专利名称：一种用于治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备及质量控制方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种以植物生药牛膝、玄参、石斛、金银花为原料的治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备及质量控制方法。
背景技术：
原脉络宁注射液用于血栓闭塞性疾病的治疗，自上市以来凭借其稳定的生产工艺及良好的临床疗效，创造了十分显著的社会与经济效益，深受广大医生和患者的欢迎。但在生产和应用中发现此产品仍存在一些问题该品种开发较早，提取分离及制剂工艺缺乏系统性研究；临床应用时需将注射液注入氯化钠或葡萄糖注射液中，供滴注，医护人员甚感不便，并易致微生物交叉污染。因此拟对该品种进行剂型改变，将其开发为100ml等大输液并对其制备工艺进行系统性研究。本发明将对原脉络宁注射液的生产工艺及质量标准等进行优化提高、对成品可测成分占总固体量的25％以上进行检测、建立指纹图谱进行全面质量控制，以达到提高疗效、确保用药安全和使用方便的目的。
原脉络宁注射液制备工艺分为水提、醇沉、酯提、水转溶、滤过、灭菌等工序，从而保证制剂达到静脉滴注的要求。本发明为在原脉络宁注射液基础上发展而来的大输液。故为确保其临床疗效，大输液制备工艺在参考原剂型工艺基础上，结合大输液自身剂型特点，拟采用以下制备工艺路线药材—水提—醇沉—酯提—水转溶—滤过—加适量水—加助溶剂—调pH值—调节渗透压—加水至全量—过滤—灌封—灭菌—成品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种符合大输液(即大容量输液)自身剂型特点的治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备及质量控制方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的牛膝1-4重量份 玄参1-4重量份 石斛1-4重量份 金银花1-4重量份以上四味药材饮片，加药材4-8倍量水，浸泡1-3小时后，煎煮提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至65℃下相对密度为1.25-1.35，冷却。加乙醇使含醇量至70％-85％，静置。取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至65℃下相对密度为1.05-1.15。用2-4倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量10％-50％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入0.06％-0.08％吐温-80，搅匀，用20％-40％NaOH溶液调pH至8.5-9.2，加入氯化钠搅拌溶解，加全量注射用水使成等渗溶液，最后用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，灯检，包装。
上述制备过程中，水转溶量的最佳比例为40％，吐温-80的最佳比例为0.06％；在调节渗透压过程中也可使用葡萄糖或者葡萄糖氯化钠溶液，其中葡萄糖氯化钠溶液中葡萄糖和氯化钠的常用比例为葡萄糖∶氯化钠＝5∶0.9或葡萄糖∶氯化钠＝10∶0.9。
葡萄糖氯化钠溶液的具体用法为50ml葡萄糖2.5g与氯化钠0.45g50ml葡萄糖5g与氯化钠0.45g100ml葡萄糖5g与氯化钠0.9g100ml葡萄糖10g与氯化钠0.9g250ml葡萄糖12.5g与氯化钠2.25g250ml葡萄糖25g与氯化钠2.25g500ml葡萄糖25g与氯化钠4.5g500ml葡萄糖50g与氯化钠4.5g上述制备过程中，助溶剂除可采用吐温-80外，还可采用吐温-20、吐温-40、吐温-60、泊洛沙姆类、β-羟丙基环糊精、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇。
另外，灌封前精滤的方法除了使用0.22μm的微孔滤膜膜滤过外，还可以使用超滤的方法滤过，其分子量截留值为5万～10万。
本发明的质量控制方法为指纹图谱高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B
