专利名称：人血清白蛋白与人甲状旁腺激素(1－34)融合蛋白及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，更具体的说是涉及用DNA重组技术合成一种人血清白蛋白和人甲状旁腺激素(hPTH)(1-34)融合蛋白、含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主。
背景技术：
甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)是生物体内调节钙、磷代谢的一种重要因子。人甲状旁腺素(hPTH)是由84个氨基酸组成的多肽激素，分子量为9500，是甲状旁腺主细胞分泌的，最初合成产物是115个的前甲状旁腺素原preprohPTH在分泌过程中切除N端的31个残基后形成成熟的由84个氨基酸组成直链多肽激素。早在70年代末Tregear等就证明了hPTH发挥钙磷调节作用仅需N端的34个氨基酸残基。即只需要氨基端1-34肽就已具有完整的生物学功能，目前研究应用最多的是人hPTH氨基端1-34片段(human PTH1-34，hPTH(1-34))，它被认为是hPTH在体内的自然分解产物，同时在检测中保留了自然hPTH所有可测的生物活性。理想的治疗骨质疏松的药物应同时具有抗骨重吸收和促骨形成双重作用，hPTH正是同时具有这两种活性的多肽分子。通过受体介导，hPTH能够激活腺苷酸环化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等产生cAMP、IP3、Ca2+和二酰基甘油等胞内二级信使。[1]大量的动物实验和临床研究证实hPTH(1-34)对预防和治疗妇女绝经后骨质疏松疗效喜人，能显著降低脊椎骨和非脊椎骨骨折风险。[2]目前hPTH(1-34)注射剂已经在美国上市。由于hPTH(1-34)分子量较小，体内的吸收消除速度比较快。肌肉注射半衰期为1小时，静脉注射半衰期只有5min，在血浆中30min即达到血浓峰值。目前已有的hPTH(1-34)制剂价格昂贵，需要每天皮下注射给药，限制了其长期应用。因此开发经济、方便的hPTH(1-34)制剂十分必要。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆的重要成分，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。它是由585个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子量约为66.5KD，在血浆中的半衰期较长，长达2周体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，因而是一种理想的生物活性蛋白载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种集血清白蛋白与hPTH(1-34)的特性为一体的人血清白蛋白与人甲状旁腺激素(hPTH)(1-34)的融合蛋白，SEQ ID NO1为该融合蛋白的蛋白质序列和基因序列。
本发明的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，包含与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与hPTH(1-34)至少85％序列同源的第二区。
其中优选的是包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与hPTH(1-34)至少95％序列同源的第二区。
最优选的是包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与hPTH(1-34)氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
所述的功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别的氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
在本发明的融合蛋白中，是与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，所述与hPTH(1-34)序列同源的第二区位于融合蛋白的C-末端。
本发明提供的融合蛋白，包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与hPTH(1-34)氨基酸残基序列相同的第二区的融合蛋白的蛋白质序列，中间设有Gly Gly Gly Gly Ser连接肽。
本发明的又一个目的是提供携带编码本发明的融合蛋白的编码基因序列的重组表达载体，包括pPIC9-HSA-hPTH(1-34)，pPIC9K-HSA-hPTH(1-34)。
SEQ ID NO1为融合蛋白的基因和蛋白质序列gat gca cac aag agt gag gtt gct cat cgg ttt aaa gat ttg gga gaa 48Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15gaa aat ttc aaa gcc ttg gtg ttg att gcc ttt gct cag tat ctt cag 96Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30cag tgt cca ttt gaa gat cat gta aaa tta gtg aat gaa gta act gaa 144Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45ttt gca aaa aca tgt gtt gct gat gag tca gct gaa aat tgt gac aaa 192Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60tca ctt cat acc ctt ttt gga gac aaa tta tgc aca gtt gca act ctt 240Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80cgt