专利名称：抗肿瘤活性茯苓菌核葡聚糖硫酸酯及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗肿瘤活性的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯及其制备方法和用途。它属于高分子化学领域，也属于分子生物学领域。
背景技术：
近年研究表明，真菌多糖对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、高血脂等都具有显著的疗效。然而，从茯苓菌核中提取的主要成分是(1→3)-β-D-葡聚糖，但它不溶于水且基本上无生物活性。通过衍生化反应对其进行结构修饰，有可能提高水溶性和生物活性。Chihara等人(Nature，225，943，1970)将茯苓中提取出的茯苓葡聚糖(Pachyman)通过高碘酸氧化、硼氢化钠还原和温和水解等方法对其进行化学改性，得到一种线型的茯苓葡聚糖(Pachymaran)，它具有明显的抗S-180肉瘤活性。Hamuro等人(Nature，233，486，1971)进一步将茯苓葡聚糖与氯乙酸钠反应得到羧甲基茯苓多糖，生物活性试验表明它对小鼠体内S-180肉瘤、艾氏腹水瘤(EAC)有抑制作用。方积年等人(生物化学与生物物理学报，31，594，1999)报道了对香菇多糖进行硫酸酯衍生化的方法。然而，对茯苓菌核葡聚糖的其它衍生化修饰研究报道很少。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种茯苓菌核葡聚糖硫酸酯及其制备方法和用途，所得茯苓菌核葡聚糖硫酸酯具有明显抗肿瘤活性，而且其制备方法简单易行、成本较低廉。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯，由下法制得采用新鲜茯苓(Poriacocos)菌核(湖北罗田县)，用0.5～1.0M NaOH提取出水不溶性多糖。气相色谱、红外光谱和13C NMR谱等检测其结构，并且证明它是一种高纯度的线型(1→3)-β-D-葡聚糖。将水不溶性多糖溶解于二甲亚砜(DMSO)中，在室温下搅拌4～16小时；然后以0.5～1.0mL/min的速度逐滴加入吡啶，室温下继续搅拌20～30分钟；然后在冰浴条件、搅拌下以0.4～0.6mL/min的速度逐滴缓慢加入氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2～1∶2.5；将反应液升至30～100℃下反应2～6小时，冷至室温，调节pH值至6～8。所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH为10～11的NaOH溶液透析12～24小时除去吡啶，然后用流水透析4～10天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。
本发明还提供了上述茯苓菌核葡聚糖硫酸酯的制备方法，将茯苓菌核依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中提取，离心；离心后剩余物用105～120℃的热水在0.12～0.20Mpa下浸泡提取，离心；离心后剩余物以0.5～1.0M含0.05～0.1wt％NaBH4的NaOH溶液在0～5℃下提取得到水不溶性多糖；将水不溶性多糖溶解于无水二甲亚砜中，在室温下搅拌4～16小时，然后以0.5～1.0mL/min的速度逐滴加入吡啶，室温下继续搅拌20～30分钟；然后在冰浴条件、搅拌下以0.4～0.6mL/min的速度逐滴缓慢加入氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2～1∶2.5；将反应液升至30～100℃下反应2～6h，冷至室温，调节pH值至6～8；所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH为10～11的NaOH溶液透析12～24小时除去吡啶，然后分别用流水透析4～10天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。
用红外光谱、元素分析、一维和二维核磁共振谱、粘度计及激光光散射仪确定了其化学组成和二级结构。产品为白色粉末状，具有很好的水溶性。取代反应属于非选择性取代，主要发生在C-6位羟基，取代度为0.66～1.21，重均分子量为0.8×104～16.4×104。
该葡聚糖硫酸酯对Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌细胞(MKN-45和SGC-7901)的体外增殖抑制率的结果见附表1。显然，它具有明显的体外抑制作用。此外，在试验浓度范围内观察到抑制率具有明显的时间依赖关系和剂量依赖关系，说明它有稳定的药效。体内活性实验也表明，该葡聚糖硫酸酯对植入小鼠体内的Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌细胞MKN-45的增殖有显著的抑制效果，结果见附表2。小鼠毒性试验证明该葡聚糖硫酸酯的半数致死量(LD50)＞1600mg/kg，表明无毒副作用。因此，该葡聚糖硫酸酯可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品，具有推广和应用前景。
