具有含肽涂层的生物医学装置的制作方法

专利名称：具有含肽涂层的生物医学装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及涂有肽的医学装置和给医学装置涂肽的方法。更具体地，本发明提供了在其表面形成了稳定的抗微生物肽涂层的医学装置，该涂层是通过所述抗微生物肽的亲核部分与医学装置表面中的潜在羧酸基团进行反应、由此形成酯和/或酰胺键形成的。
背景技术：
用于人体内和人体上的装置是众所周知的。这样的装置表面的化学组成在决定装置的总体功效方面起关键作用。这些装置中，已经用涂层来增强理想的性质。在一个实例中，许多装置(包括导管、支架、透镜和植入物)需要生物学不污的表面，即细菌、蛋白、脂类和细胞不会粘附到表面。涂层会赋予医学装置这些特征。在另一个实例中，给这样的装置涂布抗微生物表面，可以减少与微生物有关的感染，也是有利的。
已经开发了众多方法来涂布装置表面，以给它们提供理想的特征。但是，仍然需要能提供稳定涂层的简单、有效的方法。
发明详述和优选实施方案本发明提供了生产具有稳定的表面抗微生物肽涂层的装置的简单的、经济的方法。“抗微生物的”是指，粘附在装置表面上的细菌比未涂布的表面减少了约30％或更多。“生物活性的”是指，表面能在使用过程中为周围环境提供有益的性质。合适的生物活性剂，特别对于隐形眼镜而言，包括肽，所述肽为但不限于下述的肽亲水肽、抗微生物肽、阳离子肽、阴离子肽等。
本发明提供了生产生物医学装置的方法，其包括下述步骤、基本由下述步骤组成和由下述步骤组成固化(curing)包含至少一种潜在的羧酸活性组分的活性单体混合物，固化所述的活性单体混合物，形成制品，在涂布条件下，使所述的制品与包含亲核部分的抗微生物肽涂层组合物反应，形成有涂层的制品。在另一个实施方案中，本发明提供了生物医学装置，其包括下述内容、基本由下述内容组成和由下述内容组成涂肽的生物医学装置。
“生物医学装置”是指设计为在人组织或液体或两者的内部或表面使用的任何装置。这样的装置的实例包括但不限于支架、植入物、导管和眼科透镜。在一个优选的实施方案中，生物医学装置是眼科透镜，包括但不限于隐形眼镜或眼内透镜。更优选地，装置是隐形眼镜。
本发明意外地发现，羧酸酯官能团可以容易地整合进多种聚合物制品中，并随后与肽等涂层组分中的亲核部分反应。本发明的方法提供了使多种肽涂层共价地结合到成形的聚合物制品上的方便的方法。本发明的肽涂层是稳定的，且能提供理想的性质强化。“稳定的”是指，对涂层进行高压灭菌、用清洁剂洗涤和/或用盐水溶液冲洗，基本上不会改变该生物医学装置或涂层的化学性质。
本发明使用的潜在的活性组分包括但不限于式R-CO-L的酯化合物，其中，R包含能进行阳离子聚合、阴离子聚合或自由基聚合的基团，L是离去基团。合适的R基团包括包含至多20个碳原子的能进行自由基和/或阳离子聚合的单价基团。优选的R基团包括自由基反应基团，例如丙烯酸酯、苯乙烯基、乙烯基、乙烯基醚、C1-6烷基丙烯酸酯、丙烯酰胺、C1-6烷基丙烯酰胺、N-乙烯基内酰胺、N-乙烯基酰胺、C2-12链烯基、C2-12链烯基苯基、C2-12链烯基萘基、或C2-6链烯基苯基C1-6烷基，或阳离子反应基团，例如乙烯基醚或环氧基和其混合物。特别优选的R基团包括甲基丙烯酸酯、丙烯酰氧(acryloxy)、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺和其混合物。
合适的L在反应条件下是稳定的，且能保护羧酸酯基团，并能在涂布条件下容易地离去。合适的L基团包括烷基酯、苯酯、羟基对硝基芳基、对硝基苯酯、N-羟基胺衍生物和甲苯磺酸酯，它们都可以是取代的或未取代的。优选的L基团包括叔丁酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基-氧代二氢苯并三嗪衍生物、1-羟基苯并三唑酯、甲苯磺酸酯和其组合。优选的合适的L基团包括五氟苯酯、甲苯磺酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯和其混合物。优选的潜在的活性化合物包括五氟甲基丙烯酸酯和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和其混合物等。
潜在的活性组分以涂布有效量包含在单体混合物中。足以为涂层聚合物提供理想水平的结合位点的任何量都是足够的。合适的量包括约0.01至10重量％、优选约0.01至5重量％、更优选约0.01至1重量％，都基于活性组分的总重量。
潜在的活性组分可以加入到任意的透镜材料中，但是对于不含有羧酸基团的透镜材料是特别有用的。合适的透镜材料包括硅水凝胶(silicone hydrogel)。用于制备硅水凝胶的活性组分是已知的，包括含有聚硅氧烷的组分、亲水组分和任选的含氟组分。合适的含有聚硅氧烷的组分包括含有聚硅氧烷的单体、预聚物和大分子单体。合适的含氟组分包括含氟单体、预聚物和大分子单体。
