专利名称：用姜黄素治疗人多发性骨髓瘤的制作方法
参照相关专利申请本非临时专利申请要求2002年6月24日提交现已撤销的美国临时专利申请序列号60/390,926的权益。
背景技术：
发明领域本发明总的涉及癌生物领域。更具体说，本发明揭示用姜黄素治疗人多发性骨髓瘤的方法。
相关领域的描述多发性骨髓瘤是一种B细胞恶性肿瘤，其特征是增殖指数低且寿命延长的分泌性浆细胞在骨髓中的潜优性积聚。多发性骨髓瘤占所有癌症的1％和所有血液癌的10％以上。其标准治疗方案包括联合应用长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、阿霉素和强的松或地塞米松。尽管采用大剂量糖皮质激素和烷化剂治疗，此恶性瘤仍不能治愈。其完全缓解率是5％，存活时间中值是30-36个月。在90％以上的病人中，此病变为化学药物抗性。因此，治疗多发性骨髓瘤迫切需要安全和有效的制剂。
现认为浆细胞的细胞凋亡机制失调是多发性骨髓瘤发病机理和后来的化学药物抗性的主要因素。已确定以自分泌或旁分泌方式产生的IL-6通过调节肿瘤细胞的生长和存活在多发性骨髓瘤恶性发展中起着重要作用。IL-6的存在导致组成型活化Stat 3，进而导致高水平抗细胞凋亡蛋白Bcl-xL的表达。Bcl-2过度表达是大部分多发性骨髓瘤细胞系的另一个重要特征，拯救这些肿瘤细胞避免了糖皮质激素诱导的细胞凋亡。用TNF治疗多发性骨髓瘤细胞使NF-kB活化，诱导IL-6分泌，诱导各种粘附分子表达和促进增殖。此外，多发性骨髓瘤细胞显示可表达能活化NF-kB受体的配基(RANKL)，RANKL是TNF超家族的成员，能介导多发性骨髓瘤诱导的溶骨性疾病。
多发性骨髓瘤细胞发展成细胞凋亡抗性的一种可能机制是通过活化核转录因子NF-kB。在正常条件下，NF-kB作为无活性的异三聚体存在于细胞质中，由p50、p65和IkBα亚基组成。活化时，IkBα经过磷酸化和泛素-依赖的26S蛋白体降解，从而使p50-p65异二聚体上暴露出核定位信号，导致核转位和结合于特异的共有DNA序列(5’-GGGACTTTC-3’，SEQ ID NO.1)。NF-kB结合于DNA可活化基因表达，进而导致基因转录。通过活化IkBα激酶(IKK)而发生IkBα磷酸化。IkB激酶复合体由3种蛋白质IKKa、IKKb和IKKg/NF-kB必需调节物(NEMO)组成。IKKα和IKKβ是能磷酸化IkBα的激酶，而IKKγ/NEMO是对IKKα和IKKβ活性关键的支架蛋白质。
过去几年中的广泛研究表明NF-kb可调节各种基因的表达，这些基因在细胞凋亡、肿瘤发生和炎症中起着关键作用。一些NF-kB调节基因包括IkBα、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、bcl-xL、COX-2、IL-6和粘附分子ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1。近来报导NF-kB在多发性骨髓瘤细胞中可被组成型活化，导致bcl-2表达，而此表达可拯救这些细胞避免了糖皮质激素诱导的细胞凋亡。由于多发性骨髓瘤细胞表达IL-6、多种粘附分子、Bcl-xL和Bcl-2，都受到NF-kb的调节，也由于它们的抑制能导致细胞凋亡，已提出NF-kB是治疗多发性骨髓瘤的重要靶标。然而，现有技术不足以鉴定能阻断多发性骨髓瘤中组成型NF-kb活化的药学上安全和有效的制剂。本发明满足了本领域这一长期存在的需求。
发明概述由于核转录因子NF-kB在细胞存活和增殖中的重要作用，研究了将它用作治疗多发性骨髓瘤的靶标的可能性，采用已知在人中体毒性很小或无毒的制剂姜黄素(二阿魏酸基甲烷(diferuloylmethane))。NF-kb能在所有检测的人多发性骨髓瘤细胞系中组成型活化，化学预防剂姜黄素如电泳迁移率变化试验所示那样，能下调所有细胞系中的NF-kB，且如免疫细胞化学所示那样，能防止p65的核内保留。所有多发性骨髓瘤细胞系显示有组成型活化的IkB激酶(IKK)和IkBα磷酸化。姜黄素能通过抑制IkB激酶活性来抑制组成型IkBα磷酸化。姜黄素也能下调NF-kB-调节基因产物的表达，包括IkBα、Bcl-2、Bcl-xL、细胞周期周期蛋白D1和白介素-6的表达。这导致增殖抑制和细胞停滞在细胞周期的G1/S期。
IKKg/NF-kB必需调节物-结合结构域肽对NF-kB复合体的抑制，也抑制了多发性骨髓瘤细胞的增生。姜黄素也能诱导细胞凋亡，如通过胱冬酶-7和胱冬酶-9的活化和PARP切割所示。姜黄素诱导的NF-kB下调也诱导了对长春新碱的化学敏感性，其中NF-kB是参与化学抗性的一种因子。这些结果表明姜黄素能下调人多发性骨髓瘤细胞中的NF-kB，从而抑制增殖和诱导细胞凋亡。
本发明也测试了22个多发性骨髓瘤患者骨髓的CD138+细胞并通过免疫细胞化学核查NF-kB和STAT3的活化形式。发现所有病人的多发性骨髓瘤细胞均表达NF-kB和STAT3的活化形式。NF-kB的组成型活化已独立的通过电泳迁移率变化试验得到验证。与多发性骨髓瘤患者相反，健康个体的细胞中没有NF-kB和STAT3。活体外用姜黄素(二阿魏酸基甲烷)处理抑制多发性骨髓瘤细胞中的NF-kB和STAT3活化，导致了细胞活力减少。地塞米松可部分抑制NF-kB活化且对骨髓瘤细胞的细胞毒性最小。总之，这些结果表明多发性骨髓瘤患者的新鲜细胞能表达组成型活化的NF-kB和STAT3，抑制这些转录因子可抑制这些细胞的存活。
本发明的其它和更多方面、特征和优点将从以下提供的本发明优选实施方案的描述中得知。给出这些实施方案目的是说明。
附图的简要说明
图1显示姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞中的组成型核NF-kB。图1ANF-kB对姜黄素处理U266细胞的剂量反应。将200万个细胞/ml用所示浓度的姜黄素处理4小时，并用EMSA测试核NF-kB。图1B接触持续时间对U266细胞中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞用姜黄素(50μM)处理所示时间并用EMSA测试核NF-kB。图1C接触持续时间对MM.1细胞中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞如图1B所述处理。图1D接触持续时间对MM.1R细胞中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞如图1B所述处理。图1E接触持续时间对RPMI 8226中姜黄素诱导的NF-kB抑制的作用。细胞如图1B所述处理。图1FNF-kB结合DNA是特异性的且由p50和p65亚基组成。从U266细胞(2×106/ml)中制备核提取物，用不同抗体或未标记的NF-kB寡核苷酸探针孵育30分钟，然后用EMSA测定NF-kB。
图2显示姜黄素诱导p65的重分布。U266和RPMI 8226细胞单独或用姜黄素(50μM)孵育4小时，然后用免疫细胞化学分析p65的分布。红色表示p65的定位，蓝色(Hoechst)表示核(放大200X)，图3显示姜黄素抑制IkBα磷酸化和IkB激酶。将500万个U266细胞/2.5ml用姜黄素(50μM)处理所示时间并制备细胞质提取物。图3A用蛋白质印迹法测定磷酸化IkBα的水平。图3B免疫沉淀IkB激酶和测定IkB激酶活性的激酶试验(上面一排图)或蛋白质印迹法分析细胞质提取物中的总IKKα和IKKβ蛋白质(下面一排图)。图3C免疫沉淀IkB激酶，激酶试验在没有或存在所示浓度姜黄素时进行(上面一排图)。下面一排图表示在同一干燥凝胶的各孔中用考马斯蓝染色的GST-IkBα蛋白的量。
