包含重组hcg的药物制剂的制作方法

专利名称：包含重组hcg的药物制剂的制作方法
包含重组HCG的药物制剂本发明涉及用于治疗不育的促性腺激素。具体地，本发明涉及人绒毛膜促性腺激素(hCG)。所述促性腺激素是一组在男性和女性中调节生殖腺功能的异二聚体糖蛋白激素。 它们包括促卵泡激素(FSH)，黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。人绒毛膜促性腺激素(hCG)由垂体前叶腺自然分泌，并且发挥功能以支持卵泡发育和排卵。hCG包含对于其它糖蛋白激素LH和FSH也是常见的92个氨基酸的α亚基，以及赋予该激素特异性的hCG独有的145个氨基酸的β亚基。每个亚基通过添加复杂的糖残基进行翻译后修饰。α亚基包含在氨基酸52和78处的2-Ν-连接的糖基化位点，β亚基包含在氨基酸13和30处的2-Ν-连接的糖基化位点和在氨基酸121、127、132和138处的4个0-连接的糖基化位点。从怀孕妇女的尿液中提取的hCG[Choragen(Ferring)]已经在不育治疗中使用了许多年。从尿液中提取的hCG的产生包括大量尿液的收集和处理。重组形式的hCG，即 Ovitrelle(Serono)是可获得的。这在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。已知的重组hCG 产物具有与从人尿中产生的hCG不同的药物代谢动力学模式。具有更紧密地重复或模拟从人尿中产生的产物的药物代谢动力学模式的hCG产品是合乎需要的。存在与hCG制剂相关的相当大的异质性，其涉及在存在的各种同种型的量上的不同。单独的hCG同种型显示相同的氨基酸序列，但是在它们翻译后修饰的程度上不同；具体的同种型特征为糖分枝结构的异质性以及唾液酸(末端糖)结合量的不同，这两者都显示影响具体的同种型生物活性。天然hCG的糖基化是高度复杂的。在自然来源的垂体hCG中的聚糖可以包含广泛范围的结构，其可以包括二触角聚糖、三触角聚糖和四触角聚糖的组合。所述聚糖可以具有其它的修饰核心岩藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙酰基乳糖胺延伸的链、部分或完全唾液酸化(sialylation)，具有α 2，3和α 2，6连接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺。此外，在单独的糖基化位点的聚糖结构的分布之间存在差异。重组hCG(“rhCG”)产品的糖基化反映在宿主细胞系中存在的糖基转移酶范围。现存的rhCG产品Ovitrelle源自改造的中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。在CHO来源的rhCG 中的聚糖修饰范围比在源自尿液的天然产物中发现的那些更有限。在CHO来源的rhCG中发现的减少的聚糖异质性的实例包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心岩藻糖基化和乙酰基乳糖胺延伸。此外，CHO细胞仅能够使用α2，3连接加入唾液酸(Kagawa等，1988， Takeuchi等，1988，Svensson等.，1990)。这不同于天然产生的hCG，其包含具有α 2，3禾口 α 2,6-连接的唾液酸混合物的聚糖。已经证实当与垂体、血清或绝经期后尿液FSH比较时，重组FSH制剂(Organon) 在具有低于4的等电点(pi)的FSH(考虑酸性同种型)的量上不同(U1 Ioa-Aguirre 等.199 。与重组产物Gonal-f Gerono)和Puregon(Organon)比较，在尿制备物中的酸性同种型的量高得多(Andersen等.2004)。这必定反映在rFSH中更低摩尔含量的唾液酸，因为用硫酸盐修饰的带负电荷的聚糖的含量在FSH中很低。与天然FSH比较，更低的唾液酸含量是两种商购FSH产品的特征，并且因此必定反映制备方法中的限制(Bassett和 Driebergen, 2005).已经关于来自多种来源的物质记载了 FSH的循环寿命。这些物质中的一些已经基于总分子电荷进行分离，总分子电荷如通过它们的Pl表征，其中更多的酸等同于更高的负电荷。对于总分子电荷的主要贡献者是每种FSH分子的总唾液酸含量。例如， rFSH(Organon)具有约8m0l/m0l的唾液酸含量，而尿来源的FSH具有更高的唾液酸含量 (de Leeuw等· 1996)。在大鼠中的相应血浆清除率是0. 34和0. 14ml/min (U1 Ioa-Aguirre 等.2003)。在另一个实例中，其中将重组FSH样品分为高和低pi级分，高pi (更低唾液酸含量)级分的体内功效减少并且其具有更短的血浆半衰期(D'Antonio等.1999)。本发明人已经发现，与FSH类似，已知的来源于CHO的重组hCG产物(例如，Ovitrelle)也具有比尿hCG更低量的具有低于4的等电点(pi)(认为是酸性同种型)的hCG，这也反映已知的 rhCG产品比尿hCG更低的唾液酸含量。hCG和rhCG的总唾液酸含量不是直接可比较的，因为唾液酸一般通过两种方式连接。垂体/血清/尿hCG都包括α 2，3和α 2，6-连接的唾液酸，其中主要为前者。然而， CHO 细胞来源的重组体仅包括 α 2，3(Kagawa 等，1988，Takeuchi 等，1988，Svensson 等·， 1990)。