专利名称：柚皮素及其盐用于制备止咳化痰药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及柚皮素(Naringenin)及其盐用于制备止咳化痰药物的用途。
背景技术：
咳、痰、喘是呼吸系统疾病的常见症状，日常生活中尤常见于急、慢性支气管炎、感冒等所引起，临床上以咳嗽、咯痰伴有喘息及反复发作为特征，是由于感染或非感染因素引起的气管、支气管粘膜及周围组织的急、慢性非特异性炎症。属中医学的咳嗽、痰饮、喘症范畴，是一种常见病、多发病。特别是中老年人由于环境因素和生活习惯的影响，容易产生咳嗽、咯痰等支气管炎症状，发病初期没有很好的进行治疗控制，而逐渐发展成为疾病的。
对于用中医药来止咳化痰，人们已经进行了很多的努力，像橘红丸、克咳片等，已进入市场。但从其特点而言，目前已上市的该类药物还具有服药量多而不方便的缺点。因此有必要继续研制出服用安全、疗效可靠的止咳化痰新药物。柚皮素(Naringenin)，化学名称为5，7，4′-三羟基二氢黄酮，是黄酮类化合物柚皮苷(naringin)的苷元，广泛存在于樱花的花蕾，梅的花蕾和枳实，柑桔等植物组织中，是一种黄酮类物质，具有抗菌，消炎，抗癌，解痉和利胆，治疗心血管疾病，降胆固醇等方面的作用。但是，尚没有报道柚皮素在止咳化痰方面的应用。
柚皮素的分子式为C15H12O5。
柚皮素的结构式 柚皮素发明内容本发明的目的是提供柚皮素(naringenin)及其盐在制备用于止咳化痰药物中的应用。
本发明所述的柚皮素盐是指柚皮素与相应的碱(通常是氢氧化钠或氢氧化钾)反应所生成的金属盐(即柚皮素分子5，7或/和4′位上羟基的H被碱金属离子所取代，通常是柚皮素钠盐或钾盐)。柚皮素盐的分子式为C15HnO5Ym，n＝9-11，m＝1-3，Y为金属离子(通常是钠或钾离子)。
本发明通过药理药效实验证实，柚皮素或/和柚皮素盐具有良好的止咳化痰作用，对急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多等病症具有明显的疗效。
我们对柚皮素和柚皮素盐进行实验动物小自鼠的止咳实验。结果表明柚皮素和柚皮素盐对刺激小鼠引起咳嗽的耐受时间，与空白对照组比较，均有显著的延长，在统计学上有显著差异；与阳性对照药物氢溴酸右美沙芬片比较，耐受时间延长，疗效较阳性对照药物氢溴酸右美沙芬片显著。
我们对柚皮素和柚皮素盐进行实验动物小白鼠的化痰实验。结果表明柚皮素和柚皮素盐对小鼠支气管分泌液增加，与空白对照组比较，有显著的增加，在统计学上有显著差异。与阳性对照药物痰咳净比较，对小鼠支气管分泌液有显著增加，在统计学上有显著差异，疗效较阳性药物痰咳净显著。说明柚皮素和柚皮素盐具有化痰的作用。
本发明的实验证明，柚皮素或/和柚皮素盐不仅具有很好止咳化痰作用，而且在小鼠动物实验中几乎没有表现出毒性。动物实验表明，当300mg/kg剂量的柚皮素或柚皮素盐口服给药动物时，动物未见毒性反应，该剂量相当于人服用剂量为4-6g柚皮素或柚皮素盐/kg体重。
综上所述，说明柚皮素或/和柚皮素盐具有很好的止咳化痰效果，未见毒副作用，能很好的治疗临床中由于急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多。因此，可用于制备止咳化痰药物。
本发明上述所说的用柚皮素或/和柚皮素盐制备的止咳化痰的药物(以下称为柚皮素药物)，其成分中可以含有0.1-100％wt.柚皮素或/和柚皮素盐。所说的柚皮素药物可以单纯由柚皮素或/和柚皮素盐单体组成，或者由作为有效成分的柚皮素或/和柚皮素盐与其他有效成分或/和常规的制药辅料组成。当柚皮素和柚皮素盐一起使用时，两者之间可为任意比例。
上述所说的柚皮素药物可通过选择适合相应剂型的常规辅料或者不加辅料，用常规方法制备成所需的不同剂型的药物制剂。加入的辅料可以为固体、半固体或者液体物质，作为柚皮素或/和柚皮素盐的载体、赋型剂或者介质。因此，所说的柚皮素及其盐药物制剂可以为片剂、粉剂、小药囊剂、甘香酒剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、吸入剂、软或硬胶囊、无菌注射液等各种剂型。
