专利名称：用作激酶抑制剂的取代的吡咯并吡唑衍生物的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及吡咯并吡唑衍生物，涉及它们制备方法，涉及含有它们的药用组合物，以及涉及它们作为治疗剂的用途，特别是用于癌症和细胞增殖性疾病的治疗。
背景技术：
许多细胞毒性药物诸如，例如，氟脲嘧啶(5-FU)、阿霉素以及喜树碱，可以损伤DNA或影响细胞代谢途径，从而在许多情况下引起对细胞周期的间接的阻断。因此，由于对正常细胞以及肿瘤细胞均会产生不可逆的损伤，这些药物会引起明显的毒性和副作用。
因此，需要化合物能够作为高度特异性的抗肿瘤剂，其选择性地引起肿瘤细胞生长停止和凋亡，而与目前可以采用的药物效力相当但毒性降低。
众所周知，细胞周期的进程受一系列关卡点(也可以称其为限制点)的控制，这些限制点受一族称为细胞周期蛋白依赖性的蛋白激酶(Cdk)的酶的控制。而Cdk本身又在许多水平(例如与细胞周期蛋白的结合)上受到控制。
不同的Cdk/细胞周期蛋白复合物的协调的激活和失活是正常细胞周期进程所必需的。关键性的G1-S和G2-M转变均受到不同的Cdk/细胞周期蛋白活性激活的控制。在G1中，Cdk4/细胞周期蛋白D和Cdk2/细胞周期蛋白E被认为可以调节S-期的开始。经过S-期的进程需要Cdk2/细胞周期蛋白A的活性，而Cdc2/细胞周期蛋白A(Cdk1)和Cdc2/细胞周期蛋白B的激活是分裂开始所必须的。关于细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的一般性文献可以参见，例如，KevinR.Webster等，Exp.Opin.Invest.Drugs，1998，Vol.7(6)，865-887。
肿瘤细胞中的关卡点控制是有缺陷的，部分原因是由于cdk活性的失控。例如，在肿瘤细胞中观察到了细胞周期蛋白E和cdk表达的改变，并且证实了小鼠cdk抑制剂p27KIP基因的缺失会引起更高的癌症发病率。
有越来越多的证据支持cdk是细胞周期进程的限速酶的观点，它因此代表了治疗性干预的分子靶点。具体地讲，对cdk/细胞周期蛋白激酶活性地直接抑制将有助于限制失控的肿瘤细胞增殖。
发明概述本发明的目的是提供用于治疗由改变的细胞周期依赖型激酶活性引起的和/或与之相关的疾病的化合物。本发明的另一个目的是提供具有cdk/细胞周期蛋白激酶抑制活性的化合物。
本发明人目前已经发现某些吡唑化合物被赋予了ckd/细胞周期蛋白激酶抑制活性，因此可以作为抗肿瘤剂用于治疗并且没有目前的抗肿瘤药物的上述缺点，包括毒性和副作用方面。
更具体地，本发明的吡唑衍生物可用于治疗各种癌症，包括但不限于癌症，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌，包括小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌，包含鳞状细胞癌；淋巴系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、非Hodgkin淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burkett淋巴瘤；骨髓系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病；源于间质的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；其它肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、着色性干皮病(xenoderomapigmentosum)、角质黄色瘤(keratoctanthoma)、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
由于cdk在调节细胞增殖中的重要作用，这些吡唑衍生物还可用于治疗各种细胞增殖性疾病，例如，良性前列腺增生、家族性息肉状腺瘤病、神经纤维瘤病、牛皮癣、与动脉粥样硬化有关的血管平滑肌细胞增殖、肺纤维化、关节炎、肾小球肾炎以及手术后的狭窄和再狭窄。
由于cdk5与微管相关蛋白的磷酸化有关(J.Biochem.117，741-749，1995)，本发明的化合物还可用于治疗阿耳茨海默病。
作为细胞凋亡的调节剂，本发明的化合物还可用于治疗癌症、病毒感染、在HIV感染的个体中预防AIDS的发展、以及治疗自身免疫疾病和神经变性疾病。
本发明的化合物还可用于抑制肿瘤血管生成和转移，以及器官移植排斥反应和宿主相对移植物的疾病。
本发明的化合物还可用作其它蛋白激酶，例如，以不同同种型存在的蛋白激酶C、Met、PAK-4、PAK-5、ZC-1、STLK-2、DDR-2、Aurora1、Aurora2、Bub-1、PLK、Chk1、Chk2、HER2、raf1、MEK1、MAPK、EGF-R、PDGF-R、FGF-R、IGF-R、PI3K、weel激酶、Src、Abl、Akt、MAPK、ILK、MK-2、IKK-2、Cdc7、Nek，且因此可以有效地治疗与这些蛋白激酶相关的疾病。
本发明的化合物还可以用于治疗和防止放射疗法引发的或者化学疗法引发的脱发。
因此，本发明提供了治疗由改变的细胞周期依赖性的激酶活性引起的或与之相关的细胞增殖性疾病的方法，该方法包括向需要治疗的哺乳动物施用有效量的式(Ia)或(Ib)所示的吡唑衍生物 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自a)直链或支链的C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基；d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个空位中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链或者支链C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；前提是在式(Ia)中，当R1为式(IIc)的基团并且Rd和R’d的一个为氢原子而Rd和R’d中的另一个为乙基或者正丁基时，则R不为-CORa，其中Ra为3-溴苯基、苄基、4-叔丁基苯基、4-叔丁基苯基甲基、4-氟苯基甲基、环丙基或者2-萘基甲基；或者它们药物上可接受的盐。
在上述方法的一个优选的实施方案中，细胞增殖性疾病选自癌症、阿耳茨海默病、病毒感染、自身免疫疾病和神经变性疾病。
可以进行治疗的特定类型的癌症包括癌、鳞状细胞癌、骨髓或淋巴系的造血系统肿瘤、源于间质的肿瘤、中枢和外周神经系统的肿瘤、黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、着色性干皮病、角质黄色瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
在上述方法的另一个优选的实施方案中，细胞增殖性疾病选自良性前列腺增生、家族性息肉状腺瘤病、神经纤维瘤病、牛皮癣、与动脉粥样硬化有关的血管平滑肌细胞增殖、肺纤维化、关节炎、肾小球肾炎以及手术后的狭窄和再狭窄。此外，本发明方法提供对肿瘤血管生成和转移的抑制以及对器官移植排斥和宿主相对移植物疾病的治疗。本发明的方法还可以提供细胞周期抑制作用或cdk/细胞周期蛋白依赖的抑制。
除此之外，本发明的方法目的提供对放射疗法引发的或者化学疗法引发的脱发的治疗和预防。
本发明还提供式(Ia)或者(Ib)所表示的吡唑衍生物 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；
R1选自a)直链或支链C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基；d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个空位中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链的或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链或者支链C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；前提是在式(Ia)中，当R1为式(IIc)的基团并且Rd和R’d中的一个为氢原子而Rd和R’d中的另一个为乙基或者正丁基时，则R不为-CORa，其中Ra为3-溴苯基、苄基、4-叔丁基苯基、4-叔丁基苯基甲基、4-氟苯基甲基、环丙基或者2-萘基甲基；或者它们药物上可接受的盐。
本发明还提供了式(Ia)或(Ib)所示的吡唑衍生物的合成的方法，除非另有规定，可以方便地被组合并且定义为式(I)的化合物。本发明还包括含有式(I)的吡唑衍生物的药用组合物。
参照如下详细描述，可以更完整地理解本发明，并且可以更好地理解本发明所具有的许多优点。
发明详述许多杂环化合物在本领域中已知用作蛋白激酶抑制剂。作为一个例子，2-羧酰胺-吡唑和2-脲基-吡唑，以及它们的衍生物，已经作为蛋白激酶抑制剂公开在国际专利申请WO01/12189、WO01/12188、WO02/48114、和WO02/70515中，均以申请人本身名字申请。
包含吡唑部分并且具有激酶抑制活性的稠二环化合物，也已经公开在WO00/69846和WO02/12242以及WO03/028720(PCT/EP02/10534，其要求了US专利申请No.09/962162的优先权2001年9月26日)中以及同时待审的PCT/EP03/04862(其要求了US专利申请60/381092的优先权2002年5月17日)，均以申请人本身名字申请。
本发明的化合物对象包含在前述WO02/12242中的通式的范围内，在此引用作为参考，但是在此不特别举例。
除非特别说明，当涉及式(I)的化合物本身以及其任意的药物组合物或者含有它们的任意的治疗处理时，本发明包括本发明的化合物的所有水合物、溶剂化物、络合物、代谢物和前药。前药为任意的共价键化合物，其在体内释放按照式(I)的活性母药。
式(I)的化合物的代谢物为相同的式(I)的化合物在体内(例如给药至有需要的哺乳动物后)转变成的任意的化合物。
一般地，不代表限制性的实例，给药式(I)的化合物后，相同的衍生物可以转变成各种化合物，例如包括诸如羟基衍生物的多种水溶性衍生物，其易于排泄。因此，依靠如此产生的代谢途径，这些羟基衍生物中的任意一种均可以被认为是式(I)的化合物的代谢物。
如果本发明的化合物中存在手性中心或者另一种形式的异构体中心，所有形式的所述异构体，包括对映异构体和非对映异构体，均包含在此。含有手性中心的化合物可以作为外消旋混合物、对映体富集的混合物使用，或者外消旋混合物可以用公知技术被分离以及个别对映异构体可以单独使用。在含有未饱和的碳-碳双键的化合物中，顺式(Z)和反式(E)异构体均在本发明的范围内。在可能存在于互变异构体中的化合物中，诸如酮-烯醇互变异构体，每种互变异构体形式不论在一种形式中是否以平衡量或大多数存在都包含在本发明中。
在这里的描述中，除非另外说明，术语直链或支链C1-C6烷基，由此广泛包括C1-C4烷基，我们意指像例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基等的基团。
除非另外说明，术语C3-C6环烷基我们意指诸如环丙基、环丁基、环戊基和环己基的环脂肪环。
术语芳基包括含有1至2个环部分的碳环或杂环烃，其是稠合的或彼此通过单键连接，其中至少有一个环是芳香族的；如果存在的话，任意的芳香杂环烃也也被称为杂芳基，其含有具有1至3个选自N、NH、O或S的杂原子或者杂原子基团的5至6元环。
按照本发明的芳基的例子为，例如，苯基、联苯基、α-或β-萘基、二氢萘基、噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、异吲哚基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、二氢喹啉基、喹噁啉基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、茚满基、茚基、三唑基等。
除非另外说明，术语杂环或杂环基包括含有1至3个选自N、NH、O或S的杂原子或杂原子基团的5至6元饱和的、部分未饱和的或者全部未饱和的杂环。
除了之前作为芳香杂环提及的以及通过术语芳基所包括的全部未饱和的杂环，按照本发明的饱和的或部分未饱和的杂环的例子为，例如，吡喃、吡咯烷、吡咯啉、咪唑啉、咪唑啉酮、吡唑烷、吡唑啉、噻唑啉、噻唑烷、二氢呋喃、三氢呋喃、1，3-二氧戊烷、哌啶、哌嗪、吗啉等。
当提及本发明的其中R1为(b)的组的化合物时，R1本身可以代表给定的环烷基基团，例如环丙基；给定的环烷基烷基基团，例如环丙基甲基；或者是给定的烷基-环烷基基团，例如甲基环丙基；它们均具有下式 环烷基 环烷基-烷基 烷基-环烷基当提及本发明的其中R1为式(IIa)基团的化合物时，5至7元杂环通过X原子直接连接至分子的其余部分，如下所示 这些5至7元杂环的例子包括那些已经提及的任意5至6元杂环，以及，诸如例如氮杂、二氮杂、氧氮杂(oxazepine)等的7元杂环。
任意的Rc，如果存在的话，在式(IIa)的杂环的任一空位取代氢原子。