换言之，使用CHO系统表达的重组蛋白将在其末端唾液酸连接的类型方面不同于其天然对应物。除了后者更低的唾液酸总含量以外，这是在天然产物和目前的重组产物之间存在另一种差异，并且在生产药用的生物制剂中这是一项重要的考虑，因为糖结构部分可能有助于所述分子的药理学性质。因此，具有这样的rhCG产品是理想的，所述rhCG产品更接近地复制或模拟由人尿生产的产品的生理化学和药物代谢动力学模式。具有这样的rhCG产品是理想的，其与已知重组产物比较，具有一种或多种改善的药物代谢动力学性质。根据本发明，提供这样的重组hCG( “rhCG”或“rechCG”)，其包括α2，3唾液酸化和α 2，6唾液酸化和，任选地，α2，8唾液酸化。根据本发明的rhCG(或rhCG制剂)可以具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]，例如 15mol/mol 至 25mol/mol，例如 17mol/mol 至 24mol/mol，例如 17. 7mol/mol 至 23mol/mol，例如 18mol/mol 至 22mol/mol，例如 19mol/mol 至 21mol/mol，例如 19mol/mol 至 20mol/mol。 根据本发明的rhCG (或rhCG制剂)的全部唾液酸化的10 %以上是α2，3_唾液酸化。例如，全部唾液酸化的45% -80%可以是α 2，3-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的50% -70% 可以是α 2，3-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的55%-65%可以是α 2，3_唾液酸化。例如， 全部唾液酸化的65%-85%可以是α2，3-唾液酸化。本发明的rhCG (或rhCG制剂)的全部唾液酸化的50%以下可以是α 2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的20-55%可以是 α 2,6-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的30-50%可以是α 2,6-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的35-45%可以是α 2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的15_35%可以是α 2，6_唾液酸化。本发明的rhCG(或rhCG制剂)的全部唾液酸化的5%以下可以是α 2,8-唾液酸化，例如全部唾液酸化的0-4%，例如0. 1-4%可以是α2，8-唾液酸化。本发明的rhCG(或 rhCG制剂)可以不具有α 2，8-唾液酸化。申请人:已经开发了人来源的重组hCG，其具有比CHO来源的产物OvitrelIe更加酸性的模式，并且其具有更高的唾液酸含量。申请人的研究表明，唾液酸连接的类型，α 2， 3-或0 2，6-，可以具有对1^6的生物清除的巨大影响。与CHO细胞系相反，人细胞系可以表达唾液酸通过α 2，3和α 2，6连接两者进行连接的重组hCG。通过改造人细胞系以表达rhCG和α 2，3唾液酸转移酶两者来制备具有α 2，3和 α 2，6-连接的唾液酸的混合物的重组hCG(实施例4、^1和5b)。表达的产物是高度酸性的并且携带α2，3_和α 2，6_连接两者的唾液酸的混合物；后者由内源的唾液酸转移酶活性提供。与在常规CHO细胞中表达的rhCG比较，这具有两个优势首先，由于这两种唾液酸转移酶的组合活性，所以所述物质是更加高度唾液酸化的；其次，所述物质更接近地类似于天然hCG。与CHO细胞来源的重组产物比较，这可能在生物学上是更加适合的，所述CHO细胞来源的重组产物仅产生α 2，3连接的唾液酸并且具有减少的唾液酸含量。申请人:令人惊奇地发现与其它重组产物相比，本发明的rhCG可以更接近地复制或模拟天然人尿产物的生理化学和药物代谢动力学模式。换言之，本发明的rhCG可以更接近于“天然”hCG。关于给药等，这可能具有明显的优势。此外，更“天然”或更“人化”的产品对于可能需要治疗的患者可能是更理想的，尽管在某种意义上，人工意味着尽可能的是 “天然的”。与其它重组产物比较，在糖(例如聚糖)结构上更接近于天然(例如人尿)hCG 的重组hCG产物可能具有其它优势(例如药物代谢动力学优势)。因此，本发明是hCG的重组形式，其携带α2，3和α 2，6唾液酸的混合物并且因此更接近地类似于天然hCG。与现存的重组产物比较，预期这种化合物关于控制的卵巢刺激、 在IVF技术中的应用、以及排卵诱导的应用将导致卵巢的更天然的刺激。根据本发明，提供包含α 2，3唾液酸化和α 2,6唾液酸化的重组hCG( “rhCG”或 “rechCG”)(和/或重组hCG制剂)。rhCH或rhCG制剂可以任选地进一步包含α 2，8唾液酸化。在本文中，术语“重组hCG制剂”包括用于例如药物应用的制剂，其包含重组hCG。 在本发明的实施方案中，所述rhCG可以作为单一同种型或作为同种型的混合物存在。根据本发明的rhCG(或rhCG制剂)可以具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示](实施例8)，例如15m0l/m0l-25m0l/m0l，例如 17mol/mol-24mol/mol，例如 17. 