附表1.茯苓菌核葡聚糖硫酸酯对植入小鼠体内的Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌细胞(MKN-45和SGC-7901)的体外增殖抑制率肿瘤类型 剂量(mg/mL) 抑制率(％)Sarcoma 180肉瘤 0.00512.20.05 20.90.5 34.6546.9人体胃腺癌细胞 0.5 43.2MKN-451.0 54.02.0 70.1人体胃腺癌细胞 0.5 45.7SGC-79011.0 56.42.0 69.5
附表2.茯苓菌核葡聚糖硫酸酯对植入小鼠体内的Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌MKN-45的体内抑制率。
剂量肿瘤类型 抑制率(％) 体重增长率f(％)(mg/kg×days)32×10 35.7 27.6Sarcoma 180肉瘤16×10 22.3 20.2250×20 47.9 24.5人体胃腺癌细胞MKN-45 25×20 37.5 25.0与已有技术相比较，本发明的创新如下本发明提供的茯苓葡聚糖硫酸酯为一种全新的物质，且具有显著抗肿瘤活性，由于弄清了其化学组成和二级结构，加之无毒副作用，这种葡聚糖硫酸酯可望成为理想的和有开发前景的抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。制备方法由于采用占茯苓菌核含量90％以上的(1→3)-β-D-葡聚糖为主要原料，利用化学修饰方法制备出具有抗肿瘤活性的葡聚糖硫酸酯，生产工艺简单易行，生产周期较短，生产成本低廉，因此具有良好的应用前景和潜在的经济效益。
具体实施例方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明实施例1新鲜茯苓菌核从湖北罗田县九资河镇采集。菌核依次用乙酸乙酯、丙酮各回流6小时进行索氏提取去除脂肪。然后浸泡在生理盐水中提取，离心；离心后剩余物用120℃的热水在0.20Mpa下提取，离心；离心后剩余物再以0.5M NaOH(含0.05％NaBH4)在4℃下提取得到多糖，该多糖为白色粉状固体。气相色谱、红外光谱和13C NMR谱等检测其结构证明它是一种高纯度的线型(1→3)-β-D-葡聚糖。
将600mg上述茯苓菌核(1→3)-β-D-葡聚糖溶解于50mL DMSO中，在室温下搅拌12小时，然后以0.8mL/min的速度逐滴加入9mL吡啶，室温下继续搅拌30分钟。反应瓶置于冰浴中，搅拌下以0.5mL/min的速度逐滴缓慢加入3.7mL氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2。将反应液升至80℃下继续搅拌反应2小时，反应停止后冷至室温，用5％的NaOH调节pH值至7。所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH＝10的NaOH溶液透析16小时除去吡啶，再经流水透析9天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。该葡聚糖硫酸酯为白色粉末状固体，具有很好的水溶性。取代反应属于非选择性取代，硫酸酯基团取代度为1.21，重均分子量为3.8×104。该葡聚糖硫酸酯具有抑制Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌细胞增殖的功能，而且半数致死量(LD50)＞1600mg/kg，表明无毒副作用，因此不仅可抑制癌细胞增殖而且有利于提高机体免疫功能。
实施例2新鲜茯苓菌核从湖北罗田县九资河镇采集。菌核依次用乙酸乙酯、丙酮各回流5小时进行索氏提取去除脂肪。然后浸泡在生理盐水中提取，离心；离心后剩余物用120℃的热水在0.20Mpa下提取，离心；离心后剩余物再以1M NaOH(含0.1％NaBH4)在5℃下提取得到多糖，该多糖为白色粉状固体。气相色谱、红外光谱和13C NMR谱等检测其结构证明它是一种高纯度的线型(1→3)-β-D-葡聚糖。
将600mg上述茯苓菌核(1→3)-β-D-葡聚糖溶解于50mL DMSO中，在室温下搅拌16小时，然后以1.0mL/min的速度逐滴加入9mL吡啶，室温下继续搅拌25分钟。反应瓶置于冰浴中，搅拌下以0.5mL/min的速度逐滴缓慢加入3.7mL氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2。将反应液升至35℃下继续搅拌反应5小时，反应停止后冷至室温，用5％的NaOH调节pH值至7。所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH＝10的NaOH溶液透析16小时除去吡啶，再经流水透析7天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。该葡聚糖硫酸酯为白色粉末状固体，具有很好的水溶性。取代反应属于非选择性取代，硫酸酯基团取代度为0.96，重均分子量为16.4×104。该葡聚糖硫酸酯具有抑制Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌细胞增殖的功能，而且半数致死量(LD50)＞1600mg/kg，表明无毒副作用，因此不仅可抑制癌细胞增殖而且有利于提高机体免疫功能。