图4显示姜黄素对NF-κB调节基因产物的作用。将200万个U266细胞用姜黄素(50μM)处理所示时间，制备细胞质提取物。将60微克细胞质提取物在10％SDS-PAGE凝胶上分离，电转移至硝化纤维膜上，探测下列各项IκBα(图4A)；Bcl-2(图4B)；Bcl-XL(图4C)和细胞周期蛋白D1(图4D)。将同一印迹切成条带用抗β-肌动蛋白抗体再探测显示相等蛋白免载量(各图中下面一排图)。图4E姜黄素下调IL-6的产生。将U266、MM.1或RPMI 8226细胞(1×107)在5ml培养液中用姜黄素(10mM)处理所示时间。收集上清液并浓缩约20倍，用IL-6 ELISA试剂盒定量IL-6。将所示值标准化至1ml未浓缩上清液。
图5显示姜黄素抑制人多发性骨髓瘤细胞的生长。将U266(图5A)；RPMI8226(图5B)；MM.1(图5C)或MM.1R细胞(图4D)(5000个细胞/0.1ml)用姜黄素(1mM或10mM)37℃孵育所示时间，用标准台盼蓝染料排除试验计数活细胞。结果表示为一式三份培养物的平均(±标准偏差)细胞计数。
图6显示姜黄素抑制人多发性骨髓瘤细胞的生长和诱导细胞凋亡。图6A将U266细胞(5000个细胞/0.1ml)用不同浓度姜黄素孵育24小时，如所述进行细胞增殖测定。结果表示为一式三份培养物与未处理对照相比的平均(±标准偏差)[3H]-胸苷掺入百分率。图6B将U266细胞(5000个细胞/0.1ml)用不同浓度姜黄素孵育24小时，用MTT方法测定细胞活力。结果表示为一式三份培养物的平均(±标准偏差)活性百分比。
图6C-E显示U266细胞(2×106个细胞/ml)在没有或存在姜黄素(50μM)时孵育所示时间。洗涤细胞然后裂解细胞提取总蛋白质。取60微克提取物在10％SDS-PAGE凝胶上分离，电转移至硝化纤维膜上，用抗胱冬酶原-9(图6C)、抗胱冬酶原-7(图6D)、抗PARP(图6E，上面一排图)和抗切断PARP(图6E，下面一排图)抗体探测。
图7显示姜黄素使细胞停滞在细胞周期的G1/S期。U266细胞(2×106个细胞/ml)在没有或存在姜黄素(10μM)时孵育所示时间。然后洗涤细胞、固定、碘化丙锭染色、流式细胞仪分析DNA含量。
图8显示NEMO-结合结构域(NBD)肽抑制了多发性骨髓瘤细胞中的组成型NF-κB和诱导了细胞毒性。图8A将U266细胞(2×106个细胞/ml)用所示浓度的NEMO-对照或NBD-肽(100μM)处理所示时间。然后用EMSA检查核提取物中NF-κB DNA结合活性的存在。图8B用细胞旋转似离子未处理或NBD-肽处理的(100μM；12小时)U266细胞，如所述进行p65免疫细胞化学分析。红色表示p65的定位，蓝色表示核(放大200X)。图8C将U266细胞(2×106个细胞/ml)用所示浓度的NEMO-对照或NBD-肽(100μM)处理所示时间段，用台盼蓝染料排除法监测细胞活力。测定细胞杀伤百分比为(台盼蓝染色细胞数/总细胞数)×100。
图9显示姜黄素加强长春新碱对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用。U266细胞(10000个细胞/0.ml)在没有或存在姜黄素(10μM)时不用或用长春新碱(500μM)孵育24小时，然后用MTT法测定细胞活性。
图10显示人多发性骨髓瘤细胞系(图10A)、健康受试者外周血单个核细胞(PBMC)、患者的骨髓CD138+多发性骨髓瘤细胞(图10B)中NF-κB的免疫细胞化学定位。通过Ficoll-Pague密度梯度离心收集健康受试者血中的PBMC。用磁珠分离法富集，多发性骨髓瘤患者(患者#1)骨髓抽吸物中富含的CD138+细胞，免疫染色NF-κB(p65)。红色表示NF-κB的特异性染色，而蓝色表示相应视野中核的相对位置。
图11显示多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞中NF-κB的核定位。对不同多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中富集的CD138+细胞作NF-κB免疫染色(p65)(图11A)。红色表示NF-κB的特异性染色，而蓝色表示相应视野中核的相对位置。图11B显示用电泳迁移率变化试验测定多发性骨髓瘤患者(患者#4)骨髓抽吸物中所富含的CD138+细胞(2×106个细胞)的核中NF-κB活性。未处理或TNF-处理的KBM-6(TNF-1nM，30分钟)分别用作阴性和阳性对照。
图12显示多发性骨髓瘤细胞系(图12A)、PBMCs和患者的骨髓CD138+多发性骨髓瘤细胞(图12B-C)中STAT3的核定位。如下所述对不同多发性骨髓瘤患者骨髓抽吸物中富含的CD138+细胞作STAT3免疫染色。红色表示STAT3的特异性染色，而蓝色表示相应视野中核的相对位置。
图13显示姜黄素可防止骨髓CD138+多发性骨髓瘤细胞中的NF-κB和STAT3的核定位。将多发性骨髓瘤患者#5、#9或#10骨髓抽吸物中富集的CD138+细胞(1×105个细胞/0.1ml)在没有或存在姜黄素(50μM)时培养1小时作STAT3分析或培养2小时作NF-κB分析。将细胞通过细胞旋转离心固定于载玻片上并免疫染色NF-κB或STAT3。红色表示NF-κB或STAT3的特异性染色，而蓝色表示相应视野中核的相对位置。
图14显示姜黄素抑制人多发性骨髓瘤细胞系U266和骨髓CD138+多发性骨髓瘤细胞的生长/活性。将细胞系U266(图14A)或多发性骨髓瘤患者#7、#9或#10骨髓抽吸物中富集的CD138+细胞(2×104个细胞/0.1ml)(图14B-D)在没有或存在所示浓度姜黄素时培养24小时，用MTT试验(图14A、B)或标准台盼蓝染料排除法(图14C、D)测定细胞活性。
图15显示姜黄素和地塞米松对NF-κB和STAT3在骨髓CD138+多发性骨髓瘤细胞中核定位的作用。将多发性骨髓瘤患者#20骨髓抽吸物中富含的CD138+细胞(1×105个细胞/0.1ml)在没有或存在姜黄素或地塞米松(各50μM)时培养2小时，将细胞通过细胞旋转离心固定于载玻片上并免疫染色NF-κB或STAT3。如所示红色表示NF-κB或STAT3的特异性染色，而蓝色表示相应视野中核的相对位置。
图16显示姜黄素和地塞米松对骨髓CD138+多发性骨髓瘤细胞生长/活性的作用。将多发性骨髓瘤患者#20骨髓抽吸物中富集的CD138+细胞(2×105个细胞/0.1ml)在没有或存在所示浓度姜黄素(图16A)或地塞米松(图16B)时培养24小时，用MTT试验测定细胞活性。