7mol/mol-23mol/mol，例如 18mol/mol-22mol/mol，例如 19mo 1 /mo 1 -2Imo 1 /mo 1，例如19mo 1 /mo 1 -20mo 1 /mo 1。本发明的rhCG可以在人细胞系中生产或表达。根据本发明的rhCG(或rhCG制剂)的全部唾液酸化的10%以上可以是α2，3_唾液酸化。例如，全部唾液酸化的20，30，40，45，50，55，60，70，80或90%以上可以是α 2， 3-唾液酸化。所述rhCG (或rhCG制剂)可以以全部唾液酸化的45%-80%的量，例如全部唾液酸化的50% -70%，例如全部唾液酸化的55% -65%的量包括α 2,3-唾液酸化。所述 rhCG (或rhCG制剂)可以以全部唾液酸化的65-85%的量，例如全部唾液酸化的70-80%， 例如全部唾液酸化的71-79%的量包括α 2，3_唾液酸化。本发明的rhCG (或rhCG制剂) 的全部唾液酸化的50%以下可以是α 2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的45，40，30， 20，10，5%以下可以是(12，6-唾液酸化。所述^^6(或^^6制剂)可以以全部唾液酸化的 20-55%的量，例如全部唾液酸化的30-50%，例如全部唾液酸化的35-45%的量包括α 2， 6-唾液酸化。所述rhCG(或rhCG制剂)可以以全部唾液酸化的15-35%的量，例如全部唾液酸化的20-30%，例如全部唾液酸化的21- %的量包括α2，6_唾液酸化。本发明的 rhCG(或rhCG制剂)的全部唾液酸化的5%以下可以是α2，8_唾液酸化。例如，全部唾液
6酸化的2. 5%以下可以是α 2，8-唾液酸化。所述rhCG (或rhCG制剂)可以以全部唾液酸化的0到4%，例如全部唾液酸化的0. 1_4%，例如全部唾液酸化的0. 5-3%，例如全部唾液酸化的0. 5-2. 5%的量包括α 2,8-唾液酸化。本发明的rhCG(或rhCG制剂)可以不具有 α 2,8-唾液酸化。唾液酸化，意味着在hCG糖结构上存在着唾液酸残基的量。α 2，3-唾液酸化意味着在2，3位置处的唾液酸化(如本领域中公知的)和α 2，6唾液酸化意味着在2， 6位置处的唾液酸化(也在本领域中公知的)。因此，“全部唾液酸化的％可以是α 2，3唾液酸化”指在2，3位置处被唾液酸化的hCG中存在的唾液酸残基总数的％。术语“全部唾液酸化的％是α 2，6-唾液酸化”指在2，6位置处被唾液酸化的hCG中存在的唾液酸残基总数的％。根据本发明的rhCG(或rhCG制剂)可以具有6质量％以上(例如，6质量％-15 质量％，例如，7质量％-13质量％，例如，8质量％-12质量％，例如，11质量％-15质量％， 例如，12质量％ -14质量％ )的唾液酸含量(每个hCG分子唾液酸化的量)(基于蛋白质的质量，而不是蛋白质加上糖的质量)。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的重组hCG仅包含α 2，3唾液酸化。本发明的rhCG可以在人细胞系中生产或表达。其可以简化生产方法(并使其更有效)，因为操作和控制例如细胞生长培养基以维持唾液酸化与已知方法相比可能是较不关键的。所述方法也可以是更有效的，因为与已知rhCG产品的生产比较，有更少量碱性rhCG 产生；产生更多的酸性rhCG并且分离/去除碱性hCG是较不成问题的。rhCG可以在Per. C6细胞系、Per. C6来源的细胞系或修饰的Per. C6细胞系中生产或表达。所述细胞系可以使用α 2，3-唾液酸转移酶进行修饰。所述rhCG可以包含由[细胞系]的内源唾液酸转移酶活性提供的α 2，6-连接的唾液酸(α 2，6唾液酸化)。备选地，或另外地，所述细胞系可以使用α 2，6-唾液酸转移酶修饰。所述rhCG可以使用α 2，3_唾液酸转移酶产生。rhCG可以包含由内源唾液酸转移酶活性提供的α 2，6-连接的唾液酸(02，6唾液酸化)。所述rhCG可以使用02，3_和/ 或α 2，6-唾液酸转移酶产生。根据本发明，在另一方面，提供产生如本文所述的rhCG和/或rhCG制剂的方法 (根据本发明的各方面)，所述方法包含在人细胞系中生产或表达rhCG的步骤，所述人细胞系例如Per. C6细胞系、Per. C6来源的细胞系或修饰的Per. C6细胞系，例如已经用α 2， 3-唾液酸转移酶修饰的细胞系。所述rhCG结构包含聚糖结构部分。可以发生分支作用，结果是聚糖可以具有 1，2，3，4或更多个末端糖残基或“触角”，如本领域中众所周知的。本发明的rhCG可以具有聚糖，其中唾液酸化存在于单-触角和/或二触角和/或三触角和/或四触角的结构上。rhCG可以包含单唾液酸化的，二唾液酸化的，三唾液酸化的和四唾液酸化的聚糖结构，例如具有如下的相对量0. 1-4%单唾液酸化；35-45% 二唾液酸化；0. 5-8%三唾液酸化和0-1 %四唾液酸化(例如，如通过带电荷的聚糖的WAX分析所显示，如在实施例 8D中所显示)。优选地，本发明的重组hCG包括单(1S)、二(2S)、三(3S)和四0S)唾液酸化的结构。优选地，唾液酸化的结构的相对量在下述比率内(is 2S 3S 4S) 0. 2-1% 35-40% 2. 5-7% 0. 5-1% (例如，如通过带电荷的聚糖的WAX分析所显示， 如在实施例8D中所显示)。
