用于预防艾滋病的重组痘病毒疫苗的制作方法

专利名称：用于预防艾滋病的重组痘病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的疫苗，尤其是，所述疫苗为含有编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的经过人工修饰的Gag、Pol和野生的Env核苷酸序列的重组痘病毒。这些疫苗在体内施用时用作病毒蛋白抗原生物合成的转录单位。
背景技术：
艾滋病被认为是世界上直接威胁人类健康的第一大传染病，联合国艾滋病联合规划署发表的《2004全球艾滋病疫情年度报告》指出，目前全球有3800万名艾滋病病毒携带者，2003年共有290万人死于艾滋病。2003年，亚洲地区共有110万人被感染，50多万人死于艾滋病，该地区目前共有740万名艾滋病毒携带者。2003年底，中国有艾滋病病毒感染者约84万，其中艾滋病患者约8万例。报告感染数波及31个省、自治区、直辖市。虽然近几年抗艾滋病药物的“鸡尾酒”疗法在发达国家有效地控制了HIV的蔓延，但是昂贵的价格(在我国该药物价格大约为3000-10000元人民币/人/月)，耐药病毒株的产生，长期用药的副作用以及最终无法彻底清除患者体内病毒等方面的不利因素显示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地预防和控制艾滋病。所以艾滋病疫苗研制势在必行。
国内外有关方面研究现状 用HIV-1疫苗防治AIDS被国际上认为是目前最行之有效的方法，已成为世界上许多科研机构研究的热点。目前，关于艾滋病疫苗的生产国际上尚属空白。而HIV-1疫苗的研制工作在国外已有多家大型科研机构、制药公司正开展进行。
自八十年代发现艾滋病以来，人们就开始进行艾滋病疫苗的研究。一般来说，减毒活疫苗和灭活疫苗能产生较好免疫保护性反应，但安全性较差，不适用于作为艾滋病疫苗。随着人类对艾滋病认识的不断提高，九十年代初人们意识到CTL(Cytotoxic T Lymphocytes细胞毒性T细胞，即细胞免疫应答)的重要性，越来越多的证据显示阳性CD8介导的CTL在控制艾滋病毒感染中起举足轻重的作用。因此人们开始研究用重组病毒载体疫苗来诱导CTL，然后用胞膜蛋白亚单位疫苗增强免疫来诱导中和抗体，力图从体液免疫和细胞免疫两方面来诱导人体对艾滋病毒的保护反应。但由于免疫强度有限，而用重组载体疫苗又难以进行多次增强免疫，所以在动物模型和人体试验结果都显示了较低的对HIV的免疫保护反应。
痘病毒作为天花的有效疫苗被在世界范围内广泛应用，为人类最后在全世界范围内灭绝天花做出了决定性的贡献。痘病毒具有极高的免疫效率，但是它也具有明显的副作用。例如，接种者往往出现发烧，虚弱，肌肉痛，头痛，呕吐和淋巴结肿大等症状。绝大部分接种者都出现发烧症状。尤其儿童接种者，近70％的儿童接种者体温上升到38度，15-20％的儿童甚至达到更高的体温。更有甚者出现神经系统综合症，直至死亡。据McElwain等报道，美国七十年代平均每年有七人死于天花疫苗接种。
由于痘苗病毒的副作用，人们在六、七十年代就开始了痘苗病毒的致弱工作。1960年至1974年期间，德国教授Anton Mayr领导的研究小组通过将痘病毒在鸡胚成纤维细胞中传代的方法，成功地将从Ankara地区分离得到的痘病毒CVA株致弱。当传到516代时，这株致弱毒株被命名为MVA(Modified Vaccinia Ankara)。MVA不但继承了CVA的免疫原性好，对天花的保护性高的特点，同时由于在哺乳细胞不能繁殖，所以MVA还具有对人和动物毒副作用小的特点。动物试验(鸡，兔和小鼠)结果显示，MVA对新生动物不产生任何副作用，甚至对于免疫能力低下的动物同样没有明显的副作用。
1980年，随着世界卫生组织宣布天花在地球上的灭绝，痘苗病毒本身作为疫苗的历史结束了。然而在同一年，基因重组技术在痘苗病毒上的应用，为痘病毒作为病毒载体用于开发研制新疫苗拓开了崭新，广泛的应用前景。
MVA作为病毒载体，具备其他痘病毒载体的优点如(1)外源基因容量大，MVA不但能够表达大的外源基因，而且能够同时容纳，表达多个外源基因，从而可以同时刺激产生针对多种抗原的免疫反应或表达免疫辅助因子，诱导产生高效保护反应；(2)表达水平高；(3)感染多种细胞，使抗原有效地提呈到不同的组织；(4)同时MVA还具有独特的优势，安全性好。
MVA目前被广泛用于人类基因治疗和疫苗的研究，英国的Oxford Bio Medica和法国Strasbourg的TransGene，在分别以MVA为载体进行癌症基因治疗的人体临床试验，同时英国MRC和肯尼亚正在合作进行以MVA为载体的HIV疫苗的临床试验。
国内研究艾滋病疫苗的队伍主要有中国预防医学科学院、卫生部艾滋病预防与控制中心和病毒学研究所、清华大学、中国科学院微生物所及一些部队院校等。

发明内容
本发明提供一种用于预防艾滋病的重组痘病毒疫苗(M-GPE)。