发明详述已证明姜黄素能抑制多种炎症刺激所诱导的NF-κB活化，和抑制NF-κB活化所需的IκB激酶活性的活化。姜黄素也能下调不同NF-κB调节基因，包括bcl-2、COX2、MMP-9、TNF、细胞周期蛋白D1和粘附分子的表达。此外，报导姜黄素能在多种细胞中诱导细胞凋亡，这是通过相继活化胱冬酶-8、BID切割、细胞色素C释放、胱冬酶-9和胱冬酶-3而致。许多动物研究证明姜黄素对于多种不同肿瘤具有强效化学预防活性(Rao等，1995；Kawamori等，1999)，即使以8g每天，人服用姜黄素，在I期临床试验中安全(Cheng等，1998)。
本文所示结果表明NF-κB在所有受检查的人多发性骨髓瘤细胞系中组成型活化。姜黄素下调了NF-κB的核库或活性形式，并抑制了组成型IκBα的磷酸化、IKK激酶的活性及NF-κB调节基因产物IκBα、Bcl-2、Bcl-XL、细胞周期蛋白D1和白介素-6的表达。这导致增殖抑制、细胞停滞在细胞周期的G1/S期边界并诱导了细胞凋亡如胱冬酶-7和胱冬酶-9的活化和PARP切断指示的那样。姜黄素也诱导了对长春新碱的化学敏感性。
本文所用的全部4种多发性骨髓瘤细胞系(U266、RPMI8226、MM.1和MM.1R)均表达了组成型活化的NF-κB。这些结果与最近2个报导相一致，这2个报导通过电泳迁移率变化试验显示U266和RPMI8226细胞中有组成型NF-κB。MM.1和MM.1R是地塞米松抗性细胞系，也表达了组成型NF-κB。这些结果与Hideshima等的结果不同，他的结果显示MM.1S细胞中缺乏组成型活化的NF-κB，而MM.1S细胞与MM.1细胞在此点上相同。由于NF-κB的组成型活化导致p65的核转位，证实了免疫细胞化学检测的所有细胞系中均存在核p65。这些结果进一步表明多发性骨髓瘤细胞有组成型活化的IκB激酶，NF-κB活化需要此激酶。这是第1个显示多发性骨髓瘤细胞中IκB激酶水平升高的报导。
姜黄素在本文检测的所有4种多发性骨髓瘤细胞系中抑制了组成型NF-κB的活化，这与以前的报导一致，这些报导显示姜黄素是NF-κB活化的强效抑制剂。姜黄素通过阻断多发性骨髓瘤细胞中存在的组成型活性IκB激酶而抑制NF-κB的活化。由于姜黄素能抑制细胞内和体外的IκB激酶活性，故提出姜黄素可能是IκB激酶的直接抑制剂。因为没采用重组IκB激酶，还不能完全排除姜黄素间接抑制IκB激酶的可能性。在任何情况中，姜黄素似乎均抑制IκB激酶活化，从而抑制IκBα磷酸化并因此消除了IκBα的降解。这些结果与以前的报导一致，这些报导显示姜黄素能抑制结肠癌细胞和巨噬细胞中的IκB激酶。最近的报导显示合理设计的IκB激酶抑制剂PS-1145能阻断MM.1细胞中TNF-诱导的NF-kB活化。阻断这些细胞中IκB激酶活化所需的姜黄素浓度相当于PS-1145所报导的。
姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞的细胞增殖与以前的报导一致，这些报导显示姜黄素诱导的NF-κB抑制可导致皮肤T细胞淋巴瘤和急性髓性白血病的细胞增殖抑制。姜黄素抗增殖作用的结果与Hideshima等的结果一致，他显示IKK阻断剂PS-1145能抑制细胞增殖。这些学者报导50μM PS-1145可抑制不到50％的多发性骨髓瘤细胞系MM.1S、RPMI-8226和U226增殖。相反，发现用少至10μM的姜黄素几乎完全抑制了所有这些细胞系的增殖。
几种可能的机制能解释为什么姜黄素下调NF-κB会导致多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制。一种可能的机制包括如本文所示抑制了IL-6的产生。许多研究表明IL-6是多发性骨髓瘤细胞的强效生长因子。关于IL-6是多发性骨髓瘤细胞的旁分泌还是自分泌生长因子仍有很多争议。然而，在这些研究中，然而姜黄素不可能通过抑制IL-6的产生来抑制多发性骨髓瘤细胞的生长，因为所检测4个细胞系有3个不产生可检测的IL-6。姜黄素也不可能通过下调组成型活化的Stata3信号传递来抑制细胞生长，因为不表达组成型活化Stata3的细胞增殖也受到姜黄素的抑制。此研究中，姜黄素下调了bcl-2和bcl-XL的表达，这些蛋白参与了多发性骨髓瘤细胞的细胞存活。因此姜黄素下调bcl-2和bcl-XL可能导致多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制。
也发现多发性骨髓瘤细胞过量表达另一种NF-κB调节基因细胞周期蛋白D1，而其表达受到姜黄素下调。已注意到多种肿瘤中有细胞周期蛋白D1的过量表达，但它在多发性骨髓瘤细胞中的作用未见报导。鉴于细胞从细胞周期的G1进入到S期需要细胞周期蛋白D1，姜黄素诱导G1/S停滞和因此抑制多发性骨髓瘤细胞增殖很可能是由于细胞周期蛋白D1的下调。
姜黄素抑制NF-κB也可导致多发性骨髓瘤细胞的细胞凋亡，如胱冬酶活化和PARP切割所表明的那样。这些结果与NF-κB可介导抗细胞凋亡作用的报导一致。NF-κB的下调也使多发性骨髓瘤细胞对长春新碱敏感。甚至显示对地塞米松有抗性的MM.1R细胞对长春新碱也敏感。
多发性骨髓瘤是不能治愈的侵袭性B细胞恶性肿瘤，90％以上的多发性骨髓瘤患者成为化疗抗性。在寻找更有效治疗多发性骨髓瘤的药物中测试了一些制剂。这些制剂包括蛋白体抑制剂PS341和TNF产生抑制剂酞咪哌啶酮。非特异性药物毒性是药物开发中的主要问题之一。然而，许多研究显示姜黄素在药学上安全。最近证明在1期临床试验中，口服时每天人能耐受多至8克的姜黄素(Cheng等，1998)。此外，姜黄素显示能下调ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1的表达，它们都是参与多发性骨髓瘤细胞活化基质细胞的NF-κB调节基因产物。另一种细胞因子TNF已知在多发性骨髓瘤中具有致病作用，也显示其到受姜黄素的下调。本文所示结果清楚地证明姜黄素能抑制多发性骨髓瘤细胞中的NF-κB、IKK、bcl-2、bcl-XL、细胞周期蛋白D1和细胞增殖。这些结果提供足够的基础认为姜黄素值得在多发性骨髓瘤患者中进行临床试验。
如本文所用，“多发性骨髓瘤细胞”指多发性骨髓瘤细胞系或分离得自多发性骨髓瘤患者的CD138+浆细胞。
在本发明中，提供了采用姜黄素处理以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡和提高化学治疗剂抗多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用的方法。一般，化学治疗剂一般可以是长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、阿霉素、强的松或地塞米松。
本发明也涉及采用姜黄素处理来治疗个体的多发性骨髓瘤和提高化学治疗剂抗个体多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用的方法。化学治疗剂通常是上面所列的那些制剂。
特别考虑本发明的方法采用了包括姜黄素的药物组合物，例如含姜黄素和本领域熟知和常规使用的药学上可接受载体的药物组合物。鉴于已发表的临床试验(Cheng等，1998)和其它涉及采用姜黄素的研究，本领域普通技术人员不需过多实验即能容易地确定本发明方法中姜黄素的适当给药剂量和途径，当用于体内治疗时，姜黄素以治疗有效量予给病人或动物，即给予的量能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖、诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡或提高化学治疗剂抗多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用，例如给药剂量从约0.01mg/kg个体体重到约500mg/kg个体体重。