两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱；从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；参照物溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；供试品溶液的制备 取本品适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，应符合下列要求供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；供试品指纹图谱有10个共有峰；相对保留时间范围 1号峰0.340～0.376、2号峰0.641～0.708、3(S)1.000、4号峰1.000～1.098、5号峰1.032～1.141、6号峰1.302～1.439、7号峰1.727～1.909、8号峰1.763～1.948、9号峰1.947～2.152、10号峰2.070～2.288；相对峰面积比值范围 1号峰5.409～8.113、2号峰1.340～2.234、4号峰1.025～1.708、5号峰0.709～1.182；非共有峰面积 不得超过总峰面积的5％。
含量测定肉桂酸 按照高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；甲醇(20～21％)-0.1％磷酸溶液(55～60％)-乙腈(20～24％)为流动相，较为理想的流动相为21∶55∶24的甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈，其中磷酸溶液也可替换为甲酸溶液、冰醋酸溶液；检测波长为278nm。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；对照品溶液的制备 取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μg的溶液；供试品溶液的制备 精密量取本品1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每1ml含玄参以肉桂酸(C9H8O2)计不得少于0.03mg。
总绿原酸对照品溶液的配制 取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得；标准曲线制备 精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。以水为空白，照分光光度法，在347nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法 精密量取本品1.0ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量(μg)，计算，即得。本品每1ml含金银花以总绿原酸按绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.80mg。
本发明所称的大输液是指规格为50ml、100ml、250ml、500ml的注射液。
本发明对原脉络宁注射液的制备工艺进行了优化，将主要化学成分总绿原酸和肉桂酸列入质量控制方法，明确了其中的主要化学成分来自何种药材，并建立色谱指纹图谱进行全面的质量控制，使防治血栓闭塞性疾病的效果明显提高，同时减少了临床使用中的二次污染，并为医护人员的实际应用提供了便利。
因原剂型上市较早，其提取分离纯化及制剂成型工艺等缺乏较系统研究，故本制备工艺研究将分别对水提工艺、醇沉工艺、酯提工艺、水转溶工艺、吐温-80加入量、pH值、渗透压、灭菌条件等进行考察，同时对大输液与原脉络宁注射液在各工艺点的有关成分进行比较。
下面的实验例和实施例用于进一步说明本发明。
实验例1本发明对电凝法所致大脑中动脉阻断大鼠的保护作用1.大鼠大脑中动脉阻断模型取大鼠称重，随机分为5组，即假手术组、模型组(以上2组均给予等容积的生理盐水)、尼膜同组(给予尼膜同输液2mg/kg)、原脉络宁注射液组(给予原脉络宁注射液8.6g生药/kg)、本发明组(给予本发明8.6g生药/kg)。
各鼠以10％水合氯醛麻醉(300mg/kg，ip)后，按常规方法操作，找到大脑中动脉，用细针灸针刺破硬脑膜，暴露中动脉，将电刀置双极电凝位置，选择最大档电凝开关，除假手术组不做电凝术外，其余各组动物电凝嗅束内1mm至大脑下静脉之间的一段大脑中动脉，电凝4~6秒。大脑中动脉阻断(MCAO)后回笼饲养，各组在术后、4小时及24小时各iv给药一次，给药容积为10ml/kg。以上过程均在室温恒定(24~25℃)情况下进行，以利于评价脑缺血情况。MCAO后24小时断头取脑，肉眼进一步确证右侧大脑中动脉已在嗅束与大脑下静脉之间烧断，且脑实质无损害者，将脑置冷生理盐水(2~3℃)中10分钟，去除嗅球、小脑和低位脑干后，冠状切四刀，切成五片。第一刀在脑前极与视交叉连线之间；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄和后叶尾极之间。然后迅速将脑片置5ml含有1％红四氮唑的磷酸缓冲溶液中，遮光温孵30分钟，其中每隔7~8分钟翻动一次，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，且界限分明。
