专利名称：在化疗期间保护内皮和上皮细胞的方法
技术领域：
本发明涉及使用放射治疗和/或化疗的领域。更具体地，本发明涉及减轻与这种治疗相关的副作用的方法。
现有技术的说明同种异基因干细胞移植(SCT)是一种公知方法，用于治疗血液瘤和不断增加的各种其它恶性疾病。SCT主要由两个顺序的步骤组成预移植处理，它经典地由全身辐射(TBI))和化疗组成，从而使得残留疾病和受体免疫抑制最小化，以作为第一步，和同种异基因干细胞的转移以作为第二步，这种同种异基因干细胞的转移应当最后提供对病人的治愈。然而，由于在主要组织相容性抗原(MHC)和次要组织相容性抗原(mHAg)内的差异，在移植后的不同阶段中可能发生严重的炎症反应，其中包括急性移植物对抗宿主的疾病(GvHD)。基于本发明者1和数个其它研究者2，3的研究，广泛被接受的是，预移植处理藉助于非特异性发炎助长了这些与移植有关的并发症(TRC)。另外，特别是TBI的直接毒性已得到证明4，5。这已导致目前正在研究的各种可供替代的预移植处理方案。另外，新的预移植治疗允许扩展治疗方案和患者的选择。这些新型预移植处理概念的一种化合物是氟达拉滨(fludarabine)，一种非骨髓消融(non-myleoablative)免疫抑制剂，它最初用于治疗慢性淋巴白血病6。氟达拉滨与例如BCNU和美法仑、环磷酰胺或其它试剂的结合可替代TBI或与剂量降低的TBI方案一起使用7，8。迄今为止获得的临床数据支持氟达拉滨的低副作用以及造血和免疫细胞特异性9。然而，该化合物对非造血细胞如内皮和上皮细胞的影响还尚未进行研究。
事实上所有TRC与内皮功能障碍和损坏有关10。本发明者和其它人已证明，内皮是在体内和体外进行预移植处理的目标。电离辐射诱发内皮细胞内的程序性细胞死亡(apoptosis)11-14。与此同时，内皮以粘附分子表达的方式被激活，从而导致了作为炎症反应的先决条件的增加的白细胞-内皮细胞相互作用15，16。通过细菌的内毒素(脂质多糖，LPS)显著加强了这些效果，所述细菌的内毒素可通过破损的粘膜阻挡层从胃肠道易位17。另外，已表明LPS增加了内皮细胞对同种异基因CD8+细胞毒性T淋巴细胞的抗原性18。
迄今为止获得的含有氟达拉滨的降低强度的处理(RIC)方案的临床结果表明，对预移植处理相关的毒性具有明显向下调节作用，而没有影响免疫重建25。接受RTC的患者中，急性GvHD的发病率与接受经典处理方案的那些患者相当或甚至要小26。然而，关于同样严重或甚至加剧的后期效果如骨坏死27、肺部并发症28和更多慢性GvHD29病例的报道，清楚地证明与氟达拉滨治疗相关的严重副作用。
发明概述本发明基于下述发现氟达拉滨激活并破坏内皮和上皮细胞。这些细胞的激活导致其中使用氟达拉滨的治疗环境的破坏，例如当使用SCT治疗恶性肿瘤时。可以通过采用去纤苷酸(defibrotide)治疗，来保护内皮和上皮细胞免除这种激活和破坏。这种治疗可以是伴随的，或者在用氟达拉滨治疗之前或之后给予去纤苷酸。
缩写和定义SCT造血干细胞移植免疫抑制剂一旦给药，将向下调节受试验者免疫应答的物质。免疫抑制剂用于对接受干细胞治疗的患者的免疫系统进行抑制。免疫抑制剂的例子包括氟达拉滨、环磷酰胺、BCNU、环胞霉素(cyclosporin)、雷帕霉素(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)和美法仑。在本申请的上下文内优选氟达拉滨(也称为2-氟-9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤)。
保护性寡聚脱氧核糖核苷酸(protective oligodeoxyribonucleotide)在本申请的上下文中，应当指在美国专利5,646,268中所定义的寡聚脱氧核糖核苷酸和美国专利5,223,609中所定义的多脱氧核糖核苷酸这二者，在此通过参考将其全文引入。
美国专利5,646,268公开了一种生产具有下述物理化学和化学特征的寡聚脱氧核糖核苷酸的方法
分子量 4000-10000h ＜10A+T/C+G*1.100-1.455A+G/C+T*0.800-1.160比旋度 +30°-+48°*基本摩尔比h＝增色参数生产这种寡聚脱氧核糖核苷酸的方法包括通过添加选自由乙醇、丙醇和异丙醇组成的一组物质中的一种烷基醇，在20℃下，沉淀0.8M多脱氧核糖核苷酸钠盐的醋酸钠水溶液。
美国专利5,223,609公开了一种去纤苷酸，若形成它的核苷酸部分与以下的无规序列的多脱氧核糖核苷酸分子式在化学计量上一致的话，则它满足某些药物和治疗性能，因此是特别合适的P1-5，(dAP)12-24，(dGp)10-20，(dTp)13-26，(dCp)10-20其中P＝磷基dAP＝脱氧腺苷酸单体(deoxyadenylic monomer)dGp＝脱氧鸟苷酸单体(deoxyguanylic monomer)dTp＝脱氧胸苷酸单体(deoxythymidylic monomer)dCp＝脱氧胞苷酸单体(deoxycytidylic monomer)相应于该分子式的去纤苷酸此外显示出下述物理化学性能电泳＝均匀阳极的迁移率；消光系数，在260±1nm处的E1cm1％＝220±10；消光比，E230/E260＝0.45±0.04；摩尔消光系数(指磷)，ε(P)＝7.750±500；旋光度[α]D20°＝53°±6；在天然DNA内以％表示的可逆增色性，h＝15±5。