根据本发明，在另一方面，提供在人细胞系中产生的(例如表达的)rhCG。所述 rhCG可以包括α 2，3-和α 2，6_唾液酸化。可以在Per. C6细胞系、Per. C6来源的细胞系或修饰的Per.C6细胞系中生产或表达rhCG。可以使用α 2，3-唾液酸转移酶修饰所述细胞系。rhCG可以包含由[细胞系]的内源唾液酸转移酶活性提供的α2，6_连接的唾液酸 (α2，6唾液酸化)。备选地或另外地，可以使用α 2，6_唾液酸转移酶修饰细胞系。根据本发明的rhCG(或rhCG制剂)可以具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]，例如15mol/mol至25mol/mol，例如17mol/mol至24mol/mol，例如 17. 7mol/mol 至 23mol/mol，例如 18mol/mol 至 22mol/mol，例如 19mol/mol 至 21mol/mol， 例如19mol/mol至20mol/mol。rhCG(或rhCG制剂)的全部唾液酸化的10%以上可以是 α 2,3-唾液酸化，例如全部唾液酸化的45% -80%可以是α 2,3-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的50% -70%可以是α 2，3_唾液酸化，例如，全部唾液酸化的55_65%可以是α 2， 3-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的65-85%可以是α2，3-唾液酸化。本发明的rhCG(或 rhCG制剂)的全部唾液酸化的50%以下可以是α2，6-唾液酸化。例如全部唾液酸化的 20-55%可以是α 2，6-唾液酸化，例如，全部唾液酸化的30-50%可以是α 2，6_唾液酸化， 例如，全部唾液酸化的35-45%可以是α2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的15_35%可以是α2，6-唾液酸化。本发明的rhCG(或rhCG制剂)的全部唾液酸化的5%以下可以是 α 2，8-唾液酸化，例如全部唾液酸化的0-4%，例如0. 5-4%可以是α 2，8_唾液酸化。本发明的rhCG (或rhCG制剂)可以不具有α 2，8-唾液酸化。根据本发明，在另一方面，提供包含含有α 2，3-唾液酸化和α 2，6_唾液酸化的 rhCG(例如，如上提及)的药物组合物。所述药物组合物还可以包含FSH和/或LH。可以通过本领域已知的任何方式获得FSH。在本文中使用的FSH包含人来源的和重组FSH。可以通过本领域已知的任何方法从任何适当来源(例如，尿)纯化人来源的FSH。 所述FSH可以是重组FSH-例如，在人细胞系中表达的FSH。表达和纯化重组FSH的方法是本领域中众所周知的。LH可以通过本领域中已知的任何方法获得。LH，如本文所用，包含人来源的和重组 LH。可以通过本领域已知的任何方法从任何适当的来源(例如，尿)纯化人来源的LH。表达和纯化重组LH的方法是本领域中已知的。所述药物组合物可以用于治疗不育，例如，用于在例如辅助生殖技术(ART)，排卵诱导或宫内人工受精(IUI)中。所述药物组合物可以例如用于这样的医学适应证，在所述适应证中使用已知hCG制剂。本发明还提供本文所述的rhCG和/或rhCG制剂(根据本发明的各方面)用于制备治疗不育的药物的应用。可以将本发明的药物组合物配制为用于任何药物施用途径的众所周知的组合物，所述药物施用途径例如口服、直肠、肠胃外、透皮(例如，贴片技术)、静脉内、肌内、皮下、intrasusternal、阴道内、腹膜内、局部(粉末、药膏或滴剂)或作为含服剂或鼻喷雾剂。典型的组合物包含药用载体，如水溶液、无毒性赋形剂， 包括盐和防腐剂，缓冲剂等，如在雷明顿药物科学第15版(Remington，s Pharmaceutical Sciences fifteenth edition,Matt 出版公司，1975)，在 1405-1412 和 1461-87 页中，以及在国家药典(national formulary)XIV第 14版(美国药物协会(American Pharmaceutical Association)，1975)中所述。适合的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，羧甲基纤维素及其适合的混合物，植物油(如橄榄油)， 和可注射的有机酯如油酸乙酯。本发明的组合物还可以包含添加剂如，但不限于防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散齐U。可以包含抗细菌剂和抗真菌剂以防止微生物的生长，并且包括，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含等张剂如糖、氯化钠等可能是合乎需要的。在一些情形中，为了实现延长的作用，需要延缓自皮下或肌内注射的hCG (和其它活性成分，如果存在的话)的吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液体混悬液来实现。hCG吸收的速率于是取决于其溶出速率，其又可以取决于晶体大小和结晶形式。