专利名称：用于生化分析、诊断和治疗的具有可变物理结构的热敏聚合物载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及热敏聚合物，该热敏聚合物可以通过封装的磁性和/或金属胶体的磁感应被加热，从而产生其物理结构或形状改变。其中伴随加热的形状改变用以生产可控药物库(drug depot)、NMR诊断的对比强化介质、可操纵的微型工具，作为阻塞血管的装置和作为薄膜生产过程中的可控的生孔物质。
本发明涉及各种几何形状和颗粒尺寸的聚合物载体，其中磁性和/或金属物质或含有胶体的磁性和/或金属核心聚合物被聚合，该聚合物载体可通过引入热量或在高频、交变磁场下被选择性地加热，导致聚合物载体的物理结构和/或形状的改变，使得所述聚合物载体能够在体内应用。本发明还涉及聚合物载体的生产和用途。
背景技术：
可通过感应加热的磁性聚合物颗粒在各种出版物和专利中都有描述。例如，DE-OS 3502998、DE-OS 4201461、DE-OS 4412651和DE-OS19800294描述了用于肿瘤治疗、艾滋病治疗以及用于分子生物学的可感应加热的磁性聚合物颗粒。
Jordan等(J.Magnet.Mag.Mat.，Vol.225，118，2001以及Int.J.ofHyperthermia，Vol 9，51，1993)在肿瘤的高温治疗中采用了可被感应加热的各种的涂覆磁性胶体。Mitsumori等(Int.J.of Hyperthermia，Vol.10，785，1994)和Masuko等(Biol.Pharm.Bull.，Vol.18，1802，1995)以相似的方式采用可通过感应加热的磁性颗粒和磁性脂质体使肿瘤细胞过热(高温)美国专利US 4,735,796和4,662,359描述了同样用于肿瘤治疗方面的高温处理的磁性颗粒。
此处引用的介质和方法的共有特征是磁感应单独用于加热颗粒，以通过过热处理消灭细胞或生物有机体。已知的载体不能借助于感应实现聚合物载体的物理结构或形状的改变。
优选用于分析、诊断或医学目的的磁性微颗粒和纳米级颗粒通常通过专利PCT/WO 97/04862、PCT/WO 89/11154、PCT/WO 92/22201、PCT/WO 90/07380、PCT/WO 99/62079和美国专利US6,020,210，5,141,740，4,827,945，4,647,447，3,917,538，4,628,037，4,827,945，4,861,705，4,169,804，4,115,534，4,345,588，4,070,246，3,970,518，4,230,685，4,654,267，4,452,773，4,369,226，4,357,259，4,861,705，4,247,406，4,267,234，3,652,761，4,675,173为人们所知，它们附在本文件中作为参考文献。葡聚糖、琼脂糖、糊精、白蛋白、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚戊二醛、琼脂糖-聚戊二醛复合物、脂质体、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯醛、蛋白质和聚氧化乙烯在前述方法和产品中被用作聚合物基质，在生化-医学分析和诊断方面中，它们能够按照亲和原理通过耦联生物配体和/或受体以抗原、抗体、蛋白质、细胞、DNA片断、病毒或细菌的形式来结合分析物。
涂有不同聚合物的磁性颗粒及其在生物医学领域中的应用的进一步综述在“Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers”，Hfeli等，由Plenum Press出版，New York，1997中有记载。
所有前述产品的共同特征是，它们的功能都无一例外地来自于结合到基质的生物配体或受体与要分析的物质的互补作用。因此，它们的应用领域局限于利用亲和原理分离和分析生物分子或特定细胞的标记的已知领域。这里作为参考引用的磁性聚合物载体也与根据本发明的介质不同，由于它们的化学结构，它们不是热敏的，即，它们不能基于外部热激发而改变它们的物理结构或几何形状。而这一特性是将聚合物载体用作可操作或可控的微米或纳米级载体和/工具的基本条件。
具有热敏特性的最常用的聚合物是聚-N-异丙基丙烯酰胺，一种在27℃以上的温度下发生显著收缩的凝胶样聚合物。这一收缩是可逆的，即，如果冷却到30℃以下，聚合物几乎恢复其原始形状。聚-N-异丙基丙烯酰胺的该特殊特性和基于此的有意义的应用，如作为药物库、生物传感器、细胞培养基、细胞封装基质、促动器或阀门，已久为人知，并在数个出版物和专利中记载。
N-异丙基丙烯酰胺或与如丙烯酸、甲基丙烯酸、聚氧化乙烯或壳聚糖的共聚物的聚合和溶胀特性，及与硅橡胶和聚乙烯醇接枝共聚合作用记载在Park和Hoffman，J.Biomed.Mat.Res.，Vol.24，21，1990，Zhang等，Langmuir，Vol.18，2013，2002，Lee和Chen，J.Appl.PolymerSci.，Vol.82，2478，2001，Zhu和Napper，Langmuir，Vol.16，8543，2000，Li等，Radiat.Phys.Chem.，Vol.55，173，1999，Zhang和Zhuo，Eur.Polym J.，Vol.36，2301，2000，Serizawa等，Macromolecules，Vol.35，10，2002，Kanazawa等，Anal.Sci.，Vol.18，45，2002，Asano等，Polym.Gels &Network，Vol.3，281，1995，Sayil和Okay，Polym.Bull.，Vol.45，175，2000，Xue等，Polymer，Vol.42，3665，2001，Maolin等，Radiat.Phys.Chem.，Vol.57，481，2000，以及Ebara等，J.Appl.Polymer Sci.，Vol.39，335，2001中。作为基础聚合物的聚-N-异丙基丙烯酰胺的相应纳米颗粒(nano-particle)或微颗粒(microparticle)记载在Gan和Lyon，J.Am.Chem.Soc.，Vol.123，7517，2001，Wang等，J.Am.Chem.Soc.，Vol.123，11284，2001，Gilányi等，Langmuir，Vol.17，4764，2001，West和Halas，Curr.Opinion.Biotechn.，Vol.11，215，2000，Matsuoka等，Polym.Gels &Networks，Vol.6，319，1998以及Jones和Lyon，Macromolecules，Vol.33，8301，2000中。
Kondo和Fukuda，J.Ferment.Bioeng.，Vol.84，337，1997的工作的主题是含有磁性纳米级颗粒的N-异丙基丙烯酰胺共聚物。然而，其中所描述的过程既没有提供清楚的磁性颗粒封装，也没有提供球形颗粒。Kondo等Appl.Microbiol.Biotechn.，Vol.41，99，1994描述了在与聚-N-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸共聚物的费时的两阶段聚合过程中封装的磁性聚苯乙烯聚合物。这一产品只适于分离的抗体。也是本发明的主题的与其感应控制释放活性剂有关的活性剂的应用却不能通过这两种产品实现。
美国专利US 4,832,466，6,165,389，6,187,599，5,898,004，5,854,078，6,094,273，6,097,530，5,711,884和6,014,246公开了以利用聚-N-异丙基丙烯酰胺纳米级颗粒的过滤器或开关等形式的热敏光学系统。
美国专利US 20020032246，20020031841，20010026946其中描述了基于N-异丙基丙烯酰胺的热敏水凝胶等，用于大分子分离，用于分析物的比色检测或作为测定化合物的传感器。