合适的含有硅氧烷的单体包括3-甲基丙烯酰氧-2-羟丙基氧)丙基三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(SiGMA)、3-甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(TRIS)、美国专利4,711,943所述的TRIS的酰胺类似物、美国专利5,070,215所述的氨基甲酸乙烯基酯或碳酸乙烯基酯类似物和美国专利6,020,445中的单体，它们在这里引作参考。更具体地，3-甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(TRIS)、单甲基丙烯酰氧丙基封端的聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、3-甲基丙烯酰氧丙基二(三甲基甲硅烷氧基)甲基硅烷、甲基丙烯酰氧丙基五甲基二硅氧烷和其组合是特别有用的含有硅氧烷的单体。
合适的含有硅氧烷的大分子单体的数均分子量为约5,000至约15,000道尔顿。含有硅氧烷的大分子单体包括含有至少一个硅氧烷基、优选至少一个二烷基硅氧烷基、更优选至少一个二甲基硅氧烷基的材料。含有硅氧烷的大分子单体可以包括其它组分，例如氨基甲酸乙酯基团、亚烷基或烯化氧基团、聚氧化烯(polyoxyalkalene)基团、亚芳基、烷基酯、酰胺基、氨基甲酸酯基团、全氟烷氧基、异氰酸酯基团、其组合等。通过一种或多种硅氧烷与一种或多种丙烯酸或甲基丙烯酸材料的聚合，可以形成优选种类的含有硅氧烷的大分子单体。通过基团转移聚合(“GTP”)、自由基聚合、缩合反应等，可以形成含有硅氧烷的大分子单体。根据选择的组分，使用本领域已知的条件，可以在一步或一系列的步骤中形成含有硅氧烷的大分子单体。具体的含有硅氧烷的大分子单体和它们的生产方法包括US5,760,100中公开的材料A-D(甲基丙烯酸酯官能化的聚硅氧烷-氟醚代氨基甲酸乙酯和甲基丙烯酸酯官能化的聚硅氧烷氨基甲酸乙酯)和US6,367,929中公开的那些(羟基官能甲基丙烯酸酯和聚硅氧烷甲基丙烯酸酯的苯乙烯官能化的预聚物)，其公开内容在这里引作参考。
合适的含有硅氧烷的活性预聚物包括氨基甲酸乙烯基酯官能化的聚二甲基硅氧烷，其还公开在US5,070,215中，和基于氨基甲酸乙酯的预聚物，其包含交替的短链二醇和二异氰酸酯反应形成的“硬”段和从相对高分子量的聚合物形成的“软”段，所述聚合物用2个活性氢进行α、ω封端。合适的含有硅氧烷的预聚物和它们的生产方法的具体实例公开在US5,034,461中，其在这里引作参考。
通常，含有硅氧烷的组分的量为约5至约50重量％、优选约10至约50重量％、更优选约15至约45重量％，都基于活性组分的总重量。
合适的含氟单体包括含氟的(甲基)丙烯酸酯，更具体地包括例如(甲基)丙烯酸的含氟的C2-C12烷基酯，例如(甲基)丙烯酸2，2，2-三氟乙基酯、(甲基)丙烯酸2，2，2，2′，2′，2′-六氟异丙基酯、(甲基)丙烯酸2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基酯、(甲基)丙烯酸2，2，3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十五氟辛基酯、(甲基)丙烯酸2，2，3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9-十六氟壬基酯等。含氟大分子单体和活性预聚物包括大分子单体和预聚物，其包括所述的含氟单体。含氟组分的量可以为约0至约10重量％。
本发明的活性组分还可以包含用于制备常规水凝胶的任意的亲水单体。例如，可以使用含有丙烯酸基团(CH2＝CRCOX，其中R是氢或C1-6烷基，X是O或N)或乙烯基(-C＝CH2)的单体。其它的亲水单体的实例是N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-羟乙基酯、单甲基丙烯酸甘油酯、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、单甲基丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基-N-甲基乙酰胺、N-乙烯基-N-乙基乙酰胺、N-乙烯基-N-乙基甲酰胺、N-乙烯基甲酰胺和其组合。
除了上述的亲水单体外，可以使用聚氧乙烯多元醇，其有一个或多个末端羟基取代为含有可聚合的双键的官能团。实例包括如US5,484,863公开的聚乙二醇，如US5,690,953、US5,304,584公开的乙氧基化的烷基葡糖苷，和如US5,565,539公开的乙氧基化的双酚A，它们与一或多摩尔当量的封端基团反应，所述封端基团例如异氰酸乙酯基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、乙烯基苯甲酰氯等，生成具有一个或多个末端可聚合的烯基(olefinic group)的聚乙烯多元醇，所述的烯基通过连接部分(例如氨基甲酸酯、脲或酯基团)与聚乙烯多元醇结合。
其它的实例包括美国专利号5,070,215公开的亲水的碳酸乙烯基酯或氨基甲酸酯乙烯基单体、美国专利号4,910,277公开的亲水的噁唑酮单体和聚葡聚糖(polydextran)。
优选的其它的亲水单体是N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)、甲基丙烯酸2-羟乙基酯(HEMA)、甲基丙烯酸甘油酯、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、单甲基丙烯酸聚乙二醇酯和其组合，包含DMA的亲水单体是特别优选的。其它的亲水单体的量可以为约0至约70重量％、更优选约5和约60重量％、最优选约10和约50重量％，基于活性组分的总重量。