给出下列例子用于阐明本发明的各种实施方案但不意味以任何方式限制本发明。本文实施例与本文所述的方法、过程、处理、分子和特定化合物一起，代表了优选的实施方案。本领域技术人员不难理解本发明很适合实施而完成目标和获得所述的结果及优点，以及本文内在的目标、结果和优点。本领域技术人员知道对其的变化和其它用途均在权利要求范围所定义的本发明的思路内。
实施例1细胞和试剂人多发性骨髓瘤细胞系U266、RPMI 8226和MM.1得自美国典型培养物保藏所(Rockville，MD)。细胞系U266(ATCC#TIB-196)和RPMI 8226(ATCC#CCL-155)是B细胞来源的浆细胞瘤。U266已知能产生单克隆抗体和IL-6。RPMI 8226仅产生免疫球蛋白轻链而没有证明能产生重链或IL-6。RPMI 8226的阿霉素(Dox-6)-和美法仑(LR-5)-抗性克隆由Dr.Willium Dalton(H.Lee Moffitt Cancer Center andResearch Institute，Tampa，FL.)提供。
从IgA骨髓瘤患者外周血细胞建立的MM.1(也称为MM.1S)细胞系能分泌λ轻链，EBV基因组存在为阴性，能表达白细胞抗原DR、PCA-1、T9和T10抗原。MM.1R是MM.1细胞的地塞米松抗性变体。这2个细胞系由Dr.Steve T.Rosen ofNorthwestern University Medical School(Chicago，IL)提供。
抗IkBa、p50、p65、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、Bcl-xL及PARP和STAT3的兔多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。抗切断的-PARP、磷酸-IkBa、胱冬酶原-7、胱冬酶原-9的抗体和多核苷酸激酶试剂盒购自NewEngland Biolabs，Inc.(Beverly，MA)。抗IKKa和抗IKKb抗体由Imgenex(SanDiego，CA)友情提供。山羊抗兔-HRP偶联物购自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA)，山羊抗小鼠-HRP偶联物购自Transduction Laboratories(Lexington，KY)，山羊抗兔-Alexa 594购自Molecular Probes(Eugene，OR)。抗CD138微珠和PE-偶联的抗CD138购自Miltenyi Biotech(Auburn，CA)。
细胞可渗透的NEMO(NF-κB必需修饰物；也称为IKKγ)-结合结构域肽(NBD)、NH2-DRQIKIWFQNRRMKWKKTALDWSWLQTE-CONH2，(SEQ ID NO.2)和对照肽NEMO-C，NH2-DRQIKIWFQNRRMKWKK-CONH2，(SEQ ID NO.3)得自Imgenex(San Diego，CA)。
姜黄素购自LKT Laboratories，Inc.(St.Paul，MN.)，制备成为二甲基亚砜中的20mM溶液，然后用细胞培养液进一步稀释。长春新碱、Hoechst 33342和MTT购自Sigma-Aldrich Chemicals(St.Louis，MO)。RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、0.4％台盼蓝活性染色液和100X抗生素-抗真菌混合物得自Life TechnologiesInc.(Grand Island，NY)。蛋白A/G-琼脂糖珠得自Pierce(Rockford，IL)。g-P32-ATP得自ICN Pharmaceuticals(Costa Mesa，CA)。人IL-6试剂盒购自BioSourceInternational(Camarillo，CA)。Ultrafree 4离心滤器购自MilliporeCorporation(Bedford，MA)。
所有的人多发性骨髓瘤细胞系在RPMI 1640培养基中培养，该培养基含1X抗生素-抗真菌。U266、MM.1和MM.1R在10％FBS中培养，而细胞系RPMI 8226在20％FBS中培养。偶尔，用Hoechst染色和常规PCR来检测细胞的支原体污染。
实施例2制备用于NF-κB的核提取物核提取物根据Bharti等(2003)制备。简言之，2×106个细胞用冷PBS洗涤并悬浮于含蛋白酶抑制剂的0.4ml低渗裂解缓冲液中30分钟。细胞随后用12.5μl 10％诺乃洗涤剂P-40裂解。离心均匀混合物，取含细胞质提取物的上清液-80℃冷冻保存。将核沉淀物重悬于25μl冰冷核提取物缓冲液中。间歇混合30分钟后，离心该提取物，收集含核提取物的上清液。用Bradford方法测定蛋白含量。如果上清不是立即使用，将它们保存于-80℃。
实施例3NF-κB的电泳迁移率变化试验NF-κB的活化通过前述电泳迁移率变化试验(EMSA)进行分析(Chaturvedi等，1994)。简言之，将从姜黄素处理或未处理细胞中制备的8μg核提取物用NF-κB寡核苷酸的32P末端标记双链45聚体37℃孵育15分钟，该NF-kB寡核苷酸来自人免疫缺陷病毒-1的长末端重复(5’-TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGA CTTTCCAGGGAGGCGTGG-3’，SEQ ID NO.4)，将DNA-蛋白复合体在6.6％天然聚丙烯酰胺凝胶上分离。用Phosphor Imager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)显示和定量干燥凝胶的放射性条带，使用ImageQuant软件。
实施例4NF-κB P65和STAT3的免疫细胞化学分析将未处理或处理的多发性骨髓瘤细胞用细胞离心涂片器4(Cytospin 4)(Thermoshendon，Pittsburg，PA)离心接种在聚-L-赖氨酸-包被的载玻片上，室温空气干燥1小时，冷丙酮固定。用PBS中短暂洗涤后，载玻片用5％正常山羊血清封闭1小时，然后用兔多克隆抗人NF-κB p65抗体(SC-109；稀释度，1∶100)或抗人STAT3抗体(SC-482；稀释度，1∶100)孵育。孵育过夜后，洗涤载玻片，然后用山羊抗兔IgG-Alexa 594(A-11037；稀释度，1∶100)孵育1小时和用Hoechst(50ng/ml)复染核5分钟。将染色的载玻片用封固剂(Sigma Co.)封固并在落射荧光显微镜(Labophot-2，Nikon，Tokyo，Japan)下分析。用PhotometricsCoolsnap CF彩色摄影机(Nikon，Lewisville，TX)和MetaMorph版本4.6.5软件(Universal Imaging Corp.，Downingtown PA)捕捉图片。分别计数具有NF-κBp65或STAT3核染色的细胞。各样品计数100个细胞，根据4级给样品评分-，无核阳性细胞(0％)；+，低数量的核阳性细胞(＜10％)；++，中等数量的核阳性细胞(10-50％)；+++，高数量的核阳性细胞(＞50％)。