gaa acc tat ggt gaa atg gct gac tgc tgt gca aaa caa gaa cct 288Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95gag aga aat gaa tgc ttc ttg caa cac aaa gat gac aac cca aac ctc 336Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110ccc cga ttg gtg aga cca gag gtt gat gtg atg tgc act gct ttt cat 384Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125gac aat gaa gag aca ttt ttg aaa aaa tac tta tat gaa att gcc aga 432Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140aga cat cct tac ttt tat gcc ccg gaa ctc ctt ttc ttt gct aaa agg 480Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160tat aaa gct gct ttt aca gaa tgt tgc caa gct gct gat aaa gct gcc 528Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175tgc ctg ttg cca aag ctc gat gaa ctt cgg gat gaa ggg aag gct tcg 576Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190tct gcc aaa cag aga ctc aag tgt gcc agt ctc caa aaa ttt gga gaa 624Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205aga gct ttc aaa gca tgg gca gta gct cgc ctg agc cag aga ttt ccc 672Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220aaa gct gag ttt gca gaa gtt tcc aag tta gtg aca gat ctt acc aaa 720Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240gtc cac acg gaa tgc tgc cat gga gat ctg ctt gaa tgt gct gat gac 768Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255agg gcg gac ctt gcc aag tat atc tgt gaa aat caa gat tcg atc tcc 816Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270agt aaa ctg aag gaa tgc tgt gaa aaa cct ctg ttg gaa aaa tcc cac 864Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285tgc att gcc gaa gtg gaa aat gat gag atg cct gct gac ttg cct tca 912Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300tta gct gct gat ttt gtt gaa agt aag gat gtt tgc aaa aac tat gct 960Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320
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编码HSA多聚核苷酸和编码hPTH(1-34)的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得。用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等。人工合成时可以选用宿主偏爱的密码子，这样可以提高产物的表达。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和其他多聚核苷酸连接。编码HSA和编码hPTH(1-34)多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可用如PCR方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端用DNA连接酶连接后从而获得编码融合蛋白的基因。
许多表达载体和其对应的宿主可以购买商品化的如酵母表达载体pPIC9，pPIC9K，pPICZα等分泌型载体。这些质粒为酵母整合型质粒，带有组氨酸缺陷型选择性标记。醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母基因组，和控制编码基因的表达。
表达融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来的，优选的是从宿主中分泌出来的。分泌所用的信号肽优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽或酿酒酵母α-交配因子信号肽，或这两种信号肽的类似物。用这两种信号肽融合蛋白表达水平较高。也可以不用信号肽在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。