备选地，肠胃外施用的hCG组合形式的延缓吸收通过将所述hCG组合溶解或悬浮在油赋形剂中实现。可注射长效制剂形式可以通过在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成hCG(和其它药剂，如果存在的话)的微胶囊基质来进行制备。取决于hCG与聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性质，可以控制hCG释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚(原酸酯)，聚(酐)等。可注射的长效制剂也通过将hCG包埋在脂质体或微乳中进行制备，所述脂质体或微乳可与机体组织相容。可注射制剂可以例如通过经过留住细菌(bacterial-retaining)的滤器进行过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌，所述无菌固体组合物可以溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中，之后立即使用。可以将可注射制剂提供在任何适合的容器中，所述容器例如小瓶、预先填充的注射器、注射药筒等。可注射制剂可以作为这样的产品供应，所述产品具有包含hCG的药物组合物(任选地具有FSH，LH等)。如果存在超过一种活性成分(即hCG，和例如FSH或LH)，这些可以适合于单独或在一起施用。如果单独施用，施用可以是先后的。所述产品可以在任何适合的包装中供应。例如，产品可以包含许多含有hCG，FSH，或FSH和hCG的组合的预先填充的注射器，在泡眼包装或其它装置里包装注射器以保持无菌。产品可以任选地包含使用所述 hCG和FSH制剂的说明书。根据本领域中的常规实践调整药物组合物各种成分的pH和提取物浓度。见 GOODMAN 禾口 GILMAN，s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES (治疗剂的药理学基础)，第7版。在优选的实施方案中，本发明的组合物作为用于肠胃外施用的组合物供应。制备肠胃外制剂的一般方法是本领域中已知的并且在REMINGTON ;THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(雷明顿药物科学和实践)，同上文，第780-820页中描述。肠胃外组合物可以以液体制剂或作为固体供应，所述固体与无菌可注射介质混合，之后立即施用。 在尤其优选的实施方案中，肠胃外组合物以易于施用和均一剂量的单位剂型供应。发明详述现在参照下面的实施例和附图更详细地描述本发明，在附图中

图1显示phCG α/β表达载体的质粒图谱；图2显示α 2，3-唾液酸转移酶(ST3GAL4)表达载体；图3显示α 2，6-唾液酸转移酶(ST6GAL1)表达载体；图4显示与现有技术的制剂(泳道1，2)相比较，通过用考马斯蓝染色的IEF在人细胞系来源的重组hCG制剂(泳道3，4)中检测rhCG同种型；
图5显示α 2，3-唾液酸转移酶改造的Per. C6hCG样品的代谢清除率(MCRs)；和图6显示α 2，3_唾液酸转移酶改造的Per. C6rhCG样品的长效MCRs。序列选择人舰根据Fiddes和Goodman (1979)使用hCG α多肽的基因编码区。该序列登记为 ΑΗ007338，并且在构建时，不存在该蛋白序列的其它变体。该序列在本文中称为SEQ ID 1。根据Fiddes和Goodman (1980)使用hCGi3多肽的基因编码区。所述序列登记为 NP_000728，并且与CG0 3、CG0 5和CG0 7的蛋白序列相一致。该序列在本文登记为SEQ ID 2。睡液酸转移酶α 2，3_唾液酸转移酶-根据Kitagawa和Paulson(1994)使用β-半乳糖苷 0-2，3-唾液酸转移酶4(0 2，3-唾液酸转移酶，513641^4)的基因的编码区。该序列登记为 L23767，并且在本文称为SEQ ID 3。α 2，6-唾液酸转移酶-根据Grundmarm等(1990)使用β -半乳糖酰胺 (galactosamide) α-2，6_唾液酸转移酶1 ( α 2，6_唾液酸转移酶，ST6GAL1)的基因编码区。 该序列登记为ΝΜ_003032并且在本文称为SEQ ID 4。
实施例实施例IhCG表达载体的构建分别使用引物组合CGa-fw与CGa_rev和CGb_fw与CGb_rec，通过PCR扩增hCG α 多肽(ΑΗ007338, SEQ ID 1)禾口 hCG3 多肽(NP_000728，SEQ ID 2)的编码序列。CGa-fw 5， -CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3，CGa-rev 5’ -GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3，CGb-fw 5’ -CCAGGCGCGCCACCATGGAGATGTTCCAGGGGCTGC-3’CGb-rev 5’ -CCGGGTTAACTTATTGTGGGAGGATCGGGG-3’将得到的扩增hCG β DNA用限制性酶AscI和HpaI消化，并将其插入在携带新霉素选择标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体的AscI和HpaI位点中。