活性组分还可以含有其它的组分，例如交联剂、光敏引发剂、可见性着色剂等。在存在稀释剂的情况下，将活性组分混合在一起，形成反应混合物。合适的稀释剂公开在US 6,020,455中。
本领域通常已知的其它组分或添加剂也可以包含在活性单体混合物和/或透镜材料中。添加剂包括但不限于能吸收紫外线线的化合物和单体、活性颜料(tint)、抗微生物化合物、色素、光致变色化合物、脱模剂、其组合等。
合适的透镜材料包括aquafilcon A，balafilcon A，lotrafilcon A等。
已知多种在隐形眼镜的生产中使反应混合物成型的方法，包括旋转铸造(spincasting)和静态浇铸(static casting)。旋转铸造方法公开在美国专利号3,408,429和3,660,545中，静态浇铸方法公开在美国专利号4,113,224和4,197,266中。生产含有本发明的聚合物的隐形眼镜的优选方法是通过硅水凝胶的直接成型，该方法是经济的，且能对水合的透镜的最终形状进行精确控制。为此方法，将反应混合物置于具有最终需要的硅水凝胶(即水溶涨聚合物)的形状的模具中，使反应混合物处于能使单体聚合的条件中，从而生产出具有最终需要的产品的近似形状的聚合物。然后，任选地用溶剂、且再用水处理该聚合物混合物，生产出具有最终大小和形状的硅水凝胶，其与原始模制的聚合物制品的大小和形状非常相似。该方法可以用于形成隐形眼镜，且还记载在美国专利号4,495,313；4,680,336；4,889,664和5,039,459中，其在这里引作参考。
已经形成生物医学装置后，使其与含肽涂层反应。为了进行涂布，可以使用任意的能与羧酸酯反应、形成酯或酰胺的肽化合物。合适的含肽涂层含有一个或多个亲核部分，例如醇、伯胺和仲胺和硫醇官能团。这些含肽涂层包含含有这些官能团的肽、其混合物等。合适的肽包括含有胺、醇和/或硫醇官能团的天然肽和合成肽。在本发明的最广泛的实施方案中，选择的肽的序列不是关键的，只要该肽包含一个或多个上述的官能团，该官能团能根据本发明的方法进行附着。合适的天然的阳离子肽的实例包括防卫素、爪蟾抗微生物肽和大肠菌素，具体的实例包括鱼精蛋白、蜂毒肽、杀菌肽A和乳链菌肽。鱼精蛋白分离自多种动物(包括但不限于人)的精子。蜂毒肽分离自蜂毒。杀菌肽A和乳链菌肽分别分离自埃及伊蚊(Aedes aegypti)和乳酸乳球菌(Lactoccucus lactis)。在本发明中使用的鱼精蛋白、蜂毒肽、杀菌肽A和乳链菌肽都是市购的。这些阳离子肽和蛋白还可以通过已知的方法生产。为了本发明的目的，使用的阳离子肽的纯度通常是至少约75％、优选至少约90％。
或者，可以使用合成的肽和蛋白。具体的实例包括合成的肽，其包含蜂毒肽(mellitin)的15-26段，段ATLISWIKNKRKQ和鱼精蛋白的1-17段，段BRPRVSRRRRRRGGRRRR它们存在于肽中的任意位置。肽还可以包含第三段C，其可以是任意的连接基团，其不会在哺乳动物细胞中抑制肽的活性、或诱导毒性，且其包含0至约10个氨基酸的间隔区。如本文所定义的“氨基酸”是指具有化学式-HN-(CR1R2)n-CO-的任意结构，其中，n是1至21的整数，R1和R2独立地选自H、直链的或分支的具有1-4个碳原子的烷基、直链的或分支的具有1-2个碳原子的羟基、直链的或分支的具有1-3个碳原子的烷硫基基团、具有1-3个碳原子的氨基甲酰基、具有1-3个碳原子的羧基、具有1-4碳原子和1-3个氮原子的伯氨基和仲氨基、苄基、苯酚、苯基吲哚和N，N-吡咯。优选地，n是1至10的整数，且R1和R2中的至少一个是H，另一个选自上述的基团。合成肽的A、B和C段可以是任意的次序，且可以部分地或全部地重复。在一个优选的实施方案中，A和B段是在末端位置，且在另一个优选的实施方案中，合成肽具有式ACB或BCA，且C包含至多5个氨基酸。
本发明还包括这样的肽，其是本文列举的那些的肽的保守变异。如本文使用的术语“保守变异”是指这样的多肽，其中至少一个氨基酸被替换为另一个生物上类似的残基。保守变异的实例包括一个疏水残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，或者一个极性残基取代另一个，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。可以取代另一种的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
如本文所使用的，术语“肽”是指多肽的基本化学结构，其是本领域熟知的，且已经记载在本领域的教科书和其它出版物中。在该背景下，本文使用的术语是指任意的含有2个或多个通过肽键成直链地彼此连接的氨基酸的肽或蛋白。如本文所使用的，该术语是指短链，其在本领域中通常也称作例如肽、寡肽和寡聚体，也指长链，其在本领域中通常也称作蛋白，它们存在许多类型。应当指出，多肽经常含有20个氨基酸(通常称作20个天然氨基酸)以外的氨基酸，且可以修饰特定多肽中的许多氨基酸，包括末端氨基酸，所述修饰通过天然方法，例如加工和其它的翻译后修饰，还通过本领域熟知的化学修饰技术。尽管在多肽中天然产生的常见修饰多得在本文中难以穷尽列举，但是它们已经详细地记载在基础文献、更详细的专论和众多的研究文献中，它们是本领域的技术人员熟知的。