美国专利US 5,674,521，5,441,732，5,252,318，5,599,534，5,618,800和5,840,338中提到了其中选自例如N-异丙基丙烯酰胺、羟烷基纤维素、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、烷基纤维素、聚氧化乙烯嵌段共聚物、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、乙二胺热敏和pH值敏感的聚合物凝胶，例如作为用于生物活性物质的载体。
美国专利US 5,939,485的主题为互相渗透的聚合物网络的温度和pH值敏感的聚合物，其中包括丙烯酸酯、丙烯酰胺、尿烷或甲基丙烯酸酯和聚氧化乙烯或聚氧化丙烯的嵌段共聚物。
美国专利US 5,998,588描述了用于化验或分离的对光、温度和pH值敏感的聚-N-异丙基丙烯酰胺的交互刺激-反应分子共轭物。
美国专利US 5,753,261，5,226,902和5,053,228中也公开了作为药物库的pH值、光和温度敏感的脂质覆盖微粒及N-取代的聚丙烯酰胺的微粒和脂质体。
美国专利US 5,013,669中公开了人造纤维、纸、聚丙烯酰胺和球蛋白质(agarose bead)等多孔载体介质作为检测分析物的固相载体。
美国专利US 4,783,409的主题是固定于具有可逆溶解性的丙烯酸酯载体的酶类。
美国专利US 4,780,409公开了使用聚-N-异丙基丙烯酰胺共聚物的热诱导的相分离免疫测定法以检测药物、激素、维生素类、蛋白质、代谢物、细胞、病毒、微生物和抗体。
美国专利US 4,752,638和4,609,707公开了在免疫测定方面以及用于分析目的基于N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的抗体-聚合物共轭物的合成和应用。
美国专利US 4,912,032的主题是其中能够释放活性剂的含有受体、抗体、蛋白质、药物或核酸的温度敏感聚-N-异丙基丙烯酰胺或聚-N-异丙基丙烯酰胺共聚物。
美国专利US 5,451,411描述了藻酸盐颗粒作为口服药物库。
美国专利US 6,160,084的主题是可生物降解的形状记忆聚合物，由硬聚合物片段和软聚合物片段组成并且其原始形状可通过加热到玻璃化温度以上而被恢复。
这里列出的作为参考的所有介质具有一共同点，即，在有非磁性聚合物载体的情况下，物理结构或形状的改变仅可通过从外部直接施加的热而触发，而在磁性载体的情况下，它们的结构不能通过外部激发也不能通过外部施加能量以任何方式改变。而且，对于本领域的技术人员公知的“刺激-反应”载体要么是不规则的纳米级颗粒，要么是较大体积质量的聚合物，不适于作活性剂(药物)的载体，作为在NMR诊断(磁共振断层扫描)中的对比介质，作为分子分离的介质或作为在体内应用的可控微型工具。
发明内容
本发明的目的是提供以纳米级或微粒状及其它几何形状的聚合物基质和/或聚合物载体，其可通过一种例如磁感应形式的能量供给被选择性地激发，进而基于由此引起的温度升高，引发聚合物基质的物理结构发生相应的、确定的变化。
“物理结构的改变”的定义在这里被理解为聚合物载体的几何形状、体积或颗粒尺寸的改变。体积的改变可出现在具有聚合物孔径尺寸相应改变或聚合物外形(几何形状)改变的如收缩或溶胀过程中。物理结构的改变也可意指聚合物恢复到原始形状，该原始形状通过加热和冷却方法(冻结法)暂时改变(“形状-记忆-聚合物”)。
由于这些聚合物的相转化温度(也就是“临界溶解温度”)在27-38℃范围内，也就是在体温(37℃)范围内，这些载体仍不能用在体内，因为收缩过程已在该温度下出现和/或该载体不能再被加热。为了使基于聚-N-异丙基丙烯酰胺或N-取代丙烯酰胺的载体可作为治疗、分析和诊断类型活性剂的载体用于体内应用，本发明的进一步目的是将活性剂封装在聚合物载体中，然后在相应的体内给药之后，借助于磁感应选择性地、可控制地应用这些活性剂。
将磁场感应加热与载体物理结构和/或几何形状的相应改变结合应当创造出远远超出以前的聚合载体系统的性能范围。
本发明的目的通过磁感应，也就是通过外部施加的高频交变磁场，加热某些聚合物来解决通过将磁性和/或金属物质封装在聚合物基质中以便可吸收来自磁场的能量并可相应地加热聚合物载体。
根据本发明，此目的也可通过合成基于通过物理结构的改变对热刺激起作用的聚-N-异丙基丙烯酰胺和N-取代的丙烯酰胺的特别的聚合物和共聚物来解决。
生产热敏聚合物载体的最初产品是以铁磁、亚铁磁或超顺磁性纳米级或微粒形式的磁性胶体，该磁性胶体显示出高磁化强度并可在交变磁场中感应加热。用于该目的的优选物质是磁铁矿(Fe3O4)或γ-Fe2O3。这些化合物的生产对于本领域的技术人员来说是公知的Shinkai等，Biocatalysis，Vol.5，61，1991，Kondo等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，Vol.41，99，1994，Khalafalla and Reimers，IEEE Trans.Magn.，Vol.16，178，1980，Lee等，IEEE Trans.Magn.，Vol.28，3180，1992，Buske等，Colloids & Surfaces，Vol.12，195，1984。
未使用任何稳定剂的磁铁矿或γ-Fe2O3胶态分散体已由Kang等公开在Chem.Mater.，Vol.8，2209，l996上。
相似的主要包括磁铁矿(Fe3O4)、氧化铁(Fe2O3)或羟基氧化铁(FeOOH)，并具有5-100nm颗粒尺寸及在NMR诊断中用作造影剂、作为信息存储介质、封装剂或抑制剂或用于细胞标记的磁性胶体可在下面的专利中找到，在这里附上作为参考美国专利US 5,492,814，5,221,322，4,647,447，4,827,945，4,329,241，3,215,572，3,917,538，DE-OS 350 8000，DE-OS 39 33 210，DE-OS 39 33 210，EP 0 275 285，PCT/IL99/00275，EP 0 586 052。
具有上述特性并因而适合在聚合物基质中封装的其它物质包括，如具有通式MOFe2O3的铁素体，其中M是二价金属离子或二价金属离子的混合物或金属镍或钴。
具有各种摩尔比(2∶1，0.5∶1至4∶1)的铁(III)和铁(II)盐溶液形成生产磁铁矿或γ-Fe2O3的基础，然后通过加入碱或加热转化成相应的胶态磁性分散体(“磁性胶体”)。为了阻止由于范德华力而引起的细磁性颗粒的凝聚，可加入表面活性剂，公知的名称为“表面活性剂”，“乳化剂”或“稳定剂”，以实际阻止在水性分散中胶体的沉淀。这些稳定化胶态分散体已知为“铁磁流体”(参见Kaiser and Miskolczy，J.Appl.Phys.，413，1064，1970)。它们也是商业上可得到的(Ferrofluidics Corp.，USA；Advanced Magnetics，USA；Taibo Co，Japan；Liquids Research Ltd.，Wales；Schering AG，Gemany)。
使用的稳定剂是阳离子、阴离子或者非离子物质。适合的化合物包括如烷芳基聚醚硫酸盐、月桂基磺酸酯、烷芳基聚醚磺酸盐、磷酸酯、醇醚硫酸盐、柠檬酸盐、油酸、烷基萘磺酸盐、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸或石油磺酸盐作为阴离子物质，十二烷基三甲基氯化铵作为阳离子表面活性剂，及壬基苯氧基聚缩水甘油、聚乙烯醇、煤油、烷芳基氧化聚乙氧基乙醇、壬酚或聚乙二醇作为非离子物质。公知(见引用的参考文件)由上述制备方法生产的磁性胶体的颗粒尺寸取决于如铁盐比例、碱的浓度、pH值和温度的各种试验参数。
适于本发明介质的磁性胶体均具有5-1000nm的颗粒尺寸，优选10-500nm。这保证磁性胶体在随后的封装在聚合物基质中的过程中以良好分散形式存在。通过选择性、定量加入相应量的适当胶体，该聚合物载体的磁性特性和类似地加热特性可被特别地控制。
在单体配方中该磁性胶体浓度通常为10-30体积％，由此该磁性物质相对于单体相的固体含量一般为5-40重量％，优选10-30重量％。