类似地，将hCG α DNA用 BamHI和NheI消化，并将其插入到在已经包含hCGi3多肽DNA的表达载体上的位点BamHI 禾口 NheI中。将载体DNA用于转化大肠杆菌(E. coli)的DH5 α菌株。挑取菌落用于扩增，并且从包含含有hCGa和β两者的载体的数目中选择20个用于测序。选择用于测序的所有菌落包含正确的按照SEQ ID 1和SEQ ID 2的序列。选择质粒phCGA+B用于转染(图1)。实施例2ST3表达载体的构建使用引物组合2，3STfw和2，3STrev，通过PCR扩增β -半乳糖苷α_2，3_唾液酸转移酶4(ST3，L23767，SEQ ID 3)的编码序列。2,3STfw 5， -CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3，2,3STrev 5， -TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3，将得到的扩增的ST3 DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化，并将其插入在携带潮霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。将所述载体如前述扩增，并且测序。克隆pST3#l(图2)包含正确的根据SEQ ID 3的序列，并选择其用于转染。实施例3ST6表达载体的构建使用引物组合2，6STfw和2，6STrev，通过PCR扩增β -半乳糖酰胺α _2，6_唾液酸转移酶1(ST6，NM_003032，SEQ ID 4)的编码序列。2,6STfw 5， -CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3，2,6STrev 5， -TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3，将得到的扩增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化，并将其插入携带潮霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。将所述载体如前述扩增并且测序。克隆pST6#ll(图3)包含正确的根据SEQ ID 4的序列，并选择其用于转染。实施例4phCG A+B在PER. C6细胞中的稳定表达。转染分离和克隆的筛选。通过在单一质粒中表达hCG的两个多肽链产生生产hCG的Per. C6克隆(见实施例1)。为了获得稳定的克隆，与phCGA+B构建体一起使用基于脂质体的转染试剂。在补充了 10% FCS并包含G418的Per. C6选择培养基中选择稳定的克隆。在转染后三周，长出 G418抗性克隆。选择共389个克隆用于分离。在选择培养基中培养分离的克隆直到70-80% 汇合。使用hCG选择性ELISA测定上清液的hCG蛋白含量，并且使用cAMP积累测定法(CAMP accumulation assay)，在克隆的细胞系中测定关于hCG受体的药理学活性。表达功能蛋白的克隆(118)进一步培养扩增到M孔、6孔和T80烧瓶中。在产生足量的物质的T80烧瓶中开始关于确定来自47个克隆的物质的生产率和质量的研究。在如前述的补充培养基中培养细胞7天，并且收集上清液。使用hCG选择性 ELISA测定生产率。确定所述物质的等电情况(使用实施例6所述的方法)。将来自IEF 的信息用来选择用于代谢清除率分析的克隆。关于唾液酸转移酶改造，选择具有足够生产率和质量的克隆。实施例fe唾液酸化水平在过量表达α 2，3-唾液酸转移酶的细胞中增加。pST3在表达hCG的PER. C6细胞中稳定表达；转染分离和克隆筛选。通过从在已经表达hCG的两个多肽链的Per. C6细胞(见实施例4)中的各个质粒 (见实施例2、表达α 2，3唾液酸转移酶来产生生产高度唾液酸化hCG的Per. C6克隆。针对它们的性质，所述性质包括生产率，良好生长情况，功能蛋白的产生，和产生的包含一些唾液酸化的hCG，选择在实施例4中提及的由PER.C6 细胞产生的克隆。如前在实施例4中所述产生稳定的克隆。分离来自α 2，3-唾液酸转移酶程序的克隆，将其扩增并测定。用于α 2，3_研究的最终克隆数是5个。α 2，3_唾液酸转移酶克隆适合无血清培养基和悬浮条件。如前，使用hCG选择性ELISA，在hCG受体细胞系中的功能反应，IEF (实施例6)，测定克隆。它们还进行代谢清除率(实施例9)和USP hCG生物测定(实施例10)评估。将结果与商购重组hCG(0vitrelle，Serono)和亲代hCG Per. C6细胞系进行比较。将代表性样品显示在实施例和附图中。总之，与仅表达hCG的细胞比较，在Per.C6细胞中hCG与α 2，3_唾液酸转移酶一起的表达导致增加水平的唾液酸化的hCG。实施例恥在表达hCG的PER. C6细胞中稳定表达pST3―― —种不同的方法上述产生的α β异型二聚体(实施例4)具有导致非常基本的IEF模式的低水平唾液酸化。如上所示(实施例如)，与仅表达hCG的细胞比较，在Per.C6细胞中hCG与α 2， 3-唾液酸转移酶一起的表达导致增加水平的唾液酸化的hCG。双重转染hCGa和β亚基基因与a 2，3唾液酸转移酶基因到混悬的细胞培养形式的Per. C6细胞中。