实施例3新鲜茯苓菌核从湖北罗田县九资河镇采集。菌核依次用乙酸乙酯、丙酮各回流6小时进行索氏提取去除脂肪。然后浸泡在生理盐水中提取，离心；离心后剩余物用105℃的热水在0.12Mpa下提取，离心；离心后剩余物再以0.5M NaOH(含0.05％NaBH4)在4℃下提取得到多糖，该多糖为白色粉状固体。气相色谱、红外光谱和13C NMR谱等检测其结构证明它是一种高纯度的线型(1→3)-β-D-葡聚糖。
将600mg上述茯苓菌核(1→3)-β-D-葡聚糖溶解于50mL DMSO中，在室温下搅拌12小时，然后以1.0mL/min的速度逐滴加入9mL吡啶，室温下继续搅拌30分钟。反应瓶置于冰浴中，搅拌下以0.5mL/min的速度逐滴缓慢加入3.7mL氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2。将反应液升至80℃下继续搅拌反应4小时，反应停止后冷至室温，用5％的NaOH调节pH值至7。所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH＝10的NaOH溶液透析16小时除去吡啶，再经流水透析5天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。该葡聚糖硫酸酯为白色粉末状固体，具有很好的水溶性。取代反应属于非选择性取代，硫酸酯基团取代度为0.95，重均分子量为0.86×104。该葡聚糖硫酸酯具有抑制Sarcoma 180肉瘤和人体胃腺癌细胞增殖的功能，而且半数致死量(LD50)＞1600mg/kg，表明无毒副作用，因此不仅可抑制癌细胞增殖而且有利于提高机体免疫功能。
权利要求
1.一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯，由下法制得将茯苓(Poria cocos)菌核用0.5～1.0M NaOH提取出水不溶性多糖；将水不溶性多糖溶解于无水二甲亚砜中，在室温下搅拌4～16小时，然后以0.5～1.0mL/min的速度逐滴加入吡啶，室温下继续搅拌20～30分钟；然后在冰浴条件、搅拌下以0.4～0.6mL/min的速度逐滴缓慢加入氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2～1∶2.5；将反应液升温至30～100℃下反应2～6小时，冷至室温，调节pH值至6～8；所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH为10～11的NaOH溶液透析12～24小时除去吡啶，然后用流水透析4～10天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。
2.按权利要求1所述的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯，其特征在于茯苓菌核葡聚糖硫酸酯的硫酸酯基团取代度为0.66～1.21，重均分子量为0.8×104～16.4×104。
3.权利要求1所述的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于将茯苓菌核依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中提取，离心；离心后剩余物用105～120℃的热水在0.12～0.20Mpa下浸泡提取，离心；离心后剩余物以0.5～1.0M含0.05～0.1wt％NaBH4的NaOH溶液在0～5℃下提取得到水不溶性多糖；将水不溶性多糖溶解于无水二甲亚砜中，在室温下搅拌4～16小时，然后以0.5～1.0mL/min的速度逐滴加入吡啶，室温下继续搅拌20～30分钟；然后在冰浴条件、搅拌下以0.4～0.6mL/min的速度逐滴缓慢加入氯磺酸，其中氯磺酸与吡啶的摩尔比为1∶2～1∶2.5；将反应液升至30～100℃下反应2～6h，冷至室温，调节pH值至6～8；所得反应液注入再生纤维素透析袋，用pH为10～11的NaOH溶液透析12～24小时除去吡啶，然后分别用流水透析4～10天，冷冻干燥得到茯苓菌核葡聚糖硫酸酯。
4.权利要求1或2所述的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯在制备抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了具有抗肿瘤活性的茯苓菌核葡聚糖硫酸酯及其制备方法和用途。采用新鲜茯苓菌核，用NaOH提取出水不溶性(1→3)－β－D－葡聚糖。将其溶解于无水二甲亚砜中，加入吡啶和氯磺酸进行反应，得到葡聚糖硫酸酯。该葡聚糖硫酸酯的取代反应属于非选择性取代，主要发生在C－6位羟基，其硫酸酯基团取代度为0.66～1.21，重均分子量为0.8×10
文档编号A61P35/00GK1583800SQ20041001324
公开日2005年2月23日 申请日期2004年6月1日 优先权日2004年6月1日
发明者张俐娜, 王艺峰, 侯晓华, 李云桥 申请人:武汉大学