当提及本发明的其中R1为式(IIc)或(IId)基团的化合物时，脲基和氨基甲酸酯衍生物可以由此鉴定，具有下式 按照本发明，除非另外说明，任意上述的Ra、Rb和Rc基团可以任选地在它们的任意空位上被一个或多个基团取代，例如1至6个基团，独立地选自卤原子、硝基、氧代基(＝O)、氰基、烷基、多氟化烷基、多氟化烷氧基、烯基、炔基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环基、环烷基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂环基氧基、亚甲二氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、环烯基氧基、亚烷基氨基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、环烷基氧基羰基、氨基、脲基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、甲酸基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂环基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷氧基亚胺基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、甲酸基、烷基羰基、芳基羰基、环烷基羰基、杂环基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基硫基以及烷基硫基。
在此方面，以术语卤原子我们意指氟、氯、溴或者碘原子。
以术语烯基或炔基我们意指任意前述的进一步含有双键或三键的直链或支链的C2-C6烷基基团。本发明的烯基或炔基基团的非限制性的实例为，例如，乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、4-戊烯基等。
以术语多氟烷基或烷氧基我们意指任意上述被多于一个的氟原子取代的直链或支链的C1-C6烷基或烷氧基基团，例如，三氟甲基、三氟乙基、1，1，1，3，3，3-六氟丙基、三氟甲氧基等。
以术语烷氧基、芳基氧基、杂环基氧基、以及它们的衍生物我们意指通过氧原子(-O-)连接至分子的剩余部分的任意上述烷基、芳基或者杂环基基团。
如上所述，对于本领域技术人员而言清楚的是，基于复合名称的任何基团诸如，例如，环烷基烷基、芳基烷基、杂环基烷基、烷氧基、烷基硫基、芳基氧基、芳基烷基氧基、烷基羰基氧基、芳基烷基、杂环基烷基等，意指它们由衍生部分常规构成。作为一个例子，诸如杂环基烷氧基的基团为烷氧基基团，例如，烷氧基，其中烷基部分进一步被杂环基取代，并且其中的烷基和杂环基如上文所定义。
式(I)的化合物的药物上可接受的盐包括与无机酸或有机酸的加成盐，例如，硝酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、高氯酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、草酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、羟乙磺酸和水杨酸。优选地，本发明的化合物的酸加成盐选自盐酸和甲磺酸盐。
式(I)的化合物的药物上可接受盐还包括与无机或有机碱的盐，例如，碱金属或碱土金属，特别是钠、钾、钙或镁氢氧化物、碳酸盐或者碳酸氢盐，非环的或环胺类，优选甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、哌啶等。
第一类优选的式(Ia)或者(Ib)的化合物由其中R为基团-CORa，Ra如上定义并且R1为叔丁基的衍生物表示。
另一类优选的式(Ia)或者(Ib)的化合物由其中R为基团-CONHRa，Ra如上文定义并且R1为叔丁基的衍生物表示。
另一类优选的式(Ia)或者(Ib)的化合物由其中R为基团-CONRaRb，Ra和Rb如上文定义并且R1为叔丁基的衍生物表示。
另一类优选的式(Ia)或者(Ib)的化合物由其中R为上文定义的并且R1为选自下面的式(IIa)基团的衍生物表示 其中Rc如上定义。
另一类优选的式(Ia)或者(Ib)化合物由其中R为上文定义的并且R1为选自下面的式(IIa)基团的衍生物表示 其中n和Rc如上定义。
在上述类型中，特别优选该式(Ia)的化合物，其中R为基团-CORa，且Ra为4-氟苯基或环丁基，并且R1如通式中所定义。
还特别优选该式(Ia)的化合物，其中R如通式中所定义，并且R1为选自叔丁基、1-甲基-哌啶基-4-基、1-甲基-哌嗪基-4-基、2-(R，S)-四氢呋喃基-2-基、2-(R)-四氢呋喃基-2-基或者2-(S)-四氢呋喃基-2-基的基团。
对于本发明的式(I)的任意特别的化合物，任选以其药物上可接受盐的形式存在，参见实验部分。
如上所显示的，本发明的进一步的目的通过制备式(I)的化合物的过程表示。
因此，式(I)的化合物和药物上可接受的盐可以通过下面的过程获得，其包含a)将式(IIIa)或(IIIb)的化合物 与丙稀腈反应以获得相应的式(IVa)或者(IVb)的衍生物 b)保护式(IVa)或者(IVb)化合物的氨基基团以获得相应的式(Va)或(Vb)的衍生物 其中Q为合适的氨基保护基团；c)将式(Va)或(Vb)的化合物与合适的烷基化试剂反应以获得相应的式(VIa)或(VIb)的酯衍生物 其中Alk代表合适的C1-C4烷基基团；d)将式(VIa)或(VIb)的化合物与氢化钠(NaH)反应以获得相应的式(VIIa)或(VIIb)的衍生物。
e)将式(VIIa)或(VIIb)的化合物与水合肼反应以获得式(VIIIa)或(VIIIb)的化合物 f)将式(VIIIa)或(VIIIb)的化合物与氯甲酸乙酯反应以获得式(IXa)或(IXb)的衍生物，各以两种区域异构体的任一种形式存在 并且将式(IXa)或(IXb)的化合物按照可替代步骤(g.1)、(g.2)或(g.3)中的任一种反应g.1)与式(X)的化合物反应RaCO-Z(X)
其中Ra如上文定义并且Z为卤原子，以获得式(XIa)或(XIb)的化合物 其中R为基团-CORa；g.2)与式(XII)的化合物反应Ra-NCO(XII)其中Ra如上文所定义，以获得式(XIa)或(XIb)的化合物，其中R为基团-CONHRa；或者g.3)与合适的的式(XIII)的胺在三光气或者合适的氯甲酸酯存在下反应HNRaRb(XIII)其中Ra和Rb如上文定义，以获得式(XIa)或者(XIb)的化合物，其中R为基团-CONRaRb；h)将按照(g.1)至(g.3)的任一步骤制备的式(XIa)或(XIb)化合物的氨基基团去保护，以获得相应的式(XIVa)或(XIVb)的衍生物 其中R如上文所定义；并且将式(XIVa)或(XIVb)的化合物按照可替换步骤(i.1)、(i.2)、(i.3)或(i.4)的任一种反应i.1)与式(XV)的酰卤衍生物反应R1-COZ(XV)其中R1如在式(Ia)或(Ib)中的基团(a)、(b)、(c)、具有X作为碳原子的(IIa)和(IIb)中所描述的，并且Z为卤原子，以获得式(XVIa)或(XVIb)的化合物 其中R和R1如上文定义；i.2)与式(XVII)的5至7元杂环化合物或者合适的式(XVIII)的胺在三光气存在下反应 HN(Rd)R′d(XVIII)其中X为NH并且Y、Rc、n、Rd以及R’d如上文定义，以获得相应的式(XVIa)或者(XVIb)的化合物，其中R如上文定义并且R1或为式(IIa)的基团，其中的X为氮原子以及R、Y、Rc和n如上文定义，或R1为式(IIc)的基团，其中的Rd和R’d如上文定义；i.3)与式(XIX)的羧酸在合适的缩合剂存在下反应R1-COOH(XIX)以获得式(XVIa)或者(XVIb)的化合物，其中R1如在式(Ia)或(Ib)中的基团(a)、(b)、(c)、具有X作为碳原子的(IIa)和(IIb)中所描述的，并且R、Y、Rc和n如上文定义；i.4)与式(XX)的化合物反应R1-COZ(XX)其中R1为式(IId)基团并且Z为氯或溴原子，以获得式(XVIa)或(XVIb)的化合物，其中R如上文定义并且R1为式(IId)的基团；以及j)将按照从(i.1)至(i.4)任一步骤制备的式(XVIa)或(XVIb)的化合物在碱性条件下反应，以获得相应的式(Ia)或(Ib)的衍生物，其中R和R1如上文定义；以及，任选地，k)将它们转化成其它的式(Ia)或(Ib)的化合物，分别地，和/或它们的药物上可接受的盐。
上述过程可以是按照本领域公知的方法实施的类似过程。
根据上述内容，对于本领域技术人员清楚的是，如果按照上述过程制备的式(Ia)或(Ib)的化合物以异构体混合物的形式获得，则根据常规技术实施的将它们分离为式(Ia)或(Ib)的单一异构体也在本发明的范围内。
同样的，根据本领域的公知方法将它们相应的盐转化为游离化合物(Ia)或(Ib)也在本发明的范围内。
按照该方法的步骤(a)，式(IIIa)或(IIIb)的化合物与在合适的碱，例如氢氧化钠的存在下与丙稀腈反应。反应优选在大约-10℃至室温的温度范围内的水中进行。
按照该方法的步骤(b)，式(IVa)或(IVb)的化合物的氨基基团按照常规方法被保护，例如采用叔丁氧基羰基酐(Boc2O)并且在诸如乙腈或二氯甲烷的合适的溶剂存在下，以获得相应的式(Va)或(Vb)的衍生物，其中氨基保护基团Q表示叔丁氧基羰基(boc)。
按照该方法的步骤(c)，式(Va)或(Vb)的化合物的羧基基团被转化成相应的烷基酯衍生物，例如在诸如碘甲烷的合适的烷基卤存在下进行。
反应在诸如二甲基酰胺的合适溶剂的存在下以及在碱性条件下进行，例如通过使用碳酸氢钠或碳酸氢钾。
按照该方法的步骤(d)，式(VIa)或(VIb)的化合物通过与氢化钠反应转变成相应的式(VIIa)或(VIIb)的环状衍生物。反应在诸如二噁烷或者四氢呋喃的合适的溶剂存在下在回流温度下进行。
按照该方法的步骤(e)，式(VIIa)或(VIIb)的化合物与水合肼反应，优选与过量的肼一水合物反应，例如高至10当量，在诸如卤化烃、低级醇或它们的混合物的合适的溶剂存在下。反应优选在乙醇存在下进行，通过加入肼至式(VIIa)或(VIIb)化合物的溶液中并且搅拌合适的时间，例如大约48小时，在大约20℃至大约70℃的温度范围内。优选的，上述反应在还有冰醋酸存在的条件下进行。
按照该方法的步骤(f)，式(VIIIa)或(VIIIb)的化合物与乙基氯甲酸酯反应以获得相应的式(IXa)或(IXb)的衍生物。反应按照公知的反应条件，在诸如二异丙基乙胺的合适的碱以及诸如四氢呋喃的合适溶剂存在下进行。
显然，乙氧基羰基基团可能连接至式(VIIIa)和(VIIIb)的化合物的任一吡唑氮原子上以产生下面的式(IXa)或(IXb)的区域异构体 在此方面，每一对式(Ixa)或(Ixb)的区域异构体可以通过公知方法方便地被分离，例如在色谱条件下，并且由此随后得到分离出的每种区域异构体。在另一种可选择的方法中，区域异构体的混合物可以如在该方法随后的步骤中那样被处理，不用进行任何的分离。
事实上，导致两种不同的区域异构体的乙氧基羰基基团在过程的最后被移去。本领域技术人员清楚上述两种方法均可以实施以制备本发明的式(Ia)或(Ib)的化合物。
优选地，无论如何，该方法通过先从它们的混合物中分离出式(IXa)或(IXb)的区域异构体，如操作实施例中所述进行，并且随后将它们与目标化合物反应而实施。
按照该方法的步骤(g.1)，式(IXa)或(IXb)的化合物与式(X)的合适的衍生物反应，其中Z代表卤原子，优选为氯或溴。
一般地，式(IXa)或(IX6)的化合物溶解于诸如二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二噁烷等合适的溶剂中，并且加入诸如三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钠等的合适的碱。随后加入式(X)的化合物并且混合物搅拌大约2至大约15个小时的时间，在约20℃至约80℃的温度范围内。
可以任选使用诸如二甲基氨基-吡啶的合适的催化剂。
按照该方法的步骤(g.2)，式(IXa)或(IXb)的化合物通过基本上如在该方法的步骤(g.1)中所述的操作与式(XII)的异氰酸酯衍生物反应，除了不需要碱。
按照该方法的步骤(g.3)，式(IXa)或(IXb)的化合物与式(XIII)的胺在三光气或合适的氯甲酸酯，例如4-硝基苯基氯甲酸酯存在下反应，以获得相应的脲基衍生物。反应在四氢呋喃(THF)或者在合适的卤化烃，优选二氯甲烷(DCM)中，且在诸如二异丙基乙胺或三乙胺的合适的胺存在下在约-70℃至室温的温度范围内进行。
按照该方法的步骤(h)，在式(XIa)或(XIb)中保护的胺基团在公知的操作条件下去保护，例如在三氟乙酸或盐酸存在的酸性条件下。
式(XIa)或(XIb)的化合物随后在诸如二氯甲烷或二噁烷的合适的溶剂中混悬，并且用所选酸的浓缩溶液处理。或者，优选使用气体氯化氢溶于二噁烷中(4M HCl)的商品溶液。混合物随后在约20℃至约40℃的温度范围内搅拌约2个小时至约15个小时的时间。
按照该方法(i.1)、(i.2)、(i.3)或(i.4)中的任一步骤，式(XIVa)或(XIVb)的化合物进一步的与合适的衍生物反应以获得式(XVIa)或(XVIb)的相应的羧酰胺、脲基或氨基甲酸酯衍生物。步骤(i.1)用式(XV)的芳基卤化物，优选为氯化物在诸如二氯甲烷的合适的溶剂中且在碱性条件下，例如在诸如二异丙基乙胺的合适的胺存在下进行。
反应获得(XVIa)或(XVIb)的羧酰胺衍生物，其中R1如在式(I)中的基团(a)至(c)、具有X作为碳原子的(IIa)和(IIb)中所描述的；从上述可知，对本领域的技术人员清楚的是，直接连接至式(XVIa)或(XVIb)的羰基部分的R1基团的原子为碳原子。
步骤(i.2)用式(XVII)或式(XVIII)胺的杂环衍生物，在三光气存在下进行，基本上如该方法的步骤(g.3)所述。
在此方面，步骤(i.2)获得式(XVIa)或(XVIb)的脲基衍生物，其中R1为X为氮原子的式(IIa)或式(IIc)的基团并且其中Y、Rc、n、Rd和R’d如上文定义。
同样，步骤(i.3)的缩合用式(XIX)的羧酸衍生物在诸如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)或者O-苯并三唑基四甲基异脲(tetramethylisouronium)四氟硼酸盐(TBTU)的合适的缩合剂存在下，通过按照制备羧酰胺衍生物的公知的方法处理。
按照该方法的步骤(i.4)，式(XIVa)或(XIVb)的化合物与适合的式(XX)衍生物反应，其中R1是式(IId)基团且Re如式(Ia)或(Ib)所示，以获得相应的(XVIa)或(XVIb)的氨基甲酸酯衍生物。