通过在无血清条件下共转染hCG载体(双α / β，实施例1)和编码α 2，3_唾液酸转移酶的载体(实施例幻而产生细胞系。针对它们的性质，所述性质包括生产率，良好生长情况，功能蛋白的产生，和产生的包含一些唾液酸化的hCG，选择由 PER.C6 细胞产生的克隆。分离、扩增和测定克隆。如前，使用hCG选择性ELISA，在hCG受体细胞系中的功能反应，IEF (实施例6)，测定克隆。它们还进行代谢清除率(实施例9)和USP hCG生物测定(实施例10)评估。将结果与商购重组hCG(0vitrelle，Serono)和亲代hCG Per. C6细胞系进行比较。将代表性样品显示在实施例和附图中(见实施例6，9，10，附图4和5)。与不与a 2，3-唾液酸转移酶表达的hCG和Ovitrelle相比，由所述克隆产生的重组hCG(即，根据本发明的重组hCG) 具有显著提高的唾液酸化(即，平均更多的具有大量唾液酸的hCG同种型)(见实施例6和 8，附图4)。实施例6通过等电聚焦分析Per. C6产生的hCG同种型的等电点pi。电泳定义为带电荷的分子通过电场经过溶剂的转运。生物分子经过电场的移动性将取决于场强、分子上的净电荷、分子的大小和形状、离子强度和分子迁移经过的介质的性质。等电聚焦(IEF)是基于它们的pi分离蛋白质的电泳技术。Pl是这样的pH，在所述PH蛋白质不带净电荷并在电场中不会迁移。hCG同种型的唾液酸含量精细地改变每种同种型的Pl点，其可以使用这种技术研究以显现来自每种克隆的Per. C6hCG同种型。使用等电聚焦分析在细胞培养物上清液中的Per. C6产生的hCG同种型的等电点。 如在实施例4、fe和恥中所述产生来自Per. C6hCG克隆的细胞培养基。在两性电解质溶液pH 3. 0-7. 0中，在pH 3. 0-7. 0梯度的天然条件下，在包含5% 聚丙烯酰胺的Novex IEF凝胶上分离Per.C6hCG样品。蛋白使用本领域公知方法用考马斯蓝染色显现。图4显示，根据本发明的组合物(泳道3，10 μ g，和泳道4，15 μ g)和现有技术CHO 来源的组合物 Ovitrelle (泳道 1，Ovitrelle, 10 μ g,和泳道 2，Ovitrelle, 15 μ g)，通过考马斯蓝染色的IEF检测rhCG同种型。条带代表包含不同数量唾液酸分子的hCG的同种型。使用这种方法，鉴定产生具有更多数量唾液酸分子的hCG同种型的克隆。图4显示， 用a2，3-唾液酸转移酶改造的人细胞系来源的重组hCG(根据本发明的组合物)具有比 Ovitrelle更加酸性的模式。实施例7Per. C6hCG的唾液酸连接的分析使用基于凝集素的聚糖区分方法分析复合糖。使用这种方法，可以表征与硝基纤维素结合的糖蛋白和复合糖。凝集素选择性识别特定结构部分，例如a2，3连接的唾液酸。 使用的凝集素与类固醇半抗原洋地黄毒苷缀合，这使得能够进行结合的凝集素的免疫学检测。使用标准SDS-PAGE技术分离来自亲代克隆(没有另外的唾液酸转移酶)和α 2， 3-唾液酸转移酶改造的克隆的纯化的Per. (HiCG。将商购重组hCG (Ovitrelle，Serono)用作标准物。根据制造商的说明书，使用DIG聚糖区分试剂盒(目录号11 210 238001，罗氏)分析唾液酸。与黑接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)的阳性反应指示末端连接 (2-6)唾液酸。与朝鲜槐(Maackia amurensis)凝集素II (MAA)的阳性反应指示末端连接(α 2-3)的唾液酸。简言之，亲代克隆包含低水平的α 2，3-和α 2，6_唾液酸两者。用α2，3_唾液酸转移酶改造的克隆包含高水平的α 2，3-唾液酸连接和低水平的α2，6_唾液酸连接。标准对照Ovitrelle仅包括α 2，3_唾液酸连接。这与关于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的重组蛋白已知的情况是一致的(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等·，1990)。结论为，用α 2，3-唾液酸转移酶改造Per. C6hCG细胞成功地增加与样品中重组 hCG缀合的唾液酸分子的数量。实施例8A和8B总唾液酸量化唾液酸是被认为是单糖的蛋白结合的糖并且与其它单糖如半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺和岩藻糖组合存在。使用基于Manton等的方法(J. Biochem. Biophys. Methods.(生物化学生物物理学方法杂志)30 (1995)，37-48)的方法，测量根据本发明纯化的rhCG上的总唾液酸。实施例8A测量用α 2，3-唾液酸转移酶修饰的Per. C6重组hCG (例如，实施例，实施例恥) 的总唾液酸含量，并且发现其大于15m0l/m0l[以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]，例如大于18mol/mol，例如大于19. lmol/mol。这可以与Ovitrelle相比较，Ovitrelle 的总唾液酸含量为17. 