优选的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸是去纤苷酸(CAS登记号83712-60-1)，熟练本领域的技术人员公知的一种多核苷酸，它通常被认为是通过从动物和/或植物组织中萃取获得的多脱氧核糖核苷酸(US3,770,720和US3,899,481)；这种多脱氧核糖核苷酸通常以碱金属盐，通常钠盐的形式使用，和通常具有约45-50kDa的分子量。去纤苷酸主要是因它的抗凝活性而被使用，例如用于治疗急性肾功能不足(US4,694,134)和治疗急性心肌缺血(US4,693,995)。美国专利US4,985,552和US5,223,609公开了一种生产去纤苷酸的方法，它能使获得的产品具有恒定和非常确定的物理化学特征，且还不具有任何非所需的副作用。
发明详述本发明涉及治疗患者的方法，所述患者正在接受免疫抑制剂的治疗，该方法包括给患者施用有效剂量的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤。采用免疫抑制剂的治疗优选在SCT期间发生。免疫抑制剂优选选自包括抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU))、甲氨蝶呤(MTX)、氟达拉滨、抗微管剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉烷类(taxanes)(如紫杉醇和多烯紫杉醇))、烷化剂(例如环磷酰胺、抗瘤氨酸美法仑、双氯乙亚硝脲(BCNU))、铂试剂(例如顺铂(也称为cDDP)、卡铂、奥沙利铂，JM-216，CI-973)、蒽环霉素(例如阿霉素、柔毛霉素)、包括丝裂霉素-C在内的抗生素，拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷、喜树碱)、环胞菌素、他克莫司、雷帕霉素(sirolimus)，和起到抑制免疫系统作用的其它细胞毒试剂。可在Gonzale等著的，Alergol.Immunol.Clin.15，161-181，2000中，找到在恶性肿瘤的治疗中常用的这种试剂的综述，在此通过参考将其引入。优选的免疫抑制剂是核苷(即来自从核苷酸中除去磷酸基团的糖苷)，顺便说一下，例如氟达拉滨，对于本发明目的来说，它是优选的免疫抑制剂。
可平行、同时或一起施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸与免疫抑制剂。优选的组合是去纤苷酸和氟达拉滨的同时给药。
优选施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤与给予患者免疫抑制剂平行、伴随、同时、之后或之前发生。
在本发明的一个优选实施方案中，在给予患者免疫抑制剂之后发生施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤。在进一步优选的实施方案中，施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸和给予患者免疫抑制剂的步骤之间的时间延迟为约1小时到约2周。施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸和给予患者免疫抑制剂的步骤之间的时间延迟优选为约2天到约7天。
在本发明另一优选实施方案中，在给予患者免疫抑制剂之前发生施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤。优选地，施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸和给予患者免疫抑制剂的步骤之间的时间差为约1小时到约2周。更优选，施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸和给予患者免疫抑制剂的步骤之间的时间差优选为约2小时到约2天。
优选的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸是去纤苷酸，然而，可使用以上提及的作为保护性寡聚核苷酸的其它物质。下述实施方案确定了去纤苷酸的优选剂量；然而，当使用不是去纤苷酸的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸时，可使用类似的剂量。至于任何保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的最佳剂量，将由参与的医生来确定。以下所述的实验示出了去纤苷酸的保护效果。在这样的实验中确定的有效剂量可用作确定治疗用有效剂量的指导。优选口服施用或静脉注射去纤苷酸。
选择去纤苷酸的优选剂量，以便达到约100μg/mL-0.1μg/mL的血液水平。更优选地，选择去纤苷酸的优选剂量，以便达到约10μg/mL-100μg/mL的血液水平。最优选地，选择去纤苷酸的优选剂量，以便达到约100μg/mL的血液水平。
在本发明的一个优选实施例中，所施用的去纤苷酸的剂量为约100mg/kg患者体重到约0.01mg/kg体重。优选地，所施用的去纤苷酸的剂量为约20mg/kg患者体重到约0.1mg/kg体重。更优选地，所施用的去纤苷酸的剂量为约15mg/kg患者体重到约1mg/kg体重。更优选地，施用每Kg患者体重约12mg到约14mg的每日剂量。最优选地，所施用的去纤苷酸的剂量为约12mg/kg患者体重。
优选地，根据本发明的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的施用能保护内皮细胞和上皮细胞避免免疫抑制剂的影响。免疫抑制剂优选激活内皮细胞和上皮细胞，并诱导其内的程序性细胞死亡。因此，在一个优选实施例中，保护性寡聚脱氧核糖核苷酸保护上皮和/或内皮细胞避免程序性细胞死亡和/或被免疫抑制剂激活。免疫抑制剂优选氟达拉滨。保护性寡聚脱氧核糖核苷酸优选去纤苷酸。
