专利名称：一种雷蘑提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌提取物及其应用，特别涉及一种雷蘑提取物及其在制备治疗癌症药物中的应用。
背景技术：
目前，恶性肿瘤已成为人类主要的死亡原因之一。我国每年新出现的肿瘤患者约100万，死亡80万左右。特别是白血病，近年来呈上升趋势，严重地危害人类的生命和健康，而且大多患者是儿童和青少年。以白血病为代表的儿童恶性肿瘤目前已经成为我围5-15岁儿童的第二大死亡原因，每年平均有两万左右十五岁以下的儿童患白血病。科学家至今无法摸清造成白血病的原因。因此恶性肿瘤的防治成为现代医学亟待解决的重大课题。许多科学家和医学工作者进行了大量研究，得到很多能够杀死和抑制肿瘤细胞的药物，但同时这些药物也对正常细胞产生一定程度的危害性。
70年代初，人们开始研究是否可以通过诱导分化，使肿瘤细胞向正常细胞分化，从而达到治疗恶性肿瘤地目的。肿瘤细胞的诱导分化疗法优于传统的化疗和放疗，该疗法不是杀伤肿瘤细胞，而是在分化诱导剂的作用下，诱导肿瘤细胞向成熟阶段分化，恢复细胞的正常或接近正常的表型和功能。当前，寻找肿瘤细胞分化诱导剂已成为新的研究领域。
现已发现十余种化合物可以作为肿瘤细胞分化诱导剂。其中研究最多的是维甲酸类化合物(RA)与杂极性化合物，如二甲亚砜(DMSO)、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)、丁酸等。据文献报导二甲亚砜诱导率为80％，是公认最好的诱导剂。1986年我国首先应用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病，取得了良好效果。上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所与哈尔滨医科大学的研究发现可以使用As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病，其机制主要是促进急性早幼粒细胞凋亡。虽然ATRA及As2O3在治疗急性早幼粒细胞白血病上取得了成功，维甲酸、HMBA已进入临床阶段，但是这些药物都属纯化学药剂，副作用很大，而且在适应病情范围、剂量依赖的毒性等方面存在着局限性，还不能广泛应用于临床肿瘤治疗。
我国作为一个中药大国，利用我们的传统优势，在中药抗癌方面作了很多研究。发现很多类中草药能够抑制癌细胞生长，而且毒性较低。目前已开发了一些能够治疗癌症的中草药，如灵芝孢子粉、云芝多糖、香菇多糖以及已经上市的天仙丸等。但是由于这些中草药成分复杂，其有效成分及机理还未研究清楚，且疗效不显著，不适用于白血病和肝癌。
雷蘑是一种天然伞菌目白蘑科口蘑属的口蘑，拉丁名为Leucopaxillusgiganteus；其子实体夏秋季生长在草原上，子实体菌盖约5-30cm，常见于秋季的内蒙古锡林郭勒草原。目前对雷蘑的应用尚处于开发阶段，对其含有的各类化学成分没有详细研究记载，中药方一般用于透发小儿麻疹，治疗感冒，抗肺结核杆菌等。
发明创造内容本发明的目的是提供一种能够得到有效利用的雷蘑提取物。
一种雷蘑提取物，是通过下述方法得到的将雷蘑搅碎，加入其8-12倍体积0.6-0.8％的NaCl水溶液或水，离心，取上清或用120-200目网过滤，取滤液，即为雷蘑提取物。
本发明的雷蘑提取物可以从野生的雷蘑子实体也可以从人工培养的雷蘑菌丝体中提取。
所述雷蘑一般选用干燥雷蘑，为了使雷蘑的有效成分得到充分释放，应将干燥雷蘑子实体粉碎机粉碎至70-90目。
所述NaCl水溶液或水的体积优选的为雷蘑体积的10倍，所述NaCl水溶液的浓度优选的是0.7％。
所述离心为4000转20分钟。
所述雷蘑提取物经电泳及全光谱分析表明，其有效成分主要为多糖蛋白及小分子肽类，其中还含有杯伞素(Clitocybin)。
本发明的另一个目的是提供一种治疗癌症的药物。
本发明所提供的治疗癌症的药物，它的活性成分是上述雷蘑提取物。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，优选为口服液。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为提取物原液0.2ml/kg/day，还应加入药学上可接受的载体，稀释剂、吸收促进剂、香味剂、甜味剂等。疗程一般为45-60天。
