新型用途的制作方法

专利名称：新型用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含烟碱受体激动剂的正性调节剂的组合物，所述正性调节剂具有增强所述烟碱受体激动剂功效的能力。
背景技术：
在正常情况下，胆碱能受体结合内源性神经递质乙酰胆碱(ACh)，因此引发离子通道的开放。哺乳动物中枢神经系统中的ACh受体可分为蕈毒碱的(mAChR)和烟碱(nAChR)子型，它们分别以蕈毒碱和烟碱的激动剂活性为基础。烟碱型乙酰胆碱受体是包含5个子单元并具有配体选通的离子通道(评论文献参见Colquhon等人(1997)“药物学进展”39，191-220；Williams等人(1994)“药物新闻与前景”7，205-223；Doherty等人(1995)“药物化学年报”30，41-50)。nAChR基因族的成员基于其顺序分为两组；一组成员被认为是β子单元，而第二组被归类称为α子单元(评论文献参见Karlin和Akabas(1995)“神经原”15，1231-1244；Sargent(1993)“神经科学年度综述”16，403-443)。当单独表达时，三个α子单元α7、α8和α9形成功能性受体，并因此可能形成同质低聚物受体。
nAChR的异位转变状态模型至少涉及休止状态、激活状态和“脱敏”关闭通道状态(Williams等人，如上所述；Karlin和Akabas，如上所述)。因此，不同的nAChR配体可不同程度地稳定它们优先结合的构象状态。例如，激动剂ACh和(-)-烟碱稳定所述激活和脱敏状态。
烟碱受体活性的改变涉及许多疾病。其中的一些包括例如重症肌无力和ADNFLE(常染色体显性夜发型前叶癫痫)(Kuryatov等人(1997)“神经科学杂志”17(23)9035-47)与烟碱传递活性降低有关，所述烟碱传递活性降低是通过减少受体数量或增强脱敏作用出现的，这是一种使受体对激动剂不敏感的过程。也有人假设烟碱受体减少可介导某些疾病，如早老性痴呆和精神分裂症中所见到的认知缺陷(Williams等人，如上所述)。通过烟碱受体也可以介导来自烟草的烟碱的作用。增强烟碱受体的活性可降低对吸烟的需求。
在McDonald等人(1995)“烟碱型乙酰胆碱受体分子生物学、化学和药理学”第五章《药物化学年报》vol 30，pp 41-50，Academic pressInc.，San Diego，CA和Williams等人(1994)在“神经元的烟碱型乙酰胆碱受体”《药物新闻与前景》vol.7，pp.205-223中讨论了利用与烟碱型乙酰胆碱受体结合的化合物来治疗一系列涉及胆碱能功能降低的疾病，如早老性痴呆、认知或注意力障碍、注意力不集中性多动症、焦虑、抑郁、戒烟症、自闭症、精神分裂症、痛觉缺失、图雷特氏综合症和帕金森氏病。
然而，利用在ACh相同的位点处发挥作用的烟碱型受体激动剂治疗是成问题的，因为ACh通过包括脱敏(评论文献参见Ochoa等人(1989)“细胞内和分子神经生物学”9，141-178)和非竞争性阻断(打开通道阻断)(Forman & Miller(1988)生物物理杂志54(1)149-58)在内的过程，不仅激活受体活性而且也阻断受体的活性。因此，预期ACh激动剂既可降低活性也增强活性。一般对烟碱受体，特别是对α7-烟碱受体来说，脱敏作用限制了激动剂应用期间测试时电流的持续时间。

发明内容
意外地发现，某些化合物如5-羟基吲哚(5-OHi)可增强激动剂对烟碱受体的功效。所述功效增强可能大于2倍。相信具有该种作用的化合物(下文称作正性调节剂)将特别用于治疗与烟碱传递减少有关的疾病。在治疗处置中，所述化合物可以恢复正常的神经元间的传递，而不影响激活作用的暂时特点。另外它们将不会象长时间应用激动剂那样产生长期的灭活作用。
