改性释放的药物制剂的制作方法

专利名称：改性释放的药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的改性释放药物制剂，所述制剂提供特定药物的改性递送，还涉及这类制剂的制造和这类制剂在血栓形成治疗或预防中的用途。
经常有必要在一天内频繁给以药学活性化合物，目的是维持活性成分在血浆、机体组织和/或胃肠道中的所需治疗水平。特别是在打算口服递送药物和长时间提供始终如一的响应时更是如此。
近三十年来，改性释放剂型已经日益成为向患者递送某些药物的优选方法，特别是经由口服途径。这类剂型例如可以提供长时间的药物释放，从而减少所需每日给药的次数，在此期间释放的速率可以在胃肠道的特定部位内基本上是始终如一的和/或恒定的，或者是脉动的。
本领域已知有大量改性释放剂型，它们尤其已经被总结在下列文献中De Haan and Lerk in Pharmaceutisch Weekblad ScientificEdition，6，57(1984)；Bankerin″Medical Applications of ControlledRelease″，Vol II，eds.Langer and Wise(1984)Bocaraton，Florida，atpages 1 to 34；Graffner in Industrial Aspects of Pharmaceuticals，ed.Sandel，Swedish Pharmaceutical Press(1993)at pages 93 to 104；和Proudfoot″Dosage RegimensTheir Influence on the Concentration-Time Profile of the Drug in the Body″at pages 191 to 211 of″Pharrnaceutics.The Science of Dosage Form Design″，ed.M.E.Aulton(1988)(Churchill Livingstone)。
国际专利申请No.PCT/SE01/02657(WO 02/44145，最早的优先权日为2000年12月1日，于2001年11月30日提交，于2002年6月6日公布)公开了大量化合物，它们是、或者被代谢为这样的化合物，它们是胰蛋白酶样蛋白酶、例如凝血酶的竞争性抑制剂。其中具体公开了下列三种化合物(a)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)
该化合物以下被称为化合物A；(b)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe) 该化合物以下被称为化合物B；(c)Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe) 该化合物以下被称为化合物C。
甲氧基脒化合物A、B和C在对哺乳动物口服和/或肠胃外给药后被代谢生成对应的游离脒化合物，已经发现后者化合物是有力的凝血酶抑制剂。因而·化合物A经由前体药物中间体Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OH)(该化合物以下被称为化合物G)被代谢为Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(该化合物以下被称为化合物D)；·化合物B经由前体药物中间体Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OH)(该化合物以下被称为化合物H)被代谢为Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(该化合物以下被称为化合物E)；·化合物C经由前体药物中间体Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OH)(该化合物以下被称为化合物J)被代谢为Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(该化合物以下被称为化合物F)。
化合物A、B、C、D、E、F、G和J的合成方法(分别)被描述在国际专利申请No.PCT/SE01/02657的实施例12、40、22、3、39、21、2和31中。这些化合物或它们代谢产物的改性释放制剂尚未见诸文献报道。
我们已经发现，化合物A和C能够被配制在某些改性释放的ι-角叉菜胶制剂中，还已经发现，式(I)化合物和它们的盐能够被配制在其他改性释放的药物制剂中，这些制剂是容易给药的，例如借助口服给药。
按照本发明的第一方面，提供了改性释放的药物制剂，包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分 其中R1代表被一个或多个氟代取代基取代的C1-2烷基；R2代表氢、羟基、甲氧基或乙氧基；n代表0、1或2；和药学上可接受的稀释剂或载体，其条件是当式(I)化合物是盐的形式时，该制剂可以仅含有ι-角叉菜胶和中性胶凝聚合物；这些制剂以下被称为“本发明的制剂”。
式(I)化合物或其药学上可接受的盐可以是溶剂化物、水合物、混合型溶剂化物/水合物的形式，或者优选为无溶剂化物的形式，例如无水化物。溶剂可以是一种或多种有机溶剂，例如低级(例如C1-4)烷基醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇)、酮(例如丙酮)、酯(例如乙酸乙酯)或其混合物。
在本发明的一个特定方面，R1是CHF2或CH2CH2F。
变量n优选地是0或2。
更优选的式(I)化合物包括其中n代表0的那些或其中n代表2的那些，于是提供两个位于2-和6-位的氟原子(也就是两个邻-位，相对于苯环与-NH-CH2-基团的连接点而言)。
式(I)化合物尤其是化合物A、化合物B或化合物C。
中性胶凝聚合物是单一的或者一种以上中性可侵蚀聚合物的混合物，它(们)具有胶凝性质，并且具有基本上依赖于pH的溶解度。
式(I)化合物的优选的盐是酸加成盐。酸加成盐包括无机酸加成盐，例如硫酸、硝酸、磷酸和氢卤酸的盐，氢卤酸例如氢溴酸和盐酸。更优选的酸加成盐包括有机酸的盐，例如二甲基磷酸、糖精酸、环己氨基磺酸的盐；羧酸的盐，羧酸例如马来酸、富马酸、天冬氨酸、琥珀酸、丙二酸、乙酸、苯甲酸、对苯二甲酸、马尿酸、1-羟基-2-萘甲酸、扑酸、羟基苯甲酸等；羟基酸的盐，羟基酸例如水杨酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸(包括L-(-)-苹果酸和D，L-苹果酸)、葡糖酸(包括D-葡糖酸)、乙醇酸、抗坏血酸、乳酸等；氨基酸的盐，氨基酸例如谷氨酸(包括D-谷氨酸、L-谷氨酸和D，L-谷氨酸)、精氨酸(包括L-精氨酸)、赖氨酸(包括L-赖氨酸和盐酸L-赖氨酸)、甘氨酸等；特别是磺酸的盐，磺酸例如1，2-乙烷二磺酸、樟脑磺酸(包括1S-(+)-10-樟脑磺酸和(+/-)-樟脑磺酸)、乙烷磺酸、丙烷磺酸(包括正丙烷磺酸)、丁烷磺酸、戊烷磺酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、对-二甲苯磺酸、2-磺酸、萘磺酸(包括1，5-萘磺酸和萘磺酸)、苯磺酸、羟基苯磺酸、2-羟基乙烷磺酸、3-羟基乙酸磺酸等。
特别优选的盐包括C1-6(例如C1-4)链烷磺酸的盐，链烷磺酸例如乙烷磺酸(乙烷磺酸)和丙烷磺酸(例如正丙烷磺酸)；和可选被取代的(例如被一个或多个C1-2烷基取代的)芳基磺酸，例如苯磺酸和萘二磺酸。
酸与游离碱的适合的化学计量比在0.25∶1.5至3.0∶1的范围内，例如0.45∶1.25至1.25∶1，包括0.50∶1至1∶1。
按照本发明的进一方面，提供了包含基本上结晶形式的式(I)化合物的制剂。
尽管我们已经发现有可能生成结晶性大于80％的本发明化合物，不过“基本上结晶性”包括结晶性大于20％，优选大于30％，更优选大于40％(例如大于任意的50、60、70、80或90％)。
按照本发明的进一方面，还提供了部分结晶形式的本发明化合物。“部分结晶性”包括5％或者在5％与20％之间的结晶性。
技术人员利用X-射线粉末衍射(XRPD)可以测定结晶度(％)。还可以采用其他技术，例如固态NMR、FT-IR、拉曼光谱学、示差扫描量热法(DSC)和微量热法。
可以制成结晶形式的优选式(I)化合物包括C1-6(例如C2-6，例如C2-4)链烷磺酸的盐，链烷磺酸例如乙烷磺酸、丙烷磺酸(例如正丙烷磺酸)和可选被取代的芳基磺酸(例如苯磺酸和萘二磺酸)。
术语“改性释放”药物组合物将被技术人员容易理解为包括任意这样的组合物/制剂，其中药物的起效和/或释放速率被盖仑操作所改变，因而包括如美国药典(USP XXH)绪言/前言部分第xliii和xliv页所提供的定义，该文献的相关披露结合在此作为参考。
目前，改性释放可以借助适当的药学上可接受的载体和/或其他手段来提供，该载体或手段(酌情)引起活性成分的起效和/或释放速率的改变。因而，该术语将被本领域技术人员理解为包括这样的组合物，它们经过修改(例如本文所述)，以提供药物的“持续”、“延长”或“延续”释放(其中药物以充分延迟的速率被释放，以产生治疗反应历经所需一段时间，可选地包括提供在给药后预定时间内可获得的初始量药物，以导致初始所需的治疗反应)；它们提供药物的“延时”释放(其中药物的释放被延时了，直至到达胃肠道的指定区域，此后药物的释放可以是脉冲性的或者进一步如上所示加以修饰)；以及所谓的“反复作用”组合物(其中一剂药物被立即或者在给药后一定时间释放，其他剂量在后面的时间被释放)。
我们优选的是，本发明组合物提供药物的延时释放或者更优选持续(也就是延长或延续)释放历经一段时间。更优选的本发明组合物可以经过修改(例如本文所述)，以提供充分的药物剂量历经服药间隔(与每单位时间服药次数无关)，以产生所需的治疗效果。在所延续的一段时间，释放可以是统一的和/或恒定的，或者其他。
本发明组合物例如可以是下列形式，所有这些都是本领域技术人员熟知的(a)包衣的颗粒剂、片剂或胶囊剂，它们可以被设计成当有关制剂到达胃肠道特定区域时释放至少一些药物。这类片剂例如可以带有一定形式的胃酸耐受性包衣，例如肠溶衣层，在胃肠道的特定部分、例如肠区释放存在于制剂中的至少一部分药物。
(b)多单元或多粒子系统，它们可以是微粒、微球或颗粒的形式，其中包含有药物(该多单元/多粒子可以提供含药制剂从胃进入十二指肠的逐渐排空，进一步穿过小肠和大肠，同时以预定速率释放药物)。
(c)在一种基质中包含活性化合物分散体或固体溶液的制剂，所述基质可以是蜡、树胶或脂肪的形式，或者特别是聚合物的形式，在其中借助片剂的逐渐表面侵蚀和/或扩散发生药物释放。
(d)包含一种生物粘合层的系统，该层可以提供本发明组合物的长时间留置在胃肠道的特定区域(例如胃)。这包括漂浮或沉没系统(分别是低密度和高密度系统)，以及所谓的“扩容”系统。
(e)所谓的“待定”药具，其中药物附着于离子交换树脂，借助存在于胃肠道中的其他离子的影响提供药物的逐渐释放，例如胃的酸性环境。
(f)这样的药具，其中借助其化学电位控制药物的释放速率(例如渗透泵)。
(g)这样的系统，其中借助跨膜扩散释放药物，包括多层系统。
(h)根据外部信号发挥作用的药具，以释放少量药物。
(i)主动的自程序化系统，它可以含有传感元件，该元件响应于特定的生物环境，以调节药物递送。
(j)硅橡胶控释药库，作为水和/或胃肠液经由入口/出口扩散进入药具的函数而释放药物，导致药物的溶解和随后释放。
上述原理详尽讨论在现有技术参考文献中，包括PharmaceutischWeekblad Scientific Edition，6，57(1984)；Medical Applications ofControlled Release，Vol II，eds.Langer and Wise(1984)Bocaraton，Florida，p.1-34；Industrial Aspects of Pharmaceuticals，ed.Sandel，Swedish Pharmaceutical Press(1993)p.93-104；″PharmaceuticsTheScience of Dosage Form Design″，ed.M.E.Aulton(1988)p.191-211(Churchill Livingstone)；以及上述文献所引用的参考文献，全部这些文献的披露结合在此作为参考。
另一方面，本发明提供口服改性释放制剂，其中R2是羟基或甲氧基(例如化合物A、B、C、G、H或J；R2尤其是甲氧基，例如化合物A、B或C)或其药学上可接受的盐(尤其是其结晶性盐；例如C1-6(例如C2-6，例如C2-4)链烷磺酸盐或可选被取代的芳基磺酸盐)。
本发明包括采用式(I)化合物的肠胃外改性释放制剂。进一方面，本发明提供肠胃外改性释放制剂，其中R2是氢(例如化合物D、E或F)。
更进一方面，本发明提供包含胶凝基质的改性释放制剂。该基质优选地包含羟丙基甲基纤维素(HPMC)、ι-角叉菜胶、十二烷基硫酸钠(SDS)和/或黄原胶。更优选地，该基质包含羟丙基甲基纤维素(HPMC)、ι-角叉菜胶和/或PEO。HPMC可以是一种HPMC或者两种或多种不同粘度或分子量HPMC的混合物(如下文所述)。
本发明还提供包含一种或多种HPMC和一种或多种其他组分的改性释放制剂，所述其他组分选自由ι-角叉菜胶、微晶纤维素、润滑剂(例如硬脂酰富马酸钠)或甘露糖醇组成的组。
本发明在进一方面进一步提供包含黄原胶或者包含ι-角叉菜胶和PEO的改性释放制剂(如下所述)。
适合的改性释放制剂因而可以按照药学中的标准技术加以制备，如本文或上述文献所述，和/或是熟知的。
我们优选的是，在本发明的组合物中，活性成分是与药学上可接受的载体一起被提供的。我们特别优选的是，本发明组合物呈现活性成分在聚合物基质中的形式。
在这方面我们优选的是，本发明组合物是供口服给药的，为所谓的“溶胀”改性释放系统或“胶凝基质”改性释放系统的形式，其中活性成分是与一种聚合物一起被提供的，所述聚合物在水性介质中溶胀(也就是“亲水性胶凝组分”)。术语“水性介质”在本文中被理解为包括水和这样的液体，它们是或者近似于存在于哺乳动物胃肠道中的那些。这类聚合物系统通常包含亲水性大分子结构，它们在干燥时可以是玻璃状或至少部分结晶性状态，在与水性介质接触时溶胀。药物的改性释放因而受到一种或多种下列过程的影响溶剂向聚合物基质中的转运、聚合物的溶胀、药物穿过溶胀聚合物的扩散和/或聚合物的侵蚀，其中一种或多种过程可以起到从聚合物基质中缓慢释放药物进入水性介质的作用。
