离心管底部的载药微粒，悬浮于75mL D-甘露糖醇的水溶液中(含甘露糖醇1,050mg)，冷冻干燥所得悬浮体系，得到牛血清蛋白载药微粒冻干粉。
在相同条件下，按相同的原料投料比，制备高分子量PLGA(Mw10,091)载药微粒冻干粉。
将20mg的冻干微粒加入5mL 5％的十二烷基硫酸钠的0.1N的NaOH水溶液中，在室温下静置15h直至混合体系转变为澄清溶液。采用microBCA蛋白质测法(Prerce，IL，USA)在494nm的波长下测定溶液中BSA的含量，计算微粒的载药量与包封率(载药率和包封率的计算参见实施实例1)。计算得以不同分子量PLGA树脂混合物制备的载药微粒的载药量和包封率分别为1.04％和35.2％，以高分子量PLGA树脂为基材的载药微粒的载药率和包封率分别为0.99％和33.5％。
将20mg冻干微粒置于测试管中，加入4mL pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，在37℃的水浴中恒温震荡(水浴震荡器的转速为60rpm)，每隔一定时间从离心管中取出2mL上清液，并向离心管中加入相同量的释放介质，以microBCA蛋白质测定法通过前述方法测定牛血清蛋白含量，计算药物释放率(计算方法参见实施实例1)。由附图4可见，此微粒载药系统可实现药物释放周期为35天，释药速率基本符合零级释放规律的控制释放；而高分子量PLGA制备的载药微粒的在释放周期内，释药速率随时间的改变非常明显。
实施实例4以不同分子量PLA树脂混合物制备牛血清蛋白控释微粒。
以溶剂挥发法制备载药微粒分别称取重均分子量分别为22,313和2,127的两种聚乳酸22.19g和7.14g溶解于50mL二氯甲烷中制成油相树脂溶液；将1.04mg B型明胶溶解在10mL高纯水中形成明胶水溶液，将1g牛血清蛋白溶解于明胶溶液中；所得的溶液与油相树脂溶液混合，采用超声发生器对混合物超声5次，每次超声时间为60s，超声输出功率为20W，以形成油包水乳液，所得乳液在冰箱中冷却至0℃左右；然后加入500mL 0.5％的聚乙烯醇水溶液中，将所得的混合物用针式匀质器在10,000rpm的转速下匀浆2min形成水包油包水复合乳液，将所得乳液在转速为230rpm的机械搅拌下，加入12.5L蒸馏水中，在室温下挥发油相溶剂(挥发时间3h)，得到含有载药微粒的悬浮体系；以90目筛子过滤悬浮液，将滤液转入离心管中，离心5min(离心力400×g力)，收集离心管底部的载药微粒，悬浮于75mL D-甘露糖醇的水溶液中(含甘露糖醇1,050mg)，冷冻干燥所得悬浮体系，得到牛血清蛋白载药微粒冻干粉。
通过实施实例3的方法计算微粒载药量和包封率和药物释放性能。计算得微粒的载药率和包封率分别为1.10％和37.9％。由附图5可见，此微粒载药系统可实现药物释放周期为37天，释药速率基本符合零级释放规律的控制释放。
权利要求
1.一种以聚α-羟基酸树脂载药微粒为基材的载药微粒的制备方法，其特征在于以包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的聚α-羟基酸树脂中某一种的重均分子量Mw为900-10,000的树脂，或以上述某一种树脂的两种或两种以上不同分子量的混合物为基材，通过树脂熔融载药法、盐析法、溶剂萃取法、溶剂挥发法或自乳化-溶剂挥发法进行制备。
2.一类按照权利要求1所述的以聚α-羟基酸树脂为基材的载药微粒的应用，其特征在于用于包载亲水性或疏水性药物以及生物活性大分子，或用于包载细胞和疫苗，或用于包载化妆品、农药、涂料、染料、精细化学品。
3.按照权利要求2所述的以聚α-羟基酸树脂为基材的载药微粒的应用，其特征在于亲水性或疏水性药物包括化学药或中药提取物；生物活性大分子包括蛋白质和肽类。
全文摘要
本发明公开了一种聚α－羟基酸树脂微米颗粒的制备方法及其应用，属于树脂微粒制备技术。该方法以聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸－乙醇酸共聚物中某一种的低分子量的树脂，或以上述某种树脂不同分子量的混合物为基材进行微粒制备。本树脂微粒可用于包载亲水性或疏水性药物以及生物活性大分子，包载细胞和疫苗，还可以用于包载其它的化学物质如化妆品、农药、涂料、染料。本发明的优点在于以低分子量的聚α－羟基酸树脂制备的载药微粒可实现包载药物释放周期为1周至1个月，初期突释效应较小的控制释放；以不同分子量的某种聚α－羟基酸树脂混合物为基材制备的载药微粒可实现释放周期为1个月至1年，在释放周期内释药速率保持稳定或恒定的药物控释。
文档编号A61K47/34GK1481902SQ0313044
公开日2004年3月17日 申请日期2003年7月24日 优先权日2003年7月24日
发明者吴学森, 卢剑 申请人:天津麦凯泰生物制品有限公司