由现有技术不可能预料存在所述功效增强活动。Albuquerque等人报道了烟碱受体的另一异位，他们称之为“非竞争性激动剂”位点。在该位点发挥作用的化合物也称作“异位增效配体”(APL’s)。在该位点发挥作用的化合物包括几种胆碱酯酶抑制剂、可待因和5-HT。据称，借助所述非竞争性激动剂位点的活动不影响对ACh的最大反应水平；它使剂量-反应曲线向左移动(Maelicke & Albuquerque(1996)DDT，vol.1，53-59)。其特异性区别是，在所发现的位点发挥作用的化合物可增强对ACh的最大反应(其功效)。
APL’s和本发明之间的另一区别是在饱和浓度的激动剂存在下调节剂对总电流的影响(通过曲线下面积测定)。APL’s对以卵母细胞表达的nAChRα7曲线下面积有很小或没有影响；在激动剂应用1秒钟后观察到曲线下面积增加8-10％。相反，在同样条件下，5-OHi引起曲线下面积大大增加(～400％增加)(参见图4上部踪迹)。
烟碱受体族作用的特异性也是APL’s和本发明之间的另一区别特征。对所有的试验烟碱受体，包括肌肉型(α1βδe)烟碱受体，APL’s均发挥其正调制作用。
已经发现，对某些非烟碱受体，化合物可降低受体的脱敏作用。对AMPA-型兴奋性氨基酸受体，化合物，如环噻嗪、某些凝集素，如小麦胚凝集素、吡拉西坦类似物nootropics和AMPA类似物显示可降低脱敏作用(Partin等人(1993)“神经元”11，1069-1082)。据报道，甘氨酸降低NMDA-型兴奋性氨基酸受体的脱敏作用(Mayer等人(1989)“自然”338，425-427)。然而已经发现，一般来说降低一类受体脱敏作用的化合物对另一类受体没有相同的影响。例如环噻嗪对NMDA和KA子型谷氨酸盐受体具有很小作用或没有作用(Partin等人(1993)“神经元”11，1069-1082)；而且发现，环噻嗪阻断5-HT3受体(D.A.Gurley，未发表的结果)。甘氨酸对5-HT3受体没有作用(Gurley and Lanthorn，(付印中)“神经科学通讯”)。
利用已知降低5-HT3受体脱敏作用的化合物(5-OHi)来发现该位点(Kooyman.A.R.等人(1993)“英国药理学杂志”108，287-289)。然而，据报道，只有另外一个产生或增强5-HT3(OHi)受体和5-HT本身活性的化合物会增强烟碱受体的活性(Schrattenholz等人(1996)“分子药理学”49，1-6)，尽管在非洲蟾蜍属卵母细胞中还未曾有人报道过该活性。大多数5-HT3受体激动剂没有激动烟碱受体的活性或者是烟碱受体的拮抗剂(未发表的结果)。另外，本发明者未能再现5-HT增强烟碱受体活性的发现。因此，也不可能预见到5-OHi对烟碱受体的增强作用。
所以，一方面，本发明提供一种药物组合物，它包含烟碱受体激动剂的正性调节剂和可药用载体，所述正性调节剂具有增强所述受体激动剂功效的能力。就本发明目的而言，术语“正性调节剂”或“烟碱受体激动剂的正性调节剂”将理解为具有增强烟碱受体激动剂最大功效能力的化合物。
应明确，本发明包括组合物，所述组合物包含作为唯一活性物质的正性调节剂，由此调节内源性烟碱受体激动剂活性，或者包含正性调节剂和烟碱受体激动剂相结合。因此，所述包含烟碱受体激动剂正性调节剂的药物组合物可另外还包含烟碱受体激动剂。
在本发明优选形式中，所述正性调节剂是5-羟基吲哚。
在本发明另一优选形式中，所述烟碱受体激动剂是α7-烟碱受体激动剂。α7-烟碱受体激动剂的实例是(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。有几种α7-烟碱受体激动剂是本领域已知的，例如来自WO96/06098、WO97/30998和WO99/03859。
另一方面，本发明提供一种治疗与烟碱传递减少有关疾病的方法，该方法包括给予需要该治疗的病人医疗有效量的烟碱受体激动剂的正性调节剂，所述正性调节剂具有增强所述烟碱受体激动剂功效的能力。
应明确，本发明治疗方法包括给予作为唯一活性物质的正性调节剂，由此调节内源性烟碱受体激动剂活性，或者与烟碱受体激动剂一起给予正性调节剂和。
在本发明优选形式中，所述治疗方法包含的正性调节剂是5-羟基吲哚。