激活包括ICAM-1和MHC I类分子的加强表达。表达的加强优选为实质性的。进一步优选地，免疫抑制剂诱导患者的内皮细胞和/或上皮细胞的促炎激活。细胞优选为人类微血管内皮细胞(HMEC)和/或表皮和/或肺泡上皮细胞。对细胞的破坏优选发生在当患者的内皮细胞和/或上皮细胞已暴露在免疫抑制剂下约1小时至约1周或更多的时候。更优选地，当所述细胞已暴露约5小时至约72小时时，发生所述破坏。甚至更优选地，这种暴露的持续时间为20小时至72小时。最优选地，这种暴露的持续时间大于48小时。
用免疫抑制剂的治疗优选发生在造血干细胞移植期间。造血干细胞移植优选为同种异基因造血干细胞移植。
本发明还涉及包括至少一种保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的药物组合物，用于治疗需要它的患者，其中所述患者正在采用免疫抑制剂治疗。施用所述药物组合物减轻或避免由免疫抑制剂，或由免疫抑制剂和移植物所引起的副作用。移植物优选是骨髓或造血干细胞移植物。更优选地，移植物是同种异基因骨髓或造血干细胞移植物。
副作用优选涉及患者的内皮细胞和/或上皮细胞和/或组织。优选地，所述副作用涉及所述细胞的程序性细胞死亡，和/或所述细胞的激活。激活优选包括MHC I类分子和/或细胞间粘附分子1(ICAM-1)的加强表达。当以药物相关的浓度(范围10μg/mL至1μg/mL)使用时，副作用在培养48小时之后破坏人类的微血管内皮细胞(HMEC)，以及，优选表皮和肺泡上皮细胞系。
副作用通常包括与破坏移植的靶组织相关的并发症和被激发的同种异基因免疫应答。
副作用优选包括对在患者的内皮细胞和/或上皮细胞内，尤其在肺泡内皮细胞内的细胞间粘附分子1(ICAM-1)和MHC I类分子的显著正调节。副作用进一步包括微血管的内皮细胞的促炎激活。副作用进一步优选包括通过来自于移植物的同种异基因MHC I类的受限的细胞毒性T淋巴细胞所导致的这种细胞的加强裂解。
施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸优选防止免疫抑制剂诱导的副作用，其中包括程序性细胞死亡和同源激活。含本发明免疫抑制剂的药物组合物可采用常规和公知类型的技术、赋形剂和载体配制，供通过口服与注射这两种方式给药，尤其通过静脉线路给药。至于单位剂量，在本发明组合物内的活性成分的剂量范围介于50至1500mg，而为了达到所需结果，建议10到40mg/kg的每日给药量。可在US4,985,552和US5,223,609中找到制备去纤苷酸的方法，该专利在此通过参考将其全文引入。
本发明还涉及一种药物组合物，它含有有效治疗剂量的免疫抑制剂和有效治疗剂量的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸。免疫抑制剂优选氟达拉滨，保护性寡聚脱氧核糖核苷酸优选去纤苷酸。
附图的简要说明
图1氟达拉滨在人类微血管内皮细胞(HMEC)内诱发程序性细胞死亡。HMEC或者静置未处理，或者与浓度递减的2-氟-9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(下文称为F-Ara，氟达拉滨的代谢形式)一起培养48小时，并进行流式细胞分析(A)或微区DAPI染色分析。A碘化吡啶(PI)-负细胞的侧面散射(SSC)图像(x-轴)对正面散射图像(y-轴)的轮廓图作为细胞粒度对细胞尺寸的参数。BDAPI染色的内皮细胞的定量荧光显微分析。以凋亡的HMEC的百分数(凋亡细胞％)±标准偏差(n＝10的显微场之中，平均70个细胞/场)给出结果。示出了代表性的至少5个独立的实验。*未处理的对照组对F-Ara(10μg/mL)处理过的细胞的P＜0.001。
图2去纤苷酸(D)在HMEC内抑制F-Ara-诱发的程序性细胞死亡，胞内拮抗作用的证据。F-Ara10μg/mL，D100μg/mL。PI-负细胞的SSC-图像的流式细胞分析。A由F-Ara重复诱发的细胞凋亡。B由D造成的对F-Ara诱发的细胞凋亡的剂量相关的抑制作用。C左图HMEC与F-Ara一起培育1小时，随后在洗涤之后与D一起培育48小时。右图HMEC与D一起培育1小时，随后在洗涤之后与F-Ara一起培育48小时。关于实验细节，参见图1的图注和材料与方法部分。示出了三个独立的实验之中的一个代表。
图3F-Ara在角质形成细胞和肺泡上皮细胞内诱发细胞凋亡，但在内脏或支气管上皮细胞内没有诱发细胞凋亡去纤苷酸的保护效果。F-Ara10μg/mL，D100μg/mL。PI-负细胞的SSC-图像的流式细胞分析(图3A)和凋亡细胞的DAPI-染色分析(图3B)。以出自三个不同实验的平均凋亡细胞百分数(％)±标准偏差给出结果。HaCaT人类角质形成细胞系。SW 480内脏上皮细胞系。A 549来自肺泡上皮的肺癌细胞系。BEAS-2B支气管上皮细胞系。主支气管上皮细胞来自于支气管镜刷步骤。图3A*F-Ara对F-Ara+D处理过的HaCaT细胞的p＝0.005；**F-Ara对F-Ara+D处理过的A 549细胞的p＝0.116； 没有诱发细胞凋亡。图3B+F-Ara对F-Ara+D处理过的HaCaT细胞的p＝0.026；++F-Ara对F-Ara+D处理过的A 549细胞的p＝0.001。关于实验细节，参见图1的图注和材料与方法部分。对于每一细胞系概述了三个独立的实验。
图4去纤苷酸(D)没有干扰F-Ara的抗白细胞和抗PBMC效果。F-Ara10μg/mL，D100μg/mL。A在胚细胞危象中，来自于患者的初级急性骨髓白细胞(AML)的碘化吡啶染色(全部PBMC数量的70％的胚细胞)。以三个独立的实验的平均活力百分数(％)给出结果。*对照组对F-Ara处理过的AML细胞的p＝0.008。BPI-负PBMC的SSC-图像的流式细胞分析。示出了具有不同血液供体的5个独立的实验之中的一个代表。