上述所说的柚皮素药物的胶囊剂，其内含物含有0.5-100％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐；通常可由不少于0.5％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐与其他有效成分或/和各种常规辅料组成。所说的柚皮素药物的片剂，其成分中含有不少于0.1％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐；可以由不少于0.1％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐与其他有效成分或/和各种常规辅料组成。所说的柚皮素药物的吸入剂，其内含物含有0.1-100％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐；通常可由不少于0.1％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐与其他有效成分或/和各种常规辅料组成。
本发明所述的柚皮素药物在0.1-700mg柚皮素或/和柚皮素盐/kg体重/天，具有良好的止咳化痰效果，优选的日剂量约为1-100mg柚皮素或/和柚皮素盐/kg体重/天。
本发明所述的柚皮素药物，具有良好的止咳化痰效果。能有效治疗急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多病症。并且具有质量稳定、服用量小、疗效迅速、安全等特点。
本发明所说的柚皮素可以是通过以下方法之一制备得到的柚皮素粗品或柚皮素单体(纯品)方法一由柚皮苷(naringin)粗品或者单体通过水解的方法得到。水解的方法可以是酸水解、碱水解或酶水解。具体方法可以依照以下步骤进行柚皮苷粗品或者单体加水溶解，搅拌均匀，加入酸、碱或酶，混合均匀；混合溶液室温/加热水解；水解结束，沉淀滤过，得柚皮素粗品；再经有机溶剂或水多次重结晶，得柚皮素单体。
上述方法一中，水解加入的水量(体积)可以为柚皮苷粗品或单体(重量)的1～1000倍，加水量过多不限；酸水解中的酸可以是盐酸、硫酸、磷酸或硝酸等各种酸，酸的用量可以是加入酸后使溶液PH≤7的用量，酸水解的温度可以为室温～100℃，水解的时间可以是0.1～170小时；碱水解中的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等各种无机碱，碱的用量可以是加入碱后使溶液PH≥7的用量，碱水解的温度可以为室温～100℃，水解的时间可以是0.1～170小时；酶水解中的酶可以是葡萄糖醛酸酶等各种断裂六碳糖的酶，酶的用量可以是加入酶后使溶液中酶的浓度为0.1微摩尔/升～0.1摩尔/毫升，酶水解的温度可以为室温～70℃，水解的时间可以是0.1-120小时。酸、碱或酶水解的时间延长不限。
上述方法一中，所用的柚皮苷粗品或单体可按照已有方法(例如中国专利申请CN1431216A公开的方法)从含柚皮苷的各种药材(例如枳壳，枳实，柑橘，柠檬，葡萄柚，橘红，橙，柚等)中提取得到；也可通过化学方法进行合成得到。
方法二从含柚皮素的各种药材(例如樱花的花蕾，梅的花蕾，枳实，柑橘，葡萄柚，橙等)中提取得到柚皮素粗品或柚皮素单体(纯品)。提取的方法可以依照以下步骤进行药材粉碎，经过有机溶剂提取一至多次，滤过，合并滤液；滤液浓缩成浸膏，浸膏放置沉淀，得柚皮素粗品；再经有机溶剂或水多次重结晶，得柚皮素单体。