本发明采取的技术方案是该预防艾滋病的重组痘病毒疫苗一种含有转录单位的经过重组的痘病毒，所述转录单位编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列，该人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列是具有免疫原性的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中转录单位指导抗原的合成。本发明的一个重要方面，采用的痘病毒是经过修饰的痘病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankara，MVA)。在本发明的另一个重要方面，所含有的转录单位编码的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白，进一步包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、编码酶类蛋白的Pol和外膜蛋白Env。其各氨基酸序列分别如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4所述。
本发明所述的重组的痘病毒是非复制型的。
本发明可作为一种用于预防艾滋病的非复制型重组痘病毒载体疫苗，它包含了可编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列。
本发明包含一个β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达报告基因Lac Z，含有两个启动子，分别是引导Lac Z基因的启动子P11和引导人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白基因的HIV-1-GagPol和Env的P7.5，包含两个阅读框架，可以同时表达β-半乳糖苷酶表达报告基因Lac Z和人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白HIV-1-GagPol和Env。
在本发明的一个重要实施方案中，包含由穿梭质粒PSC11-GPE与经过修饰的痘病毒安卡拉株重组而成，穿梭质粒PSC11-GPE包含了编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列，穿梭质粒PSC11-GPE的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述，其中编码GagPol的核苷酸序列来源于经过修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的GagPol的核苷酸序列，而编码Env蛋白的核苷酸序列则来源于未经修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env的核苷酸序列。
本发明提供了一种药用组合物，为含有转录单位的经过重组的痘病毒和一种可药用的载体。它的一个重要实施方案中含有转录单位的经过重组的痘病毒M-GPE与生理盐水的滴度体积比为106-1010pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。
本发明提供了一种抗原，其由含有转录单位的经过重组的痘病毒表达产生，该表达产生的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的结构蛋白Gag、Pol和Env。
本发明的优点在于(1)表达水平高；(2)感染多种细胞，使抗原有效地提呈到不同的组织；(3)安全性好；(4)疫苗靶抗原包括了几乎所有的HIV-1结构蛋白，如GagPol和Env，更好的诱导人体产生对HIV有效的免疫保护。


图1、穿梭质粒pSC11-GPE示意图。该质粒共含有14958bp，包括两个方向相反的启动子P11和P7.5分别驱动LacZ和HIV-1抗原基因的转录，FL-1-TK和FL-2-TK是两段与MVA病毒载体上TK基因的同源序列，正是由于这两段同源序列的存在，使该重组穿梭质粒和MVA在细胞内能发生同源重组，把包括LacZ和HIV-1抗原基因的表达框重组到MVA病毒载体中，从而构建了重组MVA病毒载体疫苗M-GPE。
图2、M-GPE示意图。HIV-1结构基因表达框架重组到MVA的TK基因中，基因表达的启动子采用P7.5。
图3 gagpol基因重组痘苗病毒在哺乳动物细胞中的表达情况。
含有gagpol基因的MVA重组病毒感染HEK293细胞，感染16-24小时后收集细胞，用WESTEN BLOT检测蛋白表达情况。LANE 1空白对照；LANE 2未修饰的gagpol基因表达产物；LANE 3修饰的gagpol基因表达产物。
图4 M-GPE在哺乳动物细胞中的表达。
人HEK293细胞被M-GPE感染。蛋白表达用WESTERN BLOT分析。实验所用抗体为广西壮族自治区HIV-1阳性血清。LANE 1标准蛋白分子量；LANE 2空白对照；LANE 3M-GPE表达产物；LANE 4标准病毒(广西壮族自治区HIV-1高发区病毒样品)。
具体实施例方式
实施例1抗原的选择与修饰1、目的基因的选择目前中国主要的HIV-1流行株为B/C重组型HIV-1。
选择的HIV-1中国流行株gagpol基因序列如SEQ ID NO6，选择的HIV-1中国流行株env基因序列如SEQ ID NO7，我们这里用于构建艾滋病疫苗的HIV-1目的基因就是根据上述B/C重组亚型的基因序列为基础，然后对gagpol进行了全序列人工合成，该合成的基因所表达的氨基酸序列与野生的HIV-1中国流行株gagpol基因表达的氨基酸序列一致，但基因表达效率则大大提高。
