专利名称：组织工程化软骨细胞移植及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物学工程领域，其具体地说是涉及到组织工程化软骨细胞移植及其制备方法。
背景技术：
软骨病是临床常见疾病之一，如由创伤、感染、自身免疫力、肿瘤等因素引起的各种关节表面疾患；耳廓软骨、鼻、喉软骨支架的缺损、畸形；以及儿童骨骺生长板的创伤、早闭、坏死等。因为软骨细胞属于增生能力极弱的终末分化细胞，缺乏再生能力，软骨创伤后的修复甚为困难，所以必须利用软骨或其他替代材料进行修复。自体软骨移植来源有限，容易造成供区缺损影响供区功能，因而在临床应用受到限制。软骨组织移植曾广泛应用，但由于负重及磨损最终使细胞暴露于循环抗体之中而引起免疫排斥反应，目前临床已极少应用。人工合成的生物材料虽可以替换软骨，但存在植入松动及不耐磨损的缺点，且易引起感染而作为异体排除体外。
随着组织工程技术的出现，软骨修复的研究得到了很大的发展。软骨是应用该技术研究最早，也是研究最多、发展最快和最早获得成功的组织之一。其基本方法是将体外培养的有正常功能的软骨组织细胞种植于生物相溶性良好的可被机体降解的天然的或人工合成的细胞载体上，形成细胞-载体复合物，然后回植到体内，以修复软骨缺损，最终达到形成有功能的软骨组织的目的。现阶段软骨组织工程研究主要集中在下述三个方面1)软骨细胞来源研究；2)细胞载体材料的开发及其修饰的研究；3)组织工程化软骨组织构建和对病损组织的替代研究。其中细胞载体材料的组成成分、表面理化特性和载体材料的修饰及塑形与软骨细胞的生物学行为紧密相关，直接所形成软骨组织的形态和功能，成为软骨组织工程支架研究的重要内容。
目前许多天然和人工合成的支架被应用于软骨组织工程，从水凝胶、多孔结构到纤维基质。人工合成材料分为固体和液体材料两种，固体以聚羟基己酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及两者的共聚体为代表。其主要优点可塑形，有一定的强度，但在生物相溶性、理化性能、降解速率的控制等方面尚有许多问题有待解决。如聚羟基己酸(PGA)具有良好的生物想相溶性，作为软骨组织工程支架材料能很好诱导、促进软骨细胞的黏附、增殖和分化，形成软骨组织，但PGA降解较快，易出现崩裂，使PGA整体塌陷。而且由于PGA降解过快，降解产物羟基酸在局部聚集，会造成局部PH值下降，使软骨细胞中毒乃至死亡。液体材料氧化己丙烯(Pluronic)为代表，Pluronic虽然能在有完全免疫功能的动物自体内形成软骨，但该凝胶在常温下可溶于水，从而无法做任何的体外的组织培养实验，材料的降解时间无法在较大范围内调节，并且不能塑形，而且其在体内最终转归及是否会对机体存在不良影响尚不清楚。天然材料以胶原、明胶及纤维蛋白研究较多，其最突出优点是无抗原性，生物相溶性好，与细胞外基质结构相似，参与组织的愈合过程，然而由于其降解太快，在作为软骨细胞支架时往往提前塌陷而达不到诱生软骨组织的目的。由此可见，细胞支架已成为软骨组织工程临床推广应用的主要限制，因而寻找更合适的支架材料已成为软骨组织工程研究的焦点。
另外，软骨组织细胞来源也极为重要，以往常用身体软骨移植，一方面来源有限，而且容易造成供区缺损或影响供区功能，因此在临床应用上受到很大限制。后来曾经广泛应用异体软骨移植，但由于负重及磨损，最终使细胞暴露于循环抗体之中而引起免疫排斥反应，目前已很少在临床上应用。因此，制取体外培养的、有正常功能的软骨细胞，然后和上面所述的生物相溶性好、可被机体接受的人工合成材料形成软骨细胞-载体复合物，即组织工程化软骨细胞移植物，再回植到机体内，以修复软骨缺损，最终达到形成有功能的软骨组织，这是现阶段软骨工程化主要研究的方向。
发明内容
本发明的目的之一，在于选择一种具有药学上可以接受的安全性高、稳定性好、制备方法简单易行、效果更为可靠的合成高分子材料作为细胞工程化软骨细胞移植的载体材料。
本发明的目的之二，在于提供一种通过体外培养，有正常功能的软骨细胞及其在软骨细胞组织工程化技术中的应用。
本发明的目的之三，是选定细胞工程化软骨细胞移植中含有软骨细胞的最佳个数。
本发明通过下面技术方案来实施的本发明的第一方面是选择一种药学上可以接受的聚丙烯酰胺水凝胶作为载体材料，然后将在体外培养具有正常功能的软骨细胞均匀地混合于载体之中，使之成为细胞共和化软骨细胞。
生物体中的许多组织和水凝胶结构相似，生物体组织是由细胞和细胞外基质组成，而细胞外基质成分是由蛋白质、多糖等构成的水凝胶结构，如眼的玻璃体和软骨基质等。聚丙烯酰胺水凝胶是一种新型软组织充填物，含水量可达97％以上作为载体应用时，吸水率一般控制在1-20倍。实践证明聚丙烯酰胺水凝胶具有良好的生物相溶性，是一种新型软组织填充物，可用于体表和体内各组织凹陷性缺损的软组织填充和增大组织的容量，如面部、躯干、四肢、等组织的凹陷，隆胸、颞颊及阴茎增粗，膀胱输尿管反流的填充等。作为长期人体置入材料具有良好的组织相溶性、无免疫原性、无毒性、无刺激性、无热源反应、无致突变及致死性突变效应。具有很好的化学稳定性，长期置入人体不产生化学结构改变，耐腐蚀性好，不产生有毒溶出物。本发明根据上述研究结果，选定聚丙烯酰胺制成的水凝胶作为软骨细胞的载体，开发出一种安全性高、稳定性好、效果突出、操作性强的组织工程软骨细胞移植物。
所述的软骨细胞为体外培养的原代至第六代的自体或同种异体软骨细胞，也可以是经过向软骨细胞表形诱导的胚胎干细胞、组织干细胞、骨髓间质细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、上皮细胞、肌腱细胞，及其与软骨细胞的混合物。