在已知的可以存在于本发明的多肽中的修饰中，解释性地举几个例子乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价附着，血红素部分的共价附着，核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着，脂类或脂类衍生物的共价附着，磷脂酰肌醇的共价附着，交联，环化，二硫键形成，脱甲基化，共价交联物的形成，胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧基化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘化，甲基化，肉豆蔻化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊二烯基化，外消旋化，硒酰化(selenoylation)，硫酸盐化，转运-RNA介导的氨基酸向蛋白的添加，例如精氨酰化和遍在蛋白化。这些修饰是本领域的技术人员熟知的，且已经详细地记载在科学文献中。几种特别常见的修饰，例如糖基化、脂类附着、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化，已经记载在最基础的文献中，例如PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)。可以得到许多关于该主题的详细的综述，例如Wold，F.，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives和Prospects，pgs.1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter等，(1990)，Meth.Enzymol.182，626-646和Rattan等，“Protein SynthesisPosttranslationalModifications and Aging”，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.663，48-62。应当理解，正如众所周知的和上面指出的，多肽不总是完全线性的。例如，翻译后的事件可以导致多肽(线性的和非线性的)的产生，包括天然的加工事件，以及通过不会天然发生的人工操纵发生的事件。另外，通过非翻译的天然方法和完全的合成方法，可以合成环状的、分支的和分支的环状多肽。修饰可以发生于多肽的任意位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。实际上，在天然的和合成的多肽中，经常发生通过共价修饰对多肽的氨基或羧基或二者的封闭，这样的修饰也可以存在于本发明的多肽中。例如，在蛋白水解处理之前，在大肠杆菌(E.coli)或其它细胞中制备的多肽的氨基末端残基几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。在肽的翻译后修饰过程中，可以删除NH2-末端处的甲硫氨酸残基。因此，本发明预期含有甲硫氨酸的和缺少甲硫氨酸的本发明蛋白的氨基末端变体的用途。在多肽中产生的修饰一般由其如何制备决定。例如，对于通过在宿主中表达克隆的基因制备的多肽，修饰的性质和程度大部分由宿主细胞的翻译后修饰能力和存在于多肽氨基酸序列中的修饰信号决定。例如，如众所周知的，糖基化一般不会发生在细菌宿主中，例如大肠杆菌。因此，当需要糖基化时，应当在糖基化宿主(通常是真核细胞)中表达多肽。昆虫细胞通常能进行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化作用，鉴于该原因，已经开发了昆虫细胞表达系统，以有效地表达尤其具有糖基化自然模式的哺乳动物蛋白。类似的观点也适用于其它的修饰。应当理解，相同种类的修饰可以以相同的或不同的程度存在于特定的多肽中的几个位点。同样，特定的多肽可以含有许多种类的修饰。通常，如本文所使用的，术语多肽包括所有的这样的修饰，特别是存在于通过在宿主细胞中表达多核苷酸重组地合成的多肽中的那些修饰。
如本文所使用的“Melimine”是指包含下述氨基酸序列的多肽T-L-I-S-W-I-K-N-K-R-K-Q-R-P-R-V-S-R-R-R-R-R-R-G-G-R-R-R-R其中T是苏氨酸，L是亮氨酸，I是异亮氨酸，S是丝氨酸，W是色氨酸，K是赖氨酸，N是天冬酰胺，R是精氨酸，Q是谷氨酰胺，P是脯氨酸，V是缬氨酸，G是甘氨酸。如本文所使用的，L-melimine包含自然存在的上述氨基酸序列。氨基酸的旋光异构体会发生自发的非酶促的外消旋化。每种氨基酸的速度随给定的温度或pH(保藏条件)而异，但是D异构体比L异构体更快。如本文所使用的L-或D-肽可以包含约99％的L或D异构体，分别在pH7和温度约25℃。
L-氨基酸是生物系统中的天然形式，因此D-异构体对酶促分解更有抗性，且可以具有提高的持久性。可以开发该性质，使用立体异构体的混合物生成理想水平的活性和寿命，用于特定的应用。所以，对于需要长期持久性的应用，优选使用具有优势(大于约50％、优选大于约70％)的D异构体的立体异构体的混合物。当需要更大的抗菌活性时，优选使用具有优势(大于约50％、优选大于约70％)的L异构体的立体异构体的混合物。