除磁性胶体之外，作为一种方案，金属胶体也可以被封装在聚合物基质中。在高频交变场中可被感应加热的胶态或良好分散形式的所有金属物质原则上都是合适的。由于根据本发明介质的生理学应用代表现了本发明的一方面，优选使用在生理学上无害的和/或在化学-物理上惰性的那些可被感应加热的金属胶体，包括第8族至第11族的金属(1986年IUPAC定义)，因此由于生物相容性优选使用金、银、钯和铂胶体或相应的粉末。根据本发明用于介质的金属胶体通常具有5-300nm的颗粒尺寸。由于其在可见光区中的特别吸收特性，这些胶体长期在生物分析中用于测定蛋白质和核酸，这些胶体，尤其是金胶体的生产对于本领域的技术人员来说是公知的Ackerman等，J.Histochem.Cytochem.，Vol.31，433，1983，Geoghagen等，J.Histochem.Cytochem.，Vol.24，1187，1977，Wang等，Histochem.，Vol.83，109，1985，Birell等，J.Histochem.Cytochem.，Vol.35，843，1987，Khler等，Sensors &Actuators B，Vol.76，166，2001，Moeremans等，Anal.Biochem.，Vol.145，315，1985，Englebienne，Analyst，Vol.123，1599，1998，and美国专利US6,361,944。如本领域的技术人员所知，它们都是通过相应金属盐的还原或通过金属喷雾方法而生产的。大量的金属胶体或粉末也可从商业得到(Sigma，Aldrich，Fluka)。
金属胶体和相应粉末两者都可用于根据本发明的介质和方法中，在聚合前，这些物质以想要的浓度混和到单体配方中。在聚合物和/或颗粒中金属通常占5-40重量％。
在加入胶体后，使用超声探头或超声浴将胶体-单体混合物短暂地暴露在超声波下以确保胶体的良好分散是有利的。胶体的均匀分布使得热量在聚合物基质中有一相应的更好消散，随之又保证封装的活性剂连续地释放。
N-异丙基丙烯酰胺和/或N-取代的丙烯酰胺，如N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-n-丙基甲基丙烯酰胺、N-异甲基丙烯酰胺、N，N’-乙基甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、丙基甲基丙烯酰胺以及N-丙烯酰基吡咯烷酮或N-丙烯酰基哌啶被用作聚合物基质和纳米级或微粒载体的热敏单体。正如所知道的(参见参考文件)，聚-N-异丙基丙烯酰胺由于其特别的化学结构具有27和38/40℃之间的相转化温度，在超过这一温度时在凝胶体中导致一个清楚的收缩过程。为了生产通常用作5-30％溶液的热敏聚合物，依据聚合物载体的形式和预定的用途而使用两种基本的方法a)在溶液中的自由基聚合；b)在分散状态下的自由基聚合。
后者包括常见的方法如使成珠聚合法、悬浮聚合法、乳液聚合法、喷雾聚合法和沉淀聚合法以生产良好分散的聚合物颗粒。已证明在分散或悬浮聚合中生产根据本发明介质特别有利，其中单体混合物通过与相应胶体一起搅拌而悬浮在不能与水混合的有机相中，并由此进行自由基聚合(“逆向悬浮聚合”)。
在悬浮聚合中使用的这些有机相的例子是公知的Johansson andMosbach，Biochem.Biophys.Acta，Vol.370，339，1974。在这里主要使用如甲苯或苯的芳香烃、氯化烃、脂族烃或矿物和植物油。
令人惊奇的是，具有5-10(cal/cm3)1/2的极性溶解参数的烃被证明特别适于根据本发明的介质和方法，因而被K.L.Hoy引用的溶解参数(″Tables of Solubility Parameters″，Union Carbide Corporation，SouthCharleston，1969)被用作本发明的依据。在本发明使用的例子为1，2-二氯丙烷、1，1，2-三氯乙烷、三氯乙烯、溴三氯甲烷、四氯甲烷、1，1，1，2-四氯乙烷、氯仿、2，3-二氯丙醇、1，2，3-三氯丙烷。
除使用相应的有机溶剂之外，加入一定的表面活性剂物质促进了聚合物颗粒涉及分散性的质量，其例子包括聚氧化乙烯加成物的衍生物、烷基磺基丁二酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酯、聚氧化乙烯丙烯嵌段共聚物、烷基苯氧聚乙氧基乙醇、脂肪醇乙二醇醚磷酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖硬脂酸棕榈酸酯、脂肪醇聚乙二醇酯、聚甘油酯、聚氧乙撑醇、聚氧化乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯和聚氧化乙烯酸，本发明不限于此。为了将由悬浮过程生产的聚合物滴尺寸减小到小于1μm，0.3-15重量％，优选0.5-5重量％的一种或多种表面活性剂通常被加入到分散相中。
这些颗粒尺寸首先是适于在体内的生物医学应用。具有20-200nm大小的颗粒优选作为在DNA诊断中的反差剂，和作为在薄膜中产生可调节的孔的宽度的生孔物质，100-500nm的颗粒特别作为药物库，用于选择性应用活性剂，例如治疗剂、诊断剂或预防剂形式的活性剂。这些颗粒尺寸在体内应用中持久地维持穿透组织的能力。如果以聚-N-异丙基丙烯酰胺颗粒为媒介来设定膜中的确定的孔宽度，则类似的情形也是适用的。通过在无规塑料基质中插入聚N-异丙基丙烯酰胺纳米颗粒，可产生通过感应加热和随后的冷却尺寸在10％-80％之间减小及放大的孔。
分散过程通常使用常规的KPG搅拌机或分散机进行。具有600-1500rmp搅拌速度的常规螺旋桨式搅拌器对于10-500μm的颗粒尺寸是足够的。小于10μm的颗粒尺寸通常通过大于1500rmp的搅拌速度实现。另一方面，对于小于1μm的颗粒尺寸仅需要具有大于2000rmp的混合速度的分散机。所有按照转子-定子原理工作的搅拌器都可用于此目的。在这些高速混合速度下，实验优选在氩或氮气环境或真空下进行，以在很大程度上排除可能永久影响分散质量的空气的介入。
对于特别在生物医学领域的应用，可证明聚-N-异丙基丙烯酰胺均聚物不能单独地用于体内应用。这涉及聚-N-异丙基丙烯酰胺的相转化温度，由于制造原因该温度通常在27-38℃之间。由于该温度已低于正常体温，这意味着已发生了聚合物凝胶物理结构的预期和应用相关的改变。为了使这些特别的特性仍然用于体内应用，令人惊奇地显示出相转化温度可通过N-异丙基丙烯酰胺与含有羧基基团的共聚单体的的共聚合而升高，以致使根据本发明介质的功能可结合感应热被完全地利用。
因此，共聚单体含量在0.02-3mol％之间的纳米和微粒的丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物在高于40℃温度下显示出最大收缩。作为加入部分带电的羧基的结果是该聚合物凝胶的基本的溶胀，以便通常引起凝胶体收缩的疏水相互作用力在升高的温度大大降低。在中性pH条件下38℃放置4分钟后，具有平均颗粒尺寸3.4μm和丙烯酸含量为1mol％的微粒凝胶体显示出的流体动力学颗粒直径与室温(20℃)下的值相比有18％的减小，另一方面，相同的载体其它条件相同在大于45℃下显示出大于40％的收缩率。
除了收缩度外，高温也加速收缩运动。因此，在45℃下的收缩过程通常比在35℃下的收缩快1.5到3倍。
聚合物凝胶体由于含有羧基的共聚合单体的溶胀现象也可被用于优化凝胶的对于各自的封装任务的孔尺寸和孔结构。具有大于500kDa分子质量的高分子生物分子，如IgM抗体和半乳糖苷酶通常在合理长的时间(几分钟)内不能从N-异丙基丙烯酰胺均聚体中扩散出来。在这种情况下孔通道太小。由于与所述的具有羧基基团的共聚单体的共聚合，该孔也可扩大以使这种生物分子也能扩散。共聚单体的含量为0.01-2mol％足以导致必要的结构和特性药征。