待MCAO后4小时及24小时，进行神经行为学评分。MCAO后24小时断头取脑，称湿重；106℃烘干至恒重，即干重；按下列公式计算脑指数和脑含水量∶脑指数＝脑湿重(g)/体重(100g)。脑含水量(％)＝[脑湿重(g)-脑干重(g)]/脑湿重(g)×100％，分离并称重梗塞区域，求出梗塞区重量占脑重的百分比，即脑梗塞率(％)。
MCAO后24小时断头取脑，置10％甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，镜检脑缺血的病理改变。
2.结果本发明对大脑中动脉阻断所致的神经行为学评分有改善作用；可降低脑梗塞率、脑指数、脑含水量，在改善神经行为学评分及降低脑梗塞率方面，本发明要明显优于原脉络宁注射液，结果见表1。
组织学检查发现，假手术组脑组织均见皮层神经元结构清楚，1例见神经元尼氏小体消失，其余各例胞体无肿胀，尼氏小体无减少或消失，神经元数目未见减少，无软化灶形成。模型组脑组织均见皮层神经元结构模糊，胞体肿胀，尼氏小体减少或消失，出现不同程度的核深染、核固缩及核溶解，神经元数目明显减少，可见明显软化灶形成。尼膜同组脑组织病理学改变有明显改善，见少量神经元尼氏小体消失，胶质细胞增生，2例未见病理学异常改变。原脉络宁注射液组脑组织病理学改变有明显改善，见少量神经元尼氏小体消失，胶质细胞增生，4例未见病理学异常改变。本发明组脑组织病理学改变有明显改善，见少量神经元尼氏小体消失，胶质细胞增生。
表1本发明对大脑中动脉阻断大鼠的保护作用(X±s)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较实验例2本发明对急性不完全脑缺血小鼠的保护作用1.小鼠急性不完全性脑缺血模型取ICR小鼠，雌雄兼备，随机分为4组，即模型组(给予等容积的生理盐水)、尼膜同组(给予尼膜同输液2mg/kg)、原脉络宁注射液组(给予原脉络宁注射液17.2g生药/kg)、本发明组(给予本发明17.2g生药/kg)，每组17只；各组均通过尾静脉给药，给药容积为20ml/kg。静脉给药10分钟后，将动物仰卧位固定，用0号手术缝线两端结扎双侧颈总动脉(合并迷走神经)后中间剪断。记录呼吸维持时间。
2.结果结果显示，模型对照组呼吸维持时间为1.93±0.76min，原脉络宁注射液组为3.32±1.96min，本发明组为4.31±1.23min，尼膜同组为4.10±2.18min。后3组与模型组比较，均有显著性差异(P＜0.05)，且本发明在延长急性不完全脑缺血小鼠的存活时间方面要优于原脉络宁注射液。
实验例3本发明对麻醉犬脑循环的影响1.犬脑循环的在体实验法犬称重后随机分为4组，即生理盐水对照组(给予等容积生理盐水)、尼膜同组(给予尼膜同输液0.165mg/kg)、原脉络宁注射液组(给予原脉络宁注射液4g生药/kg)、本发明组(给予本发明4g生药/kg)。各组给药容积为2ml/kg。
取动物用3％戊巴比妥钠30mg/kg前肢皮下头静脉麻醉，背位固定于手术台上，剪去颈部和左后肢内侧的毛。分离股静脉插入静脉插管，缓慢恒速输入生理盐水或实验用药(约1ml/min)；分离股动脉插入动脉插管(管内充满500u/ml的肝素生理盐水)，以测量动脉血压。分离颈内动脉和椎主动脉沿颈部正中线切口，沿气管右部分离出右颈总动脉，以粗丝线提起颈总动脉并略向外牵引，沿颈总动脉向胸锁乳突肌方向分离，以手指触摸出颈部最下的横突，在这一突出向中线1cm向下肢方向1.5cm有一凹陷，能触摸到搏动明显的动脉即为椎动脉，以小弯止血钳椎将动脉与周围结缔组织分离，以左手手指为引导，以长止血钳轻轻夹起椎动脉，并穿线，放置适宜内径的电磁血流量计探头(1.5mm)，测量椎动脉血流量；沿颈总动脉向头端分离出在下颌深部进入颅内之前的颈外动脉，并将其结扎，这时放置适宜内径的电磁血流量计探头(2mm)，此时测得颈总动脉血流即为颈内动脉血流量。实验结束时，处死动物，开颅取出全脑称重，将全脑重量除以2得一侧脑重。计算脑血流量和脑血管阻力。
2.结果本发明能降低脑血管阻力，增加脑血流量而且效果明显优于原脉络宁注射液，结果见表2、表3。
表2 本发明对麻醉犬脑血管阻力的影响(X±s，n＝5)
*P＜0.05，**P＜0.01与给药前(0min)比较a给药后时间(min)表3 本发明对麻醉犬脑血流量的影响(X±s，n＝5)
*P＜0.05，**P＜0.01与给药前(0min)比较a给药后时间(min)
综上所述，本发明能改善脑缺血后的神经行为障碍，缩小脑梗塞面积，降低缺血大脑的肿胀程度，降低脑血管阻力，增加脑血流量。通过主要药效学指标的对比发现，本发明明显优于原脉络宁注射液这些作用对临床上改善脑缺血缺氧是十分有利的，也是该药防治脑血栓形成等血栓闭塞性疾病的重要药理学基础。