图5F-Ara诱发在HMEC上的ICAM-1表达，去纤苷酸(D)的保护效果。ICAM-1正细胞的流式细胞分析。在存在或者不存在浓度递减的D的情况下，HMEC或者静置未处理，或者与F-Ara(10μg/mL，或在B中以递减浓度)一起培养。A来自代表性实验的ICAM-1表达的直方图。虚线背景染色(零对照)；细线未处理的对照细胞的ICAM-1表达粗线F-Ara处理过的细胞的ICAM-1表达。B由F-Ara诱导的剂量相关的ICAM-1表达。概述了三个独立的实验。以ICAM-1正细胞的平均百分数(％)±标准偏差的形式给出结果。*F-Ara对未处理的对照细胞的p＝0.075。C由去纤苷酸(D)造成的对F-Ara诱导的剂量相关的ICAM-1表达的抑制。以ICAM-1正细胞的平均百分数(％)±标准偏差的形式给出结果。**F-Ara对F-Ara+D处理过的HMEC的p＝0.004。
图6F-Ara增加HMEC对CD8-正细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的同种异基因性，去纤苷酸的保护效果。A在白介素2(50U/mL)存在下，用辐照过的HMEC刺激PBMC 7天，并采用未处理(对照组)和F-Ara(10μg/mL)处理过的HMEC(24小时培育)作为靶细胞进行51Cr释放分析。自身的B-LCL自身(效应子)EBV-转化的B-成淋巴细胞。K562天然杀伤细胞(NK)用靶细胞。以材料与方法部分中所述的比裂解百分数(％)形式给出结果。*-在抗MHC I类抗体w6/32存在下，F-Ara处理过的HMEC的比裂解％。E/T比效应子/靶之比。B由去纤苷酸(D)造成的，HMEC对CD8-正CTL的F-Ara诱导的同种异基因性的向下调节。已经通过磁珠分离，负选择(非CD8+-细胞-耗尽)CD8-正PBMC。关于实验细节参见图6A的图注。
图7F-Ara降低HMEC对NK细胞的同种异基因性，通过阻断MHC I类提高裂解。已经通过磁珠分离，负选择(非NK-细胞-耗尽)NK细胞，并在IL-2(50U/mL)存在下，采用辐照过的HMEC刺激4天，随后如图6所述进行51Cr释放分析。图下方的表用HMEC刺激之前和之后，效应子细胞群的流式细胞分析。NK细胞表征为CD3-/CD16+CD56+.*-在20∶1的E/T比下，K 562细胞的比裂解百分数(％)。
表1抗内皮CTL引起Tc1状显形
用于在刺激效应子细胞的上清液中生产γ-干扰素(IFN-γ)和白介素4(IL-4)(7天，辐照过的HMEC，50U/mL，IL-2)的酶联免疫吸附测定(ELISA)。如图6中的实验所给出的那样，PBMC或者静置未分离，或者对CD8+T细胞负选择。以3个独立实验的平均pg/mL细胞因子±标准偏差形式给出结果。
举例方法细胞培育和试剂人类表皮微血管内皮细胞系CDC/EU.-HMEC-1(进一步称为HMEC)由疾病控制和预防中心(美国乔治亚州亚特兰大)友好地提供，并以如前所述的形式确立19。HMEC在MCDB 131介质中培育，并补充加入15％的胎牛血清(FCS)，1μg/mL的氢化可的松(德国，Deisenhofen，Sigma)，10ng/mL的表皮生长因子(美国，MA，贝德福德，协作生物化学产品)和抗生素。除非另有说明，所有细胞培育试剂通过Gibco BRL(德国，卡尔斯鲁厄)购买。2-氟腺嘌呤-9-β-D-阿拉伯呋喃糖(F-Ara)获自德国，Deisenhofen，Sigma。去纤苷酸小瓶获自意大利，Como，Crinos，ProciclideTM。
程序性细胞死亡分析一种在人类内皮细胞内进行细胞凋亡检测的公知方法是采用如前所述20的流式细胞法(德国，海德尔堡，Becton Dickinson的FACScanTM和CellQuestTM软件)。内皮细胞和上皮细胞或者静置未处理，或者以递减的浓度(范围10μg/mL-0.1μg/mL)，在存在或不存在去纤苷酸下与F-Ara一起培育48小时。之后，在PBS/10％FCS中洗涤细胞，并用坏死检测染料碘化吡啶(PI，0.2μg/mL，德国，Deisenhofen，Sigma)染色。通过PI-负染色和通过不同于非凋亡细胞的特征侧散射图像来鉴定凋亡细胞。每类细胞进行至少三次实验。
检测细胞凋亡的一种替代方法是使用DNA荧光标记的细胞的显微分析。在35mm培养皿(德国，Wiesbaden，Nunc)中接种1×105/板内皮细胞。按照以上所给出的方法处理这些细胞，和随后用甲醇/丙酮(1∶1)固定2分钟，在PBS内洗涤1次，并用溶解在20％甘油/PBS内的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(0.5μg/mL，德国，Deisenhofen，Sigma)染色。放置样品并进行显微分析。在不存在锥虫蓝吸收的情况下，通过DAPI染色揭示的核缩合被认为是与坏死病毒相反的细胞凋亡的特征21。定量分析包括计算相对于所有可鉴定的细胞，来自至少10个显微场的细胞凋亡的数量，其中平均70个细胞/场。
为了图表的清楚起见，仅对具有内皮细胞和HaCaT以及A 549细胞的实验显示DAPI染色结果。