在这方面，将式(XIVa)或(XIVb)化合物溶解于诸如二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二噁烷等合适的溶剂中，随后加入诸如三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钠等合适的碱。随后加入通式(XX)的化合物并且混合物在约20℃至约80℃的温度范围内搅拌约2个小时至约15个小时的时间。按照优选的实施例，可以任选使用诸如二甲基氨基吡啶的催化剂。
按照该方法的步骤(j)，在从(i.1)至(i.4)的任一步骤中获得的式(XVIa)或(XVIb)的化合物与合适的碱，例如三乙胺在诸如甲醇或乙醇的合适的溶剂的存在下反应以获得式(Ia)或(Ib)的目标化合物。
最后，如通过该方法的步骤(k)，这些较晚得到的化合物(Ia)或(Ib)可以如前面所描述的并且按照常规的方法任选地转变成药物上可接受的盐或者，可选择的，可以转变成式(Ia)或(Ib)的附加化合物。
仅作为非限制性的实例，具有羧基酯功能的式(Ia)或(Ib)的化合物可以按照本领域中公知的将羧基酯基团转变成羧酰胺、N-取代的羧酰胺、N，N-二取代的羧酰胺、羧酸等的方法转变成各种衍生物。
反应进行的条件为本领域中广泛公知的那些并且可以包括，例如在羧基酯基团至羧酰胺基团的转变中，与氨或氨水在诸如低级醇、二甲基甲酰胺或者它们混合物的合适溶剂存在下的反应；优选反应在甲醇/二甲基甲酰胺混合物中在约50℃至约100℃的温度范围内与氨水进行。
类似的反应条件应用于N-取代的或N，N-二取代的羧酰胺的制备中，其中合适的伯胺或仲胺用于替代氨或氨水。
同样的，羧酸酯基团可以通过本领域广泛公知的常规的或酸性水解条件转变成羧酸衍生物。
作为一个附加的例子，具有氨基功能的式(Ia)或(Ib)的化合物易于转变成相应的羧酰胺或脲基衍生物。
从所有上述内容中，对技术人员而言清楚的是，按照该方法的步骤(k)，任何具有可以进一步衍生为另一官能基团的官能基团的式(Ia)或(Ib)的化合物，通过按照本领域公知的方法操作由此产生其它的式(Ia)或(Ib)的化合物，也将包含在本发明的范围内。
按照制备式(I)的化合物的任何变型的方法，起始物质和任何其它的反应物是已知的或者易于按照已知的方法制备。
作为一个例子，当式(IIIa)或者(IIIb)的起始物质是可商购的，式(X)、(XII)、(XIII)、(XV)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)以及(XX)的化合物是已知的或根据已知的方法易于制备。
该方法中的式(VIIa)或(VIIb)的中间化合物 其中Q代表合适的氮保护基团，例如叔丁氧基羰基(boc)，是新的，并且，因此作为本发明进一步的发明目的。
由于易于被理解，如果按照如上文所描述的方法制备的式(I)的化合物以异构体的混合物的形式获得，将它们按照常规技术分离为式(I)的单异构体也在本发明的范围内。解析外消旋化合物的常规技术包括，例如，非对映异构盐衍生物的分段结晶或者制备性HPLC。
此外，从上述可清楚得知，给定的式(Ia)或(Ib)的化合物可以通过从式(IXa)或(IXb)的区域异构体的混合物开始制备，或者，可选择的，从两种区域异构体它们自身的每一种开始。
当按照前述方法变型的任一种制备式(I)的化合物时，起始物质或其中间体任选的功能性基团以及可产生不需要的副反应的功能性基团，需要按照常规技术进行适当的保护。同样的，这些后者至自由的去保护的化合物的转变可以按照已知的方法进行。
此外，本发明式(I)的化合物还可以按照本领域广泛公知的组合化学技术制备，通过一系列方法在几个中间体之间完成前述反应并且在固体-相-合成(SPS)条件下进行。
作为一个例子，按照(g.1)、(g.2)或(g.3)中任一步骤制备的式(XIa)或(XIb)的化合物可以被载入合适的聚合树脂。更优选的，式(XIa)或(XIb)中的乙氧基羰基基团可以在碱性条件下移去，例如在三乙胺或二异丙基胺存在下，并且所得化合物通过吡唑氮原子本身粘附至上述支撑树脂 由此获得的支撑中间体随后可以按照该方法的步骤(h)和(i.1)、(i.2)、(i.3)或(i.4)中任一步骤反应，以获得仍然支撑在聚合树脂上的相应的本发明的式(Ia)或(Ib)的化合物。
接下来树脂裂开，例如在碱性或酸性条件下按照已知方法，以获得式(Ia)或(Ib)的目标化合物。
清楚地，通过使用一系列方式实施该方法的上述反应，即通过采用如前面所描述的组合步骤，由此可以制备和收集式(Ia)和(Ib)的几种化合物。
因此，两种或多种式(Ia)的化合物的库是本发明的进一步的目的 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自a)直链的或支链的C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基；d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个空位中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链或者支链的C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；前提是在式(Ia)中，当R1为式(IIc)的基团并且Rd和R’d中的一个为氢原子而Rd和R’d中的另一个为乙基或者正丁基时，则R不为-CORa，其中Ra为3-溴苯基、苄基、4-叔丁基苯基、4-叔丁基苯基甲基、4-氟苯基甲基、环丙基或者2-萘基甲基；或者它们药物上可接受的盐。
同样的，两种或多种式(Ib)的化合物的库是本发明进一步的目的 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选地含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自
a)直链的或支链的C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意空位中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链的或者支链的C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；或者它们药物上可接受的盐。
对上述式(I)化合物库的一般参考见实验部分。
如上所述，本领域技术人员清楚的是一旦制备由几千种式(I)的化合物组成的吡咯并吡唑衍生物的库，所述库针对如上所述给出的激酶的筛选是非常有利的。
关于化合物库及其作为筛选生物活性的用途的一般参考参见，J.Med.Chem.1999，42，2373-2382；和Bioorg.Med.Chem.Lett.10(2000)，223-226。
药理式(I)的化合物具有作为蛋白激酶抑制剂的活性，因此用于例如限制肿瘤细胞的不受调控的增殖。
在治疗中，可以将其用于治疗各种肿瘤，例如以前报导的那些，也可以用于治疗其它细胞增殖性疾病，例如牛皮癣，与动脉粥样硬化相关的血管平滑细胞增生，和手术后狭窄和再狭窄，以及用于治疗阿尔茨海默氏病。
通过基于SPA技术(Amersham Pharmacia Biotech)的分析方法测定推测的Cdk/细胞周期蛋白抑制剂的抑制活性和所选化合物的效力。
实验包括通过激酶将放射性标记的磷酸盐部分转移到生物素化的底物。所获得的33P标记的生物素化的产物可以结合到链霉亲和素包被的SPA小珠(生物素容量130pmol/mg)，在闪烁计数器上测定发射的光。
Cdk2/细胞周期蛋白A活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl的缓冲液(TRIS HCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，DDT 7.5mM+0.2mg/ml BSA)，其含4μM内部的(in house)生物素化组蛋白H1(Sigma#H-5505)底物，10μM ATP(0.1microCi P33γ-ATP)，4.2ng Cdk2/细胞周期蛋白A复合物，抑制剂。在室温下温育30分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％ Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板(Optiplate)。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数(Top-Count)仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定测试不同浓度的抑制剂，范围从0.0015到10μM。实验数据的分析采用计算机程序GraphPad Prizm，其使用四参数对数方程式y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((logIC50-x)*斜率))其中x是抑制剂浓度的对数，y是响应值；y从底部起始并且以S形向上底发展。
Ki计算实验方法在含有3.7nM酶、组蛋白和ATP(非标记/标记ATP的恒定比率为1/3000)的缓冲液(10mM Tris，pH7.5，10mM MgCl2，0.2mg/ml BSA，7.5mM DTT)中进行反应。用EDTA终止反应并且在磷酸膜(Millipore的Multiscreen 96孔板)上进行底物捕获。大致洗涤后，使用顶部计数器读取multiscreen板。对每个ATP和组蛋白浓度的对照(零时间)进行测量。
实验设计测定不同的四种ATP、底物(组蛋白)和抑制剂浓度下的反应速率。以各个ATP与底物Km值、和抑制剂IC50值(0.3、1、9倍的Km或IC50值)为基础设计80点的浓度矩阵。不含抑制剂和不同ATP与底物浓度下的预备时间进程实验可以在用于Ki测定实验的反应的线性范围中选择单个端点时间(10分钟)。
动力学参数估计通过采用[Eq.1]的同步非线性最小平方回归分析(对于ATP的竞争性抑制剂，随机机制)进行动力学参数估计，其使用完整的数据集(80个点)v=Vm·A·Bα·Ka·Kb+α·Ka·B+a·Kb·A+A·B+α·KaKi·I·(Kb+Bβ)---[Eq.1]]]>其中A＝[ATP]，B＝[底物]，I＝[抑制剂]，Vm＝最大速率，Ka、Kb、Ki分别为ATP、底物和抑制剂的解离常数。α和β分别为底物与ATP结合和底物与抑制剂结合间的协同因子。
另外，所选的化合物用一组严格与细胞周期相关的丝氨酸/苏氨酸激酶(cdk2/细胞周期蛋白E，cdk1/细胞周期蛋白B1，cdk5/p25，cdk4/细胞周期蛋白D1)表征，并且表征为对MAPK，PKA，EGFR，IGF1-R，Aurora-2和Akt的特异性。
Cdk2/细胞周期蛋白E活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl的缓冲液(TRIS HCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，DDT 7.5mM+0.2mg/ml BSA)，其中含10μM内部生物素化组蛋白H1(Sigma#H-5505)底物，30μMATP(0.3microCi P33γ-ATP)，4ng GST-Cdk2/细胞周期蛋白E复合物，抑制剂。在室温下温育60分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％ Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定同上Cdk1/细胞周期蛋白B1活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积是30μl的缓冲液(TRIS HCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，DDT 7.5mM+0.2mg/ml BSA)，其含4μM内部生物素化组蛋白H1(Sigma#H-5505)底物，20μM ATP(0.2microCi P33γ-ATP)，3ng Cdk1/细胞周期蛋白B复合物，抑制剂。在室温下温育20分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％ Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定同上Cdk5/p25活性的抑制分析根据下述程序进行Cdk5/p25活性的抑制分析。
激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl的缓冲液(TRIS HCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，DDT 7.5mM+0.2mg/ml BSA)其中含10μM生物素化组蛋白H1(Sigma#H-5505)底物，30μM ATP(0.3microCi P33γ-ATP)，15ng CDK5/p25复合物，抑制剂。在室温下温育30分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定同上Cdk4/细胞周期蛋白D1活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积50μl的缓冲液(TRIS HCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，DDT 7.5mM+0.2mg/ml BSA)，其中含0，4uM μM小鼠GST-Rb(769-921)(#sc-4112，购自SantaCruz)底物，10μM ATP(0.5μCi P33γ-ATP)，100ng杆状病毒表达的GST-Cdk4/细胞周期蛋白D1，适当浓度的抑制剂。在37℃下温育40分钟之后，用20μl 120mM EDTA终止反应。