实验例4水转溶工艺的研究按处方量分别取牛膝等四味药材各2250g，分成三批，批号为20010310、20010311、20010312，按前述提取工艺分别进行提取，经水提、醇沉、酯提等工序得酯提浸膏，各批浸膏分别等分为10份，分别加入处方全量用水的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即水转溶量)，煮沸，除尽醋酸乙酯，并适时补足蒸发的水量，冷却后冷藏，过滤，再分别补加适量注射用水，加入0.08％吐温-80，用20％的NaOH溶液调pH至9.0，适量氯化钠搅拌溶解，加注射用水至全量，用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得样品。
1.总固体量的研究精密吸取各组样品10ml，挥干溶剂后测定其总固体量，结果见表4。
表4 总固体量的研究
将以上不同水转溶量对应的数据进行数理统计(1)各组数据的显著性差异比较(F检验)以水转溶量为水平，每个水平3个重复试验。此时F＝20.00，而F0.01(9，20＝3.46，因20.00＞3.46，所以水转溶量对总固体量有显著影响。
(2)各组数据的组间比较(q检验)以水转溶量为水平，每个水平3个重复试验。此时DT＝0.46，得出的结论是40％水转溶量以下不同水转溶量时总固体量差异明显，40％水转溶量以上无显著性差异。
从统计结果可知，水转溶量对总固体量有明显影响，随着水转溶量的增加，40％水转溶量以下各组样品总固体量增加显著，但从40％水转溶量对应的样品起，总固体量增加量减少。
2.总绿原酸的研究取上述各组样品，分别测定其中总绿原酸含量，测定方法详见申报资料15，结果见表5。
表5 总绿原酸含量的研究
将以上不同水转溶量对应的数据进行统计(1)各组数据的显著性差异比较(F检验)以水转溶量为水平，每个水平3个重复试验。此时F＝69.855，而F0.01(9，20)＝3.46，因69.855＞3.46，所以水转溶量对总绿原酸的含量有显著影响。
(2)各组数据组间比较(q检验)以水转溶量为水平，每个水平3个重复试验。此时DT＝0.12，得出的结论是40％水转溶量以下，不同水转溶量之间总绿原酸的含量有显著性差异，40％水转溶量以上无显著性差异。说明总绿原酸在40％水转溶量时已较充分转溶。
3.肉桂酸含量的研究取上述各组样品，分别测定其中肉桂酸的含量。结果见表6。
表6 肉桂酸含量的研究
将以上不同水转溶量对应的数据进行统计(1)数据的显著性差异比较(F检验)以水转溶量为水平，每个水平3个重复试验。此时F＝44.88，而F0.01(9，20)＝3.46，因44.88＞3.46，所以得出的结论是不同水转溶量对肉桂酸的含量有显著影响；(2)数据的组间比较(q检验)以水转溶量为水平，每个水平3个重复试验。此时DT＝0.00475，得出的结论是40％水转溶量以下，不同水转溶量之间肉桂酸的含量有显著性差异，40％水转溶量以上无显著性差异。此结果与总绿原酸的含量变化趋势基本一致。
从统计结果可知，不同的水转溶量对肉桂酸含量有明显影响。开始时肉桂酸的含量随浸膏水转溶量的增大增加较快，但水转溶量达到40％后，肉桂酸含量的增加随浸膏水转溶量的增大而明显减少，说明肉桂酸此时已较充分转溶。
4.不同水转溶量样品的澄明度考察取上述各组样品，于37℃、RH75％条件下恒温恒湿箱放置，进行加速试验，以澄明度对样品的稳定性进行考察。加速试验进行30天后，样品70％转溶量20010311批、90％转溶量20010312批、100％转溶量三批均开始出现肉眼可辨出的黑点或出现轻微浑浊现象；进行90天后，转溶量在50％以上的样品大部分出现黑点或浑浊现象。说明转溶量在50％以上的样品澄明度差于转溶量在50％以下样品。详细结果见表7。
表7 不同水转溶量样品的澄明度考察试验
注+表示澄明度不合格，-表示澄明度合格，/表示该时间点停止试验。
5.水转溶量的确定综合以上总固体量、总绿原酸及肉桂酸的研究结果可知，当转溶量达到40％以上时，其总固体量已较少变化；而当转溶量达到40％时，总绿原酸和肉桂酸等成分转溶已较充分，再增加转溶的水量意义已不大，此时样品中可检测成分占总固体量的比例已达25％以上，符合中药静脉注射剂质量要求；其次，水转溶量在50％以上的样品澄明度较差。故综合考察以上各因素，确定处方量药材的酯提浸膏水转溶量为40％较为理想，即酯提浸膏先加入处方全量40％的注射用水，煮沸，冷却，滤除不溶性物质后再补加注射用水至足量。
实验例5吐温-80加入量的研究原脉络宁注射液(10ml)成分复杂，为改善其澄明度，生产工艺中加入了0.8％的吐温-80。脉络宁注射液(100ml)所含总固体量较原脉络宁注射液(10ml)有较大幅度增加，故为改善其澄明度，在参考原10ml规格的脉络宁注射液的基础上，考虑仍加入吐温-80作为助溶剂。本试验对脉络宁注射液(100ml)所需加入吐温-80量进行了筛选。