上述方法二中，有机溶剂提取所用的有机溶剂可以是乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或石油醚等各种常用有机溶剂，可以采用各种浓度(包括浓度为100％)的有机溶剂；有机溶剂提取可以采用在室温～100℃条件下或/和超声波条件下进行，提取次数一般为一至三次，次数增加不限；有机溶剂的用量为至少能没过药材，用量过多不限；每次提取时间一般为0.1-144小时，时间延长不限；加温或/和超声波条件下提取可缩短提取时间。
上述方法一和方法二中，重结晶所用的有机溶剂可以采用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或石油醚等各种常用有机溶剂，重结晶的次数可以为一次至十次，次数增加不限。
采用本发明的上述方法一和方法二，从柚皮苷水解得到柚皮素(纯品)和从不同的含柚皮素/柚皮苷药材中提取得到柚皮素(纯品)，提取得率均在85％以上，提取得率高。所得到的柚皮素单体(纯品)，经过《中华人们共和国药典》2000版一部高效液相色谱法测定，以中国药品生物制品检定所提供的柚皮素对照品进行外标法定量，得提取所得柚皮素样品中柚皮素单体的含量。结果表明，样品中柚皮素单体的含量高于95％。表明本发明工艺简单可行。
本发明的上述柚皮素制备方法，具有提取工艺简单，提取率高，提取得到的柚皮素单体纯度高等特点。
方法三通过其他化学方法合成得到。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
各实施例中所涉及的材料用量配比及成分含量中的固体与固体、液体与液体以及液体与固体的比分别以wt/wt(重量比)、v/v(体积比)、wt/v(重量/体积比)计算，除非另有说明。实施例1～4所用的柚皮苷单体和柚皮苷粗品按照中国专利申请CN1431216A公开的方法制备。实施例15～20所用柚皮素分别为按照实施例1～6所述方法获得的柚皮素单体，纯度为95％以上。
实施例1柚皮苷单体(纯度97.3％)，加入10倍水，混合均匀，加入浓盐酸使溶液PH＝1，混合均匀；100℃加热水解2小时；水解结束后，滤过，得柚皮素粗品；用无水乙醇重结晶五次后，得柚皮素单体。得率为91.4％。
实施例2柚皮苷粗品(纯度98.2％)，加入20倍水，混合均匀，加入浓硫酸使溶液PH＝0，混合均匀；80℃加热水解3小时；水解结束后，滤过，得柚皮素粗品；用乙酸乙酯重结晶六次后，得柚皮素单体。得率为89.3％。
实施例3柚皮苷粗品(纯度98.5％)，加入50倍水，混合均匀，加入氢氧化钠溶液使溶液PH＝13，混合均匀；80℃加热水解1.5小时；水解结束后，滤过，得柚皮素粗品；用丙酮重结晶三次后，得柚皮素单体。得率为86.9％。
实施例4柚皮苷单体(纯度96.7％)，加入35倍水，混合均匀，加入葡萄糖醛酸酶使样品中酶的浓度为0.1毫摩尔/升，混合均匀；37℃水浴加热水解8小时；水解结束后，滤过，得柚皮素粗品；用无水乙醇重结晶四次后，得柚皮素单体。得率为94.8％。
实施例5樱花花蕾，加无水乙醇没过药材，提取三次，提取温度为50℃，每次一小时，滤过；滤液浓缩成浸膏，产生沉淀，滤过，得柚皮素粗品；沉淀用乙酸乙酯结晶三次，得柚皮素单体。得率为90.7％。
实施例6梅的花蕾，加丙酮没过药材，室温浸泡，提取三次，每次48小时，滤过，合并滤液；滤液浓缩成浸膏，放置过夜，得沉淀，沉淀干燥，得柚皮素粗品；用氯仿重结晶五次后，得柚皮素单体。得率为87.4％。
实施例7枳实药材切成饮片，经100℃水提取两次，每次3小时，滤过，合并滤液；滤液浓缩成浸膏，产生沉淀，滤过，得柚皮素粗品；沉淀用乙酸乙酯重结晶六次，得柚皮素单体。得率为85.3％。
实施例8葡萄柚药材不粉碎，经超声波用乙酸乙酯提取4次，每次1小时，滤过，合并滤液；浓缩，得浸膏，浸膏放置过夜，产生沉淀，分离沉淀，干燥沉淀，得柚皮素粗品；沉淀用丙酮重结晶二次，得柚皮素单体。得率为86.1％。
实施例9枳实药材粉碎，过20目筛，室温下水提取三次，每次两天，滤过，合并滤液；滤液浓缩，加入浓盐酸使液体的PH＝3，90℃加热水解，水解结束，滤过，得沉淀，干燥沉淀，得柚皮素粗品；沉淀用乙酸乙酯重结晶四次，得柚皮素单体。得率为90.7％。