细胞表面分析通过间接的免疫荧光技术，和随后使用FACScanTM流式细胞计数器和CellQuestTM分析程序(德国，Heidelberg，Becton Dickinson)的流式细胞法，评估在HMEC上的ICAM-1(德国，Heidelberg，Becton Dickinson/ Pharmingen)和MHC I类(美国，VA，Manassas，ATCC，杂交瘤的上清液，w6/32)分子的细胞表面表达。按照所给出的方法处理内皮细胞和在培育之后用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)收获，在冷的PBS/10％FCS中洗涤1次，和连同5μg/mL的抗粘附分子MoAbs在冰上培育1小时。再次洗涤细胞，并与山羊抗鼠IgG-FITC共轭抗体F(ab)2片段(德国，Hamburg，Dako)一起在冰上培育45分钟。然后在PBS/10％FCS中洗涤，和随后进行分析。通过平行的碘化吡啶(0.2μg/ml，德国，Deisenhofen，Sigma)染色确定细胞的活力。省去作为负对照来检测非特异的荧光的第一抗体。与使用同种型的对照抗体不同，该方法通过内皮细胞缺少Fc受体的前述观察结果而被证明是合理的22。因此，可排除通过其Fc部分的抗体的非特异结合。
用HMEC异体刺激外周血液细胞根据使用Ficoll-hypaque(德国，Freiburg，Pharmacia)密度梯度离心的标准实验程序，外周血液单核细胞(PBMC)来自于健康人类志愿者的肝素化(德国，Mainz，Novo Nordisk)血液，或来自巴伐利亚红十字(Bavarian Red Cross)的血沉棕黄色层。然后，在白介素2(50U/mL)和10％人类AB血清(德国，Deisenhofen，Sigma)的存在下，细胞和辐照(20Gy)过的HMEC以1∶1和2∶1的比例，刺激细胞7天。或者，根据制造商的说明书，使用细胞分离试剂盒(德国，Bergisch-Gladbach，Miltenyi Biotech，MACSTM)，分别基于非CD8+和非NK细胞的缺失，对CD8+T细胞和天然杀伤细胞(NK)选择PBMC。对所选择的细胞的刺激与对整个PBMC培养物的刺激相同，所不同的是，对于NK细胞，仅刺激3天。
细胞毒性测定根据公知的实验程序23，使用4小时的51Cr放射性同位素分析，评估T细胞或NK细胞介导的细胞毒性。或者静置未处理，或者过夜的用F-Ara(10μg/mL)培育的HMEC用作靶细胞，所述靶细胞将用0.4mCi Na251CrO4标记2小时。在3个洗涤步骤之后，调节细胞到104个细胞/mL，并以递减的效应子对靶细胞之比，用PBMC、CD8+或NK效应子细胞共培育另外4小时。将上清液转移到干燥闪烁板上，并在γ-计数器内计数(所有均来自德国，Darmstadt，CanberraPackard)。取自身(效应子)B-成淋巴细胞系(B-LCL)和作为NK敏感细胞的K562作为额外的对照靶。比裂解的百分数计算为[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100。在所有实验中的自发释放总是低于20％。
酶联免疫吸附测定(ELISA)根据制造商的试剂盒的说明书(美国，MN，Minneapolis，R&D Systems)，准确地进行ELISA，以检测在同种异型效应子T细胞的上清液内的白介素4(IL-4，Tc2应答)和干扰素γ(IFN-γ，Tc1应答)、IL-1和IL-10。
统计分析藉助研究者的t试验来评估在实验值之间的差别显著性。
例1F-Ara在人类微血管内皮细胞(HMEC)内诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)为了评估F-Ara对培育的人类内皮细胞活力的影响，用递减的药学相关浓度(10μg/mL至0.1μg/mL)的2-氟腺嘌呤-9-β-D-阿拉伯呋喃糖作为氟达拉滨的代谢形式，培育HMEC。靶细胞内活性(细胞毒性)氟达拉滨三磷酸盐的中值胞内水平为20μM，这代表5.8μg/mL的浓度(medac SCHERING，制造商的说明书)。在培育48小时之后，分别使用碘化吡啶负细胞的细胞粒度(在流式细胞法内的侧散射(SSC)图像)和DAPI-染色细胞的显微分析的检测结果，对HMEC进行细胞凋亡分析。与分析系统无关，图1A和B清楚地证明了在HMEC内，10至5μg/mL浓度下的F-Ara引起细胞凋亡，而1μg/mL不再有效。F-Ara的细胞毒性的临界阈值为2至3μg/mL之间。因F-Ara导致的细胞凋亡在24小时后已经是可检测的，但在较低的程度下(数据未示出)。
例2去纤苷酸保护HMEC避免F-Ara诱导的细胞凋亡在存在或者不存在可变浓度(100μg/mL至0.1μg/mL)的去纤苷酸的情况下，HMEC或者静置未处理，或者用F-Ara处理，并使用图1A所述的SSC图像的流式细胞分析法，在48小时后评估程序性细胞死亡。图2A(中间的轮廓曲线图)示出了去纤苷酸单独作为第二对照组不影响内皮细胞的活力。在图2A(右边的轮廓曲线图)中重现了F-Ara的细胞凋亡效果，而图2B示出了去纤苷酸对F-Ara诱导的细胞死亡的依赖于剂量的保护作用。为了排除在体外F-Ara和去纤苷酸的非特异人工胞外相互作用，用去纤苷酸预处理HMEC 1小时，和随后，在3次洗涤步骤之后，用F-Ara培育另外48小时，和反之亦然。图2C(右边的轮廓曲线图)证明对HMEC预处理1小时足以保护细胞避免F-Ara诱导的细胞凋亡。类似地，用F-Ara预处理HMEC 1小时(图2C，左边的轮廓曲线图)和随后用去纤苷酸培育并没有导致内皮细胞的程序性细胞死亡。