本发明的雷蘑提取物含有诱导分化因子，在一定的浓度下能诱导癌细胞向正常细胞分化；经体外细胞实验验证，该提取物不但能够杀死白血病细胞而且对人体正常细胞无任何杀伤作用，无毒副作用；与目前国内外常见同类药物比较，本发明的诱导分化率均高于其他诱导分化剂，发明人用常规方法在同等条件下做诱导分化试验比较，二甲亚砜DMSO诱导分化极微量，目前已上临床试验的维甲酸仅30％左右，而本发明的雷蘑提取物诱导分化率达到40％以上，且用量较少，是一种非常有开发价值的抗癌药物。
具体实施例方式
实施例1、培养雷蘑菌丝体取新鲜雷蘑子实体，在无菌条件下，去净表面杂物，用70％酒精消毒，然后用无菌解剖刀将子实体剖成两半，割取子实体菌柄与菌盖交接处的中间部分约黄豆大小的组织块，接入试管培养基中，培养基地配方为蔗糖20g、土豆200g、KH2PO43g、MgSO40.5g、维生素B12mg、琼脂10g、水1000ml，pH6.1(pH6.0-6.2均可)，29℃(28℃-30℃均可)恒温培养15天(10-20天均可)，在培养基表面生长出浓密的雷蘑原代菌丝体；再将该雷蘑原代菌丝体接入另一与上述培养基同组分的培养基上进行传代培养3代(1-4代均可)，得到驯化的雷蘑菌丝体菌种；将上述转接得到的驯化雷蘑菌丝体菌种接入经灭菌(1.5kg/cm2高压的条件下灭菌30分钟)的液体培养基(蔗糖20g、黄豆粉10g、玉米粉10g、KH2PO43g、MgSO40.5g、维生素B12mg、酵母粉1g、CaCO31g、水1000ml)中，并在摇床上29℃(28℃-30℃均可)恒温培养3天(4-5天均可)，速度为120转/分，然后接入发酵罐培养，其接种量为10v％，在29℃(28℃-30℃均可)恒温培养4天(3-5天均可)，并经过滤，得到雷蘑菌丝体。
实施例2、制备雷蘑提取物将实施例1得到的雷蘑菌丝体10g(湿重)，绞碎至浆状，加入100ml 0.7％NaCl水溶液，搅拌10分钟，4000转离心20分钟，取上清，得到60ml雷蘑提取物。
实施例3、制备雷蘑提取物将实施例1得到的雷蘑菌丝体10g(湿重)，绞碎至浆状，加入100ml纯净水，搅拌20分钟，用200目尼龙网过滤，取滤液，得到60ml雷蘑提取物。
实施例4、制备雷蘑提取物将采集得到的雷蘑子实体10g，干燥，粉碎至80目，加入100ml 0.75％NaCl水溶液，搅拌30分钟，4000转离心20分钟，取上清，得到80ml雷蘑提取物。
实施例5、制备雷蘑提取物将采集得到的雷蘑子实体10g，干燥，粉碎至90目，加入100ml纯净水，搅拌30分钟，用150目尼龙网过滤，得到80ml雷蘑提取物。
实施例6、急性毒性检测实验将体重为20克的30只小鼠分为三组第一组10只为对照组，用北京动物饲养中心配制的普通鼠食喂养；第二组10只，用含有雷蘑菌丝体的鼠食，按5g菌丝体(湿重)/d.Kg喂养；第三组10只，用本发明的雷蘑提取物(用0.7％NaCl或水稀释至10wt％)，给小鼠灌胃。其它的日常饲养条件相同。
雷蘑提取物按5ml/d.Kg灌胃。
喂养、灌胃30天，称重，第一组小鼠平均体重为31.2g，第二组小鼠平均体重为32.8g，第三组小鼠平均体重为32.9g。
饲喂雷蘑菌丝体及雷蘑提取物的小鼠的平均体重略高于对照组；且无任何不良反应，由此结果可知，本发明制备的雷蘑提取物没有毒性。
实施例7、本发明雷蘑提取物对肝癌细胞的抑制用中国科学院动物所提供的S180腹水癌细胞对小鼠进行接种实验。所用的小鼠为购自北京动物饲养中心的昆明公鼠，体重为20克。将30只小鼠分为五组，每组5只，第一～二组喂养30天，第三～五组喂养60天。
用北京动物饲养中心配制的普通鼠食，或用本发明的雷蘑提取物(用0.7％NaCl或水稀释至10wt％)，给小鼠灌胃。
第一组接种癌细胞，使用普通鼠食进行喂养，30天后死亡4只；第二组接种癌细胞，先用普通鼠食喂养被接种的小鼠，一周后小鼠产生腹水，腹部与对照相比明显涨大，用手触摸腹部有腹水感觉；此时开始每只用0.2毫升/天的雷蘑提取物灌胃，30天后全部存活，腹部变小；第三组接种癌细胞，使用普通鼠食进行喂养，60天后全部死亡；第四组接种癌细胞，并在接种癌细胞同时每只用0.2毫升/天的雷蘑提取物灌胃，60天后全部存活，无腹水出现；第五组接种癌细胞，先用普通鼠食喂养被接种的小鼠，一周后小鼠产生腹水，腹部与对照相比明显涨大，用手触摸腹部有腹水感觉；此时开始每只用0.1毫升/天/只的雷蘑提取物灌胃，60天后全部存活，腹部变小。
将喂药组解剖肝部观察，无异常，且癌细胞抑制率达95％，说明本发明制备的雷蘑提取物对癌细胞具有明显地抑制作用，但对正常细胞无毒副作用。