实施例10葡萄柚药材切成饮片，加100℃水没过药材，提取二次，每次2小时，滤过，合并滤液；滤液浓缩，加入氢氧化钠至溶液PH＝11，70℃加热水解，水解结束，滤过，得沉淀，沉淀干燥，得柚皮素粗品；沉淀用丙酮重结晶三次，得柚皮素单体。得率为89.2％。
实施例11橘红药材不粉碎，经丙酮提取4次，每次24小时，滤过，合并滤液；浓缩，得浸膏，浸膏加入30％乙醇溶解，加入浓磷酸使液体的PH＝2，95℃加热水解，水解结束，滤过，得沉淀，沉淀干燥，得柚皮素粗品；沉淀用氯仿重结晶五次，得柚皮素单体。得率为87.7％。
实施例12枳壳药材切成饮片，加100℃水没过药材，加入浓盐酸使溶液PH＝2.5，提取三次，每次1.5小时，滤过，合并滤液；滤液浓缩，得浸膏，浸膏放置过夜，得沉淀；分离沉淀，用丙酮溶解，滤过，弃沉淀，滤液回收丙酮，得沉淀，干燥沉淀，得柚皮素粗品；沉淀用氯仿重结晶三次，得柚皮素单体。得率为90.4％。
实施例13沙田柚药材粉碎，加12倍100℃水没过药材，加入氢氧化钾使溶液PH＝14，提取二次，每次45小时，滤过，合并滤液；滤液浓缩，得浸膏，浸膏放置过夜，得沉淀；分离沉淀，用无水乙醇溶解，滤过，弃沉淀，滤液回收乙醇，得沉淀，干燥沉淀，得柚皮素粗品；沉淀用丙酮重结晶四次，得柚皮素单体。得率为88.3％。
实施例14柚皮素单体纯度测定实验取上述提取方法制备得到的柚皮素单体适量，甲醇溶解定容于容量瓶中，再用微孔滤膜(0.45um)过滤后，注入高效液相色谱仪中，以中国药品生物制品检定所提供的柚皮素对照品进行外标法定量，得提取所得柚皮素样品中柚皮素单体的含量。结果见表1。表1中样品1～11分别为实施例1～11制备的柚皮素单体。
色谱条件Agilent1100高效液相色谱仪(自动进样器，真空脱气机，四元泵，柱温箱，二极管阵列检测器)；色谱柱MARKER ODS柱(5um，4.0×250mm)；流动相甲醇-水(50∶50)；检测波长288nm；柱温30℃；流速1ml/min；进样量5μl。
表1样品含量测定试验结果样品浓度测得柚皮素浓 柚皮素含量样品号进样量(μl)峰面积(mg/ml)度(mg/ml) (％)柚皮素0.5005 3145.74885 0.500100对照品样品10.4625 2850.04845 0.45398.1样品20.4725 2925.54643 0.46598.5样品30.5215 3189.78933 0.50797.4样品40.4835 2925.54649 0.46596.3样品50.5125 3189.78934 0.50799.0样品60.5025 3019.91890 0.48095.6样品70.4395 2661.30353 0.42396.3样品80.4945 3032.50189 0.48297.5样品90.5085 3095.41687 0.49296.9样品10 0.5175 3196.08083 0.50898.3样品11 0.4865 2988.46141 0.47597.7从表1结果看出，提取所得样品中柚皮素单体的含量均高于95％，说明本发明的提取方法所得到的柚皮素样品纯度高。
从上述实施例1～14可知，本发明的柚皮素制备方法，能有效的通过将柚皮苷粗品/单体水解成柚皮素得到柚皮素单体，能有效地从含柚皮素/柚皮苷药材中提取得到柚皮素单体，所得柚皮素样品纯度高，含量均高于95％以上。工艺简单可行。
实施例15 柚皮素药物的止咳药理学实验1、实验动物NIH小鼠，雄性，体重18.2-21.7g，普通级标准，共130只。先将动物称重，编号，选择健康，体重在18.5-21.0g克的小鼠共120只。按体重大小排序，用随机分组法分成八组，每组15只。设阴性对照组，阳性对照组和柚皮素药物样品低剂量组、柚皮素药物样品中剂量组、柚皮素药物样品高剂量组、柚皮素钠盐药物样品低剂量组、柚皮素钠盐药物样品中剂量组、柚皮素钠盐药物样品高剂量组。
2、样品来源与处理1)空白对照组生理盐水，NaCl含量0.9％。