如本文所使用的“Protattin”是指包含下述氨基酸序列的多肽R-P-R-V-S-R-R-R-R-R-R-G-G-R-R-R-R-T-L-I-S-W-I-K-N-K-R-K-Q其中，氨基酸如上文定义。
为了本发明的目的，使用的阳离子肽通常是基本上纯的。
如本文所使用的，术语“基本上纯的”是指蛋白或其生物活性部分基本上不含有来自细胞或组织源(该蛋白源自它)的细胞材料或其它的污染蛋白，或者当化学合成时，基本上不含有化学前体或其它的化学制剂。表述“基本上不含有细胞材料”包括其中的蛋白是从细胞(从中分离或重组生产蛋白)的细胞组分中分离出来的蛋白制品。因此，基本上不含有细胞材料的蛋白包括具有低于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的异源蛋白(在本文中也称作“污染蛋白”)的蛋白制品。当重组生产蛋白或其生物活性部分时，其还优选地基本上不含有培养基，即培养基低于约20％、10％或5％体积的蛋白制品。当化学生产合成蛋白时，其优选地基本上不含有化学前体或其它化学制剂，即其是从蛋白合成所涉及的化学前体或其它化学制剂中分离出来的。因此，这样的蛋白制品具有低于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的目标多肽以外的化学前体或其它化学制剂。
使用标准的肽合成技术，可以化学合成本发明的肽。或者，可以在体外翻译和/或转录系统中合成本发明的肽。
使用常规的固相肽合成技术，可以合成多肽。这样的方法是本领域的技术人员熟知的。下面描述了使用固相合成技术制备多肽的方法，但是不以任意方式将本发明的范围限制为该方法。合成可以在任意的合适的合成树脂上进行。合适的树脂包括可溶的交联聚苯乙烯树脂等。一般使用芴基甲氧基羰基等保护氨基酸，并用N-羟基苯并三唑和任选的二异丙基碳二亚胺(DIC)活化，以促进它们的偶联。使用(但不限于)三氟乙酸或氨，将完成的肽从树脂上切割下来，并通过反相高效液相层析(HPLC)纯化得到的材料，此后，将候选材料从水/乙腈混合物中冻干成干燥粉末。
还可以使用体外翻译和/或转录系统生产本发明的多肽。这样的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，合成的能编码Melimine或Protattin的mRNA可以在各种无细胞的系统中有效地翻译，所述系统包括但不限于麦胚抽提物和网织红细胞提取物。或者，合成的包含处于T7启动子控制下的Melimine或Protattin的编码序列的DNA可以在体外转录和翻译系统中有效地转录和翻译，所述系统例如TNT T7偶联的网织红细胞裂解物系统，其商购自Promega。可以通过本文所述的方法纯化得到的多肽。优选的含肽涂层聚合物包括melimine、protattin和其组合。
在本发明的方法中，要涂布的表面与涂层肽以任意的方便的方式接触。例如，可以将装置置于涂层肽、溶剂和偶联添加剂的溶液中。
在本发明中使用的合适的溶剂是非亲核的溶剂，其能溶解涂层肽，且不与生物医学装置消极地反应。合适的溶剂包括但不限于DMF、DMSO、乙酸乙酯、DPMA、其混合物等。优选的溶剂包括DMF和DPMA。
装置在适于形成涂层的条件下与溶剂/涂层肽溶液接触。合适的温度包括在选择的溶剂的凝固点和沸点之间、优选约0至约100℃、更优选约20至约50℃的温度。使用的接触时间是足以将表面涂布到理想的程度的时间长度。接触时间可以至多约2天、优选至多约1天、最优选至多约12小时。在本发明的涂布反应中，压力不是至关重要的。但是，本领域的技术人员能够认识到，高压和高温会使要进行的反应需要更短的时间。
偶联添加剂是能使装置和要形成的肽涂层之间的酰胺和/或酯键比没有它们的加入时更容易形成的任意化合物，其包括但不限于酯交换试剂、其催化剂等。实例包括4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，1，3-二异丙基碳二亚胺，1，3-二环己基碳二亚胺，1-羟基苯并三唑(HOBt)，1-羟基苯并三唑水合物，冠醚，酸，碱，酶，其组合等。
使用了涂布有效量的涂层肽，是指足以将表面涂布到需要的程度的量。通常，使用的涂层肽的量是约0.1至约20重量％、优选约0.5至约10重量％、更优选约0.8至约5重量％涂层溶液。
接触后，可以用水或缓冲盐水溶液洗涤表面，以除去无关的(或未反应的)肽、离去基团、溶剂和副产物。任选地，可以将涂肽的表面在水中加热，以提取残余的肽、离去基团和副产物，以确保可能形成的离去基团复合物的分解。
参考下面的非限制性的实施例，可以进一步阐明本发明。在实施例中使用了下面的实验。
使用Perkin-Elmer Spectram GX FTIR AutoIMAGE系统，用FTIR-ATR行扫描技术分析了透镜的涂层。在透镜的中央区域，以300微米的递增步骤从一边到另一边进行了所有的行扫描。所有的样品都在湿状态进行了分析。
如下所述检测了前进接触角。通过从透镜切出宽约5mm的中央带、并在填充溶液中平衡，制备了来自每组的至少3个样品。当样品浸入或拉出盐水时，使用Wilhelmy微量天平，在23℃测量了透镜表面和硼酸盐缓冲盐水之间的润湿力。使用了下面的方程F＝2γpcosθ或θ＝cos-1(F/2γp)其中，F是润湿力，γ是探测液体的表面张力，p是弯液面处样品的周长，且θ是接触角。从润湿实验的一部分得到了前进接触角，其中样品浸入在填充溶液中。每个样品循环4次，取结果的平均值，得到了透镜的前进接触角。