例3F-Ara对不同上皮细胞系的影响，去纤苷酸的保护效果皮肤、胃肠道(GIT)和最可能的肺，是GvHD的主要靶。因此，测试F-Ara对来自于这些器官的细胞系的影响是合理的。如图1和2所给出的用F-Ara(10μg/mL)培育来自角质形成细胞(HaCaT)、GIT(SW 480)、肺泡(A549)和支气管上皮(BEAS-2B)细胞系的细胞以及主支气管上皮细胞，并在治疗后48小时后的流式细胞法细胞凋亡分析中测定。图3A概述了内脏和支气管上皮细胞看起来对F-Ara的细胞凋亡刺激有耐受力，而角质形成细胞(HaCaT)和肺泡上皮细胞(A549)显示出细胞凋亡的信号，如SSC图像的流式细胞法所测定(分别地，对于HaCaT为34.0[±1.0]％的凋亡细胞百分数，和对于A549为42.9[±26.7]％)。另外，评估去纤苷酸(100μg/mL)的保护潜力。在用F-Ara和去纤苷酸处理之后，图3A(插入的柱状图表)，HaCaT(4.3[±3.0]％)和A549(5.4[±2.9]％)的细胞完全受到保护而避免程序性细胞死亡。为了证实这些结果，对于HaCaT(图3B，左栏)和A549细胞(图3B，右栏)，进行DAPI-染色的细胞凋亡分析。对于内皮细胞，可见，在任一细胞系内，单独的去纤苷酸不影响凋亡细胞的数量(数据未示出)。
例4去纤苷酸不干扰F-Ara的抗白细胞和抗PBMC效果对于抗F-Ara诱导的细胞凋亡的内皮细胞和上皮细胞，仅次于其所需的保护能力，重要的是研究去纤苷酸是否也干扰F-Ara的抗白细胞性能。为了解决该问题，解冻胚细胞量为70％的初级外周血液衍生的急性髓样白细胞(AML)，保温培育24小时，随后在存在或不存在去纤苷酸情况下，用F-Ara处理另外48小时。图4A证明了几乎50％的细胞因坏死性细胞死亡而自发死亡。然而，F-Ara诱导最多80％细胞的细胞死亡。与它对内皮细胞和上皮细胞的影响相反，去纤苷酸不能保护AML细胞避免F-Ara介导的毒性。值得注意的是，图4A描述了细胞的活力百分数(％)，不是凋亡细胞百分数(％)，这是因为F-Ara在AML细胞内直接引起坏死，而不是细胞凋亡的事实所致。这可在最早培育24小时之后观察到。另外，图4A清楚地示出了去纤苷酸没有干扰F-Ara对白细胞的所需毒性。我们接下来要问，去纤苷酸是否可能调节F-Ara对正常造血细胞的影响，并采用来自正常人血供体的PBMC进行细胞凋亡分析(SSC-图像)。根据图4B所描述的代表性实验可获悉，F-Ara在40.1％的细胞内诱导细胞凋亡，与之相比，在未处理的对照组中，诱导5.1％的细胞凋亡。另外，去纤苷酸没有干扰F-Ara对PBMC的细胞凋亡活性(43.1％的凋亡细胞)，这表明F-Ara的免疫抑制性能没有因使用去纤苷酸共同进行治疗而被破坏。
例5F-Ara正调节具有去纤苷酸的拮抗作用的在HMEC上的细胞间粘附分子1(ICAM-1)
基于前述观察结果，即通过粘附分子的诱导，预移植不仅破坏，而且导致内皮细胞的促炎激活15，我们接下来研究在F-Ara的影响下ICAM-1的表达。如图5A和B所示，流式细胞分析证明，在24小时培育之后，F-Ara以剂量相关的方式显著提高在HMEC上的表达，所述剂量相关的方式与在细胞凋亡诱导中所观察到的剂量相关方式相类似。减到1μg/mL的F-Ara的浓度在诱导ICAM-1方面是有效的。我们接下来要问，在该实验环境下，去纤苷酸是否也充当F-Ara的拮抗剂。如所给出的用F-Ara处理HMEC，并在不存在或存在递减浓度的去纤苷酸的情况下培育HMEC。图5C概述了独立的实验，该实验表明，在100μg/mL和10μg/mL的浓度下，去纤苷酸实际上拮抗F-Ara诱导的ICAM-1表达。值得注意的是，单独的去纤苷酸不激活内皮细胞，在所测试的每一浓度下，ICAM-1表达维持不变(数据未示出)。
由于靶细胞的促炎激活常常与主要组织相容性抗原(MHC)I和II类的增加表达有关，在各种浓度下，用F-Ara培育24小时之后，我们进行了这些抗原的进一步的流式细胞分析。尽管F-Ara具有公众所熟知的免疫抑制性能，但令人惊奇地，F-Ara在HMEC上以剂量相关的方式诱导MHC I类分子(在10μg/mL下为平均荧光强度的1.5倍诱导，在5μg/mL下为1.3倍诱导)，而MHC II类分子维持不变(数据未示出)。
例6通过去纤酸的保护，F-Ara增加内皮细胞对同种异基因外周血液细胞的抗原性MHC I类分子通过F-Ara在HMEC上的诱导促使我们检验F-Ara是否还提高HMEC刺激异源细胞毒应答。作为效应子的外周血液单核细胞(PBMC)或者来自于健康人类志愿者的肝素化血液或者来自于血沉棕黄色层，在50U/mL白介素2(IL-2)存在下，用辐照(20Gy)过的HMEC刺激7天，和随后进行标准的51Cr释放测定(关于细节，参见材料与方法部分)。在第1天，作为靶的新鲜HMEC或者静置未被刺激，或者在存在或不存在抗MHC I类中和抗体(w6/32)情况下，用F-Ara(10μg/mL)培育。转换成作为经典的天然杀伤细胞(NK)靶的B-成淋巴细胞系(B-LCL)和K562细胞的自身效应子爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒起到对照组的作用。图6A证明了在所测试的所有E/T比下，F-Ara确实增加HMEC对异基因PBMC的抗原性。K562和自身效应子B-LCL缺少比裂解证实了牵涉MHC的受限细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。另外，在用抗MHC I类抗体w6/32共培育这些细胞之后，未处理或F-Ara处理过的HMEC任何一种的裂解可几乎完全被阻断(图6A，*-)。为了进一步证实CD8+CTL决定抗内皮细胞的细胞毒活性，使用具有MACSTM珠试剂盒的磁珠分离，对于CD8+和CD4+细胞，选择PBMC(分别是非CD8+和非CD4耗尽的PBMC)。在所有情况下，制剂的纯度≥93％，且完全不存在其它细胞群(未示出)。完全如对未选择的PBMC中所述(参见上面)，用HMEC和IL-2刺激分离的T细胞，如图6B所示，通过CD8+CTL，F-Ara处理过的HMEC的裂解再次显著高于对照的HMEC。此外，用F-Ara和去纤苷酸(F-Ara+D)预处理HMEC靶向下调节比裂解甚至低于对照水平，这表明去纤苷酸也保护内皮细胞对抗异基因效应子淋巴细胞的裂解。在该实验环境中。HMEC刺激过的CD4+T细胞没有显示出细胞毒活性的任何信号(数据未示出)。F-Ara对F-Ara+D处理过的HMEC的流式细胞分析得出去纤苷酸对MHC I类分子的显著向下调节，这表明在调节由F-Ara诱导的细胞毒应答方面，MHC I类表达是临界元素(数据未示出)。