除了共聚合外，作为支持收缩动力的参数，在聚合前加入到单体混合物中的某些物质可令人惊奇地有助于收缩过程中的孔扩大和加速。通常以2-30重量％，优选2-20重量％存在的该类型物质为例如可根据Stber等，J.Colloid Interface Sci.，Vol.26，62，1968的方法而被制造的纳米级二氧化硅颗粒，以及聚乙二醇或聚氧化乙烯，在各种情况下具有200-5000的分子质量，还有具有500-10,000分子质量的多糖或改性的多糖。因此，5-15体积％(相对于单体溶液)的含有聚乙二醇(分子质量为400)的聚-N-异丙基丙烯酰胺颗粒(平均颗粒尺寸18μm)当加热到大于45℃时在3分钟内一般损失5-20％的水，然而具有大于30％聚乙二醇含量的相同颗粒在其它条件相同的情况下在3分钟内损失50-80％的水。这种伴随着聚乙二醇含量的增加的水损失增加也伴随着收缩动力的相应增加，这对于封装在聚合物载体中活性剂的释放动力学具有直接影响。因此，活性剂的释放通常可通过加入这种生孔物质而被加速1.5-5倍。
生产纳米级和微粒聚合物载体的进一步方法是在聚合过程中接枝N-异丙基丙烯酰胺到预先合成的、球形的、磁性聚合物内核上或用N-异丙基丙烯酰胺包围和封装该聚合物。这意味着除上面描述的悬浮聚合外，例如沉淀聚合和乳液聚合的其他不同的聚合可被用于生产根据本发明的介质。这也开辟了获得例如特别通过乳液聚合生产的理想球形和单分散的载体的可能性。新产品的特性也可借助于该过程和显著地扩展该新产品应用范围的产品结合而实现。例如，刚性核心聚合物如聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚缩水甘油基甲基丙烯酸酯、硅胶、聚酰胺和聚酯有助于改善聚合物载体的机械特性，以致于这些物质可被用作柱色谱法的载体介质。
通过柱分离物质的感应加热，聚合物改变了其物理特性，从原来非常亲水到相对疏水。该改变对载体介质的分离和洗脱性能具有相当大的影响。作为亲水-疏水相转化的结果，比在相转化之前多高达60％的蛋白质如白蛋白、纤连蛋白、纤维原蛋白和IgG-抗体通常保留在分离柱上。另外，分离介质的分离性质通过接通磁场在通过期间可被显著地改变，从而用于使很难分离的物质有更好的分离质量。这里的例子包括仅具有微小分子量差异的蛋白质、低聚核苷酸的分离，以及类固醇的分离，其在相变温度以上的保留时间一般增加达70％。
适合于生产热敏聚合物载体的其它磁性核心聚合物是可生物降解的或具有高生物相容性的基质。这意味着载体基质特别在体内的应用可被显著地改善。这些基质的例子为右旋糖苷、明胶、聚交酯、聚乙交酯、硅胶、淀粉、壳聚糖、白蛋白、聚氰基丙烯酸盐、藻朊酸盐、聚乙烯醇、琼脂糖、聚乙二醇和聚氧化乙烯。这些磁性基本聚合物的生产在上述的参考文件中作了说明。
磁性核心聚合物以两种不同的方式引入到基质中a)通过N-异丙基丙烯酰胺的自由基引发接枝聚合或辐射引发的接枝聚合，及b)通过在合成过程中核心聚合物的简单聚合。
通过辐射引发和在铈(IV)盐存在下的自由基接枝方式的聚合物基质的被覆是本领域的技术人员公知的，通常使用辐射剂量0.2-1Mrad(2to 10kGy)或存在0.05-0.4摩尔的铈(IV)盐溶液中与10-30％的N-异丙基丙烯酰胺水溶液进行。相应的方法可在DE-OS 4129901，DE-OS3811042，Müller-Schulte and Horster，Polymer Bull.，Vol.7，77，1982，Müller-Schulte and Thomas，Radiat.Phys.Chem.，Vol.35，93，1990，Müller-Schulte，Radiat.Phys.Chem.，Vol.42，891，1993，Tripathy等，J.Appl.Polymer Sci.，Vol.81，3296，2001，Gupta等，Biomacromolecules，Vol.2，239，2001，Matsuoka等，Polym.Gels & Networks，Vol.6，319，1998，和Li等，Radiat.Phys.Chem.，Vol.55，173，1999中找到，以便它们可被本领域的技术人员在任何时候使用。
类似于使用反向悬浮聚合的聚合物载体的生产，令人惊奇的发现在与N-异丙基丙烯酰胺接枝的过程中，与含有羧基的单体，如丙烯酸或甲基丙烯酸的共接枝也是特别有利的，因为羧基的引入导致与纯接枝聚合物相比急剧地改善了收缩的动力学。因而，当由30℃加热至45℃时，不能在水中溶胀的接枝度大于40％且丙烯酸占1-5％摩尔的N-异丙基丙烯酰胺接枝的核心聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，通常具有50％-75％的收缩度；而当丙烯酸含量小于1％摩尔时，收缩度均低于50％。另外，如果接枝配方中N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸的摩尔比不变，则收缩度随着总的接枝度的增加而增加。
通过已知的乳液、悬浮或沉淀聚合或通过悬浮交联方法生产核心聚合物，悬浮交联方法描述在下面的出版物中Li等，J.Microencapsulation，Vol.15，163，1998，Quellec等，J.Biomed.Mat.Res.Vol.42，45，1998，Hua等，J.Mater.Sci.Vol.36，731，2001，Kriwet等，J.Contr.Release，Vol.56，149，1998，Chu等，Polym.Bull.，Vol.44，337，2000，“Methods in Enzymology”，Vol.112，Part A，Widder and Greeneditors，Academic Press，Inc.，Orlando，1985。
核心聚合物的颗粒尺寸可根据需要设定在50-1000nm之间。
本发明的关键特征为通过原始混合物的组成对聚合物载体目标特性的确定，例如磁性特性、功能性或多孔性。对于封装的活性剂释放行为具有重要影响的变量-多孔性，主要通过在单体配方中的交联剂浓度来确定。单体配方通常包括0.1-10％的交联剂(相对于总单体含量)，优选0.5-5％。小于1％浓度的交联剂通常用于生产高多孔性的载体(孔宽大于50nm)。一般地，与单体混合物形成稳定共聚物的二-或三官能团单体可被用作交联剂。这种二-或三官能团单体的例子包括N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1，1，1，-三-(羟甲基)丙烷三丙烯酸酯、3-(丙烯酰氧)-2-羟丙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸烯丙酯和丙烯酸乙烯基酯。
公知的自由基试剂被用于引发聚合。聚合可通过结合加入N，N，N’，N‘-四甲基乙烯二胺(TEMED)和过硫酸铵(APS)而大大加速。TEMED和APS相对于单体相的浓度(通常是10-40％水性溶液)，TEMED为2-8体积％，APS为2-10体积％，由此TEMED和APS浓度的增加通常伴随着聚合速度的成比例的增加。这样，聚合和因而聚合物颗粒的形成可在大约几分钟内完成，根据现有技术该过程通常需要24小时。
对于生物医学的应用，已证明与具有适于耦联的基团的那些功能乙烯基单体共聚合的聚-N-异丙基丙烯酰胺是有利的。适用于本发明的共聚单体是可以与N-异丙基丙烯酰胺聚合，并且具有适于以氨基、羧基、环氧基、羟基、异硫氰酸酯、异氰酸酯或醛官能团的形式偶联的基团的共聚单体。不限制本发明的这些共聚单体的例子包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酸酯、2-异氰酰乙基甲基丙烯酸酯、丙烯醛、羟丙基甲基丙烯酸酯、2-羧基异丙基丙烯酰胺。
该类型共聚合开辟了耦联例如抗体、细胞受体、抗细胞受体抗体、核酸、低聚糖、凝集素和抗原的生物亲合配体到聚合物载体的可能性，由此该热敏载体可指向特定的目标物质如细胞、生物分子、病毒、细菌或组织间隙和/或根据亲和力原理选择性地附着在这些目标器官上。该聚合物载体因而可通过耦联直接对抗细胞表面的结构，如CD2，CD3，CD4，CD8，CD19，CD14，CD15，CD34和CD45(“分化群”)的抗体而特异性地附着在T-细胞，B-淋巴细胞，单核细胞，粒细胞，母细胞和白细胞上。