因而，适合的聚合材料(充当载体)可以用作胶凝基质改性释放组合物的亲水性胶凝组分，包括分子量在5,000g/mol以上的那些，它们(a)至少微溶于水性介质(如上文所定义)；或者(b)在与水性介质接触时溶胀，使药物能够从载体中释放。
适合的胶凝基质聚合物可以是合成的或天然的，因而包括多糖，例如麦芽糖糊精、黄原胶、小核菌聚糖、葡聚糖、淀粉、藻酸盐、支链淀粉、透明质酸、壳多糖、壳聚糖等；其他天然聚合物，例如蛋白质(白蛋白、明胶等)、聚-L-赖氨酸；聚(丙烯酸)钠；聚(羟基烷基异丁烯酸酯)，例如聚(羟乙基异丁烯酸酯)；羧聚乙烯，例如CarbopolTM；carbomer；聚乙烯吡咯烷酮；树胶，例如瓜尔胶、阿拉伯胶、卡拉牙胶、印度胶、槐树豆胶、罗望子胶、吉兰糖胶、黄蓍胶、琼脂、果胶、谷胶等；聚(乙烯醇)；亚乙基乙烯醇；聚(氧化乙烯)(PEO)；和纤维素醚，例如羟甲基纤维素(HMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、羧乙基纤维素(CEC)、乙基羟乙基纤维素(EHEC)、羧甲基羟乙基纤维素(CMHEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基乙基纤维素(HPEC)和羧甲基纤维素钠(NaCMC)；以及任意上述聚合物的共聚物和/或(简单)混合物。某些上述聚合物可以进一步借助标准工艺而交联。
就胶凝基质系统形式的本发明组合物而言，我们优选的是，所采用的主要溶胀聚合物是HPC、麦芽糖糊精、小核菌聚糖或羧聚乙烯，更优选PEO或黄原胶，尤其是HPMC，以及任意这些聚合物的共聚物和/或(简单)混合物。ι-角叉菜胶也是优选的。
当在亲水性胶凝组分中采用PEO、黄原胶和HPMC时(也就是作为聚合物的至少一种)，这些聚合物优选的分子量(也就是重均分子量，由标准技术测定，例如渗透压测定、采用折光检测器的尺寸排阻色谱(其中分子量是借助标准校正曲线测定的)、光散射和/或超离心技术)在5,000g/mol至200,000,000g/mol的范围内，例如至多100,000,000g/mol，优选至多25,000,000g/mol，更优选至多20,000,000g/mol。可以采用具有这些范围内不同分子量的PEO、黄原胶与HPMC的混合物。
适合的HPMC聚合物也包括形成2％w/w聚合物水溶液的那些，其粘度根据标准技术的测量，例如美国药典XXN(USP XXIV/NF19)p.2002 et seq的一般描述和p.843-844的具体描述(该文献中的有关披露结合在此作为参考)，在3与150,000cps(20℃)之间，例如10与120,000cps之间，优选30与50,000cps之间，更优选50与15,000cps之间。可以采用具有这些范围内不同粘度的HPMC聚合物混合物，目的例如是形成这样的HPMC混合物，它们形成“平均”粘度(即混合物的粘度)在上述优选范围内的上述溶液。类似地，可以采用HPMC聚合物(粘度和/或“平均”粘度在这些范围内)与其他上述聚合物的混合物。适合的HPMC聚合物包括满足美国药典标准替换型2208、2906、2910和1828的那些(进一步细节参见USPXXIV/NF19)。适合的HPMC聚合物因而包括冠以商标METHOCELTM(Dow Chemical Corporation)或商标METOLOSETM(Shin-Etsu)销售的那些。
适合的黄原胶聚合物包括形成1％w/w聚合物水溶液的那些，其粘度根据标准技术的测量，例如美国药典XXN(USP XXIV/NF19)p.2002 et seq的一般描述和p.2537-2538的具体描述(该文献中的有关披露结合在此作为参考)，在60与2,000cps(24℃)之间，例如600与1,800cps之间，优选1,200与1,600cps之间。可以采用具有这些范围内不同粘度的黄原胶聚合物混合物，目的例如是形成这样的黄原胶混合物，它们形成“平均”粘度(即混合物的粘度)在上述优选范围内的上述溶液。类似地，可以采用黄原胶聚合物(粘度和/或“平均”粘度在这些范围内)与其他上述聚合物的混合物。适合的黄原胶聚合物包括冠以商标XANTURALTM与KELTROLTM(CPKelco)和SATIAXANETM(Degussa，Texturant Systems)销售的那些。
聚合物的选择将取决于用在本发明组合物中的活性成分/药物的属性以及所需的释放速率。特别是将为技术人员所领会到的是，例如在HPMC的情况下，一般而言分子量越高，药物从组合物中释放的速率越慢。进而，在HPMC的情况下，不同的甲氧基和羟丙基取代度将引起药物从组合物中释放的速率变化。在这一点上，并且如上所述，可能需要提供胶凝基质系统形式的本发明组合物，其中聚合物载体是两种或多种(例如)不同分子量的聚合物的掺合物，实例如下所述，目的是产生特殊需要的或所需的释放行为。
在胶凝基质系统形式中，我们还已发现，药物从本发明组合物中释放的速率可以借助控制下列两种比例得以进一步控制包含药物和聚合物载体系统的个别组合物(例如片剂)的药物聚合物之比和表面积体积之比。
本发明组合物无论胶凝基质系统还是其他，都可以含有一种或多种进一步的赋形剂(除了聚合物载体系统以外)，以进一步修饰药物释放，改进最终组合物的物理和/或化学性质，和/或有利于制备的过程。这类赋形剂是改性释放组合物配制中常见的。
例如，本发明组合物可以含有一种或多种下列稀释剂磷酸钙(磷酸一钙、磷酸二钙和磷酸三钙)、乳糖、微晶纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、二氧化钛、硅酸铝等。优选的稀释剂包括微晶纤维素和甘露糖醇。
本发明组合物可以含有一种或多种下列润滑剂硬脂酸镁、硬脂酰富马酸钠等。
本发明组合物可以含有助流剂，例如胶体二氧化硅。
本发明组合物可以含有一种或多种下列粘合剂聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、甘露糖醇、微晶纤维素、聚乙二醇(PEG)、低分子量HPMC、低分子量MC、低分子量HPC等。优选的粘合剂包括微晶纤维素。
本发明组合物可以含有一种或多种下列pH控制剂有机酸(例如柠檬酸等)或其碱金属(例如钠)盐、无机酸(例如碳酸或磷酸)的药学上可接受的盐(例如钠、镁或钙盐)、镁的氧化物以及碱金属与碱土金属(例如钠、钙、钾等)的硫酸盐、偏硫酸氢盐、丙酸盐与山梨酸盐。
其他进一步的赋形剂可以包括着色剂、矫味剂、增溶剂(例如SDS)、包衣剂、防腐剂等。
可以采用上述进一步赋形剂的组合。
将被领会到的是，一些上述可以存在于最终本发明组合物中的进一步赋形剂可以具有一种以上的上述功能。而且，上述进一步赋形剂还可以在胶凝基质系统中充当亲水性胶凝组分的一部分。
可以存在于本发明组合物中的进一步赋形剂(在胶凝基质系统的情况下不包括主要的聚合物载体)的总量将依赖于组合物的属性以及该组合物其他成分的属性和含量，可以是至多85％，例如在0.1至75％之间，例如0.2至65％，优选0.3至55％，更优选0.5至45％，尤其是1至40％，例如2至35％w/w。无论如何，技术人员可以按照惯例(也就是无需求助创造性劳动)可以确定赋形剂的选择和含量。
在胶凝基质系统中，系统中聚合物的含量应当足以确保历经服药间隔提供充分剂量的药物，以产生所需的治疗效果。因而，就胶凝基质系统而言，我们优选的是，在下文所述试验条件下，80％(尤其60％)的组合物最初药物成分在给药后被释放至患者花费至少2小时(优选至少4小时，尤其至少6小时，特别是历经8与24小时之间的阶段。最优选地，80％的组合物最初药物成分在8与24小时之间的某一时间被释放。可以包括在内的适量聚合物将尤其依赖于用在组合物中的活性成分、任意可能存在的赋形剂和所用聚合物的属性，为5至99.5％，例如10至95％，优选30至80％w/w。无论如何，技术人员可以按照惯例确定聚合物的选择和含量。
在另一种优选的制剂中，我们优选的是，本发明化合物被一起配制在胶凝基质组合物中，其中包含ι-角叉菜胶和一种或多种中性胶凝聚合物。
ι-角叉菜胶优选地在这样一种优选制备物中的含量水平为15重量％以上。优选的ι-角叉菜胶级别包括药物级ι-角叉菜胶(例如可从FMCBiopolymer获得)，它的粘度不小于5厘泊(cps)，优选为5-10cps(就1.5％溶液而言，温热至82℃，然后在75℃下利用装有#1转轴的Brookfield LV粘度计测量粘度，转速30rpm)，和技术级ι-角叉菜胶(例如可从Fluka Biochemica获得)，它的粘度优选地不小于14mPa.s(就0.3％水溶液而言，温热至20℃，然后利用Haake型落球粘度计以及Lauda恒温器C3和Hakke Mess-System III测量粘度，采用密度7.8g/cm3的包金不锈钢球)。
中性胶凝聚合物可以是单一的或者一种以上中性聚合物的混合物，它(们)具有胶凝性质，并且具有基本上依赖于pH的溶解度。中性胶凝聚合物优选地在制剂中的含量水平超过10％，但是优选地超过20％，按重量计。
适合的中性胶凝聚合物包括聚氧乙烯(PEO)、PEO家族的衍生物和成员(例如聚乙二醇(PEG))，优选地天然以固体状态存在，具有适合的分子量或粘度。如果用作单一的中性胶凝聚合物，那么PEO优选地具有大于4百万(4M)的MW，相当于1650-5500mPa.s的水溶液粘度范围(或1650-5500cps；就25℃的1％水溶液而言，利用Brookfield RVF粘度计测量，No.2转轴转速2rpm)。其他适合的PEO实例包括MW在5百万(5M)左右的PEO，相当于5500-7500mPa.s的水溶液粘度范围，或者MW在8百万(8M)左右的PEO，相当于10000-15000mPa.s的水溶液粘度范围。这种范围覆盖了在25℃下测量的典型溶液粘度值(以cps表示)，以这种聚合物为例，见USP 24/NF 19，2000年版pp.2285-2286。如果PEG用作单一的中性胶凝聚合物，那么它优选地具有高分子量，例如MW在20000左右，相当于2700-3500mPa.s(或2700-3500cps)的粘度范围，就20℃的50％水溶液(w/w)而言，例如毛细管粘度计测量(Ubbelohde或等价仪器)[RefEuropean Pharmacopoeia 3rd Ed.，2000，Supplement，pp.908-909]。
其他适合的中性胶凝聚合物包括纤维素衍生物，例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)或羟乙基纤维素(HEC)，具有适当高的粘度(例如“HPMC 50cps”、“HPMC 10000cps”、“HPMC 15000cps”、“HH型HEC”或“H型HEC”)。在用作单一的中性聚合物时，羟丙基甲基纤维素聚合物、象“HPMC 10000cps”和“HPMC 15000cps”分别具有7500-14000mPa.s(或7500-14000cps)和11250-21000mPa.s(或11250-21000cps)的表观粘度，利用毛细管粘度剂(Ubbelohde或等价仪器)测量20℃的2％(w/w)水溶液，根据干燥后的物质计算。有一种类型的羟乙基纤维素聚合物，例如“Natrosol 250 Pharma，HH型”，来自Hercules Incorporated(Aqualon)，通常显示约20,000mPa.s的Brookfield粘度，利用Brookfield Synchro-Lectric LVF型仪器测量，条件是1％溶液浓度，No.4转轴，转速30rpm，系数200，温度25℃(Natrosol Physical and Chemical Properties booklet，33.007-E6(1993)，p.21)。
特别可以提到的制剂包括这样的，其中本发明化合物是与ι-角叉菜胶和HPMC(10,000cps)按50∶50(wt％)比例一起配制的，或者与ι-角叉菜胶和HPMC(50cps)&HPMC(10,000cps)按35∶60∶5(wt％)比例一起配制，或者与ι-角叉菜胶和PEO 4M按50∶50(wt％)比例一起配制。这类制剂中优选的另外赋形剂包括润滑剂，例如硬脂酰富马酸钠。
本发明在一方面提供不可注射的本发明制剂，包含化合物A、B或C或其盐、HPMC和润滑剂(例如硬脂酰富马酸钠)。进一方面，该制剂可以包含两种或多种不同粘度(例如10,000cps和50cps)HPMC的混合物。进而，该制剂可以另外包含增溶剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠或聚氧40氢化蓖麻油)。
本发明组合物无论胶凝基质系统还是其他，适量活性成分依赖于很多因素，例如该成分的属性(游离碱/盐等)、所需要的剂量和组合物其他成分的属性与含量。不过，它们可以在0.5至80％的范围内，例如1至75％，例如3至70％，优选5至65％，更优选10至60％，尤其是15至55％w/w。无论如何，技术人员可以按照惯例确定所要包括的活性成分的量。
式(I)化合物或其药学上可接受的盐的典型每日剂量在0.001至100mg/kg体重的游离碱的范围内(也就是说，在盐的情况下排除所有由抗衡离子的存在所带来的重量)，与在当天内给药的个别剂量次数无关。优选的每日剂量在20-500mg的范围内。
本发明组合物、例如上述那些可以按照熟知技术制备，例如上述参考文献所述那些。胶凝基质系统形式的本发明化合物可以利用技术人员已知的标准设备借助标准技术加以制备，包括湿法或干法造粒、直接压制/压缩、干燥、研磨、混合、压片和包衣，以及这些过程的组合，例如如下所述。
尽管本发明组合物优选地适合于口服给药，不过它们的用途并不限于这种给药方式。本发明的肠胃外改性释放组合物可以包括本领域技术人员熟知的系统，例如基于泊洛沙姆、生物可降解微球、脂质体、油悬液和/或乳液的那些，都可以按照标准技术制备，例如Leung et al″Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications″(Drugsand the Pharmaceutical Sciences；vol.29，2nd edition，eds.Robinsonand Lee，Dekker(1987)第10章第433页，该文献的披露结合在此作为参考。
本发明组合物可以每天服药一次或多次(优选每天一次，但是不超过两次)，与作为一“剂”的一部分给药的个别单元(制剂/组合物)的数量无关。
本发明制剂是对哺乳动物患者(包括人类)给药的，就其中R2不是氢的式(I)化合物而言，随后在体内被代谢生成其中R2是氢的式(I)化合物，后者是有药理活性的。
按照本发明的进一方面，因而提供用作药物的本发明制剂。