转化所需要核酸至宿主细胞中可用电穿孔或化学法制作的酵母感受态细胞。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可以通过提取基因组DNA进行PCR鉴定，或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中蛋白可用抗HSA或hPTH(1-34)的抗体检测。
可以通过培养本发明DNA构建的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，优选的是生物反应器。
可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及其组合，液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
通过基因工程技术改造了hPTH(1-34)多肽分子，使其在不丧失受激活受体和刺激骨重建的功能的情况下，血浆中的半衰期将会得到显著地延长。[3]这样HSA-hPTH(1-34)就会降低了给药频率和剂量，却发挥出与hPTH(1-34)相似的药效作用。重组表达HSA作为载体蛋白还避免血源中纯化可能带来的病毒污染。
本发明另一个目的是在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。本发明将血清白蛋白，或其至少85％序列同源的类似物或片段与hPTH(1-34)或其至少85％序列同源的类似物或片段融合，所形成的融合蛋白不仅保留了hPTH(1-34)激活受体和刺激骨重建的功能的作用，而且在血浆中的半衰期将会得到显著地延长。HSA-hPTH(1-34)融合蛋白将是一种很有前景的能够治疗骨质疏松症的药用蛋白质。
人血清白蛋白天然存在多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括这种多态性。
本发明提供的融合蛋白适用于毕赤酵母菌中表达，构建的载体整合至毕赤酵母菌的基因组中，十分稳定，不易丢失。而且醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达高。同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且非常有利于重组蛋白的纯化。纯化步骤简洁高效，终产品内毒素含量低，有利于临床使用。
通过基因工程技术改造了hPTH(1-34)多肽分子，使其在不丧失受激活受体和刺激骨重建的功能的情况下，血浆中的半衰期将会得到显著地延长。这样HSA-hPTH(1-34)就会降低给药频率和剂量却发挥出与hPTH(1-34)相似的药效作用。重组表达HSA作为载体蛋白还避免血源中纯化可能带来的病毒污染。
该套表达系统的优点在于设计的融合基因适用于毕赤酵母菌中表达，构建的载体整合至毕赤酵母菌的基因组中，十分稳定，不易丢失。而且醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且非常有利于重组蛋白的纯化。纯化步骤简洁高效，终产品内毒素含量低，有利于临床使用。
因此，本发明用于由遗传工程酵母巴斯德毕赤酵母分泌生产HSA-hPTH(1-34)的方法简单、有效，并且容易放大进行大规模生产。应当理解的是，本发明并不局限于本文所说明和披露的各部分的特定结构和排列顺序，而且包括可以从权利要求书范围中得出的它的改进形式。
图1为合成的hPTH(1-34)基因测序图；图2为pPIC9-HSA-hPTH(1-34)质粒的构建图；图3为pPIC9-HSA-hPTH(1-34)质粒酶切鉴定电泳图；图4为pGEMT-HSA质粒双酶切和hPTH(1-34)的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析；图5为对重组菌酵母pPIC9-HSA-hPTH(1-34)基因组PCR结果；图6为重组菌不同诱导表达时间取样蛋白质电泳结果；图7为纯化后的融合蛋白HSA-hPTH(1-34)的SDS-PAGE分析；图8为融合蛋白PVDF膜免疫印迹分析；图9为融合蛋白对兔肾皮质细胞的刺激活性分析；图10为HSA-hPTH(1-34)血药浓度—时间曲线示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。通过下列实施例对本发明的技术特征做详细的描述，但不限制本发明。
实施例1 生产HSA与hPTH(1-34)融合蛋白酵母工程菌的构建一材料和方法(一)实验材料酵母菌Pichia Pastoris GS115(his4 Mut+)，表达质粒pPIC9为Invitrogen公司的产品。克隆载体pGEM-T为Promega公司的产品。
TRIzol试剂、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成，测序服务由上海联合基因生物技术服务公司完成。
酵母培养基YPD、BMGY、BMMY、RDB、MM、MD成分均同Invitrogen毕赤酵母实验手册。羊抗人血清白蛋白多抗为Beckman公司的产品，羊抗人hPTH(1-34)多抗为美国DSL公司的产品。cAMP酶免试剂盒购置于上海晶美公司。
(二)实验方法1.HSA cDNA的克隆构建提取人肝组织的mRNA，取1mg左右加TRIzol试剂1ml，匀浆30s。4℃(≤12000g)离心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，盖紧离心管盖，手摇剧烈振荡15秒，然后冰浴放置15分钟，于4℃离心(≤12000g)15分钟，RNA存在于上层水相中。转移水相至另一个干净离心管中，加异丙醇0.5ml，混匀，室温放置10分钟以沉淀RNA，然后于4℃离心(≤12000g)10分钟。移去上清液，加75％乙醇1ml洗涤沉淀，经旋涡振荡，于4℃离心(≤7500g)5分钟，回收RNA沉淀。移去上清液，将离心管置空气中干燥，挥去乙醇，沉淀用50μl无核糖核酸酶(RNase)的水(焦碳酸二乙酯处理)溶解，65℃放置15分钟使变性，立即置冰上备用或冻于-70℃冰箱中保存。肝组织总RNA2μl，水4μl，随机引物4μl，总体积20μl振荡混匀。
按照GENEBANK中的人血清白蛋白成熟肽序列合成引物，上下游引物分别引入EcoRI和BamHI位点和保护碱基。