通过如下步骤测量了混浊度(haze)在平黑背景以上在环境温度，将水合的实验透镜置于装在透明的20×40×10mm玻璃测定池中的硼酸盐缓冲盐水中，用纤维光学灯(Titna Tool Supply Co.，在4-5.4的功率设定具有的0.5”直径光控制装置的纤维光学光)从下面沿透镜测定池法线方向66°角照射，并用置于透镜平台以上14mm处的摄影机(DVC 1300C19130 RGB摄像机，具有Navitar TV Zoom 7000变焦距透镜)，捕获上面的与透镜测定池垂直的透镜的图像。通过使用EPIX XCAP V 1.0软件减去空白测定池的图像，从透镜的散射中减去背景散射。通过在透镜中央的10mm上积分，然后与-1.00屈光度的CSI Thin Lens(它任意地设定为100混浊度值，没有透镜设定为0混浊度值)对比，定量地分析了减去的散射的光图像。分析了5个透镜，取结果的平均值，产生作为标准CSI透镜的百分比的混浊度值。
如下所述检测了水含量将要测试的透镜置于填充溶液中24小时。使用末端包有海绵的棉拭，从填充溶液中取出3个实验透镜中的每一个，并置于已经用填充溶液润湿的吸水擦上。透镜的两侧与擦子接触。使用镊子，将实验透镜置于称量盘上并称重。如上所述制备了超过2组样品，并称重。将盘称重3次，取平均值作为湿重。
通过将样品盘置于已经在60℃预热了30分钟的真空烘箱中，测量了干重。采用的真空达到至少0.4英寸汞柱。关闭真空阀和泵，干燥透镜4小时。打开放气阀，使烘箱达到大气压。取出盘子，称重。如下计算水含量湿重＝盘和透镜的总湿重-称量盘的重量干重＝盘和透镜的总干重-称量盘的重量％水含量＝(湿重-干重)/湿重×100记录计算出的样品的水含量的平均值和标准偏差。
使用装配有测压元件(load cell)(其降低至起始计量高度)的运动型张力试验机的恒定速度的十字头，测量了模量。合适的试验机包括Instron型号1122。将八字试块形的样品(其具有0.522英寸的长度、0.276英寸的“耳”宽度和0.213英寸的“颈”宽度)装入夹子中，以2英寸/分钟的恒定速度的张力拉伸，直到其断裂。测量了样品的起始计量长度(Lo)和断裂时的样品长度(Lf)。检测了每种组合物的12个样品，记录平均值。在应力/张力曲线的起始线性部分，检测了抗张模量。
在下面的实施例中，通过Cole和Ralston(1994)开发的方法，定量了结合的肽。使用滤过的在10％乙酸和10％异丙醇中的0.025％考马斯染料，在37℃对隐形眼镜染色2-24小时。在10％乙酸和10％异丙醇中，在37℃对透镜脱色。然后在25％吡啶中提取透镜过夜。使用25％吡啶作为空白，用分光光度计在A600分析了提取的溶液。通过将提取物与标准曲线(通过吸取已知量的L-Melimine到半干丙烯酰胺凝胶上并如上提取来构建，该方法能从凝胶中提取所有量的肽)相关联，确定了L-Melimine的定量。
实施例实施例1在氮、环境温度下，向放在干箱(dry box)内的干容器中加入30.0g(0.277mol)双(二甲基氨基)甲基硅烷，13.75ml 1M TBACB溶液(386.0g TBACB在1000ml无水THF中)、61.39g(0.578mol)对二甲苯、154.28g(1.541mol)甲基丙烯酸甲酯(相对于引发剂是1.4当量)、1892.13(9.352mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙基酯(相对于引发剂是8.5当量)和4399.78g(61.01mol)THF的溶液。向装配有热电偶和冷凝器(都连接到氮源上)的干三颈圆底烧瓶中，装入上面的在干箱中制备的混合物。
将反应混合物冷却至15℃，同时搅拌，并用氮吹洗。溶液达到15℃后，将191.75g(1.100mol)1-三甲基甲硅烷氧基-1-甲氧基-2-甲基丙烯(1当量)注射入反应容器中。反应放热至约62℃，然后将30ml0.40M溶液(154.4g TBACB在11ml无水THF中)计量加入反应的整个残余物中。反应温度达到30℃并开始计量后，加入467.56g(2.311mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙基酯(相对于引发剂是2.1当量)、3636.6g(3.463mol)正丁基单甲基丙烯酰氧丙基-聚二甲基硅氧烷(相对于引发剂是3.2当量)、3673.84g(8.689mol)TRIS(相对于引发剂是7.9当量)和20.0g双(二甲基氨基)甲基硅烷的溶液。
使混合物放热至约38-42℃，然后冷却至30℃。此时，加入10.0g(0.076mol)双(二甲基氨基)甲基硅烷、154.26g(1.541mol)甲基丙烯酸甲酯(相对于引发剂是1.4当量)和1892.13g(9.352mol)甲基丙烯酸2-(三甲基甲硅烷氧基)乙基酯(相对于引发剂是8.5当量)的溶液，并使混合物再放热至约40℃。使反应温度降至约30℃，并加入2加仑THF以降低粘度。加入439.69g水、740.6g甲醇和8.8g(0.068mol)二氯乙酸的溶液，使混合物回流4.5小时，以对HEMA上的保护基团解封闭。然后去除挥发物，并加入甲苯以辅助去除水，直到达到110℃的蒸汽温度。