将第一、二、四和五组存活的20只小鼠分为两组，与正常小鼠一起进行体能实验和耐缺氧实验。体能实验将小鼠的尾部用铁丝捆绑5克重物，使负重的小鼠刚好可以下沉，又能不断上浮呼吸。耐缺氧实验把做好记号的小鼠置入密闭容器中，然后逐渐抽取空气，使容器内只剩少量空气。体能实验和耐缺氧实验结果表明，存活的20只小鼠在体能和耐缺氧方面与正常小鼠并无差异，说明雷蘑提取物可以治愈癌症，使小鼠恢复正常。
分组实验结果表明，用NaCl水溶液或水从人工菌丝体和天然子实体得到的雷蘑提取物效果相同。
实施例8、本发明雷蘑提取物对白血病癌细胞的抑制作用人红白血病细胞株K562是人造血系统的恶性肿瘤细胞，K562白血病细胞系源自美国ATCC。本实验使用的K562为协和医科大学细胞生物室储存，并用含10％小牛血清的1640培养基按常规培养条件进行培养。
将本发明的雷蘑提取物用0.7％NaCl或无菌水稀释成1％、0.5％、0.1％的溶液，对人红白血病K562细胞进行抑制生长验证。将3×104/ml K562细胞分别接种到96孔板，按8孔一组，分为12组，分别加入1％、0.5％、0.1％的雷蘑提取物200微升，培养1、3、5天后，分别记数细胞，并绘制生长曲线。实验结果表明，200微升的1％，0.5％的提取物，均能100％杀死1000～5000个癌细胞，0.1％的提取物能诱导分化癌细胞，诱导率约40％以上。
实施例9、本发明雷蘑提取物对免疫器官胸腺、脾脏重量的影响胸腺与脾脏是体内的主要免疫器官。胸腺为初级淋巴器官，游走的造血干细胞进入胸腺原基，在此分化增殖成T淋巴细胞(T细胞)，与细胞免疫有关。脾脏为次级淋巴细胞，免疫活性细胞移行于此，并在此处因受免疫过程中异体抗原刺激而进一步增殖分化和成熟，脾脏中有T淋巴细胞和B淋巴细胞(B细胞)，还有巨噬细胞，与体液免疫、细胞免疫均有密切关系，一些免疫抑制剂如环磷酰胺、可的松等，均可使胸腺、脾脏明显萎缩，免疫增强剂如一些免疫多糖则使胸腺或脾脏增重。
本发明的雷蘑提取物用0.7％NaCl稀释成1％，给小鼠灌胃，幼鼠体重11-15g，成年鼠体重18-22g，给药量幼鼠为0.1g/kg/d，成年鼠为0.5g/kg/d，灌胃给药7天，每天1次，于末次给药后24小时后，处死，摘出胸腺及脾脏称重，以胸腺或脾脏重量(mg)与体重(g)之比作为胸腺或脾指数。结果如表1所示表1、提取物对小鼠免疫器官重量的影响
从表1的数据可以看出，用本发明的提取物给小鼠灌胃，可明显增加小鼠胸腺、脾脏重量。因此推断本发明的提取物对动物的免疫功能有增强作用。
权利要求
1.一种雷蘑提取物，是通过下述方法得到的将雷蘑搅碎，加入其8-12倍体积0.6-0.8％的NaCl水溶液或水，离心，取上清或用120-200目网过滤，取滤液，即为雷蘑提取物。
2.根据权利要求1所述的雷蘑提取物，其特征在于所述雷蘑为干燥雷蘑，并粉碎至70-90目。
3.根据权利要求1所述的雷蘑提取物，其特征在于所述NaCl水溶液或水的体积为雷蘑体积的10倍。
4.根据权利要求1所述的雷蘑提取物，其特征在于所述离心为4000转/分，离心20分钟。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的雷蘑提取物，其特征在于所述NaCl水溶液的浓度为0.7％。
6.根据权利要求1或2或3或4所述的雷蘑提取物，其特征在于所述雷蘑提取物的有效成分为多糖蛋白、小分子肽类及杯伞素(Clitocybin)。
7.一种治疗癌症的药物，它的活性成分为雷蘑提取物。
8.根据权利要求7所述的治疗癌症的药物，其特征在于所述药物的剂型是任何一种药剂学上可接受的剂型。
9.根据权利要求8所述的治疗癌症的药物，其特征在于所述药剂是口服液。
10.根据权利要求7或8或9所述的治疗癌症的药物，其特征在于所述药物中还添加有药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种雷蘑提取物及其应用，目的是提供一种雷蘑提取物及以其为活性成分治疗癌症的药物。一种雷蘑提取物，是通过下述方法得到的将雷蘑搅碎，加入其8－12倍体积0.6－0.8％的NaCl水溶液或水，离心，取上清或用120－200目网过滤，取滤液，即为雷蘑提取物。本发明还提供了一种以上述雷蘑提取物为活性成分治疗癌症的药物。本发明的药物疗效显著。
文档编号A61K38/16GK1552417SQ0314085
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者关秀清 申请人:中国科学院植物研究所