上游引物序列5’ATGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3’下游引物序列5’ATGC GGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT 3’聚合酶链反应(PCR)条件为100μl反应体系中，加入1.5μl肝组织cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μl，10mmol/L的dNTP1μl，10×反应缓冲液10μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，剩余用ddH2O补足。用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient)PCR仪，PCR条件为94℃预变性5分钟；94℃变性40秒；54℃退火45秒；72℃延伸2分钟，共33个循环以后，再72℃延伸10分钟。通过0.8％凝胶电泳分析得到预期为1.8kb的条带。PCR产物电泳纯化用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。取纯化的HSA cDNA 3μl，加入1μl pGEM-T载体，5μl 2×反应缓冲液，1μl T4 DNA连接酶，16℃反应过夜，转化新鲜制作的DH5α感受态细胞。转化菌铺于x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至5mL含50μg/ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，用小量质粒提取试剂盒，用EcoRI和BamHI双酶切后进行电泳鉴定，参见图4，其中泳道1显示的是pGEMT-HSA质粒经过EcoRI和BamHI双酶切的产物，泳道2显示的是用引物PTH-up和PTH-down进行hPTH(1-34)的PCR产物。用pGEM-T通用引物对重组质粒进行测序，走了一次walking后完成HSA cDNA全长测序，经过DNASTAR软件与genebank中NM 000477序列进行比对后，证明已获得序列完全正确的血清白蛋白cDNA的克隆。
2.含有连接肽的hPTH(1-34)cDNA的克隆根据hPTH(1-34)氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，[4]设计hPTH(1-34)全长基因，并在其中设计一个PstI内切酶识别位点，以备下面的步骤中筛选克隆。参见SEQ ID NO2，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成含有hPTH(1-34)全长序列基因gga tcc ggt ggt ggt ggt agt tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac 48Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met Hisaac ctt ggt aaa cac ctg aac tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt 96Asn Leu Glu Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Argaag aaa ctg cag gat gtc cat aac ttc tag 126Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Ter测序结果显示正确，参见图1。
设计含有编码连接肽Gly Gly Gly Gly Ser基因的引物，并且在上下游引物引入BamHI和NotI酶切和保护碱基。上游引物序列5‘GCGCGGATCCGGTGGTGGTGGTAGTTCTGTTTCTGAAATCCAGCTG 3’下游引物序列5‘GCGCGCGGCCGCTTAGAAGTTATGGACATCCTGCAG 3’PCR条件为100μl反应体系中，加入1.5μl合成的cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μl，10mmol/L的dNTP 0.5μl，10×反应缓冲液10μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，剩余用ddH2O补足。用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient)PCR仪，PCR条件为94℃预变性3分钟；94℃变性30秒；58℃退火45秒；72℃延伸2分钟，共33个循环以后，再72℃延伸10分钟。通过1.0％凝胶电泳分析得到预期为约150bp的条带，参见图4的泳道2。
PCR产物电泳纯化用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。纯化后的hPTH(1-34)cDNA用BamHI和NotI过夜酶切后，再进行胶回收纯化。-20℃冻存备用以和HSA片段及酵母表达载体pPIC9相连。
实施例2 pPIC9-HSA-hPTH(1-34)重组酵母表达质粒的构建为了将HSA与hPTH(1-34)以融合蛋白的形式从毕赤酵母分泌表达，参见图2，选择pPIC9质粒作为载体，在该载体的醇氧化酶AOX启动子下游的EcoRI和NotI位点插入融合蛋白的基因。将载体pPIC9用EcoRI和NotI进行过夜双酶切后，胶回收备用。将前述的pGEM-HSA质粒用EcoRI和BamHI双酶切，回收约1.8kb的片段。将酶切后线性化的pPIC9载体与含有HSA cDNA、hPTH(1-34)cDNA片段按照合适的摩尔比放入连接体系中，用T4连接酶催化，16℃反应过夜，转化新鲜制作的DH5α感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取阳性克隆。用PstI酶切进行鉴定后，参见图3(泳道1DNA分子量标准，泳道2pPIC9经PstI酶切后，泳道3-4pPIC9-HSA-hPTH(1-34)经PstI酶切后)，送上海生工生物技术服务公司进行测序，用pPIC9载体的3′AOX1测序引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′对重组质粒进行测序。测序结果证实含有连接肽的hPTH(1-34)基因正确无误并和载体及HSA基因顺利连接。