捕获将60μl从各个孔转移到MultiScreen板，使底物与磷酸纤维素滤纸结合。然后用没有Ca++/Mg++的150μl/孔PBS将板洗涤3次并且通过MultiScreen过滤系统过滤。
检测让滤纸在37℃下干燥，然后加入100μl/孔闪烁剂，并且通过在顶部计数仪中放射性计数来检测33P标记的Rb片段。
IC50测定同上MAPK活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl缓冲液(TRISHCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，7.5mM DTT+0.2mg/ml BSA)，其中含10μM内部生物素化MBP(Sigma#M-1891)底物，15μM ATP(0.15microCiP33γ-ATP)，30ng GST-MAPK(Upstate Biotechnology#14-173)，抑制剂。在室温下温育30分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％ Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定同上PKA活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl缓冲液(TRISHCl 10mM pH7.5，MgCl210mM，7.5mM DTT+0.2mg/ml BSA)，其中含10μM内部生物素化组蛋白H1(Sigma#H-5505)底物，10μM ATP(0.2μmicroM P33γ-ATP)，0.45U PKA(Sigma#2645)，抑制剂。在室温下温育90分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定同上EGFR活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl缓冲液(Hepes 50mM pH7.5，MgCl23mM，MnCl23mM，DTT 1mM NaVO33μM+0.2mg/ml BSA)，其中含10μM内部生物素化MBP(Sigma#M-1891)底物，2μM ATP(0.04microCi P33γ-ATP)，36ng昆虫细胞表达的GST-EGFR，抑制剂。在室温下温育20分钟之后，用含有1mg SPA小珠的100μl PBS+32mM EDTA+0.1％ Triton X-100+500μM ATP终止反应。然后将110μl的体积转移到镜板。
20分钟底物捕获温育后，加入100μl 5M CsCl以使得小珠分层于板的顶部，并且在顶部计数仪器进行放射性计数前静置4小时。
IC50测定同上IGF1-R活性的抑制分析根据下面的方法进行IGF1-R活性的抑制分析。
激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl缓冲液(50mMHEPES pH7.9，3mM MnCl2，1mM DTT，3μM NaVO3)，其中含10μM生物素化MBP(Sigma cat.#M-1891)底物，0-20μM抑制剂，6μM ATP，1microCi33P-ATP，和22.5ng GST-IGF1-R(在室温下预先与冷的60μM无放射性的ATP温育30分钟)。室温下温育35分钟之后，通过加入含有32mM EDTA，500μM无放射性的ATP，0.1％ Triton X100和10mg/ml链霉亲和素包被SPA小珠的100μl PBS缓冲液来终止反应。温育20分钟之后，抽出110μL的悬浮液并且转移到含有100μl 5M CsCl的96-孔镜板。4小时之后，在Packard顶部计数放射性读数器上对板读数2分钟。
Aurora-2活性的抑制分析激酶反应向96U底孔板的各个孔加入最终体积30μl缓冲液(HEPES 50mM pH7.0，MgCl210mM，1mM DTT，0.2mg/ml BSA，3μM原钒酸盐)，其中含8μM生物素化肽(四个重复的LRRWSLG)，10μM ATP(0.5uCi P33γ-ATP)，15ng Aurora 2，抑制剂。室温下温育30分钟之后，终止反应并且通过加入100μl小珠悬浮液来捕获生物素化肽。
分层100μl的CsCl2 5M被加给各个孔并且静置4小时，然后顶部计数闪烁读数器上测定放射性。
IC50测定同上Cdc7/dbf4活性的抑制分析根据下面的方法进行Cdc7/dbf4活性的抑制分析。
在γ33-ATP示踪的ATP存在下用Cdc7/Dbf4复合体将生物素-MCM2底物反式-磷酸化。然后用链霉亲和素包被的SPA小珠捕获磷酸化生物素-MCM2底物，并且通过β计数评价磷酸化程度。
根据下面的方法在96孔板中进行Cdc7/dbf 4活性的抑制分析。
向板的每个孔加入-10μl底物(生物素化的MCM2，6μM终浓度)-10μl酶(Cdc7/Dbf4，12.5nM终浓度)-10μl试验化合物(nM至μM范围内12个递增浓度产生剂量-响应曲线)-10μl的无放射性ATP(10μM终浓度)和放射性ATP(与无放射性ATP的摩尔比是1/2500)的混合物，然后用来开始37℃下发生的反应。
在含有15mM MgCl2，2mM DTT，3μM NaVO3，2mM甘油磷酸酯和0.2mg/ml BSA的50mM HEPES pH7.9中稀释底物、酶和ATP。用于试验化合物的溶剂也含有10％DMSO。
温育20分钟之后，通过向各个孔中加入100μl含有50mM EDTA，1mM无放射性ATP，0.1％Triton X100和10mg/ml链霉亲和素包被的SPA小珠的PBS pH7.4来终止反应。
室温下温育使生物素化MCM2-链霉亲和素SPA小珠相互作用发生15分钟之后，使用Packard细胞收获器(Filtermate)在96孔过滤板(UnifilterRGF/BTM)中截获小珠，用蒸馏水洗涤后用顶部计数(Packard)读数。
读数减去空白背景之后使用非线性回归分析(Sigma Plot)对IC50测定分析实验数据(每个点重复三次)。
根据上述抑制分析，本发明式(I)的化合物导致产生明显的cdk抑制活性。作为一个实例，可见下述本发明式(Ia)和(Ib)的两典型化合物对Cdk2/细胞周期蛋白A的测试实验数据化合物1N-[5-(2，2-二甲基丙酰基)-6，6-二甲基-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-yl]-4-氟苯甲酰胺(IC500.030μM)；和化合物2N-[5-(2，2-二甲基丙酰基)-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙-3-基]-4-氟苯甲酰胺(IC500.025μM)令人惊奇的，所述产生的抑制活性明显的高于以前报导的现有技术WO02/12242中的非常接近的化合物的活性，该化合物在此引用作为参考化合物(见WO02/12242中化合物1143，第76页底部；和实施例19，242-3页间所述化合物)，其用作比较目的并且对Cdk2/细胞周期蛋白A进行测试参考化合物N-[5-乙酰基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基]-(3-溴)苯甲酰胺(IC501.7μM)
化合物1 化合物2 参考化合物由此可见，本发明的新化合物相比于现有技术WO02/12242中结构相近的化合物，意想不到的具有显著更高的cdk抑制活性，并且着在治疗与可变的细胞周期依赖性激酶活性相关的增殖性疾病方面特别有用。
本发明的化合物可以作为单一药物给药，或者，与已知的抗癌治疗结合使用，例如放射疗法或者与下面的试剂联合的化学疗法细胞生长抑制剂或细胞毒性剂，抗生素类药物，烷基化试剂，抗代谢药物，激素药物，免疫药物，干扰素型药物，环加氧酶抑制剂(例如COX-2抑制剂)，基质金属蛋白酶抑制剂，端粒酶抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，抗生长因子受体剂，抗-HER剂，抗-EGFR剂，抗血管发生剂(如血管生成抑制剂)，法尼基转移酶抑制剂，ras-raf信号转导途径抑制剂，细胞周期抑制剂，其它cdk抑制剂，微管蛋白结合剂，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂等。
如果配制成固定剂量，这样的组合产物使用上述剂量范围内的本发明的化合物和核准的剂量范围内的其他药物活性物质。
当联合制剂不合适时，可以与已知的抗癌药物顺序使用式(I)的化合物。
适合对哺乳动物，例如对人，施用的本发明的式(I)的化合物可以根据患者的年龄，体重，状况和给药途径通过常规途径和剂量水平给药。
例如，口服式(I)化合物的合适剂量可以是每剂大约10至大约500mg范围，每天1至5次。本发明的化合物可以以各种各样的剂型给药，例如以片剂，胶囊，糖或膜包衣的片剂，液体溶液或混悬剂形式口服；栓剂形式直肠给药；肠胃外给药，例如肌内给药，或者通过静脉内和/或鞘内和/或脊柱内注射或灌注。
本发明还包括药物组合物，其含有式(I)的化合物或者其药物可接受盐以及药物可接受赋形剂，可以是载体或稀释剂。
通常根据常规方法制备含有本发明的化合物的药物组合物，并且以药物合适的剂型给药。例如，固体口服剂型在药物制剂中除活性化合物外可以含有，稀释剂，例如乳糖，葡萄糖，蔗糖，蔗二糖，纤维素，玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅，滑石，硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇；结合剂，例如淀粉类，阿拉伯胶，明胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉，藻酸，藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；湿润剂例如卵磷脂，聚山梨酯类，月桂基硫酸盐；和，一般来说，没有毒的和没有药物活性的物质。可以以已知方法制备所述药物制剂，例如，利用混合，制粒，压片，糖包衣，或膜包衣工艺。
用于口服给药的液体分散体可以是例如糖浆，乳状液和混悬液。糖浆可以含有作为载体的例如蔗糖或蔗糖和甘油和/或甘露糖醇和山梨糖醇。
混悬液和乳状液可以含有作为载体的例如天然树胶，琼脂，藻酸钠，果胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素，或聚乙烯醇。用于肌内注射的混悬剂或溶液除活性化合物外可以含有药物可接受载体，例如无菌水，橄榄油，油酸乙酯，甘醇，例如丙二醇，以及，如果需要，适当量的利多卡因盐酸盐。
用于静脉内注射或输液的溶液可以含有作为载体的无菌水，或者优选地，它们可以是灭菌的、含水的、等渗的盐溶液，或者它们可以含有作为载体的丙二醇。
栓剂可以含有活性化合物和药物可接受载体，例如椰子油，聚乙二醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酯表面活性剂或卵磷脂。
下面的实施例详细说明本发明，但是不限制本发明。
一般方法在考虑本发明式(I)的特殊化合物的合成过程，例如如以下实施例所述的过程之前，需要注意一个事实，这里所列出和涉及的一些化合物是根据它们的化学命名，同时其它的，其中大部分，是通过结合它们的1H-NMR数据(见下表III、IV和V)和HPLC/Mass数据(见下表VI)的编码系统进行常规和确定的识别。
每个编码，特别的，表明单个特异的式(Ia)或(Ib)化合物并且由三个单元A-M-B组成。
A表示任何取代R[见式(Ia)或(Ib)]，并且通过-NH-基团结合到分子的其它部分；每个特异的A基团显示并且连续编号于下表I中。
类似的，B表示任何取代R1[见式(Ia)或(Ib)]，并且通过羰基(CO)结合到分子的其它部分；每个特异的B基团显示并且连续编号于下表II中。
M表示二价部分的中心核，其被基团A和B取代；特别的，M如每个下式所示区分为M1或M2，每个分别表示式(Ia)或(Ib)化合物的中心核。
为了方便参考，所有表I和II中的A和B基团均标明了正确的化学式，还指出了与分子M的其它部分连接的位点。
因此，仅作为例子，表III中的化合物A06-M1-B01表示式(Ia)的化合物，其具有中心M1核，由基团A06和基团B01在箭头所指示的位置取代；类似的表V中的化合物A04-M2-B08表示式(Ib)的化合物，其具有中心M2核，由基团A04和基团B08在箭头所指示的位置取代
A06-M1-B01 A04-M2-B08表I
表II
实施例1N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸将50g(0.48mol)2-甲基丙氨酸加入冷却的(水/冰)NaOH(19.6g)的水(100ml)溶液中。一旦溶液澄清，在冷却下滴入34ml(0.50mol)丙烯腈。混合物放置过夜。18小时后，在冷却条件(水/冰)下加入28ml乙酸；有白色固体沉淀；将200ml的95％乙醇滴入烧瓶，持续搅拌1小时，然后混合物于冰箱中静置2-3小时。过滤后，收集固体并在烘箱中于80℃下进行干燥。蒸发滤液并用乙醇(160ml)吸收。在冷却条件下获得更多量的产物，将其过滤并干燥。在第一次过滤中获得72g的标题化合物。总产率95％。
ESI MSm/z 157(MH+)1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.47(s，1H)，2.70(t，2H)，2.48(t，2H)，1.18(s，6H)。
通过类似的方法制备下述化合物
1-[(2-氰乙基)氨基]环丙羧酸EI MSm/z 154(M)，136(M-H2O)，114(M-CH2CN)，68(100％，cyclopr＝C＝O)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.47(s，1H)，2.86(t，2H，J＝6.6Hz)，2.48(t，2H，J＝6.6Hz)，1.09(dd，2H，J＝6.9Hz，J＝4.1Hz)，0.86(dd，2H，J＝6.9Hz，J＝4.1Hz)。