特别是式(I)化合物是或者在给药后被代谢生成有力的凝血酶抑制剂，例如这可以得到国际专利申请No.PCT/SE01/02657以及国际专利公报WO 02/14270、WO 01/87879和WO 00/42059所述试验的证明，这些文献的有关披露结合在此作为参考。
“凝血酶抑制剂的前体药物”包括这样的化合物，它们在给药后被代谢生成实验可检测量的凝血酶抑制剂。
“活性成分”和“活性物质”表示存在于制剂中的药物成分(涵盖凝血酶抑制剂和其前体药物)。
本发明制剂因而被预期可用于需要抑制凝血酶的病症，和/或适用抗凝疗法的病症，包括下列治疗和/或预防动物、包括人类血液和/或组织中的血栓形成和凝固性过高。已知凝固性过高可以引起血栓-栓子疾病。可以提到的与凝固性过高和血栓-栓子疾病有关的病症包括遗传性或获得性活化C蛋白抗性，例如V因子突变(V因子Leiden)，和遗传性或获得性抗凝血酶、C蛋白、S蛋白、肝素辅因子II缺陷。其他已知与凝固性过高和血栓-栓子疾病有关的病症包括循环抗磷脂抗体(狼疮抗凝剂)、高半胱氨酸血、肝素诱发的血小板减少和纤维蛋白溶解不足以及凝血综合征(例如播散性血管内凝血(DIC))和全身血管损伤(例如由手术引起)。
治疗存在不可取过量的凝血酶而无凝固性过高迹象的病症，例如神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病。
可以提到的特定疾病状态包括静脉血栓形成(例如DVT)与肺栓塞、动脉血栓形成(例如心肌梗塞、不稳定型绞痛、基于血栓形成的中风和外周动脉血栓形成)和通常在心房纤维性颤动(例如非瓣膜性心房纤维性颤动)期间来自心房的全身栓塞或在透壁心肌梗塞后来自左心室或者由充血性心力衰竭所致的全身栓塞的治疗性和/或预防性处置；血栓溶解、经皮经腔血管成形术(PTA)和冠脉旁路手术后重新闭塞(也就是血栓形成)的预防；全身显微手术和血管手术后的重新血栓形成的防止。
进一步的适应症包括由细菌、多发性创伤、中毒或任意其他机理所导致的播散性血管内凝血的治疗性和/或预防性处置；抗凝处理，此时血液与体内外来表面接触，例如血管移植物、血管固定模、血管导管、机械与生物修复阀或任意其他医用装置；抗凝处理，此时血液与体外医用装置接触，例如在采用心-肺机的心血管手术期间或者在血液透析中；自发性与成人呼吸窘迫综合征、放射或化疗后肺纤维变性、脓毒性休克、败血病、炎性反应(包括但不限于水肿)、急性或慢性动脉粥样硬化(例如冠状动脉疾病和动脉粥样硬化斑的生成)、脑动脉疾病、脑梗塞、脑血栓形成、脑栓塞、外周动脉疾病、局部缺血、绞痛(包括不稳定型绞痛)、再灌注损伤、经皮经腔血管成形术(PTA)和冠状动脉旁路手术后再狭窄的治疗性和/或预防性处置。
本发明制剂还可以包含任何作用机理不同于式(I)化合物的抗血栓形成剂，例如下列一种或多种抗血小板剂乙酰水杨酸、噻氯匹定和氯吡格雷；血栓烷受体和/或合成酶抑制剂；纤维蛋白原受体拮抗剂；前列腺环素模拟物；磷酸二酯酶抑制剂；ADP-受体(P2T)拮抗剂；和羧肽酶U(CPU)抑制剂。
抑制胰蛋白酶和/或凝血酶的式(I)化合物还可以用于胰腺炎的治疗。
本发明制剂因而适用于这些病症的治疗性和/或预防性处置。
本发明制剂可用于式(I)化合物或其盐向患者的递送。由于式(I)化合物及其盐可用于血栓形成的预防和治疗，本发明制剂也可用于这样一种障碍的治疗。
按照本发明的进一方面，提供了血栓形成的治疗方法，该方法包含本发明制剂对患有或者易患这样一种病症的个人的给药。
本发明在更进一步的方面提供在药剂制备中的本发明制剂，该药剂用于血栓形成的治疗。
为了避免疑问，“治疗”包括病症的治疗性处置以及预防。
本发明组合物具有这样的优点，它们可以提供式(I)化合物或任意这些化合物的药学上可接受的盐的改性释放，目的是获得更加连贯和/或延长的抗血栓形成效果，因而可以提供活性成分的有效服药，优选地每天不超过一次或两次。
本发明组合物还可以具有这样的优点，它们可以利用既定的药学加工方法加以制备，并且采用获得食用或药用许可或者法定的材料。
式(I)化合物可以利用下列工艺制备。
一般工艺TLC是在硅胶上进行的。手性HPLC分析是利用46mm×250mmChiralcel OD柱进行的，该柱具有一个5cm保护柱。柱温维持在35℃。使用1.0mL/min的流速。使用228nm的Gilson 115 UV检测器。移动相由己烷、乙醇和三氟乙酸组成，就每种化合物而言列出了适当的比例。通常，将产物溶于少量乙醇，再用移动相稀释。
在下列制备例A至I中，LC-MS/MS是利用HP-1100仪器进行的，该仪器配有CTC-PAL注射器和5Tm，4×100mm ThermoQuest，Hypersil BDS-C18柱。使用API-3000(Sciex)MS检测器。流速为1.2mL/min，移动相(梯度)由10-90％乙腈与90-10％4mM含水乙酸铵组成，二者均含有0.2％甲酸。或者，低分辨率质谱(LRMS)是利用Micromass ZQ光谱计以ESI正负转换离子模式记录的(质量范围m/z 100-800)；高分辨率质谱(HRMS)是利用Micromass LCT光谱计以ES负离子化模式记录的(质量范围m/z 100-1000)，以亮氨酸脑啡肽(C28H37N5O7)作为内部质量标准。
1H NMR光谱是使用四甲基硅烷作为内标记录的。
式(I)化合物的合成过程参见国际专利申请No.PCT/SE01/02657(WO 02/44145，最早的优先权日为2000年12月1日，于2001年11月30日提交，于2002年6月6日公布)，有关信息结合在此。
制备例A化合物A的制备(i)3-氯-5-甲氧基苯甲醛在25℃下，向预先用0.5N HCl的THF(100mL)溶液洗涤过的镁金属(14.2g，585mmol)滴加3，5-二氯茴香醚(74.0g，419mmol)的THF(200mL)溶液。加入后，滴加1，2-二溴乙烷(3.9g，20.8mmol)。将所得暗褐色混合物在回流下加热3小时。将混合物冷却至0℃，一次性加入N，N-二甲基甲酰胺(60mL)。将混合物用二乙醚(3×400mL)和6N HCl(500mL)分配。合并有机萃取液，用盐水(300mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到油。经过硅胶快速色谱处理(2x)，用己烷∶EtOAc(4∶1)洗脱，得到小标题化合物(38.9g，54％)，为黄色的油。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.90(s，1H)，7.53(s，1H)，7.38(s，1H)，7.15(s，1H)，3.87(s，3H).
(ii)3-氯-5-羟基苯甲醛将3-氯-5-甲氧基苯甲醛(22.8g，134mmol；见上步骤(i))的CH2Cl2(250mL)溶液冷却至0℃。历经15分钟滴加三溴化硼(15.8mL，167mmol)。将反应混合物搅拌2小时后，缓慢加入H2O(50mL)。溶液然后用Et2O萃取(2×100mL)。合并有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩。经过硅胶快速色谱处理，用己烷∶EtOAc(4∶1)洗脱，得到小标题化合物(5.2g，25％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.85(s，1H)，7.35(s，1H)，7.20(s，1H)，7.10(s，1H)，3.68(s，1H).
(iii)3-氯-5-二氟甲氧基苯甲醛将3-氯-5-羟基苯甲醛(7.5g，48mmol；见上步骤(ii))的2-丙醇(250mL)与30％KOH(100mL)溶液加热至回流。在搅拌的同时，向反应混合物通入CHClF2达2小时。将反应混合物冷却，用1N HCl酸化，用EtOAc萃取(2×100mL)。将有机层用盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩。经过硅胶快速色谱处理，用己烷∶EtOAc(4∶1)洗脱，得到小标题化合物(4.6g，46％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.95(s，1H)，7.72(s，1H)，7.52(s，1H)，7.40(s，1H)，6.60(t，JH-F＝71.1Hz，1H).
(iv)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OTMS)CN将3-氯-5-二氟甲氧基苯甲醛(4.6g，22.3mmol；见上步骤(iii))的CH2Cl2(200mL)溶液冷却至0℃。加入ZnI2(1.8g，5.6mmol)和三甲代甲硅烷基氰(2.8g，27.9mmol)，使反应混合物温热至室温，搅拌15小时。在真空中部分浓缩混合物，得到小标题化合物，为液体，直接用于下列步骤(v)，无需进一步纯化或鉴别。
(v)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OH)C(NH)OEt
向HCl/EtOH(500mL)滴加Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OTMS)CN(6.82g，预计22.3mmol；见上步骤(iv))。将反应混合物搅拌15小时，然后在真空中部分浓缩，得到小标题化合物，为液体，直接用于步骤(vi)，无需进一步纯化或鉴别。
(vi)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OH)C(O)OEt将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OH)C(NH)OEt(6.24g，预计22.3mmol；见上步骤(v))溶于THF(250mL)，加入0.5M H2SO4(400mL)，将反应物在40℃下搅拌65小时，冷却，然后在真空中部分浓缩，以除去大部分THF。然后将反应混合物用Et2O萃取(3×100mL)，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到小标题化合物，为固体，直接用于步骤(vii)，无需进一步纯化或鉴别。
(vii)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OH)C(O)OH将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OH)C(O)OEt(6.25g，预计22.3mmol；见上步骤(vi))的2-丙醇(175mL)与20％KOH(350mL)溶液在室温下搅拌15小时。然后在真空中部分浓缩反应物，以除去大部分2-丙醇。将剩余混合物用1M H2SO4酸化，用Et2O萃取(3×100mL)，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩，得到固体。经过硅胶快速色谱处理，用CHCl3∶MeOH∶浓NH4OH(6∶3∶1)洗脱，得到小标题化合物的铵盐。然后将铵盐溶于EtOAc(75mL)与H2O(75mL)的混合物，用2N HCl酸化。分离有机层，用盐水(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，在真空中浓缩，得到小标题化合物(3.2g，57％，从步骤(iv)至(vii)计算)。
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.38(s，1H)，7.22(s，1H)，7.15(s，1H)，6.89(t，JH-F＝71.1Hz，1H)，5.16(s，1H)(vii)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)OH(a)和Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(S)CH(OH)C(O)OH(b)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R，S)CH(OH)C(O)OH(3.2g，12.7mmol；见上步骤(vii))与脂酶PS“Amano”(～2.0g)在乙酸乙烯酯(125mL)与MTBE(125mL)中的混合物在回流下加热48小时。将反应混合物冷却，通过Celite过滤，滤饼用EtOAc洗涤。在真空中浓缩滤液，进行硅胶快速色谱处理，用CHCl3∶MeOH∶浓NH4OH(6∶3∶1)洗脱，得到小标题化合物(a)和(b)的铵盐。将化合物(a)的盐溶于H2O，用2N HCl酸化，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到小标题化合物(a)(1.2g，37％)。
就小标题化合物(a)而言，1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.38(s，1H)，7.22(s，1H)，7.15(s，1H)，6.89(t，JH-F＝71.1Hz，1H)，5.17(s，1H)(ix)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Teoc)在0℃，向Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)OH(1.1g，4.4mmol；见上步骤(viii))与H-Aze-Pab(Teoc)(参见国际专利申请WO 00/42059，2.6g，5.7mmol)的DMF(50mL)溶液加入PyBOP(2.8g，5.3mmol)和三甲吡啶(1.3g，10.6mmol)。将反应物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌另外15小时。在真空中浓缩反应混合物，经过硅胶快速色谱处理(3x)，先用CHCl3∶EtOH(9∶1)洗脱，再用EtOAc∶EtOH(20∶1)洗脱，最后用CH2Cl2∶CH3OH(95∶5)洗脱，得到小标题化合物(1.0g，37％)，为白色固体。
1H NMR(300MHz，CD3OD，旋转异构体混合物)δ7.79-7.85(d，J＝8.7Hz，2H)，7.15-7.48(m，5H)，6.89和6.91(t，JH-F＝71.1Hz，1H)，5.12和5.20(s，1H)，4.75-4.85(m，1H)，3.97-4.55(m，6H)，2.10-2.75(m，2H)，1.05-1.15(m，2H)，0.09(s，9H).MS(m/z)611(M+1)+.