结合可外部控制结构改变的根据本发明的聚合物载体的特别应用令人惊奇地开辟了开发新的整体活性结合的可能性。其中包括使用聚合物颗粒在NMR诊断方面作为新型对比强化介质，并与此相应地作为活性剂可控制应用的基础。从现有技术已知(DE-OS 3508000，美国专利US 5,492,814和4,647,447)超顺磁性、铁磁性或顺磁性物质导致在NMR诊断(例如磁共振断层扫描，MRT)方面成像期间对比度的显著增强，随之又使通过病理过程(例如在早期肿瘤和微转移的检测)良好的定位和分类而得到更精确的诊断。
结合生物亲和配体与聚合物基质的耦联，使得在被分析的(细胞)组织中聚合物颗粒特别富集，根据本发明的介质令人惊奇地几乎可同时被用作治疗的活性剂的载体和高灵敏的诊断指示剂。
与定向抗肿瘤细胞抗原的那些抗体或抗体片段耦联最初产生选择性集中聚合物载体在肿瘤组织中并附着聚合物载体到肿瘤细胞的前提。这些肿瘤标记物和/或抗体的例子，但本发明并不限于此，包括肿瘤-相关移植抗原(TATA)、瘤胎抗原、肿瘤-特异性移植抗原(TSTA)、p53-蛋白质、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤抗原(MAGE-1，MAGE-B2，DAM-6，DAM-10)、粘蛋白(MUC1)、人表皮受体(HER-2)、甲胎蛋白(AFP)、螺旋抗原(HAGE)、人乳头瘤病毒(HPV-E7)、caspase-8(CASP-8)、CD3、CD10、CD20、CD28、CD30、CD25、CD64、白细胞介素-2、白细胞介素-9、乳房-CA抗原、前列腺-特异性抗原(PSA)、GD2抗原、黑色素皮质素受体(MCIR)、138H11抗原。相应的抗体可随意地使用单克隆或多克隆抗体、抗体片段(Fab，F(ab‘)2)、单链分子(scFv)、“微型双功能抗体(diabodies)”、“微型三功能抗体(triabodies)”、“微抗体(minibodies)”或双特异性抗体。
对于肿瘤的并联治疗，癌症治疗所用的肿瘤药物和细胞生长抑制剂被封装在聚合物颗粒中。其例子包括氨甲叶酸、顺铂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、氟尿嘧啶、阿霉素、呋氟尿嘧啶或这些物质与蛋白质、肽、抗体或抗体片段的结合。该类型的结合对于本领域的技术人员来说是公知的“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology，Reisfeld and Sell，Editors，Alan R.Riss，Inc.，New York，1985。
耦联生物活性物质如蛋白质、肽、低聚糖或核酸到固体载体的公知方法被用于将生物和亲和配体或受体共价结合到聚合物载体(参见“Methods in Enzymology”，Mosbach，editor，Vol 135，Part B，AcademicPress，1987)。在这里使用的耦联剂包括，例如tresyl chloride、甲苯磺酰氯化物、氰溴化物、二亚胺碳、表氯醇、二异氰酸酯、二异硫氰酸盐、2-氟-1-甲基-吡啶-甲苯-4-磺酸盐、1，4-丁二醇-二环氧甘油醚、N-羟基丁二酰亚胺、氯碳酸盐、异腈、酰肼、戊二醛、1，1′，-羰基-二咪唑。而且，生物配体也可与起反应的异双官能团化合物耦联，该异双官能团化合物可进入到具有基质官能团(羧基、羟基、巯基、氨基基团)和生物配位体的化学键。本发明意义上的例子为丁二酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基-甲基)-环己烷-1-羧酸酯、4-丁二酰亚胺基氧羰基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯、丁二酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基丁二酰亚胺、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼、磺基琥珀酰亚胺基-2-(p-叠氮基水杨基氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。本领域的技术人员根据“Ullmanns Encyclopdie der TechnischenChemie”，4th Edition，Vol.10，or G.T.Hermanson，“BioconjugateTechniques”，Academic Press，San Diego，1996”的信息可在任何时候使用这些耦联剂。
该聚合物颗粒的磁性特性通过在分散到单体相之前直接混合合适的磁性胶体或金属胶体或相应的颗粒而获得。通过精确地混合胶体，该聚合物颗粒的加热行为可选择性地改变或调整。因此，具有10重量％含量的磁性胶体的水性分散体可以用30kA/m磁场幅度及0.8MHz频率在30秒钟内从室温加热到大约45℃。加热值随着磁性胶体含量相应升高而相应地增加。这些测定涉及在分散体中宏观记录的加热率。在聚合物颗粒中产生的实际热量因而相当高。对于根据本发明介质的应用，这意味着仅有几秒钟的非常短的一段感应时间对于引起通过加热而触发的刺激是足够的。聚-N-异丙基丙烯酰胺凝胶在大于27℃下根据凝胶的成分已显示出相对于原始体积的高达85％的显著收缩。这里的收缩度取决于共聚单体的含量和共聚单体的类型，如上所述，还有交联度。因此，具有小于1Mol％交联度的凝胶通常具有60％-85％的收缩度，然而具有大于1Mol％交联度的凝胶体的收缩度低于60％。
为了加热上述磁性和金属物质及化合物到相应于分析、治疗和诊断应用的温度，需要对磁场进行涉及磁场强度和磁场频率的特殊设计。通常使用由高频发电机馈电的载流线圈。该类型的线圈系统和高频发电机是现有技术并且是商业可得的。线圈尺寸取决于各自样品的尺寸；线圈尺寸一般为直径5-30cm及长度5-30cm。高频发电机的必要输出通常为0.5-1.5kW。原理上可使用两种发电设置以加热磁性样品a)具有100-500A/m低磁场强度的5-20MHz高频，或b)与1-45kA/m高磁场强度结合的0.2-0.8MHz低频。原理上两个场参数的结合保证在短应用时间(小于1分钟)内充足的热量输出。还可以利用较大的线圈(直径30-40cm)，通过相应提高辐射较大体积区域的磁场强度至大于15kA/m，为加热载体提供足够的能量，例如，在将活性药剂应用于人体特定部位的情形中。
由于产品和方法的特殊结合，根据本发明的聚合物载体可特别地作为用于活性剂的封装的基质并作为阻塞血管的介质。
通过使用感应加热，活性剂定量给药和应用的系统可被产生以用于医药领域或分析，其特征在于非接触的控制能力。一种活性剂可理解为一种以一种方式或其它方式触发化学、生化或生理学反应的物质，因此产生治疗、诊断和/或预防疾病的效果，或可完成分析的功能。例子包括生物学活性蛋白质或肽、酶、抗体、抗原、核酸、糖蛋白、外源凝集素、低聚糖、荷尔蒙、脂类、生长因子、白细胞介素、细胞因子、类固醇、疫苗、抗凝血剂、细胞抑制剂、免疫调节剂或抗生素。
为此，将活性剂封装在聚合物颗粒中。此过程通过在单体混合物中直接混合相应的活性剂或通过以加热与预先收缩的聚合物载体一起孵育活性剂来进行。由收缩过程产生的聚合物凝胶的浓度梯度引起活性剂在凝胶体内扩散。
第一封装变型的问题是如蛋白质、抗体或荷尔蒙的部分非常敏感的活性剂在某些聚合条件下被损坏或失活。为了与该问题斗争，令人惊奇地发现加入聚醇、糖、血清白蛋白和明胶是有用的，由于这些物质可永久地稳定活性剂而对抗聚合的影响。这些物质的例子中为肌醇、聚乙烯醇、甘露醇、山梨醇、醛醇(aldonite)、赤藓醇、蔗糖、甘油、木糖醇、果糖、葡萄糖、半乳糖或麦芽糖，在单体配方中这些物质的浓度通常为0.1-5重量％。
以这种方式生产的载有相应活性剂的载体可借助如注射、植入、渗透、扩散、流动(streaming)或活组织检查的已知给药方法应用于想要的生理学或生物分析作用部位。磁性颗粒的局部应用可通过使用从外部放置在反应区或作用部位上的电或强永磁铁将颗粒准确地定位在想要的位置以进一步强化。一旦聚合物颗粒达到它们的作用部位，它们可通过使用位于聚合物载体的实际作用和/或反应部位以外的高频交变磁场被加热到相应的相转化温度。产生的热量诱导聚合物凝胶的收缩过程，该过程触发封装的活性剂从基质中快速释放。