实施例2N-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸将44.5g(0.285mol)的N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸和51.7g四甲基铵氢氧化物五水合物在40℃下溶解于乙腈(21)中，并且当获得澄清的溶液时，加入112g的Boc2O。混合物于40℃下放置24小时。第二天，进一步加入20g的Boc2O同时保持40℃的温度。每8-12小时加入20g的Boc2O直至总共192g。4天后溶剂被蒸发，残留物用水(1000ml)吸收并且用乙基醚(500ml)洗涤两次。水溶性部分用柠檬酸调节至pH3-4，用乙酸乙酯提取，用水(200ml)洗涤并且浓缩。获得52g标题化合物。(产率72％)。
ESI MSm/z 274(M+NH4)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.52(t，2H，J＝6.8Hz))，2.68(t，2H，J＝6.8Hz)，1.18-1.38(m，15H)。
通过类似的方法制备下述化合物1-[(叔丁氧基羰基)(2-氰乙基)氨基]环丙羧酸ESI MSm/z 272(M+NH4)，255(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.55(bs，1H)，3.33(m，2H)，2.71(m，2H)，0.97-1.63(m，13H)。
实施例3甲基N-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸酯将62g(0.23mol)的N-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸溶解于350ml的DMF中并且加入50g的KHCO3。几分钟后，滴入30ml甲基碘化物(MeI)，混合物在室温下搅拌6小时。而后再加入15ml MeI。混合物室温下放置过夜。用1.5升水稀释后，溶液用乙酸乙酯萃取(3次)。有机相用少量水洗涤，硫酸钠干燥，在机械泵中蒸发和干燥。获得60.5g(97％)的甲基N-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸酯。
ESI MSm/z 288(M+NH4)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.55(m，5H)，2.70(t，2H，J＝6.7Hz))，1.40(s，6H)，1.36(s，9H)。
通过类似的方法制备下述化合物甲基1-[(叔丁氧基羰基)(2-氰乙基)氨基]环丙羧酸酯ESI MSm/z 286(M+NH4)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.61(s，3H)，3.42(t，2H，J＝6.7Hz)，2.71(m，2H)，1.07-1.62(m，13H)。
实施例4叔丁基4-氰基-3-羟基-2，2-二甲基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸酯在氮中将45g的甲基N-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氰乙基)-2-甲基丙氨酸酯溶解于二噁烷(240ml)并且加入7.9g的氢化钠。混合物回流6小时(120℃内部温度)，然后室温静置过夜(TLCCH2CL2/EtOH90/10)。蒸发溶剂，加入水(1000ml)，混合物用柠檬酸调节至pH3-4。水溶性层用乙酸乙酯萃4次，提取物用限量的水洗涤并且蒸发。然后残留物用己烷吸收，蒸发并且从己烷中结晶。这样获得33.1g的叔丁基4-氰基-3-羟基-2，2-二甲基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸盐酯(产率85％)。
ESI MSm/z 237(M-H-)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.06-4.10(2s，2H，构象异构体)，1.48(s，6H)，1.47(s，9H)。
通过类似的方法制备下述化合物叔丁基6-氰基-7-氧-4-氮杂螺[2，4]庚烷-4-羧酸酯
ESI MSm/z 235(M-H-)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.63(t，1H，J＝9.8Hz)，4.24(t，1H，J＝10.2Hz)，3.74(t，1H，J＝10.2Hz)，1.67-2.16(m，2H)，1.34-1.41(s，9H)，0.93-1.20(m，2H)。
实施例5叔丁基3-氨基-6，6-二甲基-2，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-5(4H)-羧酸酯将32g的叔丁基4-氰基-3-羟基-2，2-二甲基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸酯(0.134mol)加入430ml的无水乙醇中。在该溶液中，加入9ml(0.18mol)的水合肼，然后是12ml冰AcOH(1.5eq)；混合物在60℃下搅拌48小时，除去乙醇，残留物用400ml的碳酸氢钠溶液吸收，用乙酸乙酯萃取数次直到获得所需产物的完全萃取物。干燥并蒸发有机相。通过快速色谱法(洗脱液CHCl3/EtOH 97/3)进行纯化并与己烷/乙酸乙酯9/1的混合物研碎后，获得25g标题化合物。
总产率30.5g(产率88％)ESI MSm/z 253(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.06-4.10(2s，2H，构象异构体)，1.48(2s，6H，构象异构体)，1.47(2s，9H，构象异构体)。
通过类似的方法制备下述化合物叔丁基-3-氨基-2，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-5(4H)-羧酸酯ESI MSm/z 251(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.12(bs，1H)，5.13(bs，2H)，4.16-4.33(m，2H)，1.57-1.91(m，2H)，1.38(s，9H)，0.65-0.83(m，2H)。
实施例65-叔丁基2-乙基3-氨基-6，6-二甲基吡咯并[3，4-c]吡唑-2，5(4H，6H)-二羧酸酯和5-叔-丁基1-乙基3-氨基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯将15g的叔丁基3-氨基-6，6-二甲基-2，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-5(4H)-羧酸酯(59.4mmol)溶解于无水THF(150ml)中，并且在0℃在Ar气体中处理，首先用N，N-二异丙基乙胺(50ml)然后用ClCO2Et(4.65ml，1eq)逐滴加入。90分钟后，用EtOAc(1升)稀释溶剂，用水洗涤，然后用盐水洗涤，硫酸钠干燥并且蒸发。粗产物通过快速色谱法(己烷/EtOAc2/8)进行纯化，从而以38％的产量获得7.3g的5-叔丁基2-乙基3-氨基-6，6-二甲基吡咯并[3，4-c]吡唑-2，5(4H，6H)-二羧酸酯作为主产物，同时还以30％的产率获得了5.7g的5-叔丁基1-乙基3-氨基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯。
5-叔丁基2-乙基3-氨基-6，6-二甲基吡咯并[3，4-c]吡唑-2，5(4H，6H)-二羧酸酯ESI MSm/z 325(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.35(q，2H)，4.10(2s，2H，构象异构体)，1.50-1.51(m，6H)，1.41-1.43(2s，9H，构象异构体)，1.29(t，3H)。
5-叔丁基1-乙基3-氨基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯ESI MSm/z 325(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.28(q，2H，J＝7.1Hz)，4.09-4.14(2s，2H，构象异构体)，1.66-1.67(m，6H)，1.41-1.44(2s，9H，构象异构体)，1.27(t，3H，J＝7.1Hz)。
通过类似的方法制备下述化合物5-叔丁基2-乙基3-氨基-吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环烷丙烷-2，5(4H，6H)-二羧酸酯ESI MSm/z 323(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.30(q，2H，J＝7.1HZ)，4.27(bs，2H)，1.65-2.01(m，2H)，1.38(s，9H)，1.27(t，3H，J＝7.1Hz)，0.82-0.96(m，2H)。
5-叔丁基1-乙基3-氨基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环烷丙烷-1，5-二羧酸酯ESI MSm/z 323(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.26(bs，2H)，4.21(q，2H，J＝7.0Hz)，1.36-1.97(m，13H)，1.23(t，3H，J＝7.0Hz)。
实施例75-叔丁基1-乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯将5-叔丁基1-乙基3-氨基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯(2.0g，6.16mmol)溶解于THF(40ml)，首先用N，N-二异丙基乙胺(5.4ml，30.80mmol)处理，然后，在0℃下，逐滴加入溶解在THF(8ml)中的4-氟苯甲酰氯(800μl，6.77mmol)。反应混合物在室温下搅拌5小时，浓缩，溶解在DCM中，用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机相用硫酸钠干燥，蒸发，通过快速色谱法(洗脱剂己烷/EtOAc 80/20)进行纯化，以90％的产率获得2.5g标题化合物。
ESI MSm/z 447(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.47(s，1H)，8.04-8.17(m，2H)，7.25-7.37(m，2H)，4.44-4.47(2s，2H，构象异构体)，4.43(q，2H，J＝7.1Hz)，1.73-1.75(2s，6H，构象异构体)，1.43-1.46(2s，9H，构象异构体)，1.33(t，3H，J＝7.1Hz)。
通过类似的方法制备下述化合物。
5-叔丁基2-乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基吡咯并[3，4-c]吡唑-2，5(4H，6H)-二羧酸酯ESI MSm/z 447(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.78(s，1H)，7.95-7.99(m，2H)，7.40-7.47(m，2H)，4.51-4.49(2s，2H，构象异构体)，4.43(q，2H，J＝7.1Hz)，1.59-1.60(2s，6H)，1.43-1.46(2s，9H，构象异构体)，1.34(t，3H，J＝7.1Hz)。
5-叔丁基2-乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-2，5(4H，6H)-二羧酸酯ESI MSm/z 445(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.81(s，1H)，7.95-8.06(m，2H)，7.39-7.49(m，2H)，4.67(bs，2H)，4.41(q，2H，J＝7.1Hz)，1.80-2.10(m，2H)，1.41(s，9H)，1.32(t，3H，J＝7.1Hz)，0.93-1.06(m，2H)。
实施例85-叔丁基1-乙基3-({[(3-氟苯基)氨基]羰基}氨基)-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯将5-叔丁基1-乙基3-氨基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯(3.0g，9.24mmol)溶解于无水THF(50ml)中，在室温下用3-氟苯基-异氰酸酯(1.4g，10.21mmol，1.1eq)处理，并搅拌过夜。第二天，蒸发反应混合物，用DCM吸收，用盐水洗涤。有机相用硫酸钠和蒸发干燥。通过快速色谱法(CH2Cl2/MeOH 90/10)进行纯化，获得3.05g(产量70％)标题化合物。
ESI MSm/z 462(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.74(s，1H)，9.05(s，1H)，7.44(m，1H)，7.33(m，1H)，7.16(m，1H)，6.84(m，1H)，4.43(m，4H)，1.76(2s，6H)，1.48(2s，9H，构象异构体)，1.36(t，3H，J＝7.1Hz)。