(x)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OMe，Teoc)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Teoc)(0.40g，0.65mmol；见上步骤(ix))溶于20mL乙腈，加入0.50g(6.0mmol)盐酸O-甲基羟胺。将混合物在70℃下加热2小时。蒸发溶剂，使残余物在水与乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，蒸发。收率0.41g(91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.83(bt，1H)，7.57(bs，1H)，7.47(d，2H)，7.30(d，2H)，7.20(m，1H)，7.14(m，1H)，7.01(m，1H)，6.53(t，1H)，4.89(s，1H)，4.87(m，1H)，4.47(m，2H)，4.4-4.2(b，1H)，4.17-4.1(m，3H)，3.95(s，3H)，3.67(m，1H)，2.68(m，1H)，2.42(m，1H)0.97(m，2H)，0.01(s，9H).
(xi)化合物A将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OMe，Teoc)(0.40g，0.62mmol；见上步骤(x))溶于5mL TFA，反应30分钟。蒸发TFA，使残余物在乙酸乙酯与NaHCO3(aq.)之间分配。水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，蒸发。将产物从水/乙腈中冷冻干燥。没有纯化的必要。收率0.28g(85％)。
1H NMR(600MHz，CDCl3)δ7.89(bt，1H)，7.57(d，2H)，7.28(d，2H)，7.18(m，1H)，7.13(m，1H)，6.99(m，1H)，6.51(t，1H)，4.88(s，1H)，4.87(m，1H)，4.80(bs，2H)，4.48(dd，1H)，4.43(dd，1H)，4.10(m，1H)，3.89(s，3H)，3.68(m，1H)，2.68(m，1H)，2.40(m，1H)13C-NMR(125MHz；CDCl3)(羰基和/或脒碳，旋转异构体)δ172.9，170.8，152.7，152.6HRMS关于C22H23ClF2N4O5(M-H)-的计算值495.1242，实测值495.1247制备例B化合物B的制备(i)2，6-二氟-4-[(甲基亚磺酰基)(甲硫基)甲基]苄腈在氩下，将(甲基亚磺酰基)(甲硫基)甲烷(7.26g，0.0584mol)溶于100mL无水THF，冷却至-78℃。滴加丁基锂的己烷溶液(16mL，1.6M，0.0256mol)，同时搅拌。将混合物搅拌15分钟。同时，在氩下将3，4，5-三氟苄腈(4.0g，0.025mmol)的100mL无水THF溶液冷却至-78℃，将前者溶液通过套管历经35分钟加入到后者溶液中。30分钟后，除去冷却浴，当反应已经达到室温时，倒入400mL水中。蒸发THF，剩余水层用二乙醚萃取三次。合并醚相，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。收率2.0g(30％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.4-7.25(m，2H)，5.01(s，1H，非对映体)，4.91(s，1H，非对映体)，2.88(s，3H，非对映体)，2.52(s，3H，非对映体)，2.49(s，3H，非对映体)，2.34(s，3H，非对映体)，1.72(宽峰，1H)(ii)2，6-二氟-4-甲酰基苄腈将2，6-二氟-4-[(甲基磺酰基)(甲硫基)甲基]苄腈(2.17g，8.32mmol；见上步骤(i))溶于90mL THF，加入3.5mL浓硫酸。将混合物在室温下放置3天，随后倒入450mL水中。然后用EtOAc萃取三次，合并醚相，用碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤两次，干燥(Na2SO4)，蒸发。收率1.36g(98％)。甲酰基的位置得到13C NMR的确认。氟化碳的信号出现在162.7ppm，表明了预期的偶合方式，两个偶合常数分别为260Hz和6.3Hz，相当于氟原子的ipso与meta偶合。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.35(s，1H)，7.33(m，2H)
(iii)2，6-二氟-4-羟甲基苄腈将2，6-二氟-4-甲酰基苄腈(1.36g，8.13mmol；见上步骤(ii))溶于25mL甲醇，在冰浴上冷却。分批加入硼氢化钠(0.307g，8.12mmol)，同时搅拌，将反应物放置65分钟。蒸发溶剂，使残余物在二乙醚与碳酸氢钠水溶液之间分配。将醚层用更多的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。粗产物很快结晶，无需进一步纯化即可使用。收率1.24g(90％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.24(m，2H)，4.81(s，2H)，2.10(宽峰，1H)(iv)4-氰基-2，6-二氟苄基甲烷磺酸酯向冰冷却的2，6-二氟-4-羟甲基苄腈(1.24g，7.32mmol；见上步骤(iii))与甲磺酰氯(0.93g，8.1mmol)的60mL二氯甲烷溶液加入三乙胺(0.81g，8.1mmol)，同时搅拌。在0℃下3小时后，将混合物用1M HCl洗涤两次，用水洗涤一次，干燥(Na2SO4)，蒸发。产物无需进一步纯化即可使用。收率1.61g(89％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.29(m，2H)，5.33(s，2H)，3.07(s，3H)(v)4-叠氮甲基-2，6-二氟苄腈将4-氰基-2，6-二氟苄基甲烷磺酸酯(1.61g，6.51mmol；见上步骤(iv))与叠氮化钠(0.72g，0.0111mol)在10mL水与20mL DMF中的混合物在室温下搅拌过夜。随后将所得物倒入200mL水中，用二乙醚萃取三次。合并醚相，用水洗涤五次，干燥(Na2SO4)，蒸发。蒸发少量样品供NMR分析，使产物结晶。小心地蒸发其余产物，但是不至完全干燥。基于NMR和分析型HPLC，假设收率(理论值1.26g)是几乎定量的。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.29(m，2H)，4.46(s，2H)(vi)4-氨基甲基-2，6-二氟苄腈该反应是按照J.Chem.Res.(M)(1992)3128所述工艺进行的。向520mg 10％Pd/C(50％水)的20mL水悬液加入硼氢化钠(0.834g，0.0221mol)的20mL水溶液。有一些气体放出。将4-叠氮甲基-2，6-二氟苄腈(1.26g，6.49mmol；见上步骤(v))溶于50mL THF，历经15分钟在冰浴上加入到该含水混合物中。将混合物搅拌4小时，然后加入20mL2M HCl，使混合物通过Celite过滤。Celite用更多的水冲洗，合并水相，用EtOAc洗涤，随后用2M NaOH调至碱性。然后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。收率0.87g(80％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.20(m，2H)，3.96(s，2H)，1.51(宽峰，2H)(vii)2，6-二氟-4-叔丁氧羰基氨基甲基苄腈将4-氨基甲基-2，6-二氟苄腈(0.876g，5.21mmol；见上步骤(vi))溶于50mL THF，加入二碳酸二叔丁酯(1.14g，5.22mmol)的10mL THF溶液。将混合物搅拌3.5小时。蒸发THF，使残余物在水与EtOAc之间分配。将有机层用0.5M HCl和水洗涤三次，干燥(Na2SO4)，蒸发。产物无需进一步纯化即可使用。收率1.38g(99％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.21(m，2H)，4.95(宽峰，1H)，4.43(宽峰，2H)，1.52(s，9H)(viii)Boc-Pab(2，6-二F)(OH)将2，6-二氟-4-叔丁氧羰基氨基甲基苄腈(1.38g，5.16mmol；见上步骤(vii))、盐酸羟胺(1.08g，0.0155mol)与三乙胺(1.57g，0.0155mol)在20mL乙醇中的混合物在室温下搅拌36小时。蒸发溶剂，使残余物在水与二氯甲烷之间分配。将有机层用水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。产物无需进一步纯化即可使用。收率1.43g(92％)。
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.14(m，2H)，4.97(宽峰，1H)，4.84(宽峰，2H)，4.40(宽峰，2H)，1.43(s，9H)(ix)Boc-Pab(2，6-二F)x HOAc该反应是按照Judkins et al，Synth.Comm.(1998)4351所述工艺进行的。将Boc-Pab(2，6-二F)(OH)(1.32g，4.37mmol；见上步骤(viii))、乙酸酐(0.477g，4.68mmol)和442mg 10％Pd/C(50％水)在100mL乙酸中在5atm压力下氢化3.5小时。使混合物通过Celite过滤，用乙醇冲洗，蒸发。将残余物从乙腈和水和几滴乙醇中冷冻干燥。小标题产物无需进一步纯化即可使用。收率1.49g(99％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.45(m，2H)，4.34(s，2H)，1.90(s，3H)，1.40(s，9H)(x)Boc-Pab(2，6-二F)(Teoc)
向Boc-Pab(2，6-二F)x HOAc(1.56g，5.49mmol；见上步骤(ix))的100mL THF与1mL水溶液加入2-(三甲代甲硅烷基)乙基对-硝基苯基碳酸酯(1.67g，5.89mmol)。历经5分钟滴加碳酸钾(1.57g，0.0114mol)的20mL水溶液。将混合物搅拌过夜。蒸发THF，使残余物在水与二氯甲烷之间分配。水层用二氯甲烷萃取，合并有机相，用碳酸氢钠水溶液洗涤两次，干燥(Na2SO4)，蒸发。经过硅胶快速色谱处理，用庚烷/EtOAc＝2/1洗脱，得到1.71g(73％)纯化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.43(m，2H)，4.97(宽峰，1H)，4.41(宽峰，2H)，4.24(m，2H)，1.41(s，9H)，1.11(m，2H)，0.06(s，9H)(xi)Boc-Aze-Pab(2，6-二F)(Teoc)将Boc-Pab(2，6-二F)(Teoc)(1.009g，2.35mmol；见上步骤(x))溶于50mL用HCl(g)饱和的EtOAc。将混合物放置10分钟，蒸发，溶于18mL DMF，然后在冰浴上冷却。加入Boc-Aze-OH(0.450g，2.24mmol)、PyBOP(1.24g，2.35mmol)和最后的二异丙基乙胺(1.158g，8.96mmol)。将反应混合物搅拌2小时，然后倒入350mL水中，用EtOAc萃取三次。合并有机相，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。经过硅胶快速色谱处理，用庚烷∶EtOAc(1∶3)洗脱，得到1.097g(96％)所需化合物。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.46(m，2H)，4.65-4.5(m，3H)，4.23(m，2H)，3.87(m，1H)，3.74(m，1H)，2.45-2.3(m，2H)，1.40(s，9H)，1.10(m，2H)，0.05(s，9H)(xii)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)(Teoc)将Boc-Aze-Pab(2，6-二F)(Teoc)(0.256g，0.500mmol；见上步骤(xi))溶于20mL用HCl(g)饱和的EtOAc。将混合物放置10分钟，蒸发，溶于5mL DMF。加入Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)OH(0.120g，0.475mmol；见上制备例A(viii))、PyBOP(0.263g，0.498mmol)和最后的二异丙基乙胺(0.245g，1.89mmol)。将反应混合物搅拌2小时，然后倒入350mL水中，用EtOAc萃取三次。合并有机相，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。经过硅胶快速色谱处理，用EtOAc洗脱，得到0.184g(60％)所需小标题化合物。
1H NMR(400MHz，CD3OD，旋转异构体混合物)δ7.55-7.45(m，2H)，7.32(m，1H，主要旋转异构体)，7.27(m，1H，次要旋转异构体)，7.2-7.1(m，2H)，6.90(t，1H，主要旋转异构体)，6.86(t，1H，次要旋转异构体)，5.15(s，1H，主要旋转异构体)，5.12(m，1H，次要旋转异构体)，5.06(s，1H，次要旋转异构体)，4.72(m，1H，主要旋转异构体)，4.6-4.45(m，2H)，4.30(m，1H，主要旋转异构体)，4.24(m，2H)，4.13(m，1H，主要旋转异构体)，4.04(m，1H，次要旋转异构体)，3.95(m，1H，次要旋转异构体)，2.62(m，1H，次要旋转异构体)，2.48(m，1H，主要旋转异构体)，2.22(m，1H，主要旋转异构体)，2.10(m，1H，次要旋转异构体)，1.07(m，2H)，0.07(m，9H)(xiii)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)(OMe，Teoc)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)(Teoc)(64mg，0.099mmol；见上步骤(xii))与盐酸O-甲基羟胺(50mg，0.60mmol)在4mL乙腈中的混合物在70℃下加热3小时。蒸发溶剂，使残余物在水与EtOAc之间分配。水层用EtOAc萃取两次，合并有机相，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。产物无需进一步纯化即可使用。收率58mg(87％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.90(bt，1H)，7.46(m，1H)，7.25-6.95(m，5H)，6.51(t，1H)，4.88(s，1H)，4.83(m，1H)，4.6-4.5(m，2H)，4.4-3.9(m，4H)，3.95(s，3H)，3.63(m，1H)，2.67(m，1H)，2.38(m，1H)，1.87(宽峰，1H)，0.98(m，2H)，0.01(s，9H)(xiv)化合物B将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)(OMe，Teoc)(58mg，0.086mmol；见上步骤(xiii))溶于3mL TFA，在冰浴上冷却，反应2小时。蒸发TFA，将残余物溶于EtOAc。将有机层用碳酸钠水溶液和水洗涤两次，干燥(Na2SO4)，蒸发。将残余物从水和乙腈中冷冻干燥，得到42mg(92％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.95(bt，1H)，7.2-7.1(m，4H)，6.99(m，1H)，6.52(t，1H)，4.88(s，1H)，4.85-4.75(m，3H)，4.6-4.45(m，2H)，4.29(宽峰，1H)，4.09(m，1H)，3.89(s，3H)，3.69(m，1H)，2.64(m，1H)，2.38(m，1H)，1.85(宽峰，1H)13C-NMR(100MHz；CDCl3)(羰基和/或脒碳)δ172.1，169.8，151.9
APCI-MS(M+1)＝533/535m/z制备例C化合物C的制备(i)(2-一氟乙基)甲烷磺酸酯在0℃氮下，向磁搅拌着的2-氟乙醇(5.0g，78.0mmol)的CH2Cl2(90mL)溶液加入三乙胺(23.7g，234mmol)和甲磺酰氯(10.7g，93.7mmol)。将混合物在0℃下搅拌1.5小时，用CH2Cl2(100mL)稀释，用2N HCl(100mL)洗涤。水层用CH2Cl2(50mL)萃取，合并有机萃取液，用盐水(75mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到小标题化合物(9.7g，88％)，为黄色的油，无需进一步纯化即可使用。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.76(t，J＝4Hz，1H)，4.64(t，J＝4Hz，1H)，4.52(t，J＝4Hz，1H)，4.43(t，J＝4Hz，1H)，3.09(s，3H).