1.吐温-80加入量的研究方法据处方分别取牛膝等四味药材各2700g，等分为三批，按前述筛选工艺分别进行水提、醇沉、酯提、转溶、滤液加水至适量，各批等分为9份，分别加入0.00％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.10％、0.12％、0.16％、0.20％量吐温-80，搅匀，用20％NaOH溶液调pH至9.0，加入氯化钠搅拌溶解，加注射用水至全量，再分别用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，得样品。所得样品分成两组，分别进行热处理冷藏试验及加速试验。
2.热处理冷藏试验将上述样品每日加热煮沸0.5小时后于冰箱冷藏放置(2℃-7℃)。结果其中未加吐温-80的样品第5天即出现很轻微的浑浊现象，吐温-80加入量0.02％的一批样品第10天出现极轻微的浑浊现象，另两批20天均出现浑浊。其余样品澄明良好。结果详见表8。
3.加速试验取上述各组样品，于37℃、RH75％条件下恒温恒湿箱放置，进行加速试验，以考察样品的澄明度。至90天吐温-80加入量0.04％以下样品均有澄明度不合格。结果详见表8。
表8 不同吐温加入量样品的澄明度考察
注+表示澄明度不合格，-表示澄明度合格，/表示该时间点样品已停止试验。
通过上述试验，最终确定脉络宁注射液(100ml)加入0.06％吐温-80作为增溶剂。
实验例6pH值的确定脉络宁注射液(100ml)的pH值控制在6.5～7.5，是中药注射剂的质量要求。原脉络宁注射液(10ml)在100℃加热灭菌中pH值下降约为1～2。故此，脉络宁注射液(100ml)加热灭菌后pH值亦将有一定程度变化。
按处方分别取牛膝等四味药材各350g，经前述工艺制得药液，分为7组，用20％NaOH调至不同pH值，经灭菌处理，测得灭菌后的pH值，并于37℃、RH75％条件下进行加速试验，方法同前，以考察样品的澄明度。结果表明1、2号样品加速试验进行至60天均出现轻微浑浊，并随时间延长而加重；其余各样品澄明度良好。实验方法及结果详见表9。
表9 脉络宁注射液(100ml)灭菌前后pH值变化及澄明度考察
注+表示澄明度不合格，-表示澄明度合格，/表示该时间点样品已停止试验。
从表中可看出，灭菌后pH值下降约1.5～2.0。故根据上表数据，确定脉络宁注射液(100ml)灭菌前的pH值调到9.0～9.2，经试验证实，消毒灭菌后的pH值能控制在6.5-7.5，并具有良好的澄明度。
实验例7渗透压调节的研究人体正常体液渗透压平均为298mmol/L，正常范围为280～310mmol/L，大容量注射剂的渗透压不能低于血液的渗透压，应调节成等渗或偏高渗。故根据本品情况，拟将脉络宁注射液(100ml)调节成等渗溶液。常用于调节渗透压的附加剂有氯化钠、葡萄糖。
按脉络宁注射液(100ml)处方分取牛膝、玄参、石斛、金银花各300g，等分为三批，分别进行提取分离、水转溶、加适量注射用水、调pH值，取已调好pH值样品分别于冰点渗透压计上测定其渗透压值。计算氯化钠所需加入量。方法与结果详见表10。
表10 脉络宁注射液(100ml)渗透压的确定
通过以上结果可知，三批样品按计算量加入氯化钠后，其成品渗透压测定均符合要求。故本制剂渗透压调节采用以下方法所得药液调pH值后测定其渗透压，据测得值计算氯化钠加入量而将其调节为等渗溶液。
实验例8脉络宁注射液(100ml)与原脉络宁注射液(10ml)各工艺点有关成分的比较按脉络宁注射液(100ml)处方分别取牛膝、玄参、石斛、金银花各500g，共2000g分成二批，一批按脉络宁注射液(10ml)有关工艺分别进行提取，经醇沉、酯提等工序制成10ml注射液，另一批制成100ml注射液。从原药材、水提、醇沉、酯提及成品等各工艺点总绿原酸及肉桂酸进行比较。详见表11。
表11 脉络宁注射液(100ml)与脉络宁注射液(10ml)有关成分的比较
由以上结果可知，与原脉络宁注射液(10ml)比较，脉络宁注射液(100ml)总绿原酸及肉桂酸转移率均有较大提高，从而保证了其临床疗效。
实验例9脉络宁注射液(100ml)中试生产研究据脉络宁注射液(100ml)处方分别取药材，分三批投料，各批投料量见表12。按前述工艺进行制备，*分别测定原药材、水提浸膏、醇沉浸膏、酯提浸膏、成品中总绿原酸及肉桂酸的含量及成品率等。结果详见表12。
表12 脉络宁注射液(100ml)中试生产研究结果
中试生产研究结果表明，本研究工艺经中试放大后有关成分与小试相互一致，且初步稳定性考察结果符合要求，表明本研究工艺稳定，可行性良好，具备了工业化大生产的条件。