例7抗内皮CTL显示出Tc1状显型为了获得关于抗内皮CTL本质的信息，按照以上给出的方法，刺激PBMC和CDB+T细胞，和收集上清液，供使用ELISA分析以评估γ-干扰素(IFN-γ)和白介素4(IL-4)。如表1所示，用HMEC和IL-2刺激明显导致Tc1状T细胞的外生长，这可从IFN-γ的独特表达，而没有产生IL-4中获悉。
例8通过异基因NK细胞，F-Ara向下调节HMEC的裂解另一令人感兴趣的问题是，F-Ara诱导调节MHC I类表达将如何影响天然杀伤性能(NK)对内皮细胞的细胞毒应答。对于NK细胞(非NK细胞耗尽的)，负选择来自健康个体的PBMC，并在IL-2存在下，用辐照过的HMEC刺激4天，这与图6B中的实验所述的一样。在第4天，作为靶细胞的HMEC或者静置未处理，或者用F-Ara(10μg/mL)培育24小时，并采用刺激过的NK细胞作为效应子，进行标准51Cr释放分析。图7证明了F-Ara显著向下调节HMEC对NK细胞的抗原性。作为对NK细胞活性的正对照，可观察到MHC I类负K562细胞的裂解(图7，*-)。用抗MHC I类抗体w6/32预处理F-Ara刺激过的HMEC完全消除了F-Ara的影响，和导致HMEC几乎100％的比裂解(图7)，这再次表明在HMEC表面上的MHC I类是调节NK细胞的细胞毒应答的临界转变点。已发现杀伤细胞抑制剂受体(KIR)的作用是通过MHC I类分子的高表达来进行负调节24，这种作用可能决定了NK细胞的降低的细胞毒应答。
讨论迄今为止获得的采用含氟达拉滨的降低强度的处理(RIC)方案的临床结果表明，与处理相关的毒性的明显向下调节，且没有影响免疫重建25。接受RIC的患者中，急性GvHD的发病率与接受经典调节方案的那些患者相当或甚至要小26。然而，出现关于同样严重或甚至加剧的后期效果如骨坏死27、肺部并发症28和更多慢性GvHD病例29的报道。尽管在我们的研究中，充分地论证了氟达拉滨的免疫抑制性能，但结果是激活和破坏内皮细胞和上皮细胞。这一观察结果至少部分地解释了以上所述的非所需的临床副作用，这是因为骨坏死是内皮细胞功能障碍的表达，和氟达拉滨对肺泡上皮细胞具有毒性。令人感兴趣地注意到，氟达拉滨对肺细胞的有害效果看起来是区室特异的，因为支气管细胞没有响应免疫抑制剂而经历细胞凋亡。角质形成细胞系(HaCaT)也对氟达拉滨敏感这一事实说明了它可能也牵涉在SCT之后的皮肤疾病。由于后期并发症的病理是多因素且也可能受到SCT患者年龄增加和使用外周干细胞的影响，因此在肺和皮肤并发症的临床分析中需要进一步的评价。
由于在许多预移植实验方案中，使用氟达拉滨与电离辐射的组合，因此重要的是，测试这两种化合物在影响内皮细胞方面是否协作。令人感兴趣的是，我们未能发现由氟达拉滨诱导的辐射的任何提高或反之亦然(数据未示出)。这表明，细胞凋亡的信号如何转移到内皮细胞上的机理不同。
氟达拉滨在内皮细胞和上皮细胞内如何诱导细胞凋亡仍待解释。可能是，作为嘌呤同系物的氟达拉滨整合到DNA内并因此引起导致如前所报道的基因缺失的突变30。也已据推测，在触发细胞凋亡的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)路径31上，氟达拉滨可与细胞色素c和细胞凋亡蛋白质激活因子-1(APAF-1)协作。
对于CD8+T细胞，氟达拉滨增加内皮细胞靶的异基因性。相反，氟达拉滨通过异基因的NK细胞显著向下调节内皮细胞裂解。MHC I类表达看起来对于调节任何这些免疫应答是关键的，这是因为I类的阻断充分消除CTL裂解，和通过NK细胞极大地正调节裂解。氟达拉滨的这些相反效果，连同氟达拉滨显示出较少的急性和等于或甚至大于经典调节方案的慢性毒性的临床观察结果，提出了NK细胞和CTL在GvHD病理生理的不同期可能活性不同的推测，即NK细胞将主要在早期起作用(被氟达拉滨抑制)，和CTL在后移植的后期起作用(被氟达拉滨加强)。关于抗内皮CTL的本质，令人感兴趣的问题是，这些CTL是否是内皮特异或简单地异源特异的。以前描述过内皮特异的效应子淋巴细胞的存在32。与我们表征为显示Tc1状表型的CTL相反，所报道的许多CTL克隆几乎不显示出，如果有的话，IFN-γ和在可能提高细胞毒活性的其余处非凡表达CD40配体33。但这些数据不排除对非造血靶具有特异性的额外的异基因CTL的存在。
去纤苷酸是成功地用于治疗作为SCT之后主要肝病并发症的静脉闭塞疾病的非常耐受的药物34。另外，存在增加数量的预临床和临床报道，显示出它在治疗局部缺血/再灌注损(reperfusion)伤和粥样硬化以及反复凝血的血小板减少性紫癫35-37中的效果。已知去纤苷酸在没有进一步要求代谢的情况下，直接在内皮细胞上起作用38，和因此可在我们的体外研究中使用。去纤苷酸充分保护内皮细胞和上皮细胞避免氟达拉滨介导的细胞凋亡。需要额外的实验评估去纤苷酸拮抗氟达拉滨所藉助的准确机理，但人们可想象去纤苷酸在氟达拉滨的DNA整合或前述caspase激活的抑制中的作用。除了它的抗细胞凋亡效果以外，去纤苷酸还能通过调节MHC I类的表达来降调节抗内皮TCL应答。相反，去纤苷酸不影响氟达拉滨所需的抗白细胞效果，这通过缺少AML细胞的保护来证明。另一重要的观察结果是，去纤苷酸不可能阻断氟达拉滨介导的PBMC的细胞凋亡。这表明为了进行处理，氟达拉滨所强制的免疫抑制剂效果没有受到用去纤苷酸共处理的影响。