(ii)3-氯-5-一氟乙氧基苯甲醛在室温氮下，向3-氯-5-羟基苯甲醛(8.2g，52.5mmol；见上制备例A(ii))与碳酸钾(9.4g，68.2mmol)的DMF(10mL)溶液滴加(2-一氟乙基)甲烷磺酸酯(9.7g，68.2mmol；见上步骤(i))的DMF(120mL)溶液。将混合物加热至100℃达5小时，然后在室温下搅拌过夜。将反应物冷却至0℃，倒入冰冷的2N HCl中，用EtOAc萃取。合并有机萃取液，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩。褐色的油经过硅胶色谱处理，用己烷∶EtOAc(4∶1)洗脱，得到小标题化合物(7.6g，71％)，为黄色的油。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.92(s，1H)，7.48(s，1H)，7.32(s，1H)，7.21(s，1H)，4.87(t，J＝4Hz，1H)，4.71(t，J＝3Hz，1H)，4.33(t，J＝3Hz，1H)，4.24(t，J＝3Hz，1H).
(iii)Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R，S)CH(OTMS)CN在0℃氮下，向3-氯-5-一氟乙氧基苯甲醛(7.6g，37.5mmol；见上步骤(ii))与碘化锌(3.0g，9.38mmol)的CH2Cl2(310mL)溶液滴加三甲代甲硅烷基氰(7.4g，75.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌3小时，在室温下搅拌过夜。反应物用H2O(300mL)稀释，分离有机层，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到小标题化合物(10.6g，94％)，为褐色的油，无需进一步纯化或鉴别即可使用。
(iv)Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R，S)CH(OH)C(O)OH
向Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R，S)CH(OTMS)CN(10.6g，5.8mmol；见上步骤(iii))加入浓盐酸(100mL)，将溶液在100℃下搅拌3小时。冷却至室温后，将反应物进一步冷却至0℃，用3N NaOH(～300mL)缓慢碱化，用Et2O洗涤(3×200mL)。将水层用2N HCl(80mL)酸化，用EtOAc萃取(3×300mL)。合并EtOAc萃取液，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到小标题化合物(8.6g，98％)，为淡黄色固体，无需进一步纯化即可使用。
Rf＝0.28(90∶8∶2 CHCl3∶MeOH∶浓NH4OH)1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.09(s，1H)，7.02(s，1H)，6.93(s，1H)，5.11(s，1H)，4.77-4.81(m，1H)，4.62-4.65(m，1H)，4.25-4.28(m，1H)，4.15-4.18(m，1H).
(v)Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(S)CH(OAc)C(O)OH(a)和Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)OH(b)将Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R，S)CH(OH)C(O)OH(8.6g，34.5mmol；见上步骤(iv))与脂酶PS“Amano”(4.0g)的乙酸乙烯酯(250mL)与MTBE(250mL)溶液在70℃氮下加热3天。将反应物冷却至室温，通过Celite过滤除去酶。滤饼用EtOAc洗涤，在真空中浓缩滤液。经过硅胶色谱处理，用CHCl3∶MeOH∶Et3N(90∶8∶2)洗脱，得到小标题化合物(a)的三乙胺盐，为黄色的油。另外，得到小标题化合物(b)的三乙胺盐(4.0g)。将小标题化合物(b)的盐溶于H2O(250mL)，用2N HCl酸化，用EtOAc萃取(3×200mL)。合并有机萃取液，干燥(Na2SO4)，过滤，在真空中浓缩，得到小标题化合物(b)(2.8g，32％)，为黄色的油。
小标题化合物(b)的数据Rf＝0.28(90∶8∶2 CHCl3∶MeOH∶浓NH4OH)1H NMR(300MHz，CD3OD)δ7.09(s，1H)，7.02(s，1H)，6.93(s，1H)，5.11(s，1H)，4.77-4.81(m，1H)，4.62-4.65(m，1H)，4.25-4.28(m，1H)，4.15-4.18(m，1H).
(vi)化合物C在0℃氮下，向Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)OH(818mg，3.29mmol；见上步骤(v))的DMF(30mL)溶液加入HAze-Pab(OMe).2HCl(1.43g，4.27mmol，参见国际专利申请WO00/42059)、PyBOP(1.89g，3.68mmol)和DIPEA(1.06g，8.23mmol)。将反应物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。在真空中浓缩混合物，残余物经过硅胶色谱处理两次，先用CHCl3∶EtOH(15∶1)洗脱，再用EtOAc∶EtOH(20∶1)洗脱，得到标题化合物(880mg，54％)。
Rf＝0.60(10∶1 CHCl3∶EtOH)1H NMR(300MHz，CD3OD，旋转异构体的复杂混合物)δ7.58-7.60(d，J＝8Hz，2H)，7.34(d，J＝7Hz，2H)，7.05-7.08(m，2H)，6.95-6.99(m，1H)，5.08-5.13(m，1H)，4.77-4.82(m，1H)，4.60-4.68(m，1H)，3.99-4.51(m，7H)，3.82(s，3H)，2.10-2.75(m，2H).
13C-NMR(150MHz；CD3OD)(羰基和/或脒碳)δ173.3，170.8，152.5.
APCI-MS(M+1)＝493m/z.
制备例D化合物D的制备Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Teoc)(0.045g，0.074mmol；见上制备例A(ix))溶于3mL TFA，反应1小时。蒸发TFA，将残余物从水/乙腈中冷冻干燥，得到0.043g(100％)小标题化合物，为它的TFA盐。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)旋转异构体δ7.8-7.75(m，2H)，7.55-7.5(m，2H)，7.35(m，1H，主要旋转异构体)，7.31(m，1H，次要旋转异构体)，7.19(m，1H，主要旋转异构体)，7.15(m，1H)，7.12(m，1H，次要旋转异构体)，6.89(t，1H，主要旋转异构体)，6.87(t，1H，次要旋转异构体)，5.22(m，1H，次要旋转异构体)，5.20(s，1H，主要旋转异构体)，5.13(s，1H，次要旋转异构体)，4.80(m，1H，主要旋转异构体)，4.6-4.4(m，2H)，4.37(m，1H，主要旋转异构体)，4.19(m，1H，主要旋转异构体)，4.07(m，1H，次要旋转异构体)，3.98(m，1H，次要旋转异构体)，2.70(m，1H，次要旋转异构体)，2.55(m，1H，主要旋转异构体)，2.29(m，1H，主要旋转异构体)，2.15(m，1H，次要旋转异构体)13C-NMR(100MHz；CD3OD)(羰基和/或脒碳，旋转异构体)δ172.6，172.5，172.0，171.7，167.0MS(m/z)465(M-1)-，467(M+1)+制备例E化合物E的制备
Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)(Teoc)(81mg，0.127mmol；见上制备例B(xii))溶于0.5mL二氯甲烷，在冰浴上冷却。加入TFA(3mL)，将反应物放置75分钟。蒸发TFA，将残余物从水和乙腈中冷冻干燥。粗产物经过制备型RPLC纯化，用CH3CN∶0.1M NH4OAc(35∶65)洗脱，得到39mg(55％)标题化合物，为它的HOAc盐，纯度99％。
1H NMR(400MHz，CD3OD，旋转异构体混合物)δ7.5-7.4(m，2H)，7.32(m，1H，主要旋转异构体)，7.28(m，1H，次要旋转异构体)，7.2-7.1(m，3H)，6.90(t，1H，主要旋转异构体)，6.86(t，次要旋转异构体)，5.15(s，1H，主要旋转异构体)，5.14(m，1H，次要旋转异构体)，5.07(s，1H，次要旋转异构体)，4.72(m，1H，主要旋转异构体)，4.65-4.45(m，2H)，4.30(m，1H，主要旋转异构体)，4.16(m，1H，主要旋转异构体)，4.03(m，1H，次要旋转异构体)，3.95(m，1H，次要旋转异构体)，2.63(m，1H，次要旋转异构体)，2.48(m，1H，主要旋转异构体)，2.21(m，1H，主要旋转异构体)，2.07(m，1H，次要旋转异构体)，1.89(s，3H)13C-NMR(75MHz；CD3OD)(羰基和/或脒碳，旋转异构体混合物)δ171.9，171.2，165.0，162.8，160.4APCI-MS(M+1)＝503/505 m/z.
制备例F化合物F的制备Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab x TFA(i)Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Teoc)在0℃氮下，向Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)OH(940mg，3.78mmol；见上制备例C(v))的DMF(30mL)溶液加入HAze-Pab(Teoc)-HCl(2.21g，4.91mmol)、PyBOP(2.16g，4.15mmol)和DIPEA(1.22g，9.45mmol)。将反应物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌4小时。在真空中浓缩混合物，残余物经过硅胶色谱处理两次，先用CHCl3∶EtOH(15∶1)洗脱，再用EtOAc∶EtOH(20∶1)洗脱，得到小标题化合物(450mg，20％)，为可粉碎的白色泡沫。
Mp80-88℃Rf＝0.60(10∶1 CHCl3∶EtOH)1H NMR(300MHz，CD3OD，旋转异构体的复杂混合物)δ7.79(d，J＝8Hz，2H)，7.42(d，J＝8Hz，2H)，7.05-7.08(m，1H)，6.93-6.99(m，2H)，5.08-5.13(m，1H)，4.75-4.80(m，2H)，4.60-4.68(m，1H)，3.95-4.55(m，8H)，2.10-2.75(m，2H)，1.05-1.11(m，2H)，0.08(s，9H).
APCI-MS(M+1)＝607 m/z.
(ii)化合物F将Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Teoc)(0.357g，0.589mmol；见上步骤(i))溶于10mL TFA，反应40分钟。蒸发TFA，将残余物从水/乙腈中冷冻干燥，得到0.33g(93％)标题化合物，为它的TFA盐。
1H-NMR(600MHz；CD3OD)旋转异构体δ7.8-7.7(m，2H)，7.54(d，2H)，7.08(s，1H，主要旋转异构体)，7.04(s，1H，次要旋转异构体)，6.99(s，1H，主要旋转异构体)，6.95(s，1H)，6.92(s，1H，次要旋转异构体)，5.18(m，1H，次要旋转异构体)，5.14(s，1H，主要旋转异构体)，5.08(s，1H，次要旋转异构体)，4.80(m，1H，主要旋转异构体)，4.73(m，1H)，4.65(m，1H)，4.6-4.4(m，2H)，4.35(m，1H，主要旋转异构体)，4.21(多重峰的双峰，2H)，4.12(m，1H，主要旋转异构体)，4.06(m，1H，次要旋转异构体)，3.99(m，1H，次要旋转异构体)，2.69(m，1H，次要旋转异构体)，2.53(m，1H，主要旋转异构体)，2.29(m，1H，主要旋转异构体)，2.14(m，1H，次要旋转异构体).
13C-NMR(150MHz；CD3OD)(羰基和/或脒碳)δ172.8，172.1，167.4.