实施例1脉络宁大输液的制备牛膝250g玄参250g石斛250g金银花250g以上四味药材饮片，加药材6倍量水，浸泡1.5小时后，煎煮提取2次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至相对密度1.30(65℃)，冷却。加乙醇使含醇量至80％，静置24小时。取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至相对密度1.10(65℃)。用3倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量40％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入0.06％吐温-80，搅匀，用20％NaOH溶液调pH至9.0，加入氯化钠搅拌溶解，加全量注射用水使成等渗溶液，最后用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，共制成1000ml，每瓶100ml。
实施例2脉络宁大输液的制备牛膝300g玄参300g石斛200g金银花200g以上四味药材饮片加药材5倍量水，浸泡2小时后，煎煮提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至65℃下相对密度为1.25，冷却。加乙醇使含醇量至75％，静置。取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至65℃下相对密度为1.15。用4倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量35％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入0.07％吐温-80，搅匀，用30％NaOH溶液调pH至9.2，加入葡萄糖∶氯化钠＝5∶0.9的糖盐水搅拌溶解，加全量注射用水使成等渗溶液，最后用超滤的方法滤过，其分子量截留值为10万，灌封，灭菌，共制成1000ml，每瓶250ml。
实施例3脉络宁大输液的质量控制方法a.指纹图谱的测定用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱；从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；参照物溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；供试品溶液的制备 取脉络宁大输液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；供试品指纹图谱有10个共有峰；相对保留时间 1号峰0.364、2号峰0.678、3(S)1.00、4号峰1.043、5号峰1.083、6号峰1.362、7号峰1.794、8号峰1.833、9号峰2.020、10号峰2.149；相对峰面积比值 1号峰6.780、2号峰1.363、4号峰1.220、5号峰0.932；非共有峰面积 不得超过总峰面积的5％；b.肉桂酸的含量测定按照高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；21∶55∶24的甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈为流动相；检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；对照品溶液的制备 取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μg的溶液；供试品溶液的制备 精密量取脉络宁大输液1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至10ml，摇匀，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
c.总绿原酸的含量测定对照品溶液的配制 取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得；标准曲线制备 精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。以水为空白，照分光光度法，在347nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法 精密量取脉络宁大输液1.0ml，置100ml量瓶中，加水至100ml，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量，计算，即得。
权利要求