6mol/moL·实施例8B测量用α 2，3-唾液酸转移酶080019-19修饰的Per. C6重组hCG (通过上述实施例 5a的方法制备)的总唾液酸含量，并且发现其为20mOl/mOl [以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]。同样地，这可以有利地与Ovitrelle相比较，Ovitrelle的总唾液酸含量为17. 6mol/moL·检测该实例(080019-19)来定量α2，3禾口 α2，6唾液酸的相对量(实施例 8C)。实施例8C α 2，3和α 2，6唾液酸的相对量的量化使用已知技术-具有正常相(NP)的HPLC，测量α 2，3和α 2，6唾液酸在纯化的 rhCG[实例(080019-19)，和由实施例5的方法制备的另两个实例]上的相对百分比量。为了定量在0-连接聚糖中的α 2，3和2，6-唾液酸，进行下述分析。将0_连接的聚糖用Orela聚糖释放试剂盒从hCG样品上分解，并在NP-HPLC上分离。将提取、合并的聚糖(如上提取)的样品用不同的唾液酸酶消化以确定连接。使用α2，3，6，8唾液酸酶和 α 2，3唾液酸酶进行聚糖的酶降解。然后，将酶消化的聚糖在NP柱上重新分离，使用准备的标准，在NP-HPLC上鉴定0-聚糖。计算相对百分数，并且显示在下表中(SA=唾液酸)。
权利要求
1.重组hCG(rhCG)，其包含α2，3_和α 2，6_唾液酸化。
2.根据权利要求1的重组hCG，其具有15m0l/m0l以上的唾液酸含量，所述唾液酸含量以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示。
3.根据权利要求1或权利要求2的重组hCG，其具有15m0l/m0l至25m0l/m0l的唾液酸含量。
4.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其中全部唾液酸化的10%以上是α2，3_唾液酸化和/或其中全部唾液酸化的50%以下是α 2,6-唾液酸化。
5.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其中全部唾液酸化的45%-80%是α2， 3-唾液酸化。
6.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其中全部唾液酸化的20%-55%是α2， 6-唾液酸化。
7.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其还包含α2，8-唾液酸化。
8.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其中所述唾液酸含量是按质量计算6%以上。
9.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其在人细胞系中生产或表达。
10.根据前述权利要求中任一项的重组hCG，其在Per.C6细胞系，Per. C6衍生的细胞系或修饰的Per. C6细胞系中生产或表达。
11.根据权利要求9或10的重组hCG，其中所述细胞系已经使用α2，3_唾液酸转移酶进行修饰。
12.根据权利要求9-11中任一项的重组hCG，其包含由内源唾液酸转移酶活性提供的 α 2，6-连接的唾液酸(02，6唾液酸化)。
13.在人细胞系中表达的重组hCG。
14.一种重组hCG制剂，其包含α 2，3-和α 2，6_唾液酸化。
15.一种包含rhCG的药物组合物，所述rhCG包含α 2，3_唾液酸化和α 2，6_唾液酸化。
16.根据权利要求13的重组hCG或根据权利要求14的制剂或根据权利要求15的药物组合物，其包含15m0l/m0l以上的唾液酸含量，所述唾液酸含量以唾液酸摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示，任选地其中全部唾液酸化的10%以上是α 2，3-唾液酸化和/或任选地其中全部唾液酸化的50%以下是α 2，6-唾液酸化。
17.一种药物组合物，其任选地用于治疗不育，其包含根据权利要求1-13或16中任一项的rhCG和/或根据权利要求14或16的制剂，任选地还包含FSH和/或LH。
18.一种治疗不育的方法，其包括向受试者施用包含根据权利要求1-13或16中任一项的rhCG的组合物，和/或根据权利要求14或16中任一项的制剂，和/或根据权利要求15 或17中任一项的药物组合物的步骤。
19.根据权利要求1-13或16中任一项的rhCG和/或根据权利要求14或16中任一项的rhCG制剂在制备用于治疗不育的药物中的应用。
20.一种生产根据权利要求1-13或16中任一项的rhCG和/或根据权利要求14或16 中任一项的rhCG制剂的方法，所述方法包括在人细胞系中生产或表达所述rhCG的步骤。
21.根据权利要求1-13或16中任一项的重组hCG，其包含单(IS)、二(2S)、三(3S)和四GS)唾液酸化的结构。
22.根据权利要求22的重组hCG，其中唾液酸化的结构的相对量在下述比率内 (1S 2S 3S 4S) 0. 2-1 35—40 2.5—7 0.5—1。
全文摘要
包含重组hCG(rhCG)的制剂。
文档编号C07K14/59GK102549011SQ201080044470
公开日2012年7月4日 申请日期2010年10月4日 优先权日2009年10月5日
发明者丹尼尔·普拉克辛, 伊恩·科廷厄姆, 理查德·博伊德·怀特 申请人:辉凌公司