实施例3 HSA与hPTH(1-34)融合基因其他类型酵母表达质粒的构建基于其他不同酵母表达载体如pPIC9，pPIC9K，pPICZα，pHIL-S1，pPIC6α，pGAPZα等酵母分泌型载体及其他pPIC3.5K，pPAO815，pPICZ，pHIL-D2，pPIC6，pGAPZ等酵母胞内表达载体的酶切位点，对HSA-hPTH(1-34)的融合基因进行5’和(或)3’端的改造，运用分子生物学的常规手段如PCR，补平末端，平末端连接等，以插入表达载体的多克隆位点区。构建工作按连接，转化，酶切鉴定，测序步骤均同实施例2。
实施例4 pPIC9-HSA-hPTH(1-34)重组酵母表达质粒转化毕赤酵母GS115细胞、筛选及表达电击转化及克隆筛选方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册，其中宿主细胞采用毕赤酵母GS115菌株。根据目的基因和载体选择合适的线性化位点，最后我们选用了StuI进行酶切，回收含有融合蛋白基因的表达盒片段，此回收的表达盒片段用于电击转化。转化后的GS115，铺于含有山梨醇RDB琼脂平板，30℃培养1-2天，挑取His+克隆。接种至装有25mlBMGY培养基250ml锥形瓶，250转/分钟30℃培养48小时至OD600＝2-6。离心后收集菌体用BMMY培养基使OD600＝1.0左右(约100-200mL)，继续30℃培养，加甲醇1％每24小时，诱导表达120小时，每天取样离心上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。毕赤酵母GS115重组细胞接种3mLYPD，30℃摇床培养到OD600约5-8之间；室温离心收集菌体于1.5mL离心管中；用灭菌水洗涤一次后再用0.5mL的SCE(1M山梨醇，1mM EDTA，10mM柠檬酸缓冲盐pH8.5)溶液悬浮菌体，并添加40μL浓度为5mg/mL的溶细胞酶和10μL巯基乙醇；37μL200r/min振荡处理1h后离心去上清，沉淀的菌体用0.5mLTris-EDTA(含50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L乙二胺四乙酸钠)重新悬浮并添加50μL10％十二烷基磺酸钠；65℃处理20min后溶液变得粘稠，此时加入200μL 5M的醋酸钾，倒置混匀后放冰上30-60min；然后室温离心，上清加1mL无水乙醇，室温离心10s，倒去上清后倒置挥干DNA沉淀。所得的DNA用300μL的Tris-EDTA重新溶解并加入适量的Rnase A消化。37℃保温1h降解RNA。最后加入0.5mL的异丙醇，DNA沉淀析出后用灭菌的牙签挑出并置入新的离心管中，加入100μLTris-EDTA溶解后，用于扩增融合基因的表达盒。用5’AOX1测序引物和3’AOX1测序引物对基因组进行PCR操作验证，结果参见图5，泳道1-4是用5’、3’AOX1测序引物对融合蛋白酵母基因组的PCR结果，泳道5是用5’、3’AOX1测序引物对表达HSA酵母基因组的PCR结果。
实施例5其他生产HSA与hPTH(1-34)融合蛋白重组酵母工程菌的构建及筛选不同类型的表达载体pPIC9，pPIC9K，pPICZα，pHIL-S1，pPIC6α，pGAPZα等分泌型载体及其他pPIC3.5K，pPAO815，pPICZ，pHIL-D2，pPIC6，pGAPZ等胞内表达载体。它们的不同基于表达启动子，筛选标记，分泌信号肽等特点的不同。因此实施例3中的插入融合基因的重组表达质粒也携带了这些特点，选用与其相应的毕赤酵母宿主如GS115，X-33，KM71，KM71H，SMD1168，SMD1168H进行下一步的转化构建工作。可以参照Invitrogen酵母实验手册按实施例4中进行相同或相似的构建和筛选。
实施例6HSA与hPTH(1-34)融合蛋白的发酵生产和纯化以实施例4中构建的表达融合蛋白的工程酵母和融合蛋白纯化为例，其他的实施例5中工程酵母菌的发酵和融合蛋白的纯化可用相同的或类似的方法。
将重组酵母菌接种于25mL YPB培养基中于30℃培养生长。将含57.8g(NH4)2SO4，46.6g KCl，30.8g MgSO4·7H2O，8.6g CaSO4·2H2O和2.0g的NaCl的2.5升溶液加入发酵罐中，高压灭菌。冷却至29℃，加入350mL 50％葡萄糖，210mL 30％六甲基磷酸酯钠溶液和250mL 10倍浓度的微量元素溶液。10倍浓度的微量元素浓度为每升含27.8g FeSO4·7H2O，0.5g CuSO4·5H2O，1.09gZnCl2，1.35g MnSO4·2H2O，0.48g CoCl2·6H2O，0.24g Na2MoO4·2H2O，0.5gH3BO3，0.08g KI，5mg生物素，0.5g的维生素B1，2.5mL的硫酸，用10％的NH4OH和10％H3PO4将发酵液pH调成5.0，调节无菌压缩空气，流程为50升/分，转子的转速为300rpm；调节溶氧至30％，搅拌速度300-800rpm，搅拌速度大于800rpm时，将自动供应纯氧。培养24-36h以后，以60mL/h速度补加补加液(补加液由50％葡萄糖，300mM(NH4)2SO4和1倍浓度的微量元素组成)，此阶段共培养24小时；以20mL/h速度加入50％葡萄糖，以25mL/h速度加入纯甲醇，此阶段为诱导AOX1启动子启动，进行融合蛋白合成，收集不同诱导时间的培养基待检测。
取诱导培养的24h、48h、72h、120h培养液样品，离心上清，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果参见图6，其中自右向左是诱导120h，72h，48h，24h培养液上清。发现诱导的融合蛋白在培养上清中的百分含量大于50％，经Lowery(Folin-酚试剂法)法测定蛋白质浓度约为2g/L。50mL培养液中离心取上清加入硫酸铵至85％的饱和度，混匀后4℃静置过夜，12000r/min、4℃离心20min，沉淀用去离子H2O溶解。过脱盐柱。用Amersham的HiPrep Desalting柱，流动相为20mM Na3PO4，0.15M NaCl pH7.0，流速为15mL/min，紫外检测收集第一个峰为纯化的融合蛋白，SDS-PAGE分析显示均一条带，分子量大约在71KD。结果参见图7，右边显示的是纯化后的融合蛋白。
实施例7HSA-hPTH(1-34)活性测定1.融合蛋白的免疫学活性测定通过测定HSA免疫比浊法对融合蛋白进行测定。抗原抗体反应中形成免疫复合物，悬浮在缓冲液中使散射光信号发生变化，通过测定信号增长的速率测定血清白蛋白的抗原浓度。实验结果证明表达融合蛋白具有HSA的抗原性。