实施例95-叔丁基1-乙基3-[(哌啶-1-羰基)-氨基]-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯在-40℃下向三光气(550mg，1.85mmol，0.4eq)在四氢呋喃(50ml)中的溶液中加入5-叔丁基l-乙基3-氨基-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯(1.5g，4.62mmol)在四氢呋喃(50ml)中的溶液以及N，N-二异丙基乙胺(1.8ml，2.2eq).3小时后，加入哌啶(690gel，1.5eq)和N，N-二异丙基乙胺(1.2ml，1.5eq)在四氢呋喃(25ml)中的溶液。反应可以在两小时内达到室温(TLCEtOAc/己烷90/10)。溶剂蒸发后，固体溶解于DCM中，溶液用盐水洗涤，有机相用硫酸钠干燥和浓缩。通过快速色谱法(洗脱剂EtOAcl/己烷50/50)纯化固体。固体用二异丙醚处理，并过滤获得1.45g标题化合物，产量72％。
ESI MSm/z 436(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.36(s，1H)，4.46(m，4H)，3.40(m，4H)，1.76(2s，6H)，1.54(m，6H)，1.44(2s，9H，构象异构体)，1.36(t，3H，J＝7.1Hz)。
实施例10乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1(4H)-羧酸酯盐酸盐将5-叔丁基1-乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1，5-二羧酸酯(2.5g，5.59mmol)溶解于二噁烷(50ml)中，用二噁烷中的4M HCL进行处理。40℃下2小时(TLCCH2Cl2/MeOH 90/10)后，浓缩反应混合物，残留物用乙醚处理；过滤获得固体的标题化合物(2.09g)，产率98％。
ESI MSm/z 347(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.28(s，1H)，8.06-8.11(m，2H)，7.28-7.34(m，2H)，4.40(q，2H，J＝7.1Hz)，3.92(s，2H)，1.42(s，6H)，1.33(t，3H，J＝7.1Hz).。
通过类似的方法制备下述化合物乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-2(4H)-羧酸酯盐酸盐ESI MSm/z 347(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.92(s，1H)，9.89(s，1H)，8.02(m，2H)，7.49(m，2H)，4.61(s，2H)，4.51(q，2H，J＝7.1Hz)，1.69(s，6H)，1.39(t，3H，J＝7.1Hz)。
乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-2(4H)-羧酸酯盐酸盐ESI MSm/z 345(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.87(bs，1H)，10.00(bs，2H)，7.93-8.04(m，2H)，7.39-7.53(m，2H)，4.69(bs，2H)，4.41(q，2H，J＝7.1Hz)，1.68(dd，2H，J＝8.6Hz，J＝6.1Hz)，1.41(dd，2H，J＝8.6Hz，J＝6.1Hz)，1.33(t，3H，J＝7.1Hz)。
实施例11乙基5-(2，2-二甲基丙基)-3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1(4)-羧酸酯在0℃下，用N，N-二异丙基乙胺(1.6ml，9.2mmol，1.6eq)和用特戊酰氯(780μL，6.3mmol，1.1eq)处理二氯甲烷(70ml)中的乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1(4H)羧酸酯盐酸盐(2.0g，5.77mmol)。逐渐的，反应恢复到室温，搅拌过夜(TLCCH2Cl2/EtOAc 90/10)。溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机相用硫酸钠干燥，蒸发，通过快速色谱法(洗脱剂CH2Cl2/EtOAc 90/10)纯化，获得2.03g标题化合物，产率82％。
ESI MSm/z 431(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.51(s，1H)，8.05-8.14(m，2H)，7.23-7.37(m，2H)，4.90(s，2H)，4.42(q，2H，J＝7.1Hz)，1.80(s，6H)，1.33(t，3H，J＝7.1Hz)，1.22(s，9H)。
通过类似的方法制备下述化合物乙基5-(2，2-二甲基丙酰基)-3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-2(4H)-羧酸酯ESI MSm/z 429(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.81(bs，1H)，7.96-8.04(m，2H)，7.38-7.48(m，2H)，5.10(bs，2H)，4.42(q，2H，J＝7.1Hz)，2.33(dd，2H，J＝6.8Hz，J＝4.2Hz)，1.32(t，3H，J＝7.1Hz)，1.22(s，9H)，0.90(dd，2H，J＝6.8Hz，J＝4.2Hz)。
实施例12N-[5-(2，2-二甲基丙酰基)-6，6-二甲基-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基]-4-氟苯甲酰胺将乙基5-(2，2-二甲基丙酰基)-3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1(4H)-羧酸酯(2.0g，4.64mmol)溶解于甲醇(60ml)中，用TEA(6.45ml，46.4mmol，10eq)处理，在室温下搅拌过夜。(TLCCH2Cl2/MeOH 95/5)。蒸发后，固体用乙醚/己烷处理，过滤获得1.43g标题化合物，产率86％。
ESI MSm/z 359(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.41(bs，1H)，10.91(bs，1H)，7.98-8.11(m，2H)，7.20-7.44(m，2H)，4.66-4.92(bs，2H)，1.64(s，6H)，1.21(s，9H)。
通过类似的方法制备下述化合物N-[5-(2，2-二甲基丙酰基)-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-3-基]-4-氟苯甲酰胺ESI MSm/z 357(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.59-12.47(bs，1H)，10.94(bs，1H)，8.02-8.11(m，2H)，7.27-7.37(m，2H)，4.99(s，2H)，2.25(dd，2H，J＝6.5Hz，J＝4.4Hz)，1.20(s，9H)，0.79(dd，2H，J＝6.5Hz，J＝4.4Hz)。
N-{6，6-二甲基-5-[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺ESI MSm/z 373(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.49(bs，1H)，10.96(bs，1H)，8.09(m，2H)，7.34(m，2H)，4.86(m，2H)，4.56(t，1H)，3.83(m，2H)2.02(m，2H)，1.86(m，2H)，1.68(s，6H)。
αD+27.7(c＝0.50，MeOH)N-{6，6-二甲基-5-[(2S)-四氢呋喃-2-基羰基]-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺ESI MSm/z 373(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.49(bs，1H)，10.96(bs，1H)，8.09(m，2H)，7.34(m，2H)，4.86(m，2H)，4.56(t，1H)，3.83(m，2H)2.02(m，2H)，1.86(m，2H)，1.68(s，6H)。
αD-25.9(c＝0.76，MeOH)实施例134-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-苯甲酸甲基酯在0℃下，向含有1-甲基-哌啶-4-醇(6.8g.59mmoles)、PPh3(三苯基膦，15.5g，59mmoles)和4-羟基-苯甲酸甲酯(6g，39mmoles)的THE(150ml)溶液中缓慢加入含有偶氮二羧酸二乙酯(9.5ml，59mmoles)的THE(30ml)。反应混合物在24小时后恢复室温。而后蒸发，残留物重新溶解于5％的柠檬酸水溶液中。溶液用乙酸乙酯洗涤(3×250ml)，用浓缩的NH4OH调节为碱性(pH-8)然后用二氯甲烷萃取(3×250ml).结合的二氯甲烷萃取物用盐水洗涤，干燥，蒸发产生油，其通过硅胶上的快速色谱法采用二氯甲烷-MeOH(90∶10)作为洗脱剂进行纯化，获得标题化合物，为一种黄色的油状物质(7.4g，75％)。
ESI MSm/z 250(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-D6)δppm 1.7(m，2H)2.0(m，2H)2.2(m，5H)2.7(m，2H)3.8(s，3H)4.5(m，1H)7.1(d，J＝9.0Hz，2H)7.9(d，J＝9.0Hz，2H)。
实施例144-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-苯甲酸，盐酸盐将4-(1-甲基-哌啶-4-基氧基)-苯甲酸甲酯(7.3g，29mmoles)溶解于6N aq HCl中(220ml)。85℃加热6小时后，真空除去溶剂。残余物用水吸收，蒸发两次，然后用丙酮吸收再两次。获得的固体最终在丙酮中磨碎以得到白色粉末的氢氯化物盐(6.4g，80％产产率)。
1H NMR(400MHz，DMSO-D6)δppm 2.0(m，4H)2.8(m，3H)3.3(m，4H)4.7(m，1H)7.1(m，2H)7.9(m，2H)9.9(d，J＝20.4Hz，1H)12.6(s，1H)。
实施例154-(4-羟基-哌啶-1-基)苯甲酸乙酯4-氟-苯甲酸乙酯(1.68g，10mmoles)、哌啶-4-醇(1.12g，11mmoles)和无水碳酸钾(1.38g，10mmoles)在DMSO(10ml)中的混合物120℃加热6小时。冷却后，混合物倒入水和冰中(500ml)，用乙酸乙酯萃取。有机层用水和盐水洗涤，干燥和蒸发。残余物通过硅胶上的快速色谱法采用己烷/EtOAc(10/30)作为洗脱剂进行纯化，获得标题化合物，为一种白色固体(1.6g，64％)。
ESI MSm/z 250(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-D6)δppm 1.3(t，J＝7.1Hz，3H)1.4(m，2H)1.8(m，2H)3.0(m，2H)3.7(m，2H)4.2(q，J＝7.1Hz，2H)4.7(d，J＝4.3Hz，1H)6.9(m，2H)7.7(m，2H)。
实施例164-(4-氟-哌啶-1-基)苯甲酸乙酯在室温下惰性气体中，向含有4-(4-羟基-哌啶-1-基)苯甲酸乙酯(1.25g。5mmoles)的无水二氯甲烷(30ml)溶液中，缓慢加入含有DAST(0.97g，6mmoles)的二氯甲烷(5ml)。反应混合物在室温下搅拌1小时，而后用NaHCO3水溶液淬灭。有机层用盐水洗涤，干燥和蒸发。残余物通过硅胶上的快速色谱法采用己烷/EtOAc(70/30)作为洗脱剂进行纯化，获得标题化合物，为一种白色固体(0.7g，56％)。
ESI MSm/z 252(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-D6)δppm 1.3(t，J＝7.1Hz，3H)1.8(m，2H)2.0(m，2H)3.3(m，2H)3.6(m，2H)4.2(s，2H)4.8(s，1H)7.0(s，2H)7.8(s，2H)。
实施例174-(4-氟-哌啶-1-基)苯甲酸含有4-(4-氟-哌啶-1-基)苯甲酸乙酯(0.7g，2.7mmoles)的乙醇(50ml)和2N氢氧化钠溶液(20ml)的混合物在室温下搅拌24小时。而后蒸发乙醇，溶液用水(20ml)稀释，用2N HCL中和。分离出的酸为白色固体，其用水洗脱，并真空干燥(0.52g，82％)。
ESI MSm/z 224(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-D6)δppm 1.8(m，2H)2.0(m，2H)3.3(m，2H)3.5(m，2H)5.0(s，1H)7.0(s，2H)7.8(s，2H)12.2(s，1H)。
根据前面实施例所述的工作，依据前面所述的方法，通过使用任何合适的起始材料和合适的反应物，可以制备如下表III所示的其它式(Ia)和(Ib)的化合物。对于编码系统鉴定式(Ia)和(Ib)的每个特异的化合物的说明性注释参见在实验部分开始处的“一般方法”。
表III