ESI-MS+(M+1)＝463(m/z)制备例G化合物G的制备Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OH)(i)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OH，Teoc)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Teoc)(0.148g，0.24mmol；见上制备例A步骤(ix))溶于9mL乙腈，加入0.101g(1.45mmol)盐酸羟胺。将混合物在70℃下加热2.5小时，通过Celite过滤，蒸发。粗产物(0.145g；75％纯)直接用于下一步，无需进一步纯化。
(ii)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OH)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OH，Teoc)(0.145g，0.23mmol；见上步骤(i))溶于0.5mL CH2Cl2和9mL TFA。使反应进行60分钟。蒸发TFA，残余物用制备型HPLC纯化。汇集有关部分，冷冻干燥(2x)，得到72mg(两步收率62％)标题化合物。
MS(m/z)482(M-1)-；484(M+1)+1H-NMR(400MHz；CD3OD)δ7.58(d，2H)，7.33(m，3H)，7.15(m，2H)，6.89(t，1H，主要旋转异构体)，6.86(t，1H，次要旋转异构体)，5.18(s，1H，主要旋转异构体；和m，1H，次要旋转异构体)，5.12(s，1H，次要旋转异构体)，4.77(m，1H，主要旋转异构体)，4.42(m，2H)，4.34(m，1H，主要旋转异构体)，4.14(m，1H，主要旋转异构体)，4.06(m，1H，次要旋转异构体)，3.95(m，1H，次要旋转异构体)，2.66(m，1H，次要旋转异构体)，2.50(m，1H，主要旋转异构体)，2.27(m，1H，主要旋转异构体)，2.14(m，1H，次要旋转异构体)13C-NMR(100MHz；CD3OD)(羰基和/或脒碳，旋转异构体)δ172.4，172.3，172.0，1711.4，152.3，152.1制备例H化合物H的制备Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OH) (i)Boc-(S)Aze-NHCH2-Ph(2，6-二F，4-CN)将Boc-(S)Aze-OH(1.14g，5.6mmol)溶于45mL DMF。加入4-氨基甲基-2，6-二氟苄腈(1.00g，5.95mol，见上实施例1(xiv))、PyBOP(3.10g，5.95mmol)和DIPEA(3.95mL，22.7mmol)，将溶液在室温下搅拌2小时。蒸发溶剂，使残余物在H2O与EtOAc(各75mL)之间分配。水相用2×50mL EtOAc萃取，合并有机相，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥。快速色谱处理(SiO2，EtOAc/庚烷(3/1))得到小标题化合物(1.52g，77％)，为油，在冰箱中结晶。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)δ7.19(m，2H)，4.65-4.5(m，3H)，3.86(m，1H)，3.73(m，1H)，2.45-2.3(m，2H)，1.39(s，9H)(ii)H-(S)Aze-NHCH2-Ph(2，6-二F，4-CN)xHCl将Boc-(S)Aze-NHCH2-Ph(2，6-二F，4-CN)(0.707g，2.01mmol，见上步骤(i))溶于60mL用HCl(g)饱和的EtOAc。在室温下搅拌15分钟后，蒸发溶剂。将残余物溶于CH3CN/H2O(1/1)，冷冻干燥，得到小标题化合物(0.567g，98％)，为灰白色无定形粉末。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)δ7.49(m，2H)，4.99(m，1H)，4.58(m，2H)，4.12(m，1H)，3.94(m，1H)，2.80(m，1H)，2.47(m，1H)MS(m/z)252.0(M+1)+(iii)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-NHCH2-Ph(2，6-二F，4-CN)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)OH(0.40g，1.42mmol，见上实施例1(viii))溶于10mL DMF，加入H-(S)Aze-NHCH2-Ph(2，6-二F，4-CN)x HCl(0.43g，1.50mmol，见上步骤(ii))和PyBOP(0.779g，1.50mmol)，继之以DIPEA(1.0mL，5.7mmol)。在室温下搅拌2小时后，蒸发溶剂。使残余物在H2O(200mL)与EtOAc(75mL)之间分配。水相用2×75mL EtOAc萃取，合并有机相，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥。经过快速色谱处理(SiO2，EtOAc/庚烷(4/1))，得到小标题化合物(0.56g，81％)，为油。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)旋转异构体δ7.43(m，2H)，7.31(m，1H，主要旋转异构体)，7.26(m，1H，次要旋转异构体)，7.2-7.1(m，2H)，6.90(t，1H，主要旋转异构体)，6.86(t，1H，次要旋转异构体)，5.14(s，1H，主要旋转异构体)，5.11(m，1H，次要旋转异构体)，5.04(s，1H，次要旋转异构体)，4.71(m，1H，主要旋转异构体)，4.6-4.45(m，2H)，4.30(m，1H，主要旋转异构体)，4.2-3.9(m，1H；和1H，次要旋转异构体)，2.62(m，1H，次要旋转异构体)，2.48(m，1H，主要旋转异构体)，2.21(m，1H，主要旋转异构体)，2.09(m，1H，次要旋转异构体)13C-NMR(100MHz；CD3OD)(羰基碳)δ171.9，171.8MS(m/z)484.0，485.9(M-1)-，486.0，487.9(M+1)+(iv)Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(2，6-二F)(OH)将Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-NHCH2-Ph(2，6-二F，4-CN)(0.555g，1.14mmol，来自上步(iii))溶于10mL EtOH(95％)。向该溶液加入盐酸羟胺(0.238g，3.42mmol)和Et3N(0.48mL，3.44mmol)。在室温下搅拌14小时后，除去溶剂，将残余物溶于EtOAc。将有机相用盐水和H2O洗涤，经Na2SO4干燥。粗产物经过制备型RPLC纯化，使用CH3CN0.1M NH4OAc作为洗脱剂，冷冻干燥后得到标题化合物，为无定形粉末(0.429g，72％)。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)旋转异构体δ7.35-7.1(m，5H)，6.90(t，1H，主要旋转异构体)，6.85(t，1H，次要旋转异构体)，5.15(s，1H，主要旋转异构体)，5.12(m，1H，次要旋转异构体)，5.08(s，1H，次要旋转异构体)，4.72(m，1H，主要旋转异构体)，4.6-4.4(m，2H)，4.30(m，1H，主要旋转异构体)，4.12(m，1H，主要旋转异构体)，4.04(m，1H，次要旋转异构体)，3.94(m，1H，次要旋转异构体)，2.62(m，1H，次要旋转异构体)，2.48(m，1H，主要旋转异构体)，2.22(m，1H，主要旋转异构体)，2.10(m，1H，次要旋转异构体)13C-NMR(100MHz；CD3OD)(羰基和脒碳，旋转异构体)δ172.4，171.9，171.0，152.3，151.5MS(m/z)517.1，519.0(M-1)-，519.1，521.0(M+1)+制备例J化合物J的制备Ph(3-Cl)(5-OCH2CHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OH)(i)Ph(3-Cl)(5-OCH2CHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Z)将Boc-Aze-Pab(Z)(参见国际专利申请WO 97/02284，92mg，0.197mmol)溶于10mL用HCl(g)饱和的EtOAc，反应10分钟。蒸发溶剂，将残余物与Ph(3-Cl)(5-OCH2CHF2)-(R)CH(OH)C(O)OH(50mg，0.188mmol；见上制备例C(v))、PyBOP(109mg，0.209mmol)、最后与二异丙基乙胺(96mg，0.75mmol)混合在2mL DMF中。将混合物搅拌2小时，然后倒入50mL水中，用EtOAc萃取三次。合并有机相，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发。粗产物经过硅胶快速色谱处理，用EtOAc∶MeOH(9∶1)洗脱。收率100mg(87％)。
1H-NMR(300MHz；CD3OD，旋转异构体混合物)δ7.85-7.75(m，2H)，7.45-7.25(m，7H)，7.11(m，1H，主要旋转异构体)，7.08(m，1H，次要旋转异构体)，7.05-6.9(m，2H)，6.13(bt，1H)，5.25-5.05(m，3H)，4.77(m，1H，部分被CD3OH信号隐藏)，4.5-3.9(m，7H)，2.64(m，1H，次要旋转异构体)，2.47(m，1H，主要旋转异构体)，2.25(m，1H，主要旋转异构体)，2.13(m，1H，次要旋转异构体)(ii)Ph(3-Cl)(5-OCH2CHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(OH)将盐酸羟胺(65mg，0.94mmol)与三乙胺(0.319g，3.16mmol)混合在8mL THF中，在40℃下声波处理1小时。加入Ph(3-Cl)(5-OCH2CHF2)-(R)CH(OH)C(O)-Aze-Pab(Z)(96mg，0.156mmol；见上步骤(i))和8mL更多的THF。将混合物在40℃下搅拌4.5天。蒸发溶剂，粗产物经过制备型RPLC纯化，用CH3CN∶0.1M NH4OAc(40∶60)洗脱。收率30mg(38％)。纯度99％。
1H-NMR(300MHz；CD3OD，旋转异构体混合物)δ7.6-7.55(m，2H)，7.35-7.3(m，2H)，7.12(m，1H，主要旋转异构体)，7.09(m，1H，次要旋转异构体)，7.05-6.9(m，2H)，6.15(多重峰的三重峰，1H)，5.15(m，1H，次要旋转异构体)，5.13(s，1H，主要旋转异构体)，5.08(s，1H，次要旋转异构体)，4.77(m，1H，主要旋转异构体)，4.5-4.2(m，5H)，4.08(m，1H，主要旋转异构体)，3.97(m，1H，次要旋转异构体)，2.66(m，1H，次要旋转异构体)，2.50(m，1H，主要旋转异构体)，2.27(m，1H，主要旋转异构体)，2.14(m，1H，次要旋转异构体).
13C-NMR(100MHz；CD3OD)(羰基和/或脒碳，旋转异构体混合物)δ172.8，172.2，171.4，159.1，158.9，154.2.
APCI-MS(M+1)＝497/499 m/z方法1和2化合物A的盐的制备方法1盐制备的一般方法采用下列一般方法制备化合物A的盐将200mg化合物A(见上制备例A)溶于5mL MeOH。向该溶液加入有关酸(1.0摩尔当量)的5mL MeOH溶液。在室温下搅拌10分钟后，借助旋转蒸发器除去溶剂。将剩余固体重新溶于8mL乙腈∶H2O(1∶1)。在每种情况下冷冻干燥得到无色无定形产物。
所采用的酸(1S)-(+)-10-樟脑磺酸苹果酸环己氨基磺酸磷酸二甲基磷酸对-甲苯磺酸L-赖氨酸盐酸L-赖氨酸糖精酸甲烷磺酸盐酸适当的鉴别数据如表1所示。
表1
所有在这种方法中生成的盐都是无定形的。
方法2从下列酸开始，利用类似于上述方法1所述的技术制备化合物A的其他无定形盐氢溴酸(1∶1盐)盐酸(1∶1盐)硫酸(1∶0.5盐)1，2-乙烷二磺酸(1∶0.5盐)1S-樟脑磺酸(1∶1盐)(+/-)-樟脑磺酸(1∶1盐)乙烷磺酸(1∶1盐)硝酸(1∶1盐)甲苯磺酸(1∶1盐)甲烷磺酸(1∶1盐)对-二甲苯磺酸(1∶1盐)2-磺酸(1∶1盐)1，5-萘磺酸(1∶0.5盐)萘磺酸(1∶1盐)苯磺酸(1∶1盐)糖精酸(1∶1盐)马来酸(1∶1盐)磷酸(1∶1盐)D-谷氨酸(1∶1盐)L-谷氨酸(1∶1盐)D，L-谷氨酸(1∶1盐)L-精氨酸(1∶1盐)L-赖氨酸(1∶1盐)盐酸L-赖氨酸(1∶1盐)甘氨酸(1∶1盐)水杨酸(1∶1盐)酒石酸(1∶1盐)富马酸(1∶1盐)柠檬酸(1∶1盐)L-(-)-苹果酸(1∶1盐)D，L-苹果酸(1∶1盐)
D-葡糖酸(1∶1盐)方法3无定形化合物A乙烷磺酸盐的制备将化合物A(203mg；见上制备例A)溶于乙醇(3mL)，向该溶液加入乙烷磺酸(1eq.，95％，35μL)。将混合物搅拌几分钟，然后蒸发溶剂。将所得油悬浮在异辛烷中，蒸发至干，直至得到固体产物。最后，将该物质重新悬浮在异辛烷中，再次蒸发溶剂，得到白色干燥的无定形固体。在40℃真空下干燥过夜。
方法4至9结晶性化合物A乙烷磺酸盐的制备方法4无定形产物的结晶将无定形化合物A乙烷磺酸盐(17.8mg；见上方法3)悬浮在甲基异丁基酮(600μL)中。1周后，观察到结晶性针状物，滤出，风干。
方法5至7结晶反应(没有反溶剂)方法5将化合物A(277mg；见上制备例A)溶于甲基异丁基酮(3.1mL)。加入乙烷磺酸(1eq.，95％，48μL)。立即发生无定形乙烷磺酸盐的沉淀。加入更多的甲基异丁基酮(6mL)，将浆液用超声波处理。最后，加入第三部分的甲基异丁基酮(3.6mL)，然后将浆液放置过夜，同时搅拌(磁搅拌器)。第二天，该物质已经转化为结晶性针状物。滤出浆液，用甲基异丁基酮(0.5mL)洗涤，风干。
方法6将化合物A(236mg；见上制备例A)在室温下溶于甲基异丁基酮(7mL)。将乙烷磺酸(1eq.，41μL)与2mL甲基异丁基酮混合在小瓶中。向化合物A的溶液接种结晶性化合物A乙烷磺酸盐(见上方法4和5)。然后，历经45分钟分批加入250μL乙烷磺酸的甲基异丁基酮溶液。再次接种溶液，提高温度至30℃。然后，历经大约1小时加入500μL甲基异丁基酮溶液。将所得浆液放置过夜，然后历经20分钟加入最后一批甲基异丁基酮/酸溶液。将小瓶用1.5mL甲基异丁基酮冲洗，加入到浆液中。另外6小时后，滤出晶体，用甲基异丁基酮(2mL)洗涤，在40℃减压下干燥。得到总计258mg结晶性盐，相当于收率大约87％。