原理上活性剂从凝胶体扩散所需的时间取决于凝胶体的尺寸、活性剂的摩尔量、凝胶体的温度和载体交联度。一般地说，低交联凝胶体(0.1-1％交联度)及纳米级颗粒和微粒使活性剂快速扩散，比高交联的聚合物(大于1％交联度)或宏观凝胶体快。于是，当加热至大于40℃时，80％的小分子激素，如加压素、胰岛素、睾丸素、可的松及抗生素、细胞生长抑制剂(分子量小于kDa)在1分钟内，从平均粒径为430nm的1％交联纳米级颗粒中扩散出来；而相同活性剂在大约5μm的凝胶中却需要5～10分钟左右。高分子活性剂如白蛋白、IgG-抗体、纤维原蛋白、乳酸脱氢酶在类似的条件下需要相应更长的时间大于10分钟。为了改变活性剂的释放率，根据本发明的介质如上所述提供了大量可调节和可改变的参数，如颗粒尺寸、共聚单体含量、共聚单体类型、加热和/或交联度，可改变载体介质的特性以使根据各自的任务作出最佳的调节。
关于磁感应，第一次创造了开发聚合物载体结构特性的改变的基础以得到非接触、可控制活性剂的应用。
根据本发明的介质和方法也允许反向应用该载体溶胀行为，其通过从通过预先加热已被大大收缩的载体开始，然后通过低于相转化温度的冷却过程而恢复到其原始溶胀的形态和/或几何形状。该现象可应用在治疗抗肿瘤措施的方面中。在肿瘤生长期间致命的病理进程之一是血管生成。一般认为是在肿瘤组织中血管形成的大量散布。到目前为止主要使用药物治疗(或通过手术)的该病理过程现在可借助于本发明的介质令人惊奇地抑制或大大地推迟。预先已通过感应被加热到高于45℃并且因而达到其最大收缩度的颗粒，优选是具有0.3-5μm颗粒尺寸的颗粒被引入到肿瘤组织中。作为随后适应于体温的结果，颗粒开始溶胀并在几分钟之后达到平衡的溶胀状态。在该溶胀状态下，聚合物载体具有栓塞(embolising)功能，即它们可阻塞血管并因而与肿瘤的生长作斗争。
该特殊功能特别通过这些相变温度已经通过例如共聚而提高的聚合物颗粒展现出来。特别适合的载体是那些如上所述的具有含羧基的共聚单体的载体。具有共聚单体含量为0.05-1mol％并且最大收缩温度为高于40℃的载体在该情况下是优选。具有特别宽范围尺寸的颗粒适合于在实践中与血管生成作斗争，因为它们使所有宽度的血管立刻被阻塞。
具体实施例方式
基于下面的实施例将对本发明进行更详细地描述。
实施例110ml 0.1M的Na-磷酸盐缓冲液，pH值7.2，含有从n-己烷、5％丙烯酰胺和0.6％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺中重结晶的15％N-异丙基丙烯酰胺，及含有根据Shinkai等，Biocatalysis，Vol.5，61，1991的说明生产的2.2mM Fe/ml(平均颗粒尺寸为26nm)的2.5ml水磁胶体，一起混合并在超声波浴(250W)中暴露于超声波下5分钟，同时用冰冷却。然后，氮被引入到混合物中15分钟以除去过量的氧。由0.1mg抗-p53-抗体(Roche Molecular Biochemicals)、0.05％人血清白蛋白，2％肌醇和0.5％明胶组成的水性溶液加入到该混合物中。它在超声波下再暴露30秒钟，同时用冰冷却。然后，在氮气存在下，于4℃的热受控的分散容器(Ultra-Turrax LR 1000，IKA Werke)中，一边搅拌(15,000rpm)一边将水相与2毫升包含0.5％的Igepal 720的30％过硫酸铵溶液(APS)混合，接着使之悬浮于150毫升预先用氮气通气20分钟并包含1.5％由80％Span 85和20％Tween 20组成的混合物的三氯乙烯中。10秒钟后加入1ml N，N，N’，N’-四甲基乙烯二胺(TEMED)。悬浮过程在持续提供氮和冰冷却下持续5分钟。该分散体无需搅拌再静置20分钟以进行聚合。然后将分散液放置在装有稠密钢丝绒的玻璃柱中(装填体积大约10ml；内径0.5cm)，四周环绕着长5厘米的环形钕-硼-铁磁体，并使混合物通过玻璃柱缓慢地滴下(0.5ml/min.)。之后，用含有10％乙醇、2％肌醇和1.5％聚乙烯醇(分子量Mw5000)的约20ml Na-磷酸盐缓冲液洗涤10次。接下来用蒸馏水洗涤5次，然后以pH值为7.2、0.05M Na-磷酸盐/1％肌醇缓冲液洗涤3次。在除去磁体之后，然后用5ml pH为7.2的0.1M Na-磷酸盐缓冲液洗脱玻璃柱上的磁性聚合物馏分。以这种方式获得的洗脱物然后冷冻干燥。在再分散于pH值为7.5、2ml的0.05M Na-磷酸盐/0.1％人血清白蛋白(HSA)/0.1％聚乙二醇(PEG，Mw1000)缓冲液后，获得平均颗粒尺寸为170nm的磁性聚合物颗粒。所获得的该颗粒在交变磁场(磁场30kA/m；0.6MHz，线圈直径5.5cm，8个圈)处理后2分钟内其尺寸减小了43％。
以这种方式获得的颗粒可用作在NMR诊断方面的对比强化介质并用于肿瘤治疗。
实施例2钴-铁氧体纳米颗粒(CoFe2O4)根据Sato et al.，J.Magn.Magn.Mat.，Vol.65，252，1987的说明从CoCl2和FeCl3生产，并借助于高功率超声探头(由Dr.Hielscher制造，80％振幅)在0.75％聚丙烯酸(Mw5.500)存在下30秒钟分散在水中，5ml具有21nm颗粒尺寸的含有1.9mMFe/ml的胶体与20ml已溶解了15％N-异丙基丙烯酰胺、6％丙烯酰胺、1％丙烯酸、0.5％Igepal 520和0.8％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的高纯和脱气的水混合。该混合物再一次暴露在使用超声探头的超声波下1分钟，同时用冰冷却，然后在超声波浴下30分钟。加入2ml 40％APS后，在引入氮气和在冰冷却下的热受控的分散容器(Ultra-Turrax LR 1000，IKA Werke)中，该混合物在冰冷却和引入氮气的情况下借助分散机(Ultra-Turrax，IKAWerke，100000rpm)分散于300ml包含6％由Tween80和Span 85(72％28％)组成的混合物的1，1，1-三氯乙烷中。1mlTEMED在10秒钟后加入。该分散过程持续5分钟。该反应混合物然后在10℃下静置20分钟以完成反应。然后，该产物类似于实施例1被分离和洗涤。在用5ml pH值为7.4的0.1M Na-磷酸盐缓冲液洗脱后，用5L pH值为7.4的0.01M Na-磷酸盐缓冲液渗析3天。获得具有平均颗粒尺寸245nm的磁性颗粒。2ml获得的磁性颗粒馏分放在磁性分离柱中(参见实施例1)，然后用0.01M HCl溶液洗涤3次，并用高纯水洗涤5次。在除去磁体后，加入2ml pH值为4.2的0.1M 2-吗啉基-乙烷磺酸(MES)/0.5％PEG(Mw1000)缓冲液以洗脱在柱上的磁性颗粒。其中溶解了0.2mM N-环己基-N′-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺-甲基-p-甲苯磺酸酯的0.5ml pH值为4.2的0.1M MES缓冲液被加入洗脱。该混合物在室温下轻微振荡30分钟。随后的通过填充有钢丝棉的分离柱的流过分离任何过量的N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)-碳二亚胺-甲基-p-甲苯磺酸，然后保留的磁性颗粒馏分在各种情况下用15ml的冰水洗涤5次。在除去磁体后，用1.5ml pH值为5.5的0.05M MES缓冲液洗脱。洗出液与0.5ml的相同MES缓冲液混合，其中1.25×10-4mM抗-CD30-Fab-片段被溶解并与抗体片段在4℃耦联超过12小时。该结合物在填充钢丝棉的柱上被分离，然后在各种情况下用10ml冰冷的pH值为7.2的0.05M Na-磷酸盐/1％肌糖/0.1％HAS缓冲液洗涤10次。接下来用pH值为10.5的0.05M甘氨酸缓冲液洗涤5次，然后用蒸馏水洗涤2次。在除去手持磁铁(hand magnet)后，磁性馏分用2ml pH值为8.5的0.1M三氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris/HCl)洗脱5次。该洗出液用3ml pH值为8.5的含有1M甘氨酸的Tris缓冲液在室温下孵育12小时以钝化任何残余的碳二亚胺。然后，该磁性馏分通过磁性柱分离出来，并用pH值为7.5的0.05M磷酸盐缓冲液/0.05％HSA洗涤10次。在用2ml pH值为7.5的0.05M磷酸盐缓冲液/0.05％HAS成功洗脱磁性结合物后，磁性颗粒可按照已知的应用方法使用，作为在NMR方面诊断的对比强化介质以诊断Hodgkin′s淋巴瘤。