使反应烧瓶维持在约110℃，并加入443g(2.201mol)TMI和5.7g(0.010mol)二月桂酸二丁锡的溶液。使混合物反应至异氰酸酯峰消失(通过IR)。在减压下蒸发甲苯，生成灰白色的无水的蜡状活性单体。以约2∶1的丙酮与大分子单体的重量比，将大分子单体置于丙酮中。24小时后，加入水，沉淀出大分子单体，将大分子单体过滤，并使用真空烘箱在45-60℃干燥20-30小时。
实施例2通过加入100份表1所示的组分(以表1所示的量)以及20份3，7-二甲基-3-辛醇，形成了反应混合物。更具体地，以下面的次序，向琥珀烧瓶中加入大分子单体、Norbloc 7966、稀释剂、TEGDMA、HEMA、DMA、TRIS和mPDMS。这些组分在170-300rpm、50-55℃混合90-180分钟。在维持混合的同时，加入蓝HEMA，再混合组分20-75分钟(在170-300rpm，50-55℃)。仍然混合，加入PVP，再搅拌混合物另外的20-140分钟(在170-300rpm，50-55℃)。最后，在连续混合下，加入CGI 1850(Irgacure 1850)。
表1
将甲基丙烯酸五氟苯基酯(OPfp)(0.5重量％)加入反应混合物中。剧烈搅拌反应混合物约10分钟(或直到溶液外观澄清且均匀地混合)，然后在高真空下脱气，直到在反应混合物中看不到气泡(约20分钟)。将反应混合物置于热塑性的隐形眼镜模具中，在50℃、N2气氛下，用Philips TL 20W/03T荧光灯泡照射约50分钟。在DowanolDPMA(DPMA，商购自Aldrich)中对透镜脱模。在DPMA中洗涤透镜至多5次。每次洗涤持续约120分钟。将透镜单独地置于装有2mL 2.5mg/mLmelimine和0.05重量％N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)在二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液的小瓶中。用灰色丁基塞塞住小瓶(含有透镜和溶液)，然后在37℃、100rpm连续振荡下，在振荡培养器中温育18小时。
温育后，除去每个小瓶的溶剂。然后向每个小瓶中加入约9mL新鲜DMF溶剂。1小时后，去除溶剂，重新加入相同体积的新鲜DMF溶剂。该过程重复共计4次，每次间隔1小时。第4次溶剂改变后，将透镜直接置于室温的去离子(D1)水中，并以1小时的间隔洗涤4次。第4次洗涤后，将透镜置于室温的填充溶液中1小时，然后在121℃高压灭菌30分钟。测量了透镜的性能，如下面的表2所示。
实施例3重复了实施例2，只是将偶联添加剂加入含有Melimine的涂层溶液中。所以，完全按照实施例2，将在DPMA溶剂中释放和洗涤后的透镜单独置于装有3mL 5mg/mL N-羟基苯并三唑(HOBt)于DMF的溶液的小瓶中。使用校正过的移液器，向每个小瓶中加入50μL二异丙基碳二亚胺(DIC)。20分钟后，使用校正过的Eppendorf移液器，向每个小瓶中加入1mL 3mg/mL melimine于DMF中的溶液(含有0.05重量％N，N＇-二异丙基乙胺(DIPEA))。用灰色丁基塞塞住小瓶。然后在37℃、100rpm连续振荡下，在振荡培养器中温育透镜19小时。
温育后，除去每个小瓶的溶剂。然后向每个小瓶中加入约9mL新鲜DMF溶剂。1小时后，去除溶剂，重新加入相同体积的新鲜DMF溶剂。该过程重复共计4次，每次间隔1小时。第4次溶剂改变后，将透镜直接置于室温的去离子水中，并以1小时的间隔洗涤4次。第4次洗涤后，将透镜置于室温的填充溶液中1小时，然后在121℃高压灭菌30分钟。测量了透镜的性能，如下面的表2所示。
表2
实施例4-7重复了实施例3，只是改变了melimine涂层溶液的浓度和洗涤方法。所以，完全按照实施例3，将在DPMA溶剂中释放和洗涤后的透镜单独置于装有3mL 5mg/mL N-羟基苯并三唑(HOBt)于DMF的溶液的小瓶中。使用校正过的移液器，向每个小瓶中加入50μL二异丙基碳二亚胺(DIC)。约60分钟后，使用校正过的Eppendorf移液器，在室温，向每个小瓶中加入1mL表3所示的各种浓度的melimine涂层溶液于DMF中的溶液(含有0.05重量％N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA))。用灰色丁基塞塞住小瓶。然后在37℃、100rpm连续振荡下，在振荡培养器中温育透镜19小时。
温育后，将透镜转移到装有300mL新鲜DMF和磁力搅拌器的400mL烧杯中。在DMF中搅拌透镜1小时。该过程再重复3次(共4次)。第4次溶剂改变后，将300mL去离子水加入烧杯中，用去离子水洗涤透镜共4次。第4次洗涤后，将透镜置于装有填充溶液的小瓶中，然后在121℃高压灭菌30分钟。测量了透镜的性能，如下面的表3所示。标准偏差示于括号中。
表3
N/M表示未测量。
权利要求
1.生产涂布的生物医学装置的方法，其包含下述步骤使从包含至少一种潜在的活性组分的活性混合物形成的生物医学装置的至少一个表面与涂布有效量的至少一种含肽涂层接触。
2.权利要求1的方法，其中所述的生物医学装置是隐形眼镜。
3.权利要求2的方法，其中所述的潜在的活性组分是至少一种式R-CO-L的酯化合物，其中，R包含能进行阳离子聚合、阴离子聚合或自由基聚合的基团，L是离去基团。