以上述修饰过的gagpol和野生的env基因作为目标抗原的基因，它们的表达产物组成了HIV-1最主要的结构蛋白，因此它们是抗原基因的最佳选择。
2、抗原基因gagpol的修饰2.1方法根据我们以前研究的结果发现，HIV-1 gag，pol基因内存在许多抑制因子。这些抑制因子是以A和T为主组成，造成HIV-1 mRNA不稳定，不能从细胞核转制到细胞浆，从而影响蛋白表达。去除抑制因子的办法就是在不影响氨基酸编码的前提下，将Codon第三位的A或T尽量改为C或G。
2.2过程GPCINS、ENVCINS分别代表合成的全新的gagpol和env基因GPCINS基因序列合成引物F1GACGTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATCCCCAGCGTGAACAATGAGACCR1CTGCACTGGAAGATGGCGGGGCTGCCCTTCCAGCCCTGGGGCAGCACGTTGTACTGGTACCGGATGCCGGGGGTCTCATTGTTCACGCTGF2CCAGGACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACCGTGCTGGACGTGGGCGACGCR2CAGATCGTCCATGTACTGGTAGATCACGATGTCGGGGTTCTGCTTCCGGAAGGGCTCCAGGATCTTGGTCATGCTGCACTGGAAGATGGCF3CATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAACAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGAR3TTCAGGAGGTGCTCCCGCAGTTCCTCGATCTTGGTCCGGTGCTGGCCGATCTCCAGGTCGCTGCCCACGTACAGATCGTCCATGTACTGGF4GACCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACAACACCCCCATCTTCGCCATCCG
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第一轮PCR的目的是合成该基因中间的一段DNA序列，所以设计合成一对引物F1和R1，F1为正向引物，R1为反向引物，F1与所要合成的基因的中间部分的有义链序列一致，R1与所要合成的基因的中间部分的反义链序列一致，且它们的3’端互补(见引物序列的下划线处)，因此，第一轮PCR不需要加入模板，只需要加入Taq酶缓冲液、4种dNTP、引物F1、引物R1、Taq酶，补加水至一定体积，按照PCR的“加温变性-退火-延伸”的程序进行多次循环。
第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，引物为F2和R2，F2将使扩增产物向5’端延长，R2将使扩增产物向3’端延长，该轮PCR产物为F2与R2之间的区段。
第三轮PCR以第二轮PCR产物为模板，引物为F3和R3，其余操作过程与第二轮PCR相同。以后与此类同，经过29轮PCR可合成GPCINS基因。
2.3抗原修饰的结果合成的全新gagpol(GPCINS)基因序列如SEQ ID NO5。
我们对gagpol修饰前后的核苷酸序列进行了比较，为了增加gagpol抗原的表达水平，修饰前后核苷酸序列变化较大，但核苷酸长度没有变化，为4280bp。合成后我们用FseI限制性内切酶切去了整合酶3’端531个碱基对，新的gagpol核苷酸长度为3730bp，从1至3730个碱基对中修饰后碱基变化个数为994，突变率为26.6％。基因修饰前后Gag氨基酸序列与野生型完全一致。
我们对pol基因中的protease蛋白酶活性中心进行了失活突变(Pol第336位天门冬氨酸突变为组氨酸)，目的是使protease失去活性，从而也消除了逆转录酶保持活性的可能性。另外，由于我们用FseI限制性内切酶切去了整合酶3’端531个碱基对，从而使整合酶完全失去活性，同时，由于修饰后整合酶基因所表达的蛋白与HIV-1病毒整合酶基因所表达的蛋白有较大的区别，这一点也可以用来区分该疫苗在人体内引起的免疫反应与HIV-1病毒感染引起的免疫反应的不同。
实施例2、重组痘苗M-GPE的构建1、构建过程用于构建重组痘苗所用的gagpol基因为实施例1中修饰过的gagpol基因，构建重组痘苗所用的env基因为野生型env基因，修饰的痘病毒Ankara株(Modified Vaccinia VirusAnkara，MVA)为人体内复制缺陷型痘病毒。
上述HIV-1中国流行株(区域性)的gagpol和env基因被克隆到中间质粒pSC11中，构成pSC11-GPE。如图1所示pSC11-GPE质粒中，位于同源臂TK-R和TK-L中，分别有两个阅读框架启动子P11引导的Lac Z基因和启动子P7.5引导的HIV-1-GagPol和Env。