在本发明另一优选形式中，所述治疗方法包含的烟碱受体激动剂是α7-烟碱受体激动剂。α7-烟碱受体激动剂的实例是(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。有几种α7-烟碱受体激动剂是本领域已知的，例如来自WO96/06098，WO97/30998和WO99/03859。
另一方面，本发明以本发明药物组合物来生产用于治疗或预防下列所述疾病中之一种的、与烟碱受体传递减少有关，或与烟碱密度减少有关疾病的药物，其中所述治疗或预防方法包括给予病人医疗有效量的本发明化合物。
应明确，所述应用包括其中包含作为唯一活性物质的正性调节剂，由此调节内源性烟碱受体激动剂活性，或者包含正性调节剂和烟碱受体激动剂的组合物。因此，所述包含烟碱受体激动剂正性调节剂的药物组合物的应用可另外还包含烟碱受体激动剂。
在本发明优选形式中，所述应用包含的正性调节剂是5-羟基吲哚。
在本发明另一优选形式中，所述应用所采用的烟碱受体激动剂是α7-烟碱受体激动剂。α7-烟碱受体激动剂的实例是(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。有几种α7-烟碱受体激动剂是本领域已知的，例如来自WO96/06098，WO97/30998和WO99/03859。
所述疾病的实例包括精神分裂症、躁狂和躁狂性抑郁、焦虑、早老性痴呆、学习缺陷、认知缺陷、注意力不集中、记忆丧失和注意力不集中性多动症、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病、图雷特氏综合症、乘喷气式飞机引起的神经紊乱和烟碱成瘾(包括暴露于含烟碱产品引起的疾病)。
应明确，所述正性调节剂系以对内源性烟碱受体激动剂发挥作用的目的给药，或者以与外源性烟碱受体激动剂组合物的形式给药。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防上述由哺乳动物，优选人类的烟碱型乙酰胆碱受体神经传递机能障碍引起的疾病的药物组合物，所述组合物包含作为唯一活性物质的正性调节剂，由此调节内源性烟碱受体激动剂活性，或者包含正性调节剂和烟碱受体激动剂相结合。因此，所述包含烟碱受体激动剂正性调节剂的药物组合物可另外还包含治疗或预防所述疾病有效量的烟碱受体激动剂和惰性可药用载体。
当然，就上述应用而言，所给予的剂量将依赖于所使用的组合物、给药方式和所需要的治疗效果。然而，一般地，当以每公斤体重哺乳动物大约0.1mg-约20mg的每日剂量，优选分为每日1-4次，或以缓释形式给予所述活性组分时，将得到令人满意的结果。对人来说，每日总剂量为5mg-1400mg，更优选10mg-100mg，并且适用于口服给药的单位剂量形式包含2mg-1400mg与固态或液态可药用载体或稀释剂混合的活性组分。
上述组合物可以单独或以其适宜的药用制剂形式通过肠内、非肠道、口服、直肠或鼻给予。
适宜的稀释剂或载体的实例为-对于片剂和糖锭剂来说乳糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸；对于胶囊剂来说酒石酸或乳糖；-对于可注射溶液剂来说水、醇、甘油、植物油；对于栓剂来说天然或硬化油或蜡。
本发明也提供一种制备所述药物组合物的方法，它包括将所述组分同时或相继混合。
另一方面，本发明提供识别烟碱受体激动剂正性调节剂的方法。如果在饱和浓度nAChRα7受体激动剂ACh存在下，测定基线到峰值的电流(参见实验方法)，当所诱发的电流超过对照电流200％(100％增效)时，认为化合物是“正性调节剂”。对照电流定义为在不存在调节剂情况下由激动剂诱发的电流。ACh饱和浓度的定义为对所使用特异性nAChRα7型而言为EC50的10倍。EC50定义为诱发一半最大反应的浓度。一般来说，nAChRα7子型的EC50值的范围在100-300μM(Bertrand等人(1992)“神经科学通讯”146，87-90；Peng等人(1994)“分子药理学”45，546-554)。此外，如果在饱和浓度激动剂存在下，通过所述受体的总电流(流出)超过200％对照电流，认为该化合物是“正性调节剂”。总电流的一种度量是在激动剂施用过程中曲线(电流踪迹)下的面积。