实施例18N-{6，6-二甲基-5-[(1-甲基哌啶-4-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺在室温下，对含有乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-1(4H)羧酸酯盐酸盐(0.5g，1.3mmol)的二氯甲烷(25ml)用N，N-二异丙基乙胺(1.13ml，6.5mmol，5eq)和TBTU(0.542g，1.69mmol，1.3eq)处理1小时，然后加入1-甲基-哌啶-4-羧酸盐酸盐(0.29g，1.61mmol，1.2eq)。反应搅拌过夜(TLCCH2Cl2/MeOH 90/10)。溶液用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，有机相用硫酸钠干燥和浓缩。残余物溶解在甲醇中(16ml)，用TEA(2ml，14.3mmol，11eq)进行处理并且在室温下搅拌过夜。(TLCCH2Cl2/MeOH/NH4OH90/10/1)。蒸发后，固体用快速色谱法纯化(洗脱剂CH2Cl2/MeOH/NH4OH90/10/2)。固体用二异丙醚处理，过滤获得0.36g标题化合物，产量为69％。
ESI MSm/z 400(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.48(bs，1H)，10.97(bs，1H)，8.09(m，2H)，7.35(m，2H)，4.75(bs，2H)，2.87(m，2H)，2.40(m，1H)，2.24(s，3H)，2.05(m，2H)，1.67(m，10H)。
通过类似的方法制备下述化合物N-[5-[(1-甲基哌啶-4-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-3-基]-4-氟苯甲酰胺ESI MSm/z 398(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.20(bs，1H)，11.00(s，1H)，8.10(m，2H)，7.36(m，2H)，4.91(s，2H)，2.84(m，2H)，2.40(m，1H)，2.23(m，5H)，2.0(m，2H)，1.65(m，4H)，0.89(m，2H)。
如每个前述过程一样，通过类似的方法，采用合适的起始材料和任意合适的反应物，可以制备如下表IV所示的其它式(Ia)和(Ib)的化合物。
表IV
实施例19N-{6，6-二甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺向含有三光气(195mg，0.65mmol，0.56eq)的DCM(15ml)溶液中加入含有乙基3-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-6，6-二甲基-5，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-2(4H)-羧酸酯盐酸盐(442mg，1.15mmol)的DCM(30ml)溶液，然后加入N，N-二异丙基乙胺(760μl，4.31mmo l，3.75eq)。3小时后，加入N-甲基哌嗪(195μl，1.72mmol，1.5eq)和二异丙基乙胺(300μl，1.72mmol，1.5eq)的DCM(8ml)溶液。反应在室温下搅拌过夜(TLCCH2Cl2/MeOH 90/10)。溶液用盐水洗涤，有机相用硫酸钠干燥和浓缩。残余物溶解于甲醇(16ml)中，用TEA(1.6ml，11.5mmol，10eq)处理，室温下搅拌过夜。(TLCCH2Cl2/MeOH 90/10)。蒸发后，固体用快速色谱法纯化(洗脱剂CH2Cl2/MeOH 90/10)。固体用二异丙醚处理，过滤获得0.294g标题化合物，产量为64％。
ESI MSm/z 401(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.39(bs，1H)，10.39(s，1H)，8.04(m，2H，Ar)，7.31(m，2H)，4.53(bs，2H)，3.04(m，4H)，2.40(m，4H)，2.22(bs，3H)，1.60(bs，6H)。
通过类似的方法制备下述化合物N-[5-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙-3-基]-4-氟苯甲酰胺ESI MSm/z 399(MH+)；1H NMR (400MHz，DMSO-d6)δ12.19(bs，1H)，10.95(s，1H)，8.09(m，2H)，7.35(m，2H)，4.70(bs，2H)，3.18(m，4H)，2.34(m，7H)，1.92(m，2H)，0.970(m，2H)。
实施例204-氯-N-[6，6-二甲基-5-(4-吡咯烷-1-基甲基-哌啶-1-羰基)-1，4，5，6四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基]-苯甲酰胺，盐酸盐将N-[5-(4-氨甲基-哌啶-1-羰基)-6，6-二甲基-2，4，5，6四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基]-4-氯-苯甲酰胺的混合物(310mg，0.7mmoles)、1，4二溴丁烷(92μl，0.7mmoles)和NaHCO3(600mg，7mmoles)在无水乙醇中(15ml)的混合物在微波炉中在150℃下加热15分钟。冷却之后，溶液被蒸发。残留物用二氯甲烷/MeOH(90∶10)和水吸收，将所得的混悬液过滤，有机层蒸发至干燥。残留物通过快速色谱法用二氯甲烷/MeOH/30％NH4OHaq(95/5/0.5)纯化。所得产品的产量为20％(71mg)。
化合物用甲醇(3ml)溶解，加入二噁烷中的4N HCl溶液(40μl，0.16mmoles)并且随后溶液被蒸发。所得固体在醚中研磨以获得白色粉末状的标题化合物的盐酸盐。
ESI MSm/z 485(MH+)；1H NMR(400MHz，DMSO-D6)δppm 1.24(m，2H)1.63(s，6H)1.92(m，7H)2.67(t，J＝1 1.83Hz，2H)3.01(m，2H)3.09(t，.J＝6.46Hz，2H)3.47(m，4H)4.56(s，2H)7.59(d，J＝8.54Hz，2H)8.01(d，J＝8.66Hz，2H)9.49(s，1H)11.02(s，1H)12.50(s，1H)通过类似的方法以及通过使用适当的起始物质以及任意合适的反应物，如通过上述方法一样，也可制得式(Ia)和(Ib)的附加化合物，如下面得表V中所描述。
表V
实施例21通过前面所描述的方法制备的式(Ia)和(Ib)的本发明的几种化合物，也可以通过保留时间(r.t.)和质量[M+H]+按照HPLC/Mass技术的方法描述。
操作条件如下HPLC/MS方法1HPLC设备由装备有996Waters PDA检测器的Waters 2790 HPLC系统和Micromass模式组成。ZQ单一四极质谱仪装备有电雾化离子源(ESI)。仪器控制、数据获得以及数据处理通过Millennium 4.0和MassLynx 3.5软件进行。
HPLC在25℃以1ml/min的流动速率采用RP18 Waters X Terra(4,6×50mm，3.5pm)柱进行。流动相A是乙酸铵5mM缓冲液(pH5.5，乙酸/乙腈是95∶5)，流动相B是H2O/乙腈(5∶95)；8分钟之内梯度是10至90％B，然后保持90％B 2分钟。注射容积是10微升。
质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压设置为2.5KV；源温度是120℃；圆锥是10V；全扫描，设定质量范围100至800amu。
HPLC/MS方法2HPLC设备由装备有996Waters PDA检测器的Waters 2790HPLC系统和Micromass模式组成。ZQ单一四极质谱仪装备有电雾化离子源(ESI)。仪器控制、数据获得以及数据处理通过Millennium 4.0和MassLynx 3.5软件进行。
HPLC在25℃以1ml/min的流动速率采用RP18 Waters X Terra(4,6×50mm，3.5pm)柱进行。流动相A是乙酸铵5mM缓冲液(pH5.5，乙酸/乙腈是95∶5)，且流动相B是H2O/乙腈(5∶95)；4分钟之内梯度是10至90％B，然后保持90％B 1分钟。注射容积是10微升。
质谱仪以阳离子和阴离子模式操作，毛细管电压是2.5KV；源温度是120℃；圆锥是10V；全扫描，设定质量范围100至800amu。
HPLC/MS方法3质谱通过在Finnigan LCQ离子阱质谱仪采用电喷雾(ESI)离子化作用技术用阳离子和阴离子探测器进行记录。质谱仪直接连接至SSP4000 HPLC系统(Thermo Separation)，装备有LcPal自动采样器(CTC Andlytics)以及UV 6000LP PDA探测器(Thermo Separation)。仪器控制，数据获得以及数据处理通过Xcalibur 1.2软件进行。HPLC在室温下以1ml/min的流动速率采用RP C18 Waters X-Terra(4,6×50mm，3.5pm)柱进行。流动相A是乙酸铵5mM缓冲液(pH5.5，乙酸/乙腈是90∶10))，且流动相B是乙酸铵5mM缓冲液(pH5.5，乙酸/乙腈(10∶90)；7分钟之内梯度是0至100％B，保持100％B 2分钟然后再平衡。整个液相色谱时间为12分钟。注射容积是10微升。UV探测在215nm和400nm进行。
离子在下述条件下产生ESI喷雾电压为4.0kV，加热毛细管温度为255℃，保护氮气的压力为5.0Bar。使用全扫描探测模式(自50到1000amu)以MS/MS分析最强烈的离子(规定碰撞能量35％)。
UV探测215-400nm。
HPLC/MS方法4采用的HPLC系统(Alliance 2790，带有恒温自动采样器和转移阀门LabPro，UV探测器2487和光滑表面，带有ESI接口的ZQ质谱仪)为Waters公司(Milord，Massachusetts)的产品。化学发光氮探测器(CLND)8060型是A NTEK Instruments公司(Houston，Texas)的产品。液体handler Miniprep 75是Tecan Group Ltd(Maennedorf，Switzerland)的产品。
采用下述色谱条件流动速率设定在1mL/min。两个流动相(流动相A0.1％甲酸，流动相B甲醇中的0.1％甲酸)展开10min，直线梯度为从5％B至95％B，保持2分钟，并且随后接下来的3分钟在5％B中再平衡。展开时间为15分钟.注射容积为10μL，自动采样器温度25℃，探测波长为220nm。
如下述表VI中所描述的，按照上述实验条件制备了一些其它的式(Ia)和(Ib)，每一种均通过前述A-M-B编码系统表示，并且进一步通过HPLC/Mass表征。
表VI
权利要求
1.治疗由改变的细胞周期依赖的激酶活性引起的或与之相关的细胞增殖性疾病的方法，该方法包括向需要治疗的哺乳动物施用有效量的由式(Ia)或(Ib)所代表的化合物或其药物上可接受的盐， 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者选自直链的或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选地含有一个选自N、NH、O或S的附加的杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自a)直链的或支链的C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基；d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个自由位置上，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链的或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选地被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链的或者支链的C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；前提是在式(Ia)中，当R1为式(IIc)的基团并且Rd和R’d中的一个为氢原子而Rd和R’d中的另一个为乙基或者正丁基时，则R不为-CORa，其中Ra为3-溴苯基、苄基、4-叔丁基苯基、4-叔丁基苯基甲基、4-氟苯基甲基、环丙基或者2-萘基甲基。
2.按照权利要求1的方法，其中细胞增殖性疾病选自癌症、阿耳茨海默病、病毒感染、自身免疫疾病和神经变性疾病。
3.按照权利要求2的方法，其中癌症选自癌、鳞状细胞癌、骨髓或淋巴系的造血系统肿瘤、源于间质的肿瘤、中枢和外周神经系统的肿瘤、黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、着色性干皮病、角质黄色瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
4.按照权利要求1的方法，其中细胞增殖性疾病选自良性前列腺增生、家族性息肉状腺瘤病、神经纤维瘤病、牛皮癣、与动脉粥样硬化有关的血管平滑肌细胞增殖、肺纤维化、关节炎、肾小球肾炎以及手术后的狭窄和再狭窄。
5.按照权利要求1的方法，其提供对肿瘤血管生成和转移的抑制作用。
6.按照权利要求1的方法，其提供对器官移植排斥反应和宿主相对移植物疾病的治疗。
7.按照权利要求1的方法，其提供对放射疗法引发的或者化学疗法引发的脱发的治疗或预防。
8.按照权利要求1的方法，其进一步包括对需要治疗的哺乳动物进行与至少一种细胞抑制剂或细胞毒性剂联合的放射治疗或化疗方式。
9.按照权利要求1的方法，其中需要治疗的哺乳动物为人类。
10.抑制细胞周期蛋白依赖的激酶活性的方法，包括使所述激酶与有效量的如权利要求1定义的化合物接触。