重组穿梭质粒pSC11-GPE全序列如SEQ ID NO1在构建M-GPE时，首先以滴度0.05pfu/cell的MVA感染CEF细胞。感染2小时后，利用Lipofection2000(INVITROGEN产品)的方法将pSC11-GPE转化到感染了MVA细胞的CEF细胞中。MVA在CEF细胞内复制的过程中，由于pSC11-GPE具有与MVA的TK基因同源的TK-R和TK-L，所以有一定比例的MVA病毒基因组与pSC11-GPE发生重组，结果HIV-1-Gag-Pol-Env和Lac Z阅读框架被重组到MVA病毒基因组中。形成如图2所示的M-GPE重组病毒。
以上被感染细胞培养三天后，收集细胞，裂解细胞，离心除细胞残渣，超声波处理，离心保留上清。取一定量上清，作为种毒，在96孔板中对病毒以有限稀释法进行克隆。培养三天后，将培养液换成含X-gal的不含酚红的培养液。培养24小时后，显微镜下观察Lac Z染色情况。挑取稀释度高，Lac Z染色好的克隆进行下一代克隆。如此进行6次以上克隆。最后直至得到只含重组病毒M-GPE的克隆株。
该重组疫苗所编码的抗原蛋白的氨基酸序列如下Gag氨基酸序列如SEQ ID NO2Pol氨基酸序列如SEQ ID NO3Env氨基酸序列如SEQ ID NO4
我们比较测定序列与理论序列，没有发现任何突变或插入基因，表达框架正确，没有出现错位。
2、重组痘苗在哺乳动物细胞中抗原表达2.1、试验材料和仪器抗原在哺乳动物细胞中表达6孔板、CO2培养箱、HEK293细胞；丙烯酰胺和N，N`-亚甲双丙烯酰胺(购于Sigma公司)；底物显色液(购于Sigma公司)；细胞裂解液DTT 0.617g，SDS 0.8g，1M Tris-HCl pH6.8 3.2ml，甘油4ml，bromphenol0.08g，H2O 12.8ml；(化学试剂均购于Sigma公司)Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)，0.1％SDS；(化学试剂均购于Sigma公司)转移缓冲液39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇；(化学试剂均购于Sigma公司)5％脱脂奶粉溶液10g脱脂奶粉，200ml 1×PBST；(化学试剂均购于Sigma公司)HIV-1人阳性抗血清广西壮族自治区疾病控制中心提供；抗HIV-1 P24蛋白单克隆抗体(美国NIH试剂中心提供)；抗Env羊抗血清美国国立卫生研究院(NIH)试剂中心提供抗体稀释液100-150μl HIV-1人阳性抗血清(或抗Env羊抗血清、抗HIV-1 P24蛋白单克隆抗体)加入到10-15ml 3％脱脂奶粉溶液中；PBS-T含0.05％ TWEEN 20的PBS(TWEEN 20购于Sigma公司)；二抗液碱性磷酸酶偶联兔抗人IgG抗体、碱性磷酸酶偶联兔抗鼠IgG抗体和碱性磷酸酶偶联兔抗羊IgG抗体购于Jackson ImmunoResearch Laboratories，INC。
2.2、试验方法和步骤2.2.1重组痘苗(M-GPE)感染HEK293细胞株①于6孔板内每孔加入1.0×106个细胞，1.5ml培养基，置37℃，5％CO2培养箱培养约24小时。
②弃去培养液，加入1ml2.5％血清的培养基，各孔内以M-GPE感染培养的细胞，M-GPE用量为5-10pfu/细胞，留一孔不加M-GPE做对照。轻晃混匀，37℃培养1小时。
③补加1ml10％血清的培养基，混匀。
④置37℃，5％CO2培养箱培养16-24小时。
2.2.2细胞裂解①弃去培养液，每孔以2ml PBS洗细胞。
②每孔加入1ml PBS，以细胞刮将细胞刮下转移至具塞小离心管中，1000转/分钟离心5分钟，弃去上清。
③向离心管中加入细胞裂解液100μl，摇匀，100℃煮沸10分钟，11800转/分钟，离心20分钟，取上清于另一离心管中。
2.2.3电泳①胶板的配制10％聚丙烯酰胺分离胶10ml30％丙烯酰胺溶液3.3ml，1.5mol/L Tris(pH8.8)2.5ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，TEMED 0.004ml；5％浓缩胶溶液5ml30％丙烯酰胺溶液0.83ml，1.0mol/L Tris(pH6.8)0.63ml，10％SDS 0.05ml，10％过硫酸铵0.05ml，TEMED0.005ml。
迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加1cm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层异丙醇(当丙烯酰胺浓度＞10％时)。将凝胶垂直放置于室温下。
分离胶聚合完全后(30分钟)，倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。
在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的Telfon梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
浓缩胶聚合完全后(30分钟)，小心移出Telfon梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用注射器上的注射针头把浓缩胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