值得注意的是，去纤苷酸不是辐射诱导的内皮细胞破坏的保护剂，这表明它对氟达拉滨介导的细胞变化具有特异性(数据未示出)。
基于这些结果和关于它的很小的副作用，如果有的话39，我们根据我们的研究得出结论，特别地在冒V0D风险的患者中，去纤苷酸是在SCT之前，在处理过程中与氟达拉滨结合使用的良好选择物。内皮细胞保护对抗进一步的处理剂的分析研究应当有助于弄明白去纤苷酸是否可用作宽范围的保护剂。
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权利要求
1.保护性寡聚脱氧核糖核苷酸在制造药物中的用途，所述药物用于治疗正在接受免疫抑制剂治疗的患者。
2.保护性寡聚脱氧核糖核苷酸在制造药物中的用途，所述药物用于保护上皮细胞和/或内皮细胞避免免疫抑制剂的影响。
3.保护性寡聚脱氧核糖核苷酸在制造药物中的用途，所述药物用于保护上皮细胞和/或内皮细胞避免因施用免疫抑制剂诱导的细胞凋亡和/或激活。
4.如权利要求1-3中任何一项所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制剂是一种核苷。
5.如权利要求1-3中任何一项所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制剂选自包括氟达拉滨、环磷酰胺、BCNU、美法仑的物质组。
6.如权利要求1-3中任何一项所述的用途，其特征在于，所述免疫抑制剂是氟达拉滨。
7.如权利要求1-3中任何一项所述的用途，其特征在于，所述保护性寡聚脱氧核糖核苷酸是去纤苷酸。
8.如权利要求1-7中任何一项所述的用途，其特征在于，在给患者施用免疫抑制剂的伴随过程中、同时、之后或之前，发生施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，在给患者施用免疫抑制剂之后，发生施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，在施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤和给患者施用免疫抑制剂的步骤之间的时间延迟为约1小时至约2周，优选约2天至约7天。
11.如权利要求8所述的用途，其特征在于，在给患者施用免疫抑制剂之前，发生施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，在施用保护性寡聚脱氧核糖核苷酸的步骤和给患者施用免疫抑制剂的步骤之间的时间差为约1小时至约2周，优选约2小时至约2天。
13.如权利要求1-12中任何一项所述的用途，其特征在于，选择所施用的去纤苷酸的剂量，以便达到约100μg/mL至约0.1μg/mL的血液水平，优选约10μg/mL至约100μg/mL。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，选择所施用的去纤苷酸的剂量，以便达到约10μg/mL的血液水平。
15.如权利要求1-14中任何一项所述的用途，其特征在于，所施用的去纤苷酸的剂量为约100mg/kg患者体重至约0.01mg/kg体重，优选约20mg/kg患者体重至约0.1mg/kg体重。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所施用的去纤苷酸的剂量为约15mg/kg患者体重至约1mg/kg体重，优选约12mg/kg患者体重。
17.如前述任何一项权利要求所述的用途，其特征在于，所述激活包括ICAM-1的加强表达。
18.如前述任何一项权利要求所述的用途，其特征在于，使用免疫抑制剂治疗发生在干细胞移植期间。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述干细胞移植是同种异基因干细胞移植。
20.一种药物组合物，包含有效治疗剂量的免疫抑制剂和有效治疗剂量的保护性寡聚脱氧核糖核苷酸。
21.如权利要求20所述的药物组合物，它由两种不同的可独立地施用的配方构成，一种含有免疫抑制剂和另一种含有保护性寡聚脱氧核糖核苷酸。
22.如权利要求20所述的药物组合物，作为用于同时、单独或相继应用的组合制剂。
23.如权利要求20-22中任何一项所述的药物组合物，其特征在于，所述免疫抑制剂是一种核苷。
24.如权利要求20-22中任何一项所述的药物组合物，其特征在于，免疫抑制剂选自包括氟达拉滨、环磷酰胺、BCNU、美法仑的物质组。
25.如权利要求20-22中任何一项所述的药物组合物，其特征在于，免疫抑制剂是氟达拉滨。
26.如权利要求20-22中任何一项所述的药物组合物，其特征在于，保护性寡聚脱氧核糖核苷酸是去纤苷酸。
27.如前述任何一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，进一步含有常规的赋形剂和/或助剂。
28.如前述任何一项权利要求所述的药物组合物，其特征在于，它可静脉注射。
全文摘要
本发明涉及保护性寡聚脱氧核糖核苷酸用于治疗患者的用途，所述患者正在接受免疫抑制剂的治疗。本发明进一步涉及一种药物组合物，它含有有效治疗剂量的免疫抑制剂和有效治疗剂量的保护的寡聚脱氧核糖核苷酸。
文档编号A61K31/664GK1655801SQ03812501
公开日2005年8月17日 申请日期2003年6月2日 优先权日2002年5月31日
发明者甘特·艾斯内, 恩斯特·霍勒 申请人:雷根斯堡大学医学院