11.式(Ia)或(Ib)所示的化合物或其药物上可接受的盐， 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自a)直链或支链C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个自由位置中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选地被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链或者支链C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；前提是在式(Ia)中，当R1为式(IIc)的基团并且Rd和R’d中的一个为氢原子而Rd和R’d中的另一个为乙基或者正丁基时，则R不为-CORa，其中Ra为3-溴苯基、苄基、4-叔丁基苯基、4-叔丁基苯基甲基、4-氟苯基甲基、环丙基或者2-萘基甲基。
12.按照权利要求11的式(Ia)或(Ib)的化合物，其中R为基团-CORa，Ra如权利要求11中定义以及R1为叔丁基。
13.按照权利要求11的式(Ia)或(Ib)的化合物，其中R为基团-CONHRa，Ra如权利要求11中定义以及R1为叔丁基。
14.按照权利要求11的式(Ia)或(Ib)的化合物，其中R为基团-CONRaRb，Ra和Rb如权利要求11中定义以及R1为叔丁基。
15.按照权利要求11的式(Ia)或(Ib)的化合物，其中R如权利要求11中定义以及R1为选自下式的式(IIa)的基团 其中n和Rc如权利要求11中定义。
16.按照权利要求11的式(Ia)或(Ib)的化合物，其中R如权利要求11中定义以及R1为选自下式的式(IIa)的基团 其中Rc如权利要求11中定义。
17.按照权利要求11的式(Ia)的化合物，其中R为基团-CORa，且Ra为4-氟苯基或环丁基，并且R1如权利要求11中所定义。
18.按照权利要求11的式(Ia)的化合物，其中R如权利要求11中所定义，并且R1为选自叔丁基、1-甲基-哌啶基-4-基、1-甲基-哌嗪基-4-基、2-(R，S)-四氢呋喃基-2-基、2-(R)-四氢呋喃基-2-基或者2-(S)-四氢呋喃基-2-基的基团。
19.按照权利要求11的式(Ia)或(Ib)的化合物，其中如权利要求11中所定义的任一Ra、Rb和Rc基团任选地进一步在它们的一个或多个空位上被选自下列的基团取代卤原子、硝基、氧代基(＝O)、氰基、烷基、多氟化烷基、多氟化烷氧基、烯基、炔基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环基、环烷基、羟基、烷氧基、芳基氧基、杂环基氧基、亚甲二氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、环烯基氧基、亚烷基氨基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、环烷基氧基羰基、氨基、脲基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、甲酸基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂环基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、烷氧基亚胺基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、甲酸基、烷基羰基、芳基羰基、环烷基羰基、杂环基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、芳基硫代基以及烷基硫代基。
20.任选地以药物上可接受盐的形式存在的式(Ia)或(Ib)的化合物，其选自N-{6，6-二甲基-5-[(1-甲基哌啶-4-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}环丁烷羧酰胺；N-[5-(2，2-二甲基丙酰基)-6，6-二甲基-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基]-4-氟苯甲酰胺；N-[5-(2，2-二甲基丙酰基)-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-3-基]-4-氟苯甲酰胺；N-{6，6-二甲基-5-[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺；N-{6，6-二甲基-5-[(2S)-四氢呋喃-2-基羰基]-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺；N-{6，6-二甲基-5-[(1-甲基哌啶-4-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺；N-[5-[(1-甲基哌啶-4-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-3-基]-4-氟苯甲酰胺；N-{6，6-二甲基-5-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基}-4-氟苯甲酰胺；N-[5-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-6-螺环丙烷-3-基]-4-氟苯甲酰胺；4-氯-N-[6，6-二甲基-5-(4-吡咯烷-1-基甲基-哌啶-1-羰基)-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基]-苯甲酰胺。
21.任选地以药物可接受盐形式存在的式(Ia)和(Ib)的任意化合物，其如实验部分的表III、IV、V、和VI中特别定义的。
22.式(Ia)的化合物A13-M1-B03，其中R为基团-CORa，且Ra为环丁基并且R1为与1-甲基-哌啶基-4-基相应的式(IIa)基团，或以所述形式或以盐酸盐或者甲磺酸盐的形式存在。
23.制备如权利要求11所定义的式(Ia)或(Ib)的化合物或其药物可接受盐的方法，该方法包括a)将式(IIIa)或(IIIb)的化合物 与丙稀腈反应以获得相应的式(IVa)或者(IVb)的衍生物 b)保护式(IVa)或者(IVb)化合物的氨基基团以获得相应的式(Va)或(Vb)的衍生物 其中Q为合适的氨基保护基团；c)将(Va)或(Vb)的化合物与合适的烷基化试剂反应以获得相应的式(VIa)或(VIb)的酯衍生物 其中Alk代表合适的C1-C4烷基基团；d)将式(VIa)或(VIb)的化合物与氢化钠(NaH)反应以获得相应的式(VIIa)或(VIIb)的衍生物 e)将式(VIIa)或(VIIb)的化合物与水合肼反应以获得式(VIIIa)或(VIIIb)的化合物 f)将式(VIIIa)或(VIIIb)的化合物与氯甲酸乙酯反应以获得式(IXa)或(IXb)的衍生物，各以两种区域异构体的任一种形式存在 并且将式(IXa)或(IXb)的化合物按照可替换步骤(g.1)、(g.2)或(g.3)中的任一种反应g.1)与式(X)的化合物反应RaCO-Z(X)其中Ra如权利要求11定义并且Z为卤原子，以获得式(XIa)或(XIb)的化合物 其中R为基团-CORa；g.2)与式(XII)的化合物反应Ra-NCO(XII)其中Ra如权利要求11所定义，以获得式(XIa)或(XIb)的化合物，其中R为基团-CONHRa；或者g.3)与合适的式(XIII)的胺在三光气或者合适的氯甲酸酯存在下反应HNRaRb(XIII)其中Ra和Rb如权利要求11定义，以获得式(XIa)或者(XIb)的化合物，其中R为基团-CONRaRb；h)对按照(g.1)至(g.3)的任一步骤制备的式(XIa)或(XIb)化合物的氨基基团去保护，以获得相应的式(XIVa)或(XIVb)的衍生物 其中R如上文所定义；并且将式(XIVa)或(XIVb)的化合物按照可替代步骤(i.1)、(i.2)、(i.3)或(i.4)的任一种反应i.1)与式(XV)的酰卤衍生物反应R1-COZ (XV)其中R1如在权利要求11的基团(a)、(b)、(c)、具有X为碳原子的(IIa)和(IIb)中所描述的，并且Z为卤原子，以获得式(XVIa)或(XVIb)的化合物 其中R和R1如上文定义；i.2)与式(XVII)的5至7元杂环化合物或者合适的式(XVIII)的胺在三光气存在下反应 其中X为NH并且Y、Rc、n、Rd以及R’d如权利要求11定义，以获得相应的式(XVIa)或者(XVIb)化合物，其中R如上文定义并且R1或为其中X为氮原子以及R、Y、Rc和n如上文定义的式(IIa)基团，或为其中Rd和R’d如上文定义的式(IIc)基团；i.3)与式(XIX)的羧酸在合适的缩合剂存在下反应R1-COOH(XIX)以获得式(XVIa)或者(XVIb)的化合物，其中R1如在式(Ia)或(Ib)中的基团(a)、(b)、(c)所示或为具有X为碳原子的式(IIa)或式(IIb)的基团，并且R、Y、Rc和n如上文定义；i.4)与式(XX)的化合物反应R1-COZ(XX)其中R1为式(IId)的基团并且Z为氯或溴原子，以获得式(XVIa)或(XVIb)的化合物，其中R如上文定义并且R1为式(IId)的基团；以及j)将按照从(i.1)至(i.4)任一步骤制备的式(XVIa)或(XVIb)的化合物在碱性条件下反应，以获得相应的式(Ia)或(Ib)的衍生物，其中R和R1如上文定义；以及，任选地，k)将它们分别转化成其它的式(Ia)或(Ib)的化合物，和/或其药物上可接受的盐。
24.利要求23的方法，其中，在步骤(b)中，Q为叔丁氧基羰基(boc)。
25.权利要求23的方法，其中，在步骤(c)中，Alk为甲基。
26.式(VIIa)或(VIIb)的化合物 其中Q代表诸如叔丁氧基羰基(boc)的合适的氮保护基团。
27.两种或多种式(Ia)的化合物或其药物上可接受的盐的库 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选地取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自a)直链或支链的C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个空位中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链或者支链C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代；前提是在式(Ia)中，当R1为式(IIc)的基团并且Rd和R’d中的一个为氢原子而Rd和R’d中的另一个为乙基或者正丁基时，则R不为-CORa，其中Ra为3-溴苯基、苄基、4-叔丁基苯基、4-叔丁基苯基甲基、4-氟苯基甲基、环丙基或者2-萘基甲基。
28.两种或多种式(Ib)的化合物或其药物上可接受的盐的库 其中，R为基团-CORa、-CONHRa或者-CONRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基的任选被取代的基团，或者；与它们所连接的氮原子一起，Ra和Rb可以形成任选含有一个选自N、NH、O或S的附加杂原子或者杂原子基团的任选被取代的5或6元杂环；R1选自a)直链或支链C3-C4烷基；b)环烷基、环烷基-烷基或者烷基-环烷基，其中的环烷基部分含有任意C3-C6环烷基基团，以及其中的烷基部分含有任意的直链或支链的C1-C4烷基基团；c)3-甲基噻吩基-2-基；2-噻吩基；苯基；2，6-双氟苯基；4-(氨基磺酰基)苯基；4-(二甲基氨基甲基)苯基；4-(4-甲基哌嗪基)甲基苯基d)式(IIa)或者(IIb)的基团 其中，在式(IIa)中，环代表5至7元杂环，其中X直接连接至分子的其余部分，代表碳或者氮原子；Y为碳、氮、氧或者硫原子或者为NH基团，条件是X和Y中的至少一个不为碳原子；Rc各自独立地并且在式(IIa)的杂环的任意一个空位中，为卤素原子或者羟基基团或者为选自直链或支链C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、氨基、氨基羰基、羧基、氧代(＝O)、烷氧基羰基、烷基羰基或者芳基羰基的任选被取代的基团；并且n为0或者1至4的整数；e)式(IIc)或者(IId)的基团 其中，Rd、R’d和Re代表，相同的或者不同的并且各自独立地，氢原子或者直链或者支链C1-C6烷基，其任选地被一个或多个选自羟基(-OH)、氨基羰基(-CONH2)或者甲基氨基羰基(-CONHCH3)的基团取代。
29.药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求11所定义的式(Ia)或(Ib)的化合物，以及至少一种可药用赋形剂、载体和/或稀释剂。
30.按照权利要求29的药物组合物，其进一步含有一种或多种化疗剂。
31.产品或试剂盒，其含有如权利要求11所定义的式(Ia)或(Ib)的化合物或如权利要求29所定义的其药物组合物、以及一种或多种化疗剂，作为用于抗癌疗法中同时、分开或顺序使用的组合制剂。
32.如权利要求11所定义的式(Ia)或(Ib)的化合物，其用作药物。
33.如权利要求11所定义的式(Ia)或(Ib)的化合物的用途，其用于制备具有抗肿瘤活性的药物。
全文摘要
本发明公开了通过式(Ia)或(Ib)表示的化合物及其药物上可接受的盐，其中R和R
文档编号A61P35/00GK1726217SQ200380106447
公开日2006年1月25日 申请日期2003年12月4日 优先权日2002年12月19日
发明者M·G·布拉斯卡, R·埃米西, D·范塞利, M·耐希, P·奥希尼, F·奥兹, P·鲁塞尔, A·瓦尔佩蒂, P·派瓦莱罗 申请人:法玛西雅意大利公司