实施例5蛋白质印迹在10％SDS-PAGE凝胶上分离按所述制备(Chaturvedi等，2000)的30-50微克细胞质蛋白提取物。电泳后，将蛋白质电转至硝化纤维膜上，用5％脱脂牛奶封闭，用抗IkBa、磷酸-IkBa、Bcl-2、Bcl-xL或细胞周期蛋白D1的抗体(1∶3000)探测1小时。之后，洗涤印迹，使其接触HRP-偶联二抗1小时，最后通过化学发光(ECL，Amersham Pharmacia Biotech.，Arlington Heights，IL)检测。
对于PARP切割产物的检测，全细胞提取物的制备通过用裂解缓冲液(20mMTris，pH7.4、250mM NaCl、2mM EDTA，pH8.0、0.1％Triton-X100、0.01mg/ml抑酶肽、0.005mg/ml亮抑酶肽、0.4mM PMSF和4mM NaVO4)裂解姜黄素处理的细胞。裂解物然后以14000rpm离心10分钟去除不溶物质，在7.5％凝胶上分离并用PARP抗体探测。将PARP从116-kDa的完整蛋白质切割成85-kDa和40-kDa肽产物。为检测胱冬酶原7和胱冬酶原9的切割产物，将全细胞提取物在10％凝胶上分离并用适当的抗体探测。
实施例6IkB激酶试验IkB激酶试验用前述改良方法(Manna等，2000)进行。简言之，取200μg细胞质提取物用各1μg的抗IKKa和IKKb抗体作免疫沉淀，将如此形成的免疫复合物用0.01ml蛋白A/G-琼脂糖珠沉淀2小时。先用裂解缓冲液洗涤珠，然后用激酶试验缓冲液(50mM HEPES pH7.4、20mM MgCl2和2mM DTT)洗涤。接着测定该免疫复合物的激酶活性，采用的激酶试验缓冲液含有20mCi[g-P32]ATP、10μM未标记的ATP和2μg/样品谷胱甘肽S-转移酶-IkBa(1-54)。30℃孵育30分钟后，通过在6xSDS样品缓冲液中煮沸该溶液来终止反应。然后在12％SDS-PAGE上分离反应混合物。用PhosphorImager观察和定量干燥凝胶的放射性条带。
为测定各样品中的IKK复合物的总量，将60mg细胞质蛋白在质7.5％丙烯酰胺凝胶上分离，然后电转移至硝本纤维膜上。用5％脱脂牛乳蛋白质封闭此膜1小时，然后用抗IKKα或抗IKKβ抗体孵育1小时。洗涤膜和用HRP-偶联的第二抗小鼠IgG抗体处理，最后用化学发光(ECL，Amersham Pharmacia Biotech.，ArlingtonHeights，IL)检测。
实施例7增殖试验姜黄素对不同多发性骨髓瘤细胞系的抗增殖作用通过前述MTT染料吸收方法(Manna等，1998)测定。简言之将细胞(5000/孔)在96孔板中作一式三份培养，存在或没有所示测试样品，终体积为0.1ml，37℃培养24小时。之后，条孔加入0.025ml MTT溶液(PBS配成5mg/ml)。37℃培养2小时后，加入0.1ml提取缓冲液(20％SDS、50％二甲基甲酰胺)。37℃连续培养过夜，然后测定590nm的OD，采用96孔多头扫描仪自动读数器(Dynatech MR 5000)，用取缓冲液作为空白。细胞活性百分比＝(实验样品的OD/对照OD)×100。
姜黄素的抗增殖作用也用胸苷掺入法监测。将100微外培养液中含5000个细胞在96孔板中一式三份培养24小时，存在或没有姜黄素。实验完成前6小时，用0.5mCi3H-胸苷脉冲细胞，用Matrix-9600 b-计数器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)监测3H-胸苷的掺入。
实施例8流式细胞计数分析为确定姜黄素对细胞周期的作用，用其处理多发性骨髓瘤细胞不同次数，洗涤，用70％乙醇固定。-20℃孵育过夜后，用PBS洗涤细胞，然后碘化丙锭(PI)染色，随后悬浮于染色缓冲液(PI为10mg/ml；吐温-20为0.5％；RNA酶用PBS配成0.1％)中。细胞用FACS Vantage流式细胞仪分析，流式细胞仪使用CellQuest获得和分析程序(Becton Dickinson，San Jose，CA)。
实施例9IL-6蛋白的测定收集未处理或姜黄素处理的多发性骨髓瘤细胞培养物的上清涂并浓缩约20倍，采用装有Biomax-10K NMWL膜的Ultrafree 4离心滤器(Millipore)。取出100微升等分样品，用ELISA试剂盒(Biosource International)测定IL-6含量。
实施例10姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞表达组成型NF-κB首先通过电泳迁移率变化试验(EMSA)研究了4种不同多发性骨髓瘤细胞系中的NF-κB状况。图1所示结果表明所有4种细胞系均表达组成型活化的NF-κB，分离为该图上面和下面的条带。随后检测完全抑制NF-κB所需的姜黄素剂量，研究了姜黄素对组成型活性NF-κB的作用。U266细胞用不同浓度的姜黄素处理4小时，然后用EMSA检测NF-κB。光密度分析滞留的放射性同位素标记探针，显示NF-κB DNA结合活性降低。这些结果显示50μM姜黄素足以完全抑制U266细胞中组成型NF-κB的活化(图1A)。
随后检测抑制NF-κB所需的姜黄素最小接触持续时间。多发性骨髓瘤细胞用50μM姜黄素孵育不同时间，然后制备核提取物并用EMSA检测NF-κB。结果显示姜黄素在所有4种细胞系中均下调了组成型NF-κB，但动力学不同。U266(图1B)、MM.1(图1C)和MM.1R(图1D)细胞中NF-κB的完全下调发生于4小时内，而在RPMI8226细胞(图1E)中下调NF-κB需8小时。在大多数情况中，姜黄素下调的只是上面的NF-κB条带，而不是下面的条带。在RPMI8226细胞中，2条带都下调。
由于NF-kB是一种蛋白家族，Rel/NF-kB蛋白的不同组合可能构成能结合特异性DNA序列的活性NF-kB异二聚体。为显示多发性骨髓瘤细胞中EMSA观察到的滞留条带确实是NF-Kb，将多发性骨髓瘤细胞的核提取物用抗NF-kB的p50(NF-kB1)或p65(RelA)亚基的抗体孵育二。条带都移动到更高分子量(图1F)，从而提示多发性骨髓瘤细胞中的主要NF-kB带由p50和p65亚基组成。在一些多发性骨髓瘤细胞系中没见到因抗体所移动的非特异性小条带。免疫前血清或不相关抗体如抗细胞周期蛋白D1抗体都没有任何效果。过量未标记NF-kB(100倍)而不是突变寡核苷酸，可导致带完全消失。
当NF-κB时活化，含反式激活结构域的NF-κB p65亚基转位到核中。NF-κB的p65亚基以无活性状态留在细胞质中。随后用免疫细胞化学证实了姜黄素能抑制p65的核滞留。将姜黄素处理和未处理细胞离心加在载玻片上，用抗p65抗体免疫染色，然后用上述Alexa-594偶联二抗显现。图2的结果清楚地证明姜黄素在所有4种多发性骨髓瘤细胞系中防止了NF-κB的p65亚基转位到核内。这些细胞学发现与EMSA观察到的NF-κB抑制相一致。