方法7将化合物A(2.36g；见上制备例A)溶于甲基异丁基酮(90mL)。向该溶液加入化合物A乙烷磺酸盐(见上方法4至6)的晶种(10mg)，然后分两批加入乙烷磺酸(40TL)。然后加入另外的晶种(12mg)和两批乙烷磺酸(2×20μL)。将浆液用甲基异丁基酮(15mL)稀释，然后继续加入乙烷磺酸。历经1小时分批加入总计330μL的乙烷磺酸。加入少量晶种，最后将浆液放置过夜，同时搅拌。第二天，滤出晶体，用甲基异丁基酮洗涤(2×6mL)，在40℃减压下干燥。干燥后，得到总计2.57g的白色结晶性产物，相当于收率89％。
方法8和9结晶反应(含有反溶剂)方法8将化合物A(163mg；见上制备例A)溶于异丙醇(1.2mL)。将该溶液加热至35℃。加入乙烷磺酸(28μL)。然后加入乙酸乙酯(4.8mL)，向溶液接种结晶性化合物A乙烷磺酸盐(见上方法4至7)。几乎立即开始结晶。将浆液在35℃下放置约80分钟，然后冷却至环境温度(21℃)。两小时后，滤出晶体，用乙酸乙酯洗涤三次(3×0.4mL)，在40℃减压下干燥。得到总计170mg的结晶性标题产物，相当于收率大约82％。
方法9将化合物A(20.0g；见上制备例A)溶于40℃异丙醇(146.6mL)，向该溶液加入乙烷磺酸(3.46mL，95％，1eq.)。向所得澄清的溶液加入化合物A乙烷磺酸盐的晶种(50mg；见上方法4至8)。然后历经10分钟加入乙酸乙酯(234mL)。向所得略微不透明的溶液再一次接种(70mg)，在40℃下放置1小时，同时搅拌，使结晶开始。此后，历经1小时以恒定速率加入总计352mL的乙酸乙酯。当已经加入全部乙酸乙酯后，将浆液放置1小时，然后历经2小时冷却至21℃。使结晶在21℃下继续1小时，然后滤出晶体，用乙酸乙酯洗涤两次(50mL+60mL)，最后在40℃减压下干燥过夜。得到总计21.6g的白色结晶性盐，相当于收率大约90％。
化合物A乙烷磺酸盐用NMR鉴别如下将23mg盐溶于氘代甲醇(0.7mL)troscopy。采用1D(1H，13C和选择性NOE)与2D(gCOSY，gHSQC和gHMBC)NMR实验的组合。全部数据与盐的理论结构吻合良好，如下所示。分子在甲醇中以两种构型存在。基于称为H5(优势构象异构体)的峰和称为H5’(其他构象异构体)的峰的整合，发现两种构象异构体之比为70∶30。不能观察到H22，因为这些质子被溶剂CD3OD迅速置换。
对应于1-位的质子和碳共振都因与两个氟核在该位置的自旋-偶合而分裂。偶合常数为2JHF＝73Hz和1JCF＝263Hz。
1H和13C NMR化学漂移值和质子-质子相关性如表2所示。
表2
a相对于49.0ppm的溶剂共振而言b相对于3.30ppm的溶剂共振而言cs＝单峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，d＝双峰d在gCOSY实验中获得
e由于与两个氟核偶合，共振是三重峰。1JCF＝263HzC24H29ClF2N4O8S的HRMS(M-H)-计算值605.1284，实测值605.1296。
用XRPD分析化合物A乙烷磺酸盐晶体(借助一种或多种上述方法4至9得到)，结果列表如下(表3)，并且如

图1所示。
表3
DSC显示为吸热，推断熔化起始温度为约131℃。TGA显示在熔点附近质量减少约0.2％(w/w)。利用较低溶剂含量的样品重复DSC分析，显示熔化起始温度为约144℃。
方法10无定形化合物A苯磺酸盐的制备将化合物A(199mg；见上制备例A)溶于乙醇(2mL)。在小瓶中，将苯磺酸(1eq.，90％，70mg)溶于乙醇(1mL)。将酸的乙醇溶液加入到化合物A的溶液中，将小瓶用1mL乙醇冲洗，然后也加入到混合物中。将混合物搅拌几分钟，然后蒸发乙醇，直至生成油。加入乙酸乙酯(3mL)，再次蒸发溶剂至干。生成无定形固体。
方法11至13结晶性化合物A苯磺酸盐的制备方法11无定形产物的结晶将无定形化合物A苯磺酸盐(20.7mg；见上方法10)悬浮在乙酸乙酯(600μL)中。5天后，在浆液中观察到结晶性针状物。
方法12和13结晶反应方法12将化合物A(128mg；见上制备例A)溶于乙酸乙酯(3mL)。向该溶液接种上述方法11的浆液。然后加入苯磺酸(1eq.，90％，45mg)。立即发生苯磺酸盐的沉淀。向浆液加入异丙醇(0.8mL)，再次向混合物接种。两天后，该物质已经转化为结晶性针状物。滤出浆液，用乙酸乙酯洗涤(3×0.2mL)，在40℃真空下干燥很短时间。得到总计大约140mg的白色固体。
方法13将化合物A(246mg；见上制备例A)溶于异丙醇(1.52mL)。加入苯磺酸(88mg，90％)。向该澄清的溶液加入乙酸乙酯(3mL)，然后向混合物接种，引发结晶。1小时后，加入更多的乙酸乙酯(2.77mL)。最后使浆液结晶过夜，然后滤出晶体，用乙酸乙酯洗涤(3×0.3mL)，在40℃真空下干燥。得到总计279mg的盐，相当于收率大约86％。
化合物A苯磺酸盐用NMR鉴别如下将20mg盐溶于氘代甲醇(0.7mL)。采用1D(1H，13C和选择性NOE)与2D(gCOSY，gHSQC和gHMBC)NMR实验的组合。全部数据与盐的理论结构吻合良好，如下所示。分子在甲醇中以两种构型存在。基于称为H12(优势构象异构体)的峰和称为H12’(其他构象异构体)的峰的整合，发现两种构象异构体之比为70∶30。不能观察到H22，因为这些质子被溶剂CD3OD迅速置换。
对应于1-位的质子和碳共振都因与两个氟核在该位置的自旋-偶合而分裂。偶合常数为2JHF＝74Hz和1JCF＝260Hz。
1H和13C NMR化学漂移值和质子-质子相关性如表4所示。
表4
a相对于49.0ppm的溶剂共振而言b相对于3.30ppm的溶剂共振而言cs＝单峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，d＝双峰d在gCOSY实验中获得e由于与两个氟核偶合，共振是三重峰。1JCF＝260Hzf由于共振102与103之间的重叠，连通性难以测定C28H29ClF2N4O8S的HRMS(M-H)-计算值653.1284，实测值653.1312。
用XRPD分析化合物A苯磺酸盐晶体(借助一种或多种上述方法11至13得到)，结果列表如下(表5)，并且如图2所示。
表5
DSC显示为吸热，推断熔化起始温度为约152℃。TGA显示在熔点附近质量减少约0.1％(w/w)。
方法14无定形化合物A正丙烷磺酸盐的制备将化合物A(186mg；见上制备例A)溶于异丙醇(1.39mL)，加入正丙烷磺酸(1eq.，95％，39μL)。加入乙酸乙酯(5.6mL)，蒸发溶剂，直至生成干燥的无定形固体。
方法15和16结晶性化合物A正丙烷磺酸盐的制备方法15无定形产物的结晶将无定形化合物A正丙烷磺酸盐(20mg；见上方法14)溶于异丙醇(60μL)，加入乙酸异丙酯(180μL)。3天后观察到结晶性针状物。
方法16结晶反应将化合物A(229mg；见上制备例A)溶于异丙醇(1.43mL)。加入正丙烷磺酸(1eq.，95％，48μL)。加入乙酸乙酯(2mL)，然后向溶液接种来自上述方法15的结晶性盐。加入更多的乙酸乙酯(5mL)，使浆液结晶过夜。滤出晶体，用乙酸乙酯洗涤(3×0.3mL)，在40℃真空下干燥。
化合物A正丙烷磺酸盐用NMR鉴别如下将13mg盐溶于氘代甲醇(0.7mL)troscopy。采用1D(1H，13C)与2D(gCOSY)NMR实验的组合。全部数据与盐的理论结构吻合良好，如下所示。分子在甲醇中以两种构型存在。基于称为H12(优势构象异构体)的峰和称为H12’(其他构象异构体)的峰的整合，发现两种构象异构体之比为65∶35。不能观察到H22，因为这些质子被溶剂CD3OD迅速置换。
对应于1-位的质子和碳共振都因与两个氟核在该位置的自旋-偶合而分裂。偶合常数为2JHF＝74Hz和1JCF＝260Hz。
1H和13C NMR化学漂移值和质子-质子相关性如表6所示。
表6
a相对于49.0ppm的溶剂共振而言b相对于3.30ppm的溶剂共振而言cs＝单峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，d＝双峰d在gCOSY实验中获得e由于与两个氟核偶合，共振是三重峰。1JCF＝260HzC25H31ClF2N4O8S的HRMS(M-H)-计算值619.1441，实测值619.1436。
用XRPD分析化合物A正丙烷磺酸盐晶体(借助一种或多种上述方法15和16得到)，结果列表如下(表7)，并且如图3所示。
表7
DSC显示为吸热，推断熔化起始温度为约135℃。TGA显示在熔点附近质量没有减少。
方法17方法17-A无定形化合物A正丁烷磺酸盐的制备将无定形化合物A(277mg)溶于IPA(1.77mL)，加入丁烷磺酸(大约1eq.，70μL)。加入乙酸乙酯(6mL)，蒸发溶剂直至生成干燥的无定形固体。
方法17-B结晶性化合物A丁烷磺酸盐的制备将无定形化合物丁烷磺酸盐(71.5mg；见上制备例)悬浮在乙酸乙酯(500μL)中过夜。滤出晶体，风干。
化合物A丁烷磺酸盐用NMR鉴别如下将21.6mg盐溶于氘代二甲基亚砜(0.7mL)，用1H和13C NMR光谱进行研究。
光谱与同一化合物的其他盐是非常相似的，与下示结构吻合良好。光谱中的大多数共振以一组两个峰存在，这是由于C9-N10键附近的缓慢旋转，导致在溶液中同时存在两种阻转异构体。同一化合物的其他盐也显示这一点。
1-位的两个氟核引起该位置质子和碳的分裂共振。偶合常数为2JHF＝73Hz和1JCF＝258Hz。
质子和碳的化学漂移列在表1中。由于化学置换没有检测到22和24位质子。在质子光谱中对应于这些质子的8与9ppm之间存在非常宽的隆起。
表8化合物A正丁烷磺酸盐在25℃氘代二甲基亚砜中的1H和13CNMR化学漂移值
a相对于49.0ppm的溶剂共振而言b相对于3.30ppm的溶剂共振而言cs＝单峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，d＝双峰d由于与两个氟核偶合，共振是三重峰。1JCF＝258Hze与间位质子的4JHH偶合未被完全解析na＝不可用，nd＝未测定C26H32ClF2N4O8S的HRMS(M-H)-计算值633.1597，实测值633.1600。
用XRPD分析化合物A正丁烷磺酸盐晶体(如上方法17-B所述得到)，结果列表如下(表9)，并且如图4所示。
表9
DSC显示为吸热，推断熔化起始温度为约118℃，TGA显示0.04％重量损失。
方法18化合物B的盐的制备方法18-A盐制备的一般方法采用下列一般方法制备化合物B的盐将200mg化合物B(见上制备例B)溶于5mL MIBK(甲基异丁基酮)。向该溶液加入有关酸(1.0或0.5摩尔当量，如表10所示)的1.0mL MIBK溶液。在室温下搅拌10分钟后，借助旋转蒸发器除去溶剂。将剩余固体产物重新溶于约8mL乙腈∶H2O(1∶1)。在每种情况下冷冻干燥得到无色无定形产物。
所采用的酸乙烷磺酸盐(乙烷磺酸)苯磺酸盐(苯磺酸)环己氨基磺酸盐硫酸盐溴化物对-甲苯磺酸盐2-萘磺酸盐半硫酸盐甲烷磺酸盐硝酸盐盐酸盐适当的鉴别数据如表10所示。
表10
所有在本实施例中生成的盐都是无定形的。
方法18-B从下列酸开始，利用类似于上述方法18-A所述的技术制备化合物B的其他无定形盐1，2-乙烷二磺酸(0.5盐)1S-樟脑磺酸(+/-)-樟脑磺酸对-二甲苯磺酸2-磺酸糖精酸马来酸磷酸D-谷氨酸L-精氨酸L-赖氨酸
L-赖氨酸*HCl方法18-C无定形化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将无定形化合物B(110.9mg)溶于2.5mL 2-丙醇，加入0.5当量1，5-萘二磺酸四水合物(溶于1mL 2-丙醇)。将样品搅拌过夜。借助显微镜观察到仅有少量粒子(无定形)或油滴。将样品蒸发至干。
方法18-D结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备结晶实验是在环境温度下进行的。将无定形化合物B(0.4g)溶于乙醇(1.5mL)，加入0.5eq 1.5-萘二磺酸四水合物(1.35g，10％乙醇溶液)。然后加入庚烷(0.7mL)，直至溶液变为轻微浑浊。约15分钟后，溶液变为浑浊。约30分钟后，得到稀薄的浆液，加入另外的庚烷(1.3mL)。然后将浆液放置过夜使成熟。为了稀释浓稠的浆液，加入乙醇与庚烷的混合物(分别为1.5mL和1.0mL)。约1小时后过滤浆液，将晶体用乙醇与庚烷的混合物(1.5∶1)洗涤，最后用纯庚烷洗涤。将晶体在环境温度下干燥1天。干燥晶体重0.395g。
方法18-E结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将无定形化合物B(1.009g)溶于20mL 2-丙醇+20mL乙酸乙酯。逐滴加入351.7mg 1，5-萘二磺酸四水合物的20mL 2-丙醇溶液。在约5分钟内发生沉淀。将浆液搅拌过夜，然后过滤。
方法18-F结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将430.7mg 1，5-萘二磺酸盐溶于30mL 1-丙醇。将溶液加热至沸腾，目的是使物质溶解。将溶液在环境温度下放置过夜使结晶，然后滤出晶体。
方法18-G结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备蒸发来自方法18-F的母液，将其余固体(61.2mg)溶于6mL乙腈/1-丙醇(2∶1)。将溶液在环境温度下放置过夜使结晶，然后滤出晶体。
方法18-H结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将来自方法18-C的样品溶于约2mL甲醇。在环境温度下加入乙醇(约3mL)为反溶剂，加入晶种。没有发生结晶，因此蒸发溶剂(约一半体积)，加入新的乙醇(约2mL)和晶种。在环境温度下搅拌过夜后生成结晶性粒子。
方法18-I结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将无定形化合物B(104.1mg)溶于2-丙醇，加入1当量1，5-萘二磺酸四水合物的2-丙醇溶液。2-丙醇的总量为约2.5mL。将溶液在44℃下搅拌约80分钟，生成沉淀。根据偏振光显微镜，粒子结晶。将样品过滤。
方法18-J结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将化合物B半-1，5-萘二磺酸盐(56.4mg)溶于1.5mL甲醇。加入甲乙酮(3mL)。向该溶液加入晶种，开始结晶。滤出晶体，用甲乙酮洗涤，风干。
方法18-K结晶性化合物B半-1，5-萘二磺酸盐的制备将无定形化合物B(161.0mg)溶于3.5mL 1-丁醇，将该溶液加热至40℃。在另一只烧杯中，将57.4mg萘二磺酸四水合物溶于3mL 1-丁醇。向化合物B的溶液加入几滴酸溶液。然后向溶液加入晶种，2小时后缓慢加入其余酸溶液(40℃)。然后缓慢降低温度至室温，搅拌过夜。将浆液过滤，用1-丁醇洗涤，在44℃真空下干燥2小时。收率为83％。
鉴别用NMR鉴别借助上述方法18-D所得化合物B半-1，5-萘二磺酸盐晶体如下将21.3mg盐溶于氘代甲醇(0.7mL)，用NMR光谱进行研究。采用1D(1H，13C和选择性NOE)与2D(gCOSY，gHSQC和gHMBC)NMR实验的组合。全部数据与盐的理论结构吻合良好，如下所示。测定了所有碳和与碳连接的质子。与杂原子连接的质子被溶剂中的氘置换，没有检测。1D1H和13C NMR光谱中的大多数共振以一组两个峰存在。其原因是C9-N10键附近的缓慢旋转，这导致在溶液中同时存在两种阻转异构体。1D NOE实验是其证据。当一种阻转异构体的共振被照射时，饱和度转移至其他阻转异构体的对应峰。对应于1，5-萘二磺酸盐抗衡离子的共振不显示阻转异构现象。