对hPTH(1-34)免疫学活性的检测通过蛋白质免疫印迹(western blot)方法进行检测。用羊抗hPTH(1-34)抗体做一抗，辣根过氧化物酶标记的抗羊的IgG作为二抗，二氨基联苯胺做显色底物，检测融合蛋白的hPTH(1-34)免疫活性。实验结果证明表达融合蛋白具有hPTH(1-34)的抗原性。显色结果参见图8。
2.HSA-hPTH(1-34)融合蛋白的生物学活性测定HSA-hPTH(1-34)的活性是通过检测由于腺苷酸环化酶的活化而产生的环磷酸腺苷(cAMP)的量来衡量的。为此，从兔的肾组织中分离纯化了肾皮质细胞。[5]采用化学合成的hPTH(1-34)肽作为测活的对照品。结果参见图9，实线是合成的hPTH(1-34)对兔肾皮质细胞刺激的浓度效应曲线，虚线HSA-hPTH(1-34)对兔肾皮质细胞刺激的浓度效应曲线。
实施例8HSA-hPTH(1-34)体内半衰期初步研究取相同活性剂量的HSA-hPTH(1-34)融合蛋白和hPTH(1-34)标准品小鼠尾静脉给药，取不同时间取鼠尾静脉给药，不同时间取血清用抗hPTH(1-34)酶免试剂盒检测其中的hPTH(1-34)的浓度。融合蛋白在小鼠血浆中的代谢速度明显比hPTH(1-34)慢。注射后10分钟，两者在血浆中的活性相差不大，而1小时后，hPTH(1-34)的浓度下降了近十倍，而融合蛋白的血浆中浓度继续上升；20小时后，注射融合蛋白的小鼠仍能测到hPTH(1-34)。结果参见图10，融合蛋白在小鼠血浆中的半衰期明显延长。可作为原料，在制备治疗骨质疏松症的长效药物中应用。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
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权利要求
1.人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，SEQ ID NO1为该融合蛋白的基因和蛋白质序列，该融合蛋白包含与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人甲状旁腺素(1-34)至少85％序列同源的第二区。
2.根据权利要求1所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包含与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人甲状旁腺素(1-34)至少95％序列同源的第二区。
3.根据权利要求1和2所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包含与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人甲状旁腺素(1-34)氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
4.根据权利要求3所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述的功能等同物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代，缺失或加入得到的多肽。
5.根据权利要求1和2所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，所述与人甲状旁腺素(1-34)序列同源的第二区位于融合蛋白的C端。
6.根据权利要求1和2所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征在于所述与人甲状旁腺素(1-34)序列同源的第二区位于融合蛋白的N-末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白C端。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的人血清白蛋白与人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是所述与人血清白蛋白同源的第一区与人甲状旁腺素(1-34)序列同源的第二区之间设有连接肽，连接肽为Gly Gly Gly Gly Ser。
8.根据权利要求1所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是提供携带编码融合蛋白的基因序列的重组表达载体，pPIC9-HAS-hPTH，pPIC9K-HAS-hPTH。
9.根据权利要求1所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，其特征是表达融合蛋白的宿主优选是酵母，尤其是毕赤酵母。
10.根据权利要求1-10中任一项所述的人血清白蛋白和人甲状旁腺素(1-34)融合蛋白，在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种血清白蛋白和人甲状旁腺素(1－34)融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列，携带该基因序列的细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。本发明的融合蛋白包含与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与hPTH(1－34)至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白的特性的前提下，进行个别氨基酸的残基的取代，缺失或加入；本发明融合蛋白的第一区和第二区之间设有连接肽；本发明的融合蛋白不仅保留了hPTH(1－34)激活受体和刺激骨重建的功能的作用，而且显著延长在体内的半衰期，是一种很有前景的能够治疗骨质疏松症的药用蛋白质。
文档编号A61K38/29GK1597965SQ200410066459
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月14日 优先权日2004年9月14日
发明者陈枢青, 陈静 申请人:浙江大学