专利名称：去白蛋白神经生长因子制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及去白蛋白神经生长因子制剂，属于生物制药领域。
背景技术：
神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，影响中枢神经元的存活，促进神经细胞的分化，对保护神经系统的正常功能具有重要作用。
目前，国内外生产、销售的各种NGF制剂均为冻干粉针剂型，并使用人血清白蛋白作为稳定剂。人血清白蛋白由人血、胎盘血中提取得到，对人没有个体间差异，不会引起个体间免疫变态反应，应用于生物制品生产。然而，在生产和使用过程中，存在着下述一些问题首先，人血清白蛋白能亲和病毒具有免疫原性的糖蛋白部分，使其在病毒离开宿主细胞或病毒体裂解为片断后不被进一步降解，从而保持了病毒的免疫原性，因此长期以来被广泛用作病毒的保护剂。由于这种特性，一些携带来源于供血者血液中的不易检测的病毒的人血清白蛋白会给生产的制剂带来污染，在患者用药的同时导致严重的传染性疾病，如艾滋病、肝炎等。鉴于此种问题时有发生，业内人士普遍认实有寻找一种替代人血清白蛋白的稳定剂的必要。
其次、由于制剂中NGF的含量较低(4～30μg/ml)，而人血清白蛋白与NGF均为蛋白质，且其在制剂中的浓度明显高于NGF，导致产品检定时难以准确测定出有效成分NGF的含量，不利于产品质量控制；目前常用于生物制品中蛋白质含量测定的方法如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法等均不能有效排除这种干扰。
第三、人血清白蛋白来源非常有限，一般只用于临床提高危重病人营养机制、维持血液渗透压、抗休克、运输和解毒作用，使用该种稳定剂将增加生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含人血清白蛋白稳定剂的神经生长因子制剂。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案去白蛋白神经生长因子制剂，它基本上包括如下成分a.有效剂量的神经生长因子(NGF)；b.等渗剂；c.维持制剂pH值为5.0～8.5的缓冲液；d.作为稳定剂的氨基酸、或氨基酸与非离子表面活性剂的混合物；e.注射用水。
所述等渗剂为氯化钠，用于保持流体张力，维持制剂的等渗性，其剂量最优选8.5mg/ml。
适用于本发明的缓冲液为能够维持制剂在水溶液状态下pH值为5.0～8.5的任何一种缓冲液，如磷酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。本发明优选的缓冲液为磷酸缓冲液，pH值优选6.5～7.5，最优选6.8～7.2，由于pH值范围与人体体液的pH值一致，能够有效避免用药刺激性。
本发明的创新之处在于使用氨基酸或氨基酸与非离子表面活性剂的混合物作为稳定剂，替代人血清白蛋白。稳定剂中的氨基酸可以增强蛋白质和水之间的张力，提高蛋白质水化水平，减轻机界剪切力对蛋白质的损伤，促使有效成分在冻干过程中形成结晶，减少在冻干过程中蛋白质的聚合；防止冻干物质在升华和干燥过程中发生崩解，使冻干蛋白形成更大的表面积，加速干燥过程。稳定剂中的非离子表面活性剂可以维持蛋白质的螺旋结构、防止蛋白质在溶液中聚合、阻止蛋白质和多肽物质在容器表面的粘着。
所述的作为稳定剂的氨基酸选白丙氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷丙氨酸、赖氨酸和组氨酸中的几种，各种氨基酸在混合物中的重量份数相同。优选由丙氨酸、甘氨酸和精氨酸组成的混合物，丙氨酸、甘氨酸和精氨酸在混合物中的重量份数比为1∶1∶0.5～1∶1∶3。
所述的作为稳定剂的非离子表面活性剂选自Tween-20(吐温-20)、Tween-80(吐温-80)和F-68，优选吐温-80，其剂量为0.001～0.1％，优选0.005～0.05％，最优选0.008～0.03％。
本发明以丙氨酸、甘氨酸、精氨酸与吐温-80的混合物作为稳定剂可取得最佳效果，稳定剂的剂量为1～20mg/ml，优选8～13mg/ml。
本发明所述的制剂可以制成水针剂，包括如下成分a.4～500μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液；d.1～20mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
本发明所述的制剂可以为冻干粉针剂，它还含有生物上可接受的膨胀剂，它包括如下成分a.4～500μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液；d.1～20mg/ml稳定剂；e.6％的甘露醇；f.冻干前溶液总量加至0.66ml的注射用水。
本发明的有益效果在于本发明选用氨基酸、或氨基酸和非离子表面活性剂作为稳定剂，使NGF制剂不仅能制成冻干剂还能制备成使用方便的水剂，有效避免了人血清白蛋白导致的血液制品污染，解决了NGF定量的难题，并且降低了生产成本；通过与现有产品进行对比实验证明，本发明选用的稳定剂能够达到与现有技术相同的稳定效果，完全可以取代人血清白蛋白。
下面结合较佳实施例作进一步说明，并非对本发明实施方式的限定。
具体实施例方式
实施例1、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.4μg/ml的神经生长因子；
b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.8的磷酸缓冲液；d.1.0mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的重量份数比为1∶1∶0.5。
溶液经0.22μm滤膜过滤后，无菌分装。将水针剂置于湿度为92％、温度为40℃的孵箱中分别存放0天、5天、15天、20天、1月、2月，然后采用鸡背神经节法检测NGF的生物活性、使用pH计检测针剂pH值、按照《中国生物制品规程2000版》中所述方法检测无菌情况并观察溶液的透明度。结果，各个时间点的NGF的比活性为4545、4545、3000、3000、1500、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。在此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例2、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.10μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.5的磷酸缓冲液；d.5.0mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的组分比为1∶1∶1。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为4545、4545、4545、3000、3000、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例3、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.15μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；