在分子中存在四个氟原子。它们引起一些质子和碳的分裂共振。对应于1-位的质子和碳共振都因与两个氟核在该位置的自旋-偶合而分裂。偶合常数为2JHF＝73Hz和1JCF＝263Hz。进而，对应于H19的质子共振是畸变的双峰，3JHF＝6.9Hz，这是由于与18-位氟核的自旋-偶合。对应于C17、C18、C19和C20的碳共振也表现与这些氟核的偶合。C17和C20共振是三重峰，2JCF＝19Hz，3JCF＝11Hz。C18共振是双重双峰，1JCF＝251Hz，3JCF＝8Hz。C19共振是多重峰。
对比对应于1，5-萘二磺酸盐抗衡离子和母体化合物的共振整合幅度，得到单一1，5-萘二磺酸盐抗衡离子与两分子母体化合物结晶的化学计量关系。
1H和13C NMR化学漂移值和质子-质子相关性如表11所示。
表11
a相对于49.0ppm的溶剂共振而言b相对于3.30ppm的溶剂共振而言cs＝单峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，d＝双峰d在gCOSY实验中获得e由于与两个氟核F1偶合，共振是三重峰。1JCF＝263Hzf由于与两个氟核F18偶合，共振是三重峰。2JCF＝19Hzg由于与两个氟核F18偶合，共振是双重双峰。1JCF＝251Hz，3JCF＝8Hzh由于与两个氟核F18偶合，共振是多重峰i由于与两个氟核F18偶合，共振是三重峰。3JCF＝11Hzj与间位质子的4JHH偶合未被完全解析na＝不可用，nd＝未测定用XRPD分析化合物B半-1，5-萘二磺酸盐晶体(借助上述方法18-I得到)，结果列表如下(表12)，并且如图5所示。
表12
DSC显示为吸热，推断熔化起始温度为约183℃，TGA显示在25-110℃之间有0.3％重量损失。
缩写Ac ＝ 乙酰基APCI ＝ 大气压化学电离(关于MS)API＝ 大气压电离(关于MS)aq.＝ 含水Aze(&(S)-Aze) ＝ (S)-氮杂环丁烷-2-羧酸酯(另有指定除外)Boc＝ 叔丁氧羰基br ＝ 宽峰(关于NMR)CI ＝ 化学电离(关于MS)d ＝ 天d ＝ 双峰(关于NMR)DCC＝ 二环己基碳二亚胺dd ＝ 双重双峰(关于NMR)DIBAL-H＝ 氢化二异丁基铝DIPEA ＝ 二异丙基乙胺DMAP ＝ 4-(N，N-二甲氨基)吡啶DMF＝ N，N-二甲基甲酰胺DMSO ＝ 二甲基亚砜DSC＝ 示差扫描量热法DVT＝ 深静脉血栓EDC＝ 盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺eq.＝ 当量ES ＝ 电子喷雾ESI＝ 电子喷雾界面Et ＝ 乙基醚 ＝ 二乙醚EtOAc ＝ 乙酸乙酯EtOH ＝ 乙醇Et2O ＝ 二乙醚HATU ＝ O-(氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐HBTU＝ [N，N，N’，N’-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐]HCl ＝ 氢氯酸、氯化氢气体或盐酸盐(因上下文而异)Hex ＝ 己烷HOAc＝ 乙酸HPLC＝ 高效液相色谱LC ＝ 液相色谱m ＝ 多重峰(关于NMR)Me ＝ 甲基MeOH＝ 甲醇min ＝ 分钟MS ＝ 质谱MTBE＝ 甲基叔丁基醚NMR ＝ 核磁共振OAc ＝ 乙酸盐Pab ＝ 对-脒基苄氨基H-Pab ＝ 对-脒基苄胺Pd/C＝ 披钯碳Ph ＝ 苯基PyBOP ＝ (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐q ＝ 四重峰(关于NMR)QF ＝ 氟化四丁基铵rt/RT ＝ 室温s ＝ 单峰(关于NMR)t ＝ 三重峰(关于NMR)TBTU＝ [N，N，N’，N’-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐TEA ＝ 三乙胺Teoc＝ 2-(三甲代甲硅烷基)乙氧羰基TEMPO ＝ 2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基游离基TFA ＝ 三氟乙酸
TGA ＝ 热重量分析THF ＝ 四氢呋喃TLC ＝ 薄层色谱UV ＝ 紫外前缀n-、s-、i-、t-和tert-具有它们的通常含义正、仲、异和叔。
下列实施例阐述但决不限制本发明。除非另有指定，HPMC聚合物是从Shin-Etsu(商标METOLOSETM)获得的。就ι-角叉菜胶而言，供应商是Fluka，就全部实施例而言，实施例11和12除外(CP-Kelco是供应商)。具体级别和它们的USP等价物如下所示(仅在首次提到时)。
一般试验方法利用USP溶解仪器2(桨+篮1)，在50rpm和37℃下，在900ml介质中试验三种个别片剂的药物释放。所用溶解介质是0.1M盐酸(pH 1)和0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)。线上量化是利用C Technologies光纤系统进行的，当使用0.1M HCl作为溶解介质时以220nm作为分析波长，当使用磷酸盐缓冲液pH6.8作为溶解介质时以260nm作为分析波长。两种介质都使用350nm作为参比波长。在分析的前两个小时，每15分钟测量一次释放值，然后在剩余分析时间每小时测量一次。
(1习惯上采用四角形丝网篮，它的上部窄侧之一焊接在钢柱末端。钢柱穿过溶解容器的盖子，借助两个特富龙螺帽固定在距离容器中心3.2cm处。篮子底部下缘在桨片上方1cm处。篮子指向流动方向，将供试药片放在它的边缘上。)实施例1化合物A与50∶50的HPMC 10,000cPs和HPMC 50cPs的直接压制将活性物质和赋形剂原料混合在大桶中。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
实施例2化合物A与HPMC、增溶剂和填充剂的造粒和压制将活性物质、抗氧化剂和增溶剂溶于乙醇，分布在赋形剂中。然后将该混合物用HPC的乙醇溶液造粒。然后将颗粒在干燥烘箱中干燥。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
结果没有对来自片剂基质的显著背景吸收进行校正，因而分别在0.1M HCl和0.1M磷酸钠缓冲液pH6.8中见到120％和132％的释放值。
实施例3化合物A与HPMC、SDS和填充剂的造粒和压制将活性物质和赋形剂原料混合在大桶中。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
实施例4包含化合物A乙烷磺酸盐、HPMC和SDS的制剂实例
按照实施例3的方法制备该制剂。
实施例5含有化合物A乙烷磺酸盐和黄原胶的制剂实例
按照实施例3的方法制备该制剂。
实施例6化合物A乙烷磺酸盐与HPMC和ι-角叉菜胶的制剂实例
按照实施例3的方法制备该制剂。
实施例7化合物A正丙烷磺酸盐与HPMC和ι-角叉菜胶的制剂实例
按照实施例3的方法制备该制剂。
实施例8化合物A苯磺酸盐与HPMC和ι-角叉菜胶的制剂实例
按照实施例3的方法制备该制剂。
实施例9化合物A乙烷磺酸盐与50∶50的HPMC 10,000cPs和HPMC 50cPs的直接压制
将活性物质和赋形剂原料混合在大桶中。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
实施例10化合物A乙烷磺酸盐与50∶50的HPMC 10,000cPs和ι-角叉菜胶的直接压制将活性物质和赋形剂原料混合在大桶中。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
实施例11将化合物A的苯磺酸盐和赋形剂原料在高剪切造粒机中造粒。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
实施例12将化合物A的苯磺酸盐和赋形剂原料在高剪切造粒机中造粒。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
实施例13直接压制化合物A的苯磺酸盐和赋形剂原料。
释放数据
实施例14包含化合物A苯磺酸盐的制剂实例按照实施例3或11的一般方法制备实施例14-A和14-B。
实施例14-A
实施例14-B
实施例14-C
按照实施例3的方法制备该制剂。
实施例14-C的释放数据
实施例15包含化合物B半萘-1，5-二磺酸盐的制剂实例按照实施例11的一般方法制备全部制剂。
实施例15-A
实施例15-B
实施例15-C
如上可以制备其他实施例，其中将HPMC用PEO代替或者与PEO混合。在混合物的情况下，PEO∶HPMC的比例可以是90∶10至10∶90％。一种确切的混合物是PEO∶HPMC 80％∶20％或75％∶25％。
实施例16化合物A与HPMC、SDS和填充剂的造粒和压制将活性物质和赋形剂原料混合在大桶中。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
实施例17化合物A与50∶50的黄原胶和ι-角叉菜胶的直接压制将活性物质和赋形剂原料混合在大桶中。将颗粒用硬脂酰富马酸钠润滑，利用偏心压片机压制成片。
释放数据
使用化合物A的苯磺酸盐，可以重复任意上述使用化合物A游离碱或除苯磺酸盐以外的盐的实施例。
如下提供本发明的确切方面1、改性释放药物组合物，包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分 其中R1代表被一个或多个氟代取代基取代的C1-2烷基；R2代表氢、羟基、甲氧基或乙氧基；n代表0、1或2；和药学上可接受的稀释剂或载体，其条件是当式(I)化合物是盐的形式时，该制剂可以仅含有ι-角叉菜胶和中性胶凝聚合物。
2、如第1方面所述的组合物，其中该活性成分是下列化合物的盐Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)(化合物A)；Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe)(化合物B)；或Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)(化合物C)。
3、如第1或2方面所述的组合物，其中该活性成分是下列化合物的结晶性盐Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)(化合物A)；Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe)(化合物B)；或Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)(化合物C)。
4、如第1、2或3方面所述的组合物，其中该组合物包含一种胶凝基质。
5、如第4方面所述的组合物，其中该基质包含HPMC。
6、如第4或5方面所述的组合物，其中该基质包含ι-角叉菜胶。
7、如第4方面所述的组合物，其中该基质包含SDS。
8、如第2和5或者2和6方面所述的组合物，其中该基质另外包含黄原胶。
9、如第1方面所述制剂作为药剂的用途。
10、如第1方面所述制剂在药剂制备中的用途，该药剂用于心血管障碍的治疗。
11、治疗患有心血管障碍或者面临所述障碍危险的患者所述障碍的方法，该方法包含对该患者给以治疗有效量的如第1方面所述药物制剂。
12、制备如第1方面所述即时释放制剂的方法。
还提供了可由本文所述方法和/或实施例获得的组合物。
权利要求
1.改性释放药物组合物，包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分 其中R1代表被一个或多个氟代取代基取代的C1-2烷基；R2代表氢、羟基、甲氧基或乙氧基；n代表0、1或2；和药学上可接受的稀释剂或载体，其条件是当式(I)化合物是盐的形式时，该制剂可以仅含有ι-角叉菜胶和中性胶凝聚合物。
2.如权利要求1所要求保护的组合物，其中该活性成分是下列化合物的盐Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)；Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe)；或Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)。
3.如权利要求1或2所要求保护的组合物，其中该活性成分是下列化合物的结晶性盐Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)；Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe)；或Ph(3-Cl)(5-OCH2CH2F)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)。
4.如权利要求1、2或3任意一项所要求保护的组合物，其中该活性成分是Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)或Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe)的乙烷磺酸、正丙烷磺酸、苯磺酸、1，5-萘二磺酸或正丁烷磺酸加成盐。
5.如权利要求1至4任意一项所要求保护的组合物，其中该活性成分是Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(OMe)苯磺酸盐，其特征在于X-射线粉末衍射图案特征峰的d值为5.9、4.73、4.09和4.08。
6.如权利要求1至4任意一项所要求保护的组合物，其中该活性成分是Ph(3-Cl)(5-OCHF2)-(R)CH(OH)C(O)-(S)Aze-Pab(2，6-二F)(OMe)半-1，5-萘二磺酸盐，其特征在于X-射线粉末衍射图案特征峰的d值为18.3、9.1、5.6、5.5、4.13、4.02、3.86、3.69和3.63。
7.如权利要求1至6任意一项所要求保护的组合物，其中该组合物包含一种胶凝基质。
8.如权利要求7所要求保护的组合物，其中该基质包含HPMC。
9.如权利要求7或8所要求保护的组合物，其中该基质包含ι-角叉菜胶。
10.如权利要求7所要求保护的组合物，其中该基质包含SDS。
11.如权利要求1所要求保护的制剂作为药剂的用途。
12.如权利要求1所要求保护的制剂在药剂制备中的用途，该药剂用于心血管障碍的治疗。
13.治疗患有心血管障碍或者面临所述障碍危险的患者所述障碍的方法，该方法包含对该患者给以治疗有效量的如权利要求1所要求保护的药物制剂。
全文摘要
改性释放的药物组合物，包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中R
文档编号A61K47/36GK1655761SQ03812492
公开日2005年8月17日 申请日期2003年5月27日 优先权日2002年5月31日
发明者A·芒努松, M·图恩 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司