实施例37.5ml pH值为7.2的0.1M磷酸盐缓冲液，在其中溶解了20％N-异丙基丙烯酰胺、4％丙烯酰胺、1％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和2.4％2-羟基-甲基丙烯酸酯，用氮气洗涤20分钟，然后与2.5ml磁铁矿-铁磁流体(EMG 507，FerroTec，USA)混合。该混合物在超声波浴中暴露于超声波5分钟，同时用冰冷却。然后加入2ml 1％明胶和含有0.1％HSA(InsumanBasal，100IU/ml)的胰岛素溶液。加入1.2ml 35％APS溶液到水相后，在搅拌(1200rpm)和恒定的冰冷却及连续的氮气流下，分散在130ml三氯乙烯中，该三氯乙烯含有2.5％Span 60和1％吐温80。20秒钟后，加入0.5mlTEMED，并在10℃下搅拌该混合物8分钟。该反应混合物然后在15℃下静置20分钟以完成反应。然后，该磁性相类似于实施例1被分离且保留的产品被纯化。在冷冻干燥和重复分散在2ml pH值为7.2的Na-磷酸盐缓冲液/0.1％HSA/0.5％PEG(Mw1000)中后，获得具有平均颗粒尺寸23μm的磁性颗粒。该颗粒暴露在磁场中(15kA/m；0.6MHz，线圈直径5.5cm，8个圈)导致在3分钟内55％的收缩，由此58％原始加入的胰岛素被释放。聚合物载体可用作糖尿病治疗中的胰岛素库。
实施例4根据Müller-Schulte and Brunner，J.Chromatogr.A 711，Vol.711，53，1995的说明被生产的含有40重量％磁铁矿的1g聚乙烯醇(平均颗粒尺寸为25μm)与4ml 20％水性N-异丙基丙烯酰胺溶液、0.5ml N-乙烯基吡硌烷酮、3ml丙酮和5ml甲醇混合。然后，该混合物用氩气洗涤20分钟，接下来用来自Cs137源(Gammacell 40)γ射线辐射45小时(总剂量3.4kGy)。然后，该接枝物质用乙醇提取20小时，接下来用水提取10小时。干燥到恒重后，产生出67重量％的接枝产量(相对于原始聚合物)。感应加热到40℃导致62％的收缩度。以这种方式获得的载体可用在柱色谱法中以分离蛋白质。
权利要求
1.一种含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，其物理结构可通过磁感应或供能被改变。
2.根据权利要求1所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物包括聚-N-异丙基丙烯酰胺，聚-N-取代的丙烯酰胺，聚-N-取代的甲基丙烯酰胺，选自包含N-异丙基丙烯酰胺、N-取代的丙烯酰胺和N-取代的甲基丙烯酰胺的组的单体的共聚物，或上述聚合物和/或共聚物的混合物。
3.根据权利要求2所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物含有一种或多种共聚物或嵌段共聚物，除所提到的单体之外，该共聚物或嵌段共聚物含有一种或多种共聚单体，优选选自含有羧基的单体的组，如丙烯酸、甲基丙烯酸，或选自丙烯酸酯、丙烯酸酯衍生物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物、丙烯醛、丙烯酰胺、N-取代的丙烯酰胺和醋酸乙烯酯。
4.根据权利要求2或3所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物含有一种或多种共聚物或嵌段共聚物，选自包含聚丙烯酸、聚丙烯醛、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、N-取代的聚丙烯酰胺及其混合物的组。
5.根据权利要求1-4任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物为纳米级颗粒或微粒。
6.根据权利要求1所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，磁感应包括高频、交变磁场。
7.根据权利要求1所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该物理结构的改变包括聚合物几何形状的改变。
8.根据权利要求7所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该几何形状的改变包括恢复到通过加热引起形状改变之前的聚合物所显示的原始形状(“形状记忆聚合物”)。
9.根据权利要求1所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该物理结构的改变包括聚合物颗粒尺寸的增大和缩小。
10.根据权利要求1-9任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该磁性胶体包括具有小于1μm的颗粒大小的铁磁颗粒、超顺磁颗粒、亚铁磁颗粒、低温铁素体或铁磁流体。
11.根据权利要求10所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，低温铁素体具有30℃-100℃范围的居里温度。
12.根据权利要求1-11任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该金属胶体包括第8、9、10或11族的元素(族分类IUPAC1986的新提议)。
13.根据权利要求1-12任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该磁性和/或金属胶体以它们被包裹的核心聚合物的形式存在。
14.根据权利要求13所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该核心聚合物具有50-1000nm的颗粒尺寸。
15.根据权利要求13或14所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，封装在该核心聚合物中的该磁性和/或金属胶体以分散胶体的形式存在。
16.根据权利要求13-15任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该封装核心聚合物选自壳聚糖、右旋糖苷、淀粉、聚丙烯酸、多糖、硅胶、硅酮衍生物、纤维素、蛋白质、白蛋白、聚丙烯酸类、琼脂糖、藻朊酸盐、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酯、聚氨基酸、透明质酸、聚交酯、聚乙交酯、聚丙烯醛及其共聚物的组。
17.根据权利要求1-16任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物含有0.1-30重量％的生孔物质。
18.根据权利要求17所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该生孔物质选自硅胶、蛋白质、核酸、聚乙二醇、聚氧化乙烯和多糖的组。
19.根据权利要求1-18任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物与二或三官能团的交联剂交联。
20.根据权利要求19所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该交联剂相对于总单体含量具有0.1％-10％的浓度。