d.10mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的重量份数比为1∶1∶1。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为4545、4545、4545、4545、3000、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例4、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.20μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.4的磷酸缓冲液；d.10mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的重量份数比为1∶1∶1。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为4545、4545、4545、4545、3000、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例5、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；d.10mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和非离子表面活性剂(吐温-80)，三种氨基酸的重量份数比为1∶1∶1；吐温-80的浓度为0.03％。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为13636、4545、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000 BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例6、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和非离子表面活性剂(吐温-80)，三种氨基酸的重量份数比为1∶1∶1；吐温-80的浓度为0.01％。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为13636、13636、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例7、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷丙氨酸和非离子表面活性剂(吐温-80)，各氨基酸的重量份数相同；吐温-80的浓度为0.01％。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为13636、13636、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例8、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.4的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和吐温-80，三种氨基酸的重量份数比为1∶1∶1；吐温-80的浓度为0.005％。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为13636、4545、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例9、去白蛋白神经生长因子水针剂制剂配方a.100μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.4的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和吐温-80，三种氨基酸的重量份数比为1∶1∶1；吐温-80的浓度为0.01％。
针剂存放条件和时间同实施例1。NGF在各时间点的活性比分别为13636、13636、13636、4545、4545、3000BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性，液体保持透明。
实施例10、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂a.4μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.0磷酸缓冲液；
d.1.0mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸，三种氨基酸重量份数比为1∶1∶2。
溶液经0.22μm滤膜过滤后采用低温冷冻干燥法冻干。先将冻干机、冻干箱温度降至-45℃，再将样品放入预冻2小时，启动真空泵，待真空达到一定数值后，缓缓打开阀门，关闭冷冻机，缓缓升温至-25℃，待水分蒸发完后升温，在25℃时转入再干燥，然后封盖。
针剂存放条件和时间同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为4545、4545、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例11、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂a.10μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.5的磷酸缓冲液；d.5.0mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的重量份数比为1∶1∶1。
针剂存放条件和时间及制备工艺同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为4545、4545、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例12、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂制剂配方a.15μg/ml的神经生长因子；
b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；d.10mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的重量份数比为1∶1∶1。
针剂存放条件和时间及制备工艺同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为4545、4545、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例13、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂制剂配方a.20μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.4的磷酸缓冲液；d.10mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸，三者的组分比为1∶1∶1。
针剂存放条件和时间同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为4545、4545、4545、4545、4545、1500BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例14、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；
c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和吐温-80，三种氨基酸的组分比为1∶1∶1；吐温-80的浓度为0.03％。
针剂存放条件和时间同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为13636、13636、13636、4545、4545、3000BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例15、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.0的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和吐温-80，三种氨基酸的组分比为1∶1∶2；吐温-80的浓度为0.01％。