软骨细胞的培养与分离先对人体或动物的软骨提取部位进行局部消毒，取出软骨，可以是关节软骨、肋骨或其他软骨。剥离出去软骨，切成5mm×5mm软骨片，用磷酸盐缓冲液(PBS、含青链霉素各100u/ml)冲洗2次，加入2倍软骨化体积的3mg/ml II型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床内消化8h，用150目尼龙网筛过滤离心。沉淀出来的细胞用PBS洗二次，Ham，F-12培养液制成细胞悬液，悬液中含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300Ug/ml，维生素C 50ug/ml，青、链霉素各100ug/ml，使用前除去上清液，对细胞进行计数再用台盼蓝染色检查软骨细胞活力，活力大于50％的可用软骨组织的构建。
实验方法(包括步骤)将制成的软骨细胞与药学上可以接受的聚丙烯酰胺水凝胶混合，形成移植物，其中所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的自体或同种异体软骨细胞，所述的聚丙烯酰胺水凝胶是药学上可接受，其吸水率控制在1-20倍，最佳为2-12倍。
在移植物中软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml.
所述的软骨细胞也可选自经过向软骨细胞表型诱导的胚胎干细胞、组织干细胞、骨髓间质细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、上皮细胞、肌腱细胞，及其与软骨细胞的混合细胞。
制成组织工程化软骨移植物，可以直接注射到人体或动物的皮下，体表凹陷处或软骨缺损处等各部位，操作方便易行。
图1、实验组植入处大体观察图2、不同时期软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶形成软骨的大体标本(2、8、16、24周)图3、软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶由岛状软骨组织形成，软骨细胞包埋在软骨陷窝内，见有被染成蓝紫色、片状的水凝胶(HE×100，2周)。
图4、软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶的岛状软骨仍然存在，见成熟的软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，在纤维组织中和软骨组织中有被染成蓝紫色、片状的水凝胶，无明显的炎性细胞浸润(HE×100，8周)。
图5、6、软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶形成的岛状软骨仍然存在，软骨组织中被染成蓝紫色、片状的水凝胶仍然存在，未见明显降解，也未见退化和骨化现象，组织学特征和8周相似(HE×100，16，24周)。
实用举例一、软骨细胞的分离长风杂交 猪8周龄，雄性不限，体重6-8Kg。氯胺酮(2mg/Kg)、戊巴比妥纳(0.2ml/Kg)肌肉注射麻醉，局部洁尔灭酊消毒后，取双侧而廓软骨，剥离软骨膜，切成5×5mm大小软骨片，磷酸缓冲液(PBS、含青、链霉素各100u/ml)冲洗两边遍，加入2倍软骨化体积的3mg/ml II型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床内消化8h，用150目尼龙网筛过滤离心，沉淀出来的细胞用PBS洗2次，Ham，F-12培养液制成细胞悬液，悬液中含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300Ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100ug/ml，细胞计数，每头猪约能收获1×108个软骨细胞，台盼蓝染色检查软骨细胞活力，活力大于50％的可用作软骨组织的构建。
二、软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶复合物制备将原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代中的软骨细胞悬液分别离心、倾去上清，将其中一代的细胞沉淀与聚丙烯胺水凝胶充分混匀，制成细胞浓度为40×106/ml细胞-聚丙烯酰胺水凝胶复合物，用2ml注射器吸取复合物备用。
三、软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶复合物体内植入和取材无菌条件下，软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶复合物用粗针头接种于猪自体腹外侧壁真皮下，每点接种0.3ml，注射后用手轻压使之呈半球形。观察注射部位有无红肿、发热、硬结及其软硬度，并与注射后第2、8、16、24周分别取材，对注射后组织反应、毒副反应及形成的组织工程化组织进行评价。
大体观察结果如上述的图1所示，植入处皮肤周围均未出现明显红肿，质地较软，如图2所示，软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶复合物体内不同时间取材形成的软骨呈乳白色，形态为不规则圆片状，有一定弹性，外观和正常软骨形似。
组织学结果如上述的图3、图4、图5、和图6所示，2周时HE染色见软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶有被纤维组织所分割的岛状软骨组织形成，部分成熟软骨细胞埋在软骨陷窝内，在纤维组织中和软骨组织中有被染成蓝紫色、片状的水凝胶，无明显的炎性细胞浸润，也无新生血管长入。8周时HE染色见软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶形成的岛状软骨仍然存在，见成熟的软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，在纤维组织中和软骨组织中有被染成蓝紫色、片状的水凝胶，无明显的炎性细胞浸润。16、24周时HE染色见软骨细胞-聚丙烯酰胺水凝胶形成的岛状软骨仍然存在，软骨细胞中被染成蓝紫色、片状的水凝胶仍然存在，未见明显降解，也未见退化和骨化现象，组织学特征和8周相似。