1.一种用于治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于该制备方法为牛膝1-4重量份 玄参1-4重量份 石斛1-4重量份 金银花1-4重量份将以上四味药材饮片，加药材4-8倍量水，浸泡1-3小时后，煎煮提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至65℃下相对密度为1.25-1.35，冷却；加乙醇使含醇量至70％-85％，静置；取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至65℃下相对密度为1.05-1.15；用2-4倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量10％-50％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入0.06％-0.08％吐温-80，搅匀，用20％-40％NaOH溶液调pH至8.5-9.2，加入氯化钠搅拌溶解，加全量注射用水使成等渗溶液，最后用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，灯检，包装。
2.如权利要求1所述的一种用于治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于该制备方法为将牛膝、玄参、石斛、金银花四味药材饮片等比例混合，加药材6倍量水，浸泡1.5小时后，煎煮提取2次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至65℃下相对密度为1.30，冷却；加乙醇使含醇量至80％，静置；取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至65℃下相对密度为1.10；用3倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量40％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入0.06％吐温-80，搅匀，用20％NaOH溶液调pH至9.0～9.2，加入氯化钠搅拌溶解，加全量注射用水使成等渗溶液，最后用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，灯检，包装。
3.如权利要求1所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于该制备方法为将牛膝、玄参、石斛、金银花四味药材饮片按3∶3∶2∶2的重量比例混合，加药材5倍量水，浸泡2小时后，煎煮提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，减压浓缩至65℃下相对密度为1.25，冷却；加乙醇使含醇量至75％，静置；取上清液，回收并除尽乙醇，浓缩至65℃下相对密度为1.15；用4倍量醋酸乙酯逆流萃取，合并酯提液，回收并除尽醋酸乙酯，加全量35％注射用水，煮沸，冷却，过滤，补加适量注射用水，加入0.07％吐温-80，搅匀，用30％NaOH溶液调pH至9.0～9.2，加入氯化钠搅拌溶解，加全量注射用水使成等渗溶液，最后用0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，灭菌，灯检，包装。
4.如权利要求1、2、3所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于该制备方法中也可使用吐温-20、吐温-40、吐温-60、泊洛沙姆类、β-羟丙基环糊精、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇来替代吐温-80。
5.如权利要求1、2、3所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于在该制备方法中也可使用葡萄糖或者葡萄糖氯化钠溶液代替氯化钠来调节渗透压。
6.如权利要求5所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于葡萄糖氯化钠溶液中葡萄糖和氯化钠的常用比例为葡萄糖∶氯化钠＝5∶0.9或葡萄糖∶氯化钠＝10∶0.9。
7.如权利要求1、2、3所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的制备方法，其特征在于在该制备方法中，灌封前还可以使用超滤的方法滤过，其分子量截留值为5万～10万。