实施例11姜黄素抑制IκBα磷酸化和IκB激酶活化IκBα降解和随后的NF-κB(p65:p50)释放需要其ser 32和ser 36残基预先磷酸化。因此，为研究姜黄素的抑制作用是否是通过改变IκBα磷酸化来介导，用姜黄素处理U266细胞，检查它们蛋白提取物的磷酸-IκBα表达。图3A的结果显示未处理的U266细胞组成型表达了ser 32-磷酸化IκBα。姜黄素处理时，磷酸化的IκBα含量迅速减少。
IkBa磷酸化通过IκB激酶介导。体外激酶试验采用未处理U266细胞的免疫沉淀的IκB激酶，以GST-IκBα作为底物，显示组成型IκB激酶的活化，而在类似条件下，从姜黄素-处理细胞免疫沉淀的IκB激酶表现出激酶活性降低，与姜黄素处理的持续时间相对应(图3B；上面一排)。然而，免疫印迹分析未处理和姜黄素-处理细胞的细胞提取物显示，IκB激酶亚基IKKα和IKKβ蛋白的水平无显著变化(图3B；中间和下面一排)。
已显示IκB激酶受到一些上游激酶的调节。为确定姜黄素是否可作为IκB激酶活性的直接抑制剂，免疫沉淀未处理U266细胞中以IκB激酶，然后用不同浓度的姜黄素处理30分钟。处理后，用GST-IκBα作为底物检测样品的IκB激酶活性。图3C的结果(上面一排)显示姜黄素以剂量依赖方式直接抑制了IκB激酶活性。这些结果提示姜黄素是IκB激酶的直接抑制剂。由于未用纯化的IκB激酶，不能完全排除姜黄素抑制IκB激酶活化所需的上游激酶的可能性。
实施例12姜黄素下调NF-κB调节基因产物的表达由于IκBα、Bcl-2、Bcl-XL和细胞周期蛋白D1都显示受NF-κB调节，用免疫印迹法检测了姜黄素对这些基因产物表达的作用。如图4所示，所有4种基因产物在U266细胞中均有表达。经姜黄素处理的细胞以时间依赖方式下调了IκBα(图4A)、Bcl-2(图4B)、Bcl-XL(图4C)和细胞周期蛋白D1(图4E)的蛋白库，尽管抑制动力学不同。在姜黄素处理的4小时内细胞周期蛋白D1显示最迅速和完全的损耗。Bcl-2也表现出完全下降，但在8小时到达最低水平。另一方面，IκBα和Bcl-XL仅显示部分下降。
白介素-6是另一种受NF-κB调节的基因，显示其作用是多发性骨髓瘤细胞的生长因子。U-266细胞以时间依赖方式产生显著量的IL-6蛋白，而用ELISA测定MM.1或RPMI 8226都不产生任何可检测量的IL-6蛋白(图4E)。如图4E所示，姜黄素处理抑制了U266细胞产生IL-6。
实施例13姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖由于NF-κB参与细胞存活和增殖，检测了姜黄素对多发性骨髓瘤细胞系增殖的作用。U266、RPMI 8226、MM.1和MM.1R细胞在存在不同浓度姜黄素时培养，用台盼蓝染料排除方法检测活细胞数。
图5的结果显示低至1μM的姜黄素浓度分别抑制了U266(A排)、RPMI 8226(B排)、MM.1(C排)和MM.1R(D排)细胞的生长达27％、23％、45％和51％。10μM姜黄素完全抑制了所有细胞系的生长。这些结果表明姜黄素能抑制所有测试的多发性骨髓瘤细胞系的增殖，包括抗地塞米松-诱导细胞凋亡的MM.1R。
也通过胸苷掺入U266细胞检测了姜黄素的抗增殖作用。姜黄素以剂量依赖方式在24小时内抑制胸苷的掺入(图6A)。能显示细胞线粒体活性的MTT试验结果显示24小时内姜黄素以课题依赖方式抑制了U266细胞的线粒体活性且抑制(图6B)。
实施例14姜黄素诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡研究了多发性骨髓瘤细胞中的NF-κB抑制是否也能导致细胞凋亡。细胞凋亡的一个特点是胱冬酶活化。U266细胞用姜黄素处理不同时间，制备全细胞提取物并分析胱冬酶-9(一种上游胱冬酶)、胱冬酶-7(一种下游胱冬酶)和PARP的切割，PARP是胱冬酶-3、胱冬酶-6和-7的熟知底物。
姜黄素处理细胞提取物的免疫印迹分析清楚显示胱冬酶-9(图6C)和胱冬酶-7(图6D)的时间依赖性活化，如47-kDa和35-kDa条带分别消失所显示的那样。下游胱冬酶的激活导致118-kDa PARP蛋白切割成89-kDa片段，这是经历凋亡的细胞的另一特征(图6E)，而未处理细胞不显示任何PARP切割。采用只能识别切割的89-kDa PARP物质的抗体也检测到89-kDa片段量的增加(图6E，下面一排)。综合在一起，这些结果清楚地证明姜黄素能诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。
实施例15姜黄素使细胞停滞在细胞周期的G1/S期细胞从细胞周期的G1期前进到S期(DNA合成)需要D型细胞周期蛋白。由于在姜黄素处理的多发性骨髓瘤细胞中观察到细胞周期蛋白D1迅速下降，因而接着测定了姜黄素对U266细胞周期的作用。
地姜黄素处理细胞的DNA的流式细胞计数分析显示用10μM姜黄素处理24小时内，G1期细胞百分比显著增加(从52％到70％)，而S期细胞百分比减少(从22％到9％)(图7)。这些结果清楚地显示姜黄素可诱导细胞的G1/S停滞。
实施例16NEMG-结合结构域(NBD)肽抑制多发性骨髓瘤细胞的组成型NF-κB和增殖IKK由IKKα、IKKβ和IKKγ(也称为NEMO)组成。已显示NEMO的氨基末端a-螺旋区能与IKKα和IKKβ的C末端区相互作用。IKKα和IKKβ NEMO C末端的一个小肽显示能阻断此相互作用。为使NBD肽能透入细胞，将其与触角足(cautennapedia)同源结构域的一段小序列相偶联。此肽显示能特异性抑制NF-κB的活化。将没有触角足同源结构域蛋白序列的肽用作对照。
上述结果显示姜黄素抑制了组成型NF-κB，进而导致细胞增殖的抑制和细胞凋亡的诱导。这里采用HBD和对照肽确定了NF-κB抑制与增殖和细胞凋亡相关连。
如图8A所示，用NEMO-对照肽处理U266细胞无效，而NBD肽以时间依赖方式抑制了组成型NF-κB，完全抑制发生于12小时内。也通过免疫细胞化学单独确定了多发性骨髓瘤细胞中的NF-κB活化抑制。结果表明NF-κB的p65亚基核库减少(图8B)。NBD肽对NF-κB的抑制也导致U266细胞增殖的抑制。NBD处理后24小时观察到约32％的细胞生长受到抑制(图8C)。因此这些结果表明NF-κB抑制在多发性骨髓瘤细胞中确实与抗增殖作用相关连。
实施例17姜黄素加增强了长春新碱的细胞毒作用由于NF-κB参与细胞的化疗抗性，研究了姜黄素对化学敏感性的作用。选择长春新碱，是因为它是用于治疗多发性骨髓瘤的一种化学治疗剂。在低浓度姜黄素(10μM)存在时用长春新碱处理U266细胞，24小时后减少了细胞活性(图9)。单用最高浓度(50μM)的长春新碱杀伤U266细胞的效果最小；单用姜黄素可杀伤约35％的细胞；而2种试剂一起可杀伤65％的细胞。这些结果表明姜黄素可使多发性骨髓瘤细胞对长春新碱的细胞杀伤作用敏感。
实施例18NF-κB在多发性骨髓瘤患者的CD138+细胞中组成型活化此实施例检测在多发性骨髓瘤患者的新鲜细胞中NF-κB和STAT3是否组成型活化。表1描述这些患者的临床特征。用正常受试者的PBMC作对照。