比较现有技术，本发明的优点及积极效果所述的组织工程化软骨移植物的材料，可以是直接注射到皮下、体表凹陷处或软骨缺损处等人体或动物内各个部位，方法简单易行。应用聚丙烯酰胺水凝胶作为细胞载体，构建了一种新的安全性更高、效果更可靠、稳定性更好、操作性更强的组织工程化软骨移植物。临床表明，本发明的材料移植于人体或动物体内后，于不同时间取样，证明已形成的软骨呈乳白色，形态为不规则，有一定弹性，外观和组织细胞学特征与正常软骨相似。采用这种软骨组织工程技术，可彻底避免了应用其他细胞载体材料可能导致的细胞毒性和形成软骨退化、钙化等不良现象。
权利要求
1.一种工程化软骨移植物，其特征在于选用药学上可接受的聚丙烯酰胺水凝胶为载体，将软骨细胞均匀复合于载体中制成软骨细胞-载体复合物。
2.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于所述的移植物载体中含有软骨细胞的量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
3.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于所述的聚丙烯酰胺水凝胶是由丙烯酸、甲基丙烯酰胺聚合物，是一种富含亲水基因的三维网状结构高分子材料，其干重含量约为2.8％，溶胀后水量可达到97％以上。具有良好的生物相溶性，实际应用中吸水率一般掌握在1-20倍，最佳为2-12倍。
4.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的自体或同种异体软骨细胞。
5.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于所述的软骨细胞也可以是来源于经过向软骨细胞表型诱导的胚胎干细胞、组织细胞、骨髓间质细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、上皮细胞、肌腱细胞，及其与软骨细胞的混合细胞。
6.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于所述的软骨细胞表达II型胶原。
7.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于移植物中可以添加或复合其他各种细胞，生长因子和各种转基因成分。以保持软骨细胞生长和基质合成能力。
8.如权利要求1所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于将原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代中的软骨细胞悬液分别离心、倾去上清后计数，然后将其中的一代软骨细胞与药学上可以接受的丙烯酰胺水凝胶混合，制成软骨细胞-载体复合物。
9.如权利要求8所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于聚丙烯酰胺水凝胶含水量为原来干态的1-20倍，水凝胶中含软骨细胞量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
10.如权利要求8所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，特征在于所述软骨细胞为体外培养原代至第六代的自体或同种异体软骨细胞获得软骨部位没有特别限制，可以是关节软骨、肋骨或其他处软骨。
11.如权利要求8所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于所述的软骨细胞也可以是来源于经过经过向软骨细胞表型诱导的胚胎干细胞、组织干细胞、骨髓间质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、肌腱细胞及其与软骨细胞的混合物。
12.如权利要求8、9或10所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其特征在于软骨细胞制备时，先对软骨提取部分进行消毒，取出软骨，剥离软骨膜，并切成5×5mm大小的软骨片，用磷酸盐缓冲液(PBS、含青链霉素各100u/ml)冲洗2次，加入2倍软骨化体积的3mg/ml II型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床内消化8h，用150目尼龙网筛过滤离心，沉淀出来的细胞用PBS洗二次，Ham，F-12培养液制成细胞悬液，悬液中含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300Ug/ml，维生素C 50ug/ml，青、链霉素各100ug/ml，细胞计数，用台盼蓝染色检查软骨细胞活力，活力大于50％的可用作软骨组织的构建。
全文摘要
本发明提供了一种组织工程化软骨移植物，它包括(a)药学上可以接受的聚丙烯胺水凝胶；(b)软骨细胞，所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的软骨细胞，或经过向软骨细胞表型诱导的胚胎干细胞、组织干细胞、骨髓间质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、肌腱细胞及其与软骨细胞的混合细胞。本发明的组织工程化软骨可有效治疗软骨缺损和体表凹陷性缺损。本发明还提供了该组织工程化软骨的制备制法和用途。
文档编号A61L27/50GK1626251SQ20031010920
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月9日 优先权日2003年12月9日
发明者曹谊林, 夏万尧 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院