②每孔加入样品或对照品15μl，将电泳装置与电源相接(正极应接下槽)。凝胶上所加电压为200V。当电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约需40分钟)，然后关闭电源。
③从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上，撬开玻璃板。紧靠最左边一孔(第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
2.2.4免疫印迹①切6张Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜(Millipo HAWP或相应的滤膜)，其大小都应与凝胶大小完全吻合；以转移缓冲液浸泡硝酸纤维素膜、滤纸。用软铅笔在滤膜一角作好标记。将凝胶于去离子水中略漂洗一下。
②安装转移装置采用simi-dry(Biorad产品)方法把电泳胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。安装方法由底层依次安装底部电极(阳极)、3层滤纸、一张硝酸纤维素膜、凝胶、3层滤纸、顶部电极(阴极)。凝胶左下角置于硝酸纤维素膜标记处。排除所有气泡。
③连接电源，15V转移30分钟，断开电源。
④卸下装置，取出硝酸纤维素膜，放入5％脱脂奶粉溶液中，室温摇床摇1小时。
⑤弃去脱脂奶粉溶液，以1×PBST 15ml，室温摇床洗膜15分钟。
⑥分别加入稀释的人HIV-1阳性血清(抗Env羊抗血清、抗HIV-1 P24蛋白单克隆抗体)10-15ml，室温摇床振荡1小时，弃去阳性血清，硝酸纤维素膜以双蒸水冲洗两次。
⑦以1×PBST 15ml，室温洗膜三次，每次5分钟。
⑧弃去PBST，加入二抗液10μl，1×PBST 20ml，室温摇床振荡45分钟。
⑨取出膜，弃去液体；以1×PBST洗膜，弃去洗液；再以1×PBST洗膜，摇床振摇10分钟。
显色弃去液体，加入底物显色液20ml。
终止反应显色清晰后弃去显色液，加水适量，振摇，弃去水，将硝酸纤维素膜取出，晾干。
2.3.1修饰和未修饰的gagpol基因在MVA中表达的区别修饰的和非修饰的gagpol基因被同时重组到MVA载体中。利用相同的病毒浓度感染HEK293细胞。用以比较修饰和未修饰的gagpol基因在MVA中表达的区别。结果如图3所示修饰的gagpol基因在表达水平上远远高于未修饰的gagpol基因。所以在以后的研究中，我们始终采用修饰的gagpol基因。
实施例3 M-GPE的抗原性研究试验材料和仪器、试验方法和步骤同实施例2中2重组痘苗在哺乳动物细胞中抗原表达。
结果为检测M-GPE的抗原性是否与中国的流行(区域性)毒株的抗原性一致，我们用M-GPE感染HEK293细胞来表达HIV-1抗原，并且采用免疫印迹的方法确认上述表达的抗原是否被中国的流行(来源于广西壮族自治区HIV-1高发区)毒株抗血清在免疫印迹试验中所识别。同时用HIV-1中国流行株(来源于广西壮族自治区HIV-1高发区)病毒抗原作为阳性对照。试验结果如图4所示。
M-GPE所表达蛋白能够被中国流行(区域性)的抗血清所识别并与对应的标准病毒抗原性一致。
实施例4 药用组合物M-GPE与生理盐水的滴度体积比为109pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。
实施例5 药用组合物M-GPE与生理盐水的滴度体积比为108pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。
序列表重组穿梭质粒pSC11-GPE全序列SEQ ID NO1TTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTTGCGATCAATAAATGGATCACAACCAGTATCTCTTAACGATGTTCTTCGCAGATGATGATTCATTTTTTAAGTATTTGGCTAGTCAAGATGATGAAATCTTCATTATCTGATATATTGCAAATCACTCAATATCTAGACTTTCTGTTATTATTATTGATCCAATCAAAAAATAAATTAGAAGCCGTGGGTCATTGTTATGAATCTCTTTCAGAGGAATACAGACAATTGACAAAATTCACAGACTTTCAAGATTTTAAAAAACTGTTTAACAAGGTCCCTATTGTTACAGATGGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGATATTTGTTCGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATTCAAAAAAGAATCCTCTCTAGCTACCACCGCAATAGATCCTGTTAGATACATAGATCCTCGTCGCAATATCGCATTTTCTAACGTGATGGATATATTAAAGTCGAATAAAGTGAACAATAATTAATTCTTTATTGTCATCATGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAA
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权利要求
1.一种含有转录单位的经过重组的痘病毒，所述转录单位编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列，该人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列是具有免疫原性的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中转录单位指导抗原的合成。
2.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒，采用的痘病毒是经过修饰的痘病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankara，MVA)。
3.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒，所含有的转录单位编码的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白。
4.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒，其转录单位所编码的结构蛋白包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、编码酶类蛋白的Pol和外膜蛋白Env，其各氨基酸序列分别如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4所述。
5.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒是非复制型的。
6.如权利要求5所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒，可作为一种用于预防艾滋病的非复制型重组痘病毒载体疫苗，它包含了可编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒，包含一个β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达报告基因LacZ，含有两个启动子，分别是引导Lac Z基因的启动子P11和引导人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白基因HIV-1-GagPol和Env的P7.5，包含两个阅读框架，可以同时表达β-半乳糖苷酶表达报告基因Lac Z和人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白HIV-1-GagPol及Env。
8.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒，由穿梭质粒PSC11-GPE与经过修饰的痘病毒安卡拉株重组而成，穿梭质粒PSC11-GPE包含了编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列，穿梭质粒PSC11-GPE的核苷酸序列如SEQID NO1所述，其中编码GagPol的核苷酸序列来源于经过修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的GagPol的核苷酸序列，而编码Env蛋白的核苷酸序列则来源于未经修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env的核苷酸序列。
9.一种药用组合物，其中含有如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的痘病毒和一种可药用的载体。
10.一种抗原，其由如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组痘病毒表达产生，该表达产生的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的蛋白Gag、Pol和Env。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防艾滋病的重组痘病毒疫苗，属于一种新的疫苗，尤其是，所述疫苗为含有编码人类免疫缺陷病毒－1(HIV－1)结构蛋白的经过人工修饰的Gag、Pol和野生的Env核苷酸序列的重组痘病毒。这些疫苗在体内施用时用作病毒蛋白抗原生物合成的转录单位。本发明的优点在于(1)表达水平高；(2)感染多种细胞，使抗原有效地提呈到不同的组织；(3)安全性好；(4)疫苗靶抗原包括了几乎所有的HIV－1结构蛋白，如GagPol和Env，更好的诱导人体产生对HIV有效的免疫保护。
文档编号A61K39/12GK1631440SQ200410011249
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者孔维, 于晓方, 田春娟, 于湘辉 申请人:长春百克药业有限责任公司