如下分离多发性骨髓瘤患者的骨髓CD138+细胞。CD138+抗原也称为多配体聚糖-1(Syndecan-1)，在正常和恶性浆细胞上有利表达，但在循环B细胞、T细胞和单核细胞上无表达。采用抗CD138微珠(Miltenyi Biotec，Auburen，CA)阳性选择多发性骨髓瘤患者骨髓中的CD138+细胞。从上髂嵴或胸骨中抽吸2-10ml骨髓样品，用等体积HEPES-缓冲细胞培养液IMDM稀释，添加有100U/ml浓度的肝素，温和搅拌。为防止细胞聚集，将稀释的骨髓悬浮于含100U脱氧核糖核酸酶(DNA酶)I/ml的IMDM中并室温温和振摇30分钟。接着，将30ml稀释的骨髓细胞悬浮液层叠在50ml锥形管中的20ml菲可帕克(Ficoll-Paque)上，400xg离心30分钟分离单个核细胞(MNC)。然后，收集界面的MNC层，用含2mM EDTA的PBS300xg室温离心10分钟洗涤2次。
将MNC浓度调至107每80μl电泳缓冲液(PBS含有2mM EDTA加0.5mM BSA)。对于107MNC每80μl电泳缓冲液，加入20μl抗CD138微珠(Miltenyi Biotec，Auburen，CA)，将细胞悬浮液在4℃-8℃孵育15分钟。细胞悬浮液随后用1ml冷电泳缓冲液稀释并以300xg 4℃离心10分钟。弃上清，将细胞沉淀悬于1ml电泳缓冲液中，上样到AutoMACS系统(Miltenyi Biotec)的磁性柱上，此系统置于层流罩超净台中。
通过阳性选择分离抗CD138+细胞。测定分离的CD138+浆细胞群的纯度，这是通过10μl偶联了藻红蛋白(PE)的抗CD138抗体处理105个CD138+细胞并在冰箱中6-12℃暗处孵育。细胞用冷PBS洗涤2次，1％多聚甲醛固定，用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析。
首先检测了各种多发性骨髓瘤细胞系的NF-κB状态。图10a表明所有多发性骨髓瘤细胞系表达了NF-κB的核形式，说明多发性骨髓瘤细胞系表达NF-κB的组成型活化形式。PBMC(对照)表达了NF-κB的细胞质(失活)形式(图10B，上面一排)。患者#1的多发性骨髓瘤细胞像多发性骨髓瘤细胞系，仅表达NF-κB的核形式(图10B，下面一排)。
随后用上述方法检测了22位不同多发性骨髓瘤患者样品的NF-κB活化。所有22个病人显示核中有NF-κB蛋白(p65)表达，表明其组成型活化(图11)。然而，活化程度相当不同3位病人显示低表达组成型NF-κB，5位显示中等表达，14位显示高表达。
NF-κB的组成型活化通过电泳迁移率变化试验独立得到证实。如图11B所示，KBM-5中的对照NF-κB受到TNF的激活，KBM-5是一种无组成型NF-κB的骨髓细胞系。类似的，NF-κB活化也见于患者#4的样品，免疫细胞化学显示该患者有组成型NF-κB活化(图11B)。
表1多发性骨髓瘤患者的临床特征患者年龄 MMHgbWBC血小板％浆细血清病变尿病变位置编号性别 类型(1000) 胞 蛋白(gm)蛋白(gm)1 67MIgG 10.3 4.2203 44 6.4 0.6 骨(扩散)2 40FIgG 8.65.049 90 9.3 3.4 (-)骨测量3 57FIgG 10.2 5.3217 90 6.7 4.25 骨(扩散)4 50MIgA 11.1 4.9184 40 5.7 0 骨(扩散)5 52MIgG 12.1 2.9257 35 4.4 0.12 (-)骨测量6 56FIgG 84.0 33 96 8.4 1.68(-) 骨测量7 63FIgG 10 5.5336 45 9.9 0.36 (-)骨测量8 63MIgG 12.3 4.6151 18 (-) 0.02 骨(扩散)9 64MIgG 10.5 4.2219 50 3.5 0.01 T11，锁骨10 35FIgA 9.12.685 7 1.5 0.21 (-)骨测量11 52MIgA 10.4 3.354 66 0.8 17(-)骨测量12 45MIgG 10.2 11.8 338 63 0.1 4.273 骨(扩散)13 54MIgG 14.1 4.5262 14 4.7 0 (-)骨测量14 66MIgA 10.2 5.9154 60 3.4 0.1 骨(扩散)15 50FIgG 11.9 7.1364 18 3.7 0 骨(扩散)16 40FIgG 10.3 6.2335 60 (-) 0 头骨，顶端17 58MIgA 13.9 5.1205 20 4.3 0 (-)骨测量18 67MIgG 8.98.852 25 0.4 3.9 (-)骨测量19 56MIgG 13.3 7.8233 22 4.6 0.02 肋骨20 65MIgG 13.3 4.8227 40 2.8 0.32 C221 57MIgA 6.09.6219 68 3.1 4.8 (-)骨测量22 67FIgG 12.8 5.0249 14 1.6 0 (-)骨测量MM，多发性骨髓瘤；Hgb，血色素；WBC，白细胞实施例19STAT3在多发性骨髓瘤患者的CD138+细胞中组成型活化仅U266细胞在核中表达STAT3(图12A)，提示U266细胞表达STAT3的组成型活化形式。正常受试者的PBMC表达STAT3的细胞质(失活)形式(图12B，上面一排)。患者#1的多发性骨髓瘤细胞同样表达STAT3的核形式。这提示此患者的新鲜细胞表达STAT3的组成型活化形式(图12B，下面一排)。
检测了22位不同多发性骨髓瘤患者CD138+细胞的STAT3活化。不像NF-κB，不是所有22位病人都显示核中有STAT3蛋白表达(图12C)。核STAT3含量也不同.1位病人没有组成型STAT3活化的表达，3位有低表达，5位有中等表达，14位病人显示高表达。
实施例20姜黄素下调多发性骨髓瘤患者CD138+细胞中的组成型NF-κB和STAT3活化上述结果表明大部分多发性骨髓瘤患者的CD138+细胞表达组成型活化的NF-κB和STAT3。此实施例研究了姜黄素是否能抑制多发性骨髓瘤患者新鲜细胞中NF-κB和STAT3的组成型活化。为确定这一点，使多发性骨髓瘤患者的CD138+细胞接触50μM姜黄素2小时，然后检测STAT3和NF-κB表达。
图13A说明NF-κB在患者#5、#9和#10(仅测试病人)中组成型活化，并且接触姜黄素下调了NF-κB。图13B的结果表明STAT3同样在患者#5、#9和#10中组成型活化，并且接触姜黄素下调了此转录因子。
实施例21姜黄素下调多发性骨髓瘤患者的CD138+细胞存活由于NF-κB和STAT3活化参与细胞存活并且姜黄素下调了多发性骨髓瘤患者的CD138+细胞中的这些转录因子，故有兴趣研究此种下调是否可导致细胞活性的降低。使细胞接触不同浓度的姜黄素，随后用MTT方法检测细胞活性。如图14所示，姜黄素处理U266细胞或患者#7、#9和#10的新鲜细胞可以剂量依赖方式减少细胞存活。图14B的结果表明STAT3也在患者#5、#9和#10中组成型活化并且接触于姜黄素下调了此转录因子。这些结果提示NF-κB和STAT3的组成型活化是多发性骨髓瘤患者CD138+细胞的细胞存活因素。
实施例22地塞米松下调多发性骨髓瘤患者CD138+细胞中的组成型NF-κB和STAT3活化目前，地塞米松用作多发性骨髓瘤患者的标准疗法。研究了地塞米松是否也影响多发性骨髓瘤患者细胞中的NF-κB和STAT3。图15的结果说明地塞米松下调了患者#20CD138+细胞中的NF-κB(图15A)和STAT3(图15B)的组成型活化。然而，地塞米松下调二转录因子的效果低于姜黄素。