针剂存放条件和时间同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为13636、13636、4545、4545、4545、3000BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例16、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂制剂配方a.30μg/ml的神经生长因子；
b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.4的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和吐温-80，三种氨基酸的组分比为1∶1∶2；吐温-80的浓度为0.005％。
针剂存放条件和时间同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为13636、13636、4545、4545、4545、3000BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例17、去白蛋白神经生长因子冻干粉针剂制剂配方a.100μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为7.4的磷酸缓冲液；d.20mg/ml稳定剂；e.60mg/ml甘露醇；f.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
其中稳定剂为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和吐温-80，三种氨基酸的组分比为1∶1∶1；非离子表面活性剂的浓度为0.01％。
针剂存放条件和时间同实施例1。于各时间点用0.66ml注射用水溶解粉针，并采用实施例1所述方法检测NGF的活性，结果在各时间点NGF的活性比分别为13636、13636、13636、4545、4545、3000BU/ml(标示量3000BU/ml)。此期间针剂的pH值没有发生变化，细菌检测为阴性。
实施例18、实施例7和实施例14配方制剂与现有白蛋白NGF配方生物活性比较由上述实施例可知，实施例7和实施例14所选用的稳定剂的剂量性能比最佳，故选用其与现有含有白蛋白制剂作稳定性比较(针剂存放条件和时间同实施例1)，结果如下表表1.实施例7、14制剂与现有含白蛋白制剂稳定性比较
本发明选用氨基酸、或氨基酸和非离子表面活性剂作为稳定剂，使NGF制剂不仅能制成冻干剂还能制备成使用方便的水剂，有效避免了人血清白蛋白导致的血液制品污染，解决了NGF定量的难题，并且降低了生产成本；通过与现有产品进行对比实验证明，本发明选用的稳定剂能够达到与现有技术相同的稳定效果，完全可以取代人血清白蛋白。
权利要求
1.去白蛋白神经生长因子制剂，其特征在于它基本上包括如下成分a.有效剂量的神经生长因子(NGF)；b.等渗剂；c.维持制剂pH值为5.0～8.5的缓冲液；d.作为稳定剂的氨基酸、或氨基酸与非离子表面活性剂的混合物；e.注射用水。
2.根据权利要求1所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的等渗剂为氯化钠。
3.根据权利要求1所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的氯化钠的剂量为8.5mg/ml。
4.根据权利要求1所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的缓冲液为维持制剂pH值为5.0～8.5的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的pH值优选6.5～7.5。
6.根据权利要求5所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的pH值最优选6.8～7.2。
7.根据权利要求1所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的作为稳定剂的氨基酸选自丙氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷丙氨酸、赖氨酸和组氨酸中的几种。
8.根据权利要求7所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的作为稳定剂的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和精氨酸的混合物。
9.根据权利要求8所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的丙氨酸、甘氨酸和精氨酸在混合物中的重量份数比为1∶1∶0.5～1∶1∶3。
10.根据权利要求1所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的作为稳定剂的非离子表面活性剂选自Tween-20(吐温-20)、Tween-80(吐温-80)和F-68。
11.根据权利要求10所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述非离子表面活性剂的剂量为0.001～0.1％。
12.据权利要求11所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述非离子表面活性剂的剂量优选0.005～0.05％。
13.据权利要求12所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述非离子表面活性剂的剂量最优选0.008～0.03％。
14.根据权利要求1所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述稳定剂的剂量为1～20mg/ml。
15.根据权利要求14所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述稳定剂的剂量优选8～13mg/ml。
16.根据权利要求1至15中任何一项所述的神经生长因子制剂，其特征在于该制剂为水针剂，包括如下成分a.4～500μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液；d.1～20mg/ml稳定剂；e.溶液总量加至0.66ml的注射用水。
17.根据权利要求1至15任何一项所述的神经生长因子制剂，其特征在于所述的制剂为冻干粉针剂，它还含有生物上可接受的膨胀剂。
18.根据权利要求17所述的神经生长因子制剂，其特征在于它包括如下成分a.4～500μg/ml的神经生长因子；b.8.5mg/ml氯化钠；c.维持制剂pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液；d.1～20mg/ml稳定剂；e.6％的甘露醇；f.冻干前溶液总量加至0.66ml的注射用水。
全文摘要
本发明公开了一种去白蛋白神经生长因子制剂，它基本上包括如下成分a.有效剂量的神经生长因子(NGF)；b.等渗剂；c.维持制剂pH值为5.0～8.5的缓冲液；d.作为稳定剂的氨基酸、或氨基酸与非离子表面活性剂的混合物；e.注射用水。本发明选用氨基酸、或氨基酸和非离子表面活性剂作为稳定剂，使NGF制剂不仅能制成冻干剂还能制备成使用方便的水剂，有效避免了人血清白蛋白导致的血液制品污染，解决了NGF定量的难题，并且降低了生产成本；通过与现有产品进行对比实验证明，本发明选用的稳定剂能够达到与现有技术相同的稳定效果，完全可以取代人血清白蛋白。
文档编号A61P25/00GK1552440SQ0314073
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者李月娟, 冯宇霞, 赵春文, 顾汉忠, 魏玲 申请人:北京三诺佳邑生物技术有限责任公司