8.如权利要求1、2、3所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的质量控制方法，其特征在于该方法为a.指纹图谱的测定用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；柱温25℃；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，A、B两种流动相按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱0到5分钟时按95％的0.1％甲酸溶液加5％的甲醇溶液的比例关系进行洗脱；从5到60分钟，按0.1％甲酸溶液由95％降为50％，甲醇由5％升到50％的比例关系进行洗脱；流速1ml/min；检测波长为300nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；参照物溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含160μg的溶液，即得；供试品溶液的制备取大输液适量，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定；供试品指纹图谱中与参照物相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积比值，供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；供试品指纹图谱有10个共有峰；相对保留时间范围 1号峰0.340～0.376、2号峰0.641～0.708、3(S)1.000、4号峰1.000～1.098、5号峰1.032～1.141、6号峰1.302～1.439、7号峰1.727～1.909、8号峰1.763～1.948、9号峰1.947～2.152、10号峰2.070～2.288；相对峰面积比值范围 1号峰5.409～8.113、2号峰1.340～2.234、4号峰1.025～1.708、5号峰0.709～1.182；非共有峰面积 不得超过总峰面积的5％；b.肉桂酸的含量测定按照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；20～21％甲醇-55～60％的0.1％磷酸溶液-20～24％乙腈为流动相；检测波长为278nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于1500；对照品溶液的制备取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml中含2.0μg的溶液；供试品溶液的制备 精密量取大输液1.0ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至10ml，摇匀，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；c.总绿原酸的含量测定对照品溶液的配制取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，即得；标准曲线制备精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，分别置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀；以水为空白，照分光光度法，在347nm的波长处测定吸收度；以吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定法精密量取大输液1.0ml，置100ml量瓶中，加水至100ml，摇匀，在347nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中绿原酸重量，计算，即得。
9.如权利要求8所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品指纹图谱为供试品指纹图谱有10个共有峰；相对保留时间 1号峰0.364、2号峰0.678、3(S)1.00、4号峰1.043、5号峰1.083、6号峰1.362、7号峰1.794、8号峰1.833、9号峰2.020、10号峰2.149；相对峰面积比值 1号峰6.780、2号峰1.363、4号峰1.220、5号峰0.932。
10.如权利要求8所述的一种治疗血栓闭塞性疾病的大输液的质量控制方法，其特征在于该方法中肉桂酸含量测定的流动相为21∶55∶24的甲醇-0.1％磷酸溶液-乙腈。
全文摘要
本发明公开了一种用于治疗血栓闭塞性疾病的大输液(即大容量注射液)的制备及质量控制方法，该大输液采用的制备工艺路线如下药材－水提－醇沉－酯提－水转溶－滤过－加适量水－加助溶剂－调pH值－调节渗透压－加水至全量－过滤－灌封－灭菌－成品。该大输液的质量控制方法包括指纹图谱的测定和对总绿原酸及肉桂酸的含量测定。本发明与原小针剂型相比能更全面的控制产品质量，疗效明显提高，减少二次污染，使用更方便。
文档编号A61P7/02GK1669568SQ20041000873
公开日2005年9月21日 申请日期2004年3月16日 优先权日2004年3月16日
发明者王兴旺, 徐向阳, 万辉, 张庆晓, 张蕙, 陈钟, 张 杰, 陈希, 孙晔, 田丽娟, 倪洁, 蔡莹, 王伟, 张春来, 谢俊, 张晓静, 夏云, 范廷校, 杨俊 , 许剑锋 申请人:金陵药业股份有限公司