2)阳性对照组取美沙芬两片溶解于20毫升生理盐水中，即得阳性对照美沙芬溶液，美沙芬浓度为1.5mg/ml。
3)柚皮素样品低剂量组取柚皮素适量，用生理盐水定容于容量瓶中，柚皮素浓度为0.5mg/ml。
4)柚皮素样品中剂量组取柚皮素适量，用生理盐水定容于容量瓶中，柚皮素浓度为1.5mg/ml。
5)柚皮素样品高剂量组取柚皮素适量，用生理盐水定容于容量瓶中，柚皮素浓度为4.5mg/ml。
6)柚皮素钠盐样品低剂量组取柚皮素钠盐适量，用生理盐水定容于容量瓶中，柚皮素钠盐浓度为0.5mg/ml。
7)柚皮素钠盐样品中剂量组取柚皮素钠盐适量，用生理盐水定容于容量瓶中，柚皮素钠盐浓度为1.5mg/ml。
8)柚皮素钠盐样品高剂量组取柚皮素钠盐适量，用生理盐水定容于容量瓶中，柚皮素钠盐浓度为4.5mg/ml。
3、实验方法(浓氨水喷雾法)小鼠灌胃1小时后，开始接受喷雾。按一定时间喷入浓氨水气雾，喷雾结束，立即取出小鼠，观察有无咳嗽反应。观察一分钟内咳嗽次数，若1分钟内出现3次以上典型咳嗽动作(腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，有时可有咳声)者，算作“有咳嗽”。否则算作“无咳嗽”。
4、实验过程用序贯法(上下法)求出引起半数小鼠咳嗽的喷雾时间(EDT50)。计算R值，若R值大于130％，说明药物有止咳作用。若R值大于150％，则表明有显著的止咳作用。计算公式如下 EDT50＝log-1c/n(式中n为动物数，c为rx值的总和，r为每剂量组的动物数，x为剂量(即喷雾时间)的对数。)5实验结果经统计，各样品组半数咳嗽时间及止咳效果见表1。
表1.各样品的止咳效果组别给药剂量 样品浓度EDT50R值 止咳代号 样品名 (ml/20g) (mg/ml)(秒) (％) 效果1生理盐水组 0.2 0 38.9 --2 美沙芬组0.21.5 53.70138.05有效3柚皮素样品低剂量组 0.20.5 51.29131.85有效4柚皮素样品中剂量组 0.21.5 66.07169.85显效5柚皮素样品高剂量组 0.24.5 66.61171.23显效6 柚皮素钠盐样品低剂量组 0.20.5 55.35142.3 有效7 柚皮素钠盐样品中剂量组 0.21.5 69.48178.6 显效8 柚皮素钠盐样品高剂量组 0.24.5 73.56189.1 显效从柚皮素样品和阳性对照药物美沙芬，经口给药对刺激小鼠引起咳嗽的耐受时间比较，柚皮素对小鼠耐受时间有显著的延长，比阳性对照药品美沙芬的耐受时间长，在统计学上有显著差异。从柚皮素钠盐样品和阳性对照药物美沙芬，经口给药对刺激小鼠引起咳嗽的耐受时间比较，柚皮素钠盐对小鼠耐受时间有显著的延长，比阳性对照药品美沙芬的耐受时间长，在统计学上有显著差异。说明柚皮素和/或柚皮素盐对刺激小鼠引起咳嗽的耐受时间与美沙芬比较，耐受时间延长，疗效显著。具有良好的止咳化痰作用，对急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多等病症具有明显的疗效。
实施例16 柚皮素药物的化痰药理学实验1、实验动物NIH小鼠，雌性，体重18.0-22.1g，清洁级标准，合格证号粤检证字第2002A022号，2003年10月12日由第一军医大学实验动物中心提供。共90只。先将动物称重，编号，选择健康，体重在18.5-22.0克的小鼠共80只。按体重大小排序，用随机区组分组法分成八组，每组10只。设阴性对照，阳性对照和柚皮素高、中、低，柚皮素钠盐高、中、低八个剂量组。均按10ml/kg体重的灌胃量一次经口给药。
2、样品来源与处理1)空白对照组生理盐水，NaCl含量0.9％。
2)阳性对照组取0.2克痰咳净散剂溶解于10毫升生理盐水中，即得阳性对照痰咳净溶液，浓度为20mg/ml。
3)柚皮素样品低剂量组精密称量柚皮素样品5mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得。浓度为0.5mg/ml。