21.根据权利要求1-20任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物具有结合生物分子的反应基团。
22.根据权利要求21所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该结合基团与亲合配体、肽、蛋白质、抗体、抗原、酶类、细胞受体抗体、抗肿瘤标记物抗体、抗体片段、人造抗体、改性抗体、抗体结合物、低聚糖、糖蛋白、血凝素、核酸、抗生物素蛋白链菌素或生物素反应。
23.根据权利要求1-22任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该聚合物含有封装的活性剂。
24.根据权利要求23所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，其特征在于，该封装的活性剂选自荷尔蒙、细胞生长抑制剂、抗体、抗体衍生物、抗体片段、细胞因子、免疫调节剂、抗原、蛋白质、肽、血凝素、糖蛋白、核酸、反义核酸、低聚糖、抗生素或普通试剂。
25.根据权利要求1-24任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，分散磁性和/或金属胶体的单体溶液通过加入多官能团的交联剂和自由基引发剂被自由基聚合成固体。
26.根据权利要求1-24任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，将磁性和/或金属胶体分散于其中的水性单体溶液在加入多官能团交联剂和自由基引发剂之后通过机械粉碎悬浮在不与水混溶的有机相中，并自由基聚合成纳米颗粒或微粒。
27.根据权利要求1-24任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，将磁性和/或金属胶体分散于其中的水性单体溶液在加入多官能团交联剂之后通过机械粉碎悬浮在不与水混溶的有机相中，并在悬浮过程中，通过加入自由基引发剂而自由基聚合成纳米颗粒或微粒。
28.根据权利要求25-27任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，N-异丙基丙烯酰胺、N-取代的丙烯酰胺、N-取代的甲基丙烯酰胺或其混合物被用作单体。
29.根据权利要求25-28任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，0.05-30mol％的共聚单体加入到单体溶液中。
30.根据权利要求29所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该共聚单体为丙烯酸酯衍生物、甲基丙烯酸酯衍生物、丙烯酸、丙烯醛、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、醋酸乙烯酯或其混合物。
31.根据权利要求25-30任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，具有小于1μm的颗粒尺寸的铁磁、超顺磁或亚铁磁物质、或低温铁素体或铁磁流体被加入到该单体溶液中。
32.根据权利要求25-31任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该铁磁、超顺磁或亚铁磁物质、或低温铁素体以胶体或粉末形式存在。
33.根据权利要求26或27所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，分散封装磁性和/或金属胶体的纳米颗粒或微粒核心聚合物被加入到该单体溶液中。
34.根据权利要求33所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该核心聚合物由壳聚糖、右旋糖苷、淀粉、聚丙烯酸、多糖、硅胶、硅酮衍生物、纤维素、蛋白质、白蛋白、聚丙烯酸、琼脂糖、藻朊酸盐、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚氨基酸、透明质酸、聚交酯、聚乙交酯、聚丙烯醛或其共聚物形成。
35.根据权利要求26和27所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，作为该有机相的溶剂具有5-10(cal/cm3)1/2的极性溶解度参数。
36.根据权利要求26和27所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，将0.05-15重量％的一种或多种表面活性物质加入到该有机相中。
37.根据权利要求36所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该表面活性物质选自烷基磺基丁二酸盐、聚氧化乙烯芳基醚、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯山梨聚糖酯、聚氧化乙烯加合物、聚氧化乙烯丙烯嵌段共聚物、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇、脂肪醇聚乙二醇酯、聚甘油脂、聚氧乙撑醇、聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧化乙烯酸及其混合物的组。
38.根据权利要求26所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该单体溶液在分散于有机相中之前被预聚合5-120秒。
39.根据权利要求25-38任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，亲合配位体、肽、蛋白质、抗体、抗原、酶类、细胞受体抗体、抗肿瘤标记物抗体、抗肿瘤抗原抗体、抗体片段、人造抗体、改性抗体、抗体结合物、低聚糖、糖蛋白、血凝素、核酸、抗生物素蛋白链菌素或生物素被结合到聚合物。
40.根据权利要求25-39任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该活性剂被封装到聚合物中。
41.根据权利要求40所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该活性剂选自荷尔蒙、细胞生长抑制剂、抗体、细胞因子、免疫调节剂、抗原、蛋白质、肽、血凝素、糖蛋白、核酸、反义核酸、低聚糖、抗生素或普通试剂的组。
42.根据权利要求40或41所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，0.1-20重量％的多元醇、聚乙烯醇、明胶或碳水化合物加入到该活性剂中。
43.根据权利要求42所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该多元醇或碳水化合物选自肌醇、甘露糖醇、山梨醇、醛醇、赤藓醇、蔗糖、甘油、木糖醇、果糖、葡萄糖、半乳糖和麦芽糖的组。
44.根据权利要求40-43任一项所述的热敏聚合物的制备方法，其特征在于，该封装的活性剂因为磁感应或供能而被释放。
45.根据权利要求1-24任一项所述的含有磁性和/或金属胶体的热敏聚合物的用途，其作为在NMR诊断中的对比强化介质，作为医学治疗和诊断中活性剂的载体，作为反应物的可控制的载体，作为控制微观流体过程的介质，作为柱色谱法的分离介质，作为调节和调整膜孔尺寸的介质，作为阻塞血管的介质，作为人工细胞的载体，作为核酸、细胞、蛋白质、类固醇、病毒或细菌的分离介质。
全文摘要
本发明涉及一种包含磁性和/或金属胶体的热敏聚合物，该热敏聚合物的物理结构可通过磁感应或通过使用动力而被改变，还涉及其制备方法，及该热敏聚合物用于诊断和治疗目的用途。
文档编号A61K47/42GK1658902SQ03812675
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月28日 优先权日2002年6月1日
发明者德特勒夫·P·米勒－舒尔特 申请人:麦格纳麦迪克斯有限公司