4.权利要求3的方法，其中所述的R基团选自丙烯酸酯、苯乙烯基、乙烯基、乙烯基醚、C1-6烷基丙烯酸酯、丙烯酰胺、C1-6烷基丙烯酰胺、N-乙烯基内酰胺、N-乙烯酰胺、C2-12链烯基、C2-12链烯基苯基、C2-12链烯基萘基、C2-6链烯基苯基C1-6烷基、乙烯基醚和环氧基。
5.权利要求3的方法，其中所述的R基团选自甲基丙烯酸酯和丙烯酰氧。
6.权利要求3的方法，其中所述的L基团选自羟烷基、羟芳基、羟基对硝基芳基、烷基酯、苯酯、对硝基苯酯、N-羟基胺衍生物和甲苯磺酸酯，它们都可以是取代的或未取代的。
7.权利要求3的方法，其中所述的L基团选自叔丁酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基-氧代-二氢苯并三嗪衍生物和1-羟基苯并三唑酯。
8.权利要求3的方法，其中所述的至少一种潜在的活性化合物包含五氟甲基丙烯酸酯、N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和其混合物。
9.权利要求3的方法，其中所述的潜在的活性组分是以约0.01至约10重量％的量包含在活性混合物中，基于活性组分的总重量。
10.权利要求3的方法，其中所述的潜在的活性组分是以约0.01至约5重量％的量包含在活性混合物中，基于活性组分的总重量。
11.权利要求3的方法，其中所述的潜在的活性组分是以约0.01至约1重量％的量包含在活性混合物中，基于活性组分的总重量。
12.权利要求2的方法，其中所述的活性混合物包含至少一种含有聚硅氧烷的组分和至少一种亲水组分。
13.权利要求2的方法，其中所述的含肽涂层选自防卫素、爪蟾抗微生物肽、大肠菌素和其组合。
14.权利要求2的方法，其中所述的含肽涂层选自鱼精蛋白、蜂毒肽、杀菌肽A、乳链菌肽melimine、protattin和其组合。
15.权利要求2的方法，其中所述的含肽涂层选自鱼精蛋白、蜂毒肽、melimine、protattin和其组合。
16.权利要求2的方法，其中所述的含肽涂层包含至少一种阳离子肽。
17.权利要求2的方法，其中所述的含肽涂层包含至少一种合成肽，其包含任意次序的3段A、B和C，其中，段A是具有下述序列的肽TLISWIKNKRKQ段B是具有下述序列的肽RPRVSRRRRRRGGRRRR段C是至多10个氨基酸的连接基团，其不会在哺乳动物细胞中抑制肽的抗微生物活性或诱导毒性，并且其包含0至约10个氨基酸的间隔区。
18.权利要求17的方法，其中，段C具有式-HN-(CR1R2)n-CO-，其中，n是1至21的整数，R1和R2独立地选自H、直链的或分支的具有1-4个碳原子的烷基、直链的或分支的具有1-2个碳原子的羟基、直链的或分支的具有1-3个碳原子的烷硫基基团、具有1-3个碳原子的氨基甲酰基、具有1-3个碳原子的羧基、具有1-4碳原子和1-3个氮原子的伯氨基和仲氨基、苄基、苯酚、苯基吲哚和N，N-吡咯。
19.权利要求17的方法，其中，n是1至10的整数，R1和R2中的至少一个是H。
20.权利要求17的装置，其中，段A和B是在末端位置，并且段C包含至多5个氨基酸。
21.权利要求1的方法，其中所述的接触步骤包含将所述的装置置于包含所述的涂层肽和溶剂的溶液中。
22.权利要求21的方法，其中所述的溶剂选自DMF、DMSO、乙酸乙酯、DPMA和其混合物。
23.权利要求21的方法，其中所述的溶剂包含DMF、DPMA或其混合物。
24.权利要求21的方法，其中所述的接触步骤包含所述溶剂的凝固点和沸点之间的温度。
23.权利要求21的方法，其中所述的接触步骤包含约0和约100℃之间的温度。
24.权利要求21的方法，其中所述的接触步骤包含约20和约50℃之间的温度。
25.权利要求21的方法，其中所述的接触步骤包含至多约2天的接触时间。
26.权利要求21的方法，其中所述的接触步骤包含至多约12小时的接触时间。
27.权利要求21的方法，其中所述的溶液还包含至少一种偶联添加剂。
28.权利要求21的方法，其中所述的偶联添加剂选自4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1，3-二异丙基碳二亚胺、1，3-二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基苯并三唑水合物、冠醚、酸、碱、酶和其组合。
29.生物医学装置，其从包含至少一种潜在的活性组分的反应混合物形成，其中所述的装置涂布有涂布有效量的至少一种含肽涂层。
30.权利要求29的装置，其中所述的生物医学装置是隐形眼镜。
31.权利要求29的装置，其中所述的潜在的活性组分是至少一种式R-CO-L的酯化合物，其中，R包含能进行阳离子聚合、阴离子聚合或自由基聚合的基团，L是离去基团。
32.权利要求29的装置，其中所述的活性混合物包含至少一种含有聚硅氧烷的组分和至少一种亲水组分。
33.权利要求29的装置，其中所述的涂层肽包含一个或多个选自醇、伯胺、仲胺、硫醇和其组合的亲核部分。
全文摘要
本发明提供了具有稳定的肽涂层的生物医学装置。涂层是如下所述形成的将至少一种潜在的活性组分加入活性混合物中，从所述的活性混合物形成医学装置，并使所述的医学装置与涂布有效量的涂层肽相接触，以使所述的涂层通过酯或酰胺键结合到所述表面。
文档编号A61L27/14GK1726057SQ200380106492
公开日2006年1月25日 申请日期2003年12月18日 优先权日2002年12月19日
发明者D·扎尼尼 申请人:庄臣及庄臣视力保护公司