4)柚皮素样品中剂量组精密称量柚皮素样品15mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得。浓度为1.5mg/ml。
5)柚皮素样品高剂量组精密称量柚皮素样品45mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得。浓度为4.5mg/ml。
6)柚皮素钠盐样品低剂量组精密称量柚皮素钠盐样品5mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得。浓度为0.5mg/ml。
7)柚皮素钠盐样品中剂量组精密称量柚皮素钠盐样品15mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得。浓度为1.5mg/ml。
8)柚皮素钠盐样品高剂量组精密称量柚皮素钠盐样品45mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得。浓度为4.5mg/ml。
3、实验方法1)标准酚红曲线的绘制用分析天平准确称取一定量的酚红，用5％碳酸氢钠溶解，配成每1ml含12.5ng，然后顺次进行倍比稀释成每毫升含酚红6.25ng，3.125ng，1.5625ng，0.7813ng，0.3906ng，0.1953ng，0.0977ng，0.0488ng，用分光光度计测OD值。以酚红浓度为纵坐标，OD值为横坐标，根据酚红浓度和OD值计算出回归方程。根据回归方程计算出各鼠酚红的排泄量。
2)小鼠禁食不禁水12h。
3)灌胃给药。按动物号顺序，每只小鼠灌胃后停3分钟，再灌另外一只，时间间隔为3分钟，每组10只总共灌胃时间为30分钟。
4)各鼠灌胃后半小时，经腹腔注射5％酚红生理盐水溶液0.2ml。按顺序，即每一只小鼠腹腔注射酚红后3分钟，再注射另外一只，10只小鼠共30分钟。
5)各鼠腹腔注射后半小时，按顺序脱颈椎处死小鼠，处死时间间隔3分钟。动物处死后，仰位固定于手术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，用小镊子支起气管。
6)用大注射器吸取生理盐水冲洗气管外壁，洗去血液和气管外壁中的酚红，滤纸吸干洗液。
7)先于气管分支处剪下气管，再于另一端甲状软骨上端剪下气管(环状甲状软骨包括在内)。
8)将各气管段放入预先盛有1.5ml的5％NaHCO3溶液试管中。
9)在3分钟内完成上述气管分离剪切工作。再用同样方法处理第二只小鼠。方法如上。
10)将各试管置超声波清洗器上超声5分钟，使气管段中的酚红释放出来。
11)将各试管中溶液于721型分光光度计546nm处测OD值。
12)将各试管含气管段放置过夜，24h后重测OD值。
13)根据回归方程计算出酚红的含量。计算公式Y＝7.6266X-0.0554。X为OD值，Y为酚红含量。
14)根据酚红含量和动物体重计算出校正酚红含量，用SPSS8.0统计软件进行方差分析。校正酚红含量＝酚红含量(ng)/小鼠体重(kg)4.实验结果经统计，各剂量组酚红排出量见下表。
表2.柚皮素及其盐的化痰效果(X±S)组别化痰率b剂量动物气管酚校正酚红含量aP值代号 样品名 (mg/kg) 红含量(ng) (ng/kg)(％)1生理盐水0 0.9385±0.4148 46.7282±22.6106 - -2痰咳净 2001.3343±0.7932 70.3811±43.6970 P＜0.05 150.623柚皮素低剂量组 5 1.2757±0.4020 68.2832±23.6102 P＜0.05 146.134柚皮素中剂量组 15 1.3523±0.9303 74.7504±57.2020 P＜0.05 159.975柚皮素高剂量组 45 1.9257±0.6713 102.7325±41.0313 P＜0.01 219.856 柚皮素钠盐低剂量组5 