地塞米松也影响多发性骨髓瘤患者的细胞存活。图16A的结果表明地塞米松减少了患者#20的细胞存活。然而，地塞米松效果比姜黄素低得多(图16B)。
以前曾报导地塞米松能抑制NF-κB活化。本研究第1个显示了地塞米松对STAT3的作用。姜黄素比地塞米松更有效地抑制了多发性骨髓瘤细胞的存活(图16)。由于已确定姜黄素的药理学安全性和其能够下调大量参与细胞存活和化疗抗性的基因表达，故有足够理由联用姜黄素和地塞米松来治疗多发性骨髓瘤患者。近来已批准用蛋白体抑制剂(PS341，称为Velcade)和TNF生成抑制剂(镇静剂)治疗多发性骨髓瘤患者。这些抑制剂也都显示能抑制NF-κB活化。本文所提供的结果提示NF-κB和STAT3是开发治疗多发性骨髓瘤药物的理想靶标。
本文引用了下列参考文献Bharti等，姜黄素(diferuloylmethane)下调人多发性骨髓病细胞中的核因子-kB和IKBa激酶的组成型活化，导致抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡Blood 1011053(2003)。
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Kawamori等，一种天然产生的抗炎制剂姜黄素在结肠癌促长/进展中的化预防作用。Cancer Res.59597-601(1999)。
Manna等，来氟洛米抑制TNF-诱导的细胞反应对NF-kB、激活剂蛋白-1、C-Jun、N-端蛋白激酶的作用和细胞调亡J Immunol.1655962-5969(2000)。
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Rao等，一种天然产生的植物酚类化合物可食用姜黄素对结构肠癌发生的化学预防作用Cancer Res.55259-266(1995)。
此说明书中提到的任何专利或出版物表明了本发明涉及领域技术人员的水平。此外，这些专利和出版物以相同程度纳入本文作参考就好像各单独出版物具体和单独所表明那样纳入本文供参考。
序列表<110>B.艾加瓦尔(Aggarwal，Bharat)<120>用姜黄素治疗人多发性骨髓瘤<130>D6467PCT<140>
<141>2003-06-24<150>US 60/390,926<151>2002-06-24<160>4<210>1<211>9<212>DNA<213>未知<220>
<221>protein-bind<223>结合NfkB p50-p65异源双体的同义DNA序列<400>1gggactttc<210>2<211>28<212>PRT<213>未知<220>
<221>peptide<223>细胞可渗透的NEMO(NF-κB必需调制蛋白；也称为IKKy)-结合域肽<400>2Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp5 10 15Lys Lys Thr Ala Leu Asp Trp Ser Trp Leu Gln Thr Glu20 25<210>3<211>17<212>PRT<213>未知<220>
<221>peptide<223>细胞可渗透的NEMO的对照肽
<400>3Asp Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp5 10 15Lys Lys<210>4<211>45<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒-1<220>
<221>gene<223>来自人免疫缺陷病毒-1长末端重复的NF-_B寡核苷酸<400>4ttgttacaag ggactttccg ctggggactt tccagggagg cgtgg 4权利要求
1.一种抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使所述细胞接触姜黄素，其中所述姜黄素能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖。
2.一种诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使所述细胞接触姜黄素，其中所述姜黄素诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。
3.一种提高化学治疗剂抗多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使所述细胞接触化学治疗剂和姜黄素，其中所述姜黄素能提高所述化学治疗剂抗多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化学治疗剂选自长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、阿霉素、强的松和地塞米松。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多发性骨髓瘤细胞是CD138+浆细胞。
6.一种治疗个体中多发性骨髓瘤的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述个体姜黄素的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述姜黄素口服给药。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述姜黄素给药剂量从约0.01mg/kg个体体重到约500mg/kg个体体重。
9.一种提高化学治疗剂抗个体多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤给予所述个体所述化学治疗剂和姜黄素，其中所述姜黄素能提高所述化学治疗剂抗所述个体多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化学治疗剂选自长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、阿霉素、强的松和地塞米松。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述姜黄素口服给药。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述姜黄素给药剂量从约0.01mg/kg个体体重到约500mg/kg个体体重。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多发性骨髓瘤细胞是CD138+浆细胞。
全文摘要
所有检测的多发性骨髓瘤细胞系均显示组成型活化的I
文档编号A61K31/56GK1674917SQ03819713
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月24日 优先权日2002年6月24日
发明者B·艾加瓦尔 申请人:研究发展基金会