1.3029±0.3069 69.4942±16.3724 P＜0.05 148.727 柚皮素钠盐中剂量组15 1.4225±0.7361 75.8773±39.2651 P＜0.05 162.388 柚皮素钠盐高剂量组45 1.9705±0.6898 105.1057±36.7945 P＜0.01 224.93a校正酚红含量＝酚红含量/动物体重b化痰率＝给药组/空白对照组×100％酚红含量计算方法(ng)OD值×7.6266-0.0554从柚皮素样品和阳性药物痰咳净，经口给药对小鼠支气管分泌液增加实验看，柚皮素低，中，高剂量组各剂量组对小鼠支气管分泌液的分泌，与空白对照组比较，均有显著的增加，在统计学上有显著差异。高剂量组与阳性对照药物痰咳净比较，对小鼠支气管分泌液有显著增加，在统计学上有显著差异，疗效较阳性药物痰咳净显著。柚皮素钠盐样品和阳性药物痰咳净，经口给药对小鼠支气管分泌液增加实验看，柚皮素钠盐低，中，高剂量组各剂量组对小鼠支气管分泌液的分泌，与空白对照组比较，均有显著的增加，在统计学上有显著差异。高剂量组与阳性对照药物痰咳净比较，对小鼠支气管分泌液有显著增加，在统计学上有显著差异，疗效较阳性药物痰咳净显著。说明柚皮素和/或柚皮素盐具有良好的止咳化痰作用，对急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多等病症具有明显的疗效。
实施例17柚皮素药物的毒理学实验在28±1℃的温度，70±5％的湿度条件下，选取7-8周龄，健康的清洁级NIH小鼠20只，雌雄各半，体重在20-22g。将饲料和水消毒，试验前和试验的观察期内，均按正常饲料条件饲养。
将柚皮素溶解在0.5％Tween80中，浓度为300mg/ml，将该液体经口给药小鼠，给药剂量为0.4ml/20g小鼠体重。给药后观察1，4，8，12小时，以后每12小时观察一次。观察死亡情况，每天记录小鼠体重变化以及其它的症状。第10天，断颈处死小鼠，取各器官进行病理检查。
在第10天，全部小鼠存活，6.0g/kg剂量的柚皮素未见毒性反应。小鼠各器官病理检查正常，没有发现病变，10天内小鼠体重未见减轻。因此，说明本发明的柚皮素药物在口服给药动物时未见毒性。
实施例18柚皮素胶囊制剂按以下成分配比制备成明胶胶囊柚皮素60干燥淀粉35微粉硅胶 5将辅料与柚皮素混合均匀，装入明胶胶囊中，即得。装量100mg/胶囊。
实施例19柚皮素片剂按以下成分配比制备成片剂柚皮素 500g淀粉 472.5g淀粉浆(14％) 25.0g硬脂酸镁 2.5g总计 1000g将柚皮素与淀粉均匀混合，加淀粉浆继续搅拌使成软材，用10目尼龙筛制粒，80-90℃通风干燥，干粒加入硬脂酸镁，经过12目筛整粒，混匀，压成片剂。共得10000片，每片片重约为0.1g。
实施例20柚皮素吸入剂按以下成分配比制备成吸入剂柚皮素100g乳糖 500g泊洛沙姆 1g微粉硅胶 10gL-亮氨酸 0.5gPEG400(50％)水溶液300g总计 911.5g将柚皮素、乳糖、泊洛沙姆和L-亮氨酸用PEG400水溶液溶解，再进行喷雾干燥，所得喷雾干燥粉末加入微粉硅胶，混合均匀，分装于胶囊型干粉吸入装置中。
权利要求
1.柚皮素及其盐在制备用于止咳化痰的药物中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征是所说的药物含有0.1-100％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐。
3.按照权利要求1所述的应用，其特征是所说的药物由单纯的柚皮素或/和柚皮素盐组成，或者由作为有效成分的柚皮素或/和柚皮素盐与其他有效成分或/和常规的制药辅料组成。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征是所说的药物为胶囊剂，其内含物含有0.5-100％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征是所说的药物为片剂或吸入剂，其含有不少于0.1％wt.的柚皮素或/和柚皮素盐。
6.按照权利要求1～5之一所述的应用，其特征是所说的柚皮素和柚皮素盐是通过化学方法合成得到的。
7.按照权利要求1～5之一所述的应用，其特征是所说的柚皮素是由柚皮苷粗品或单体经酸、碱或酶水解而得到的。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征是所说的柚皮苷粗品或单体的酸水解、碱水解或酶水解的具体方法是柚皮苷粗品或者单体加水溶解，搅拌均匀，加入酸、碱或酶，混合均匀；混合溶液室温/加热水解；水解结束，沉淀滤过，得柚皮素粗品；再经有机溶剂或水多次重结晶，得柚皮素单体；所述加水溶解加入的水量按体积/重量比为柚皮苷粗品或单体的1～1000倍；酸水解中的酸可以是盐酸、硫酸、磷酸或硝酸，酸的用量是加入酸后使溶液PH≤7的用量，酸水解的温度为室温～100℃，水解的时间是0.1～170小时；碱水解中的碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙，或者有机碱，碱的用量是加入碱后使溶液PH≥7的用量，碱水解的温度为室温～100℃，水解的时间是0.1～170小时；酶水解中的酶是各种断裂六碳糖的酶，酶的用量是加入酶后使溶液中酶的浓度为0.1微摩尔/升～0.1摩尔/毫升，酶水解的温度为室温～70℃，水解的时间是0.1-120小时；重结晶所用的有机溶剂为乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或石油醚，重结晶的次数为一次至十次。
9.按照权利要求1～5之一所述的应用，其特征是所说的柚皮素是从含柚皮素的药材中提取获得的柚皮素粗品或柚皮素单体。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征是所说的从含柚皮素的药材中提取柚皮素的具体方法是药材粉碎，经过水/有机溶剂提取一至多次，滤过，合并滤液；滤液浓缩成浸膏，浸膏放置沉淀，得柚皮素粗品；再经有机溶剂或水多次重结晶，得柚皮素单体；所述有机溶剂提取所用的有机溶剂是乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或石油醚，水或有机溶剂提取采用在室温～100℃条件下或/和超声波条件下进行，提取次数为一至三次，水或有机溶剂的用量为至少能没过药材，每次提取时间为0.1-144小时；重结晶所用的有机溶剂可以采用乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或石油醚，重结晶的次数为一次至十次。
11.按照权利要求1～5之一所述的应用，其特征是所说的柚皮素盐是指柚皮素与相应的碱反应所生成的金属盐；该柚皮素盐的分子式为C15HnO5Ym，n＝9-11，m＝1-3，Y为金属离子。
12.按照权利要求11所述的应用，其特征是所说的柚皮素盐是指柚皮素与氢氧化钠或氢氧化钾反应而得到的柚皮素钠盐或钾盐，其分子式为C15HnO5Ym，n＝9-11，m＝1-3，Y为K或Na离子。
全文摘要
本发明涉及柚皮素(Naringenin)及其盐在用于制备止咳化痰的药物中的应用。所用的柚皮素可以由柚皮苷(Naringin)粗品或者单体通过水解的方法得到，或者从含柚皮素的各种药材中提取得到，或者通过其他化学方法合成得到；柚皮素盐可以通过柚皮素与相应的碱反应而得到。以柚皮素或/和柚皮素盐作为有效成分的药物具有良好的止咳化痰作用，对于由急、慢性支气管炎以及感冒等引起的各种咳嗽气喘疗效显著，未见毒副作用。
文档编号A61P11/14GK1555793SQ20041001502
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日 优先权日2004年1月8日
发明者苏薇薇, 王永刚, 方铁铮, 彭维, 吴忠 申请人:中山大学