因此，本发明识别烟碱受体激动剂正性调节剂的方法可包括步骤(a)在细胞表面表达烟碱受体；(b)将所述烟碱受体与已知是烟碱受体激动剂的化合物和准备测定其正调节活性的化合物接触；(c)测定所述待测定化合物对所述烟碱受体激动剂的作用是否显示正调节作用，导致电流振幅(通过测定基线到峰值间的电流值)或总电流(通过电流踪迹曲线下面积测定)大于对照物200％(100％增效)。所述细胞可以是非洲蟾蜍属卵母细胞、HEK-293细胞或培养的神经元。所述烟碱受体可以是人、大鼠、鸡、小鼠或牛的烟碱受体。
另一方面，本发明涉及识别烟碱受体激动剂正性调节剂的方法，所述烟碱受体是α7-烟碱受体。
另一方面，本发明提供识别作为烟碱受体激动剂化合物的方法，所述方法包括步骤(a)在细胞表面表达烟碱受体；(b)在烟碱受体激动剂的正性调节剂存在下，将所述烟碱受体与准备测定其烟碱受体激动剂活性的化合物接触；(c)测定所述待测定化合物是否显示烟碱受体激动剂活性。所述细胞可以是非洲蟾蜍属卵母细胞、HEK-293细胞或培养的神经元。所述烟碱受体可以是人、大鼠、鸡、小鼠或牛的烟碱受体。本领域技术人员可以理解，“烟碱受体激动剂活性”可通过本领域已知的方法，如下面的“实验方法”部分所描述的那些方法测定。
另一方面，本发明涉及识别作为烟碱受体激动剂化合物的方法，所述烟碱受体是α7-烟碱受体。
实验方法(a)非洲蟾蜍属卵母细胞的电流记录非洲蟾蜍属卵母细胞提供了一种估价认为是配体选通离子通道子单元的蛋白质功能的有力手段。注射由编码适宜受体子单元的cDNA克隆转录的RNA，或注射其编码序列置于启动子下游的cDNA，结果在卵母细胞表面出现功能性配体选通离子通道(例如参见Boulter等人(1987)“美国国家科学院学报”84，7763-7767)。
因此，一种方便的评价烟碱功效增强作用的技术是记录表达来自cRNA的α7-烟碱受体的非洲蟾蜍属卵母细胞的双电极箝位电压。
将有爪蟾蜍属青蛙(非洲蟾蜍属I，Kalamazoo，MI)用0.15％三卡因麻醉。将卵母细胞取出放到OR2溶液(82mM NaCl，2.5mM KCl，5mM HEPES，1.5mM NaH2PO4，1mM MgCl2，0.1mM EDTA；pH7.4)中。在以1Hz的频率振动的振动台上，在25ml含0.2％胶原酶1A(Sigma)的OR2中孵育两次60分钟，将所述卵母细胞去卵泡(defolliculate)，并贮存在Leibovitz’s L-15培养基(50μg/ml庆大霉素、10单位/ml青霉素和10μg/ml链霉素)中。第二天，每个卵母细胞注射大约50ng cRNA。cRNA是通过使用Message Machine(购于Abion)，由cDNA合成的。
外部的记录用溶液是由90mM NaCl、1mM KCl、1mM MgCl2、1mM BaCl2和5mM HEPES组成，pH7.4。通过使用卵母细胞箝位放大器(OC 725C；Warner Instrument，Hamden，CT)进行双电极箝位电压记录。将卵母细胞用充满3M KCl并且尖端电阻为1-2MΩ的两个电极刺穿。当膜电位稳定在负值至-20mV时开始记录(当槽液中用Ba++代替Ca++时，静止膜电位是较小负值)。膜电位固定在-80mV。ACh购于Sigma.
将卵母细胞用含或不含ACh的记录溶液连续灌注(5ml/min)。
测定基线到峰值的电流振幅。通过用GraphPad Prism(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)将数据调整使之适合对数方程式来估测EC50值、最大作用和Hill斜率。
可通过两种方法计算由正性调节剂诱发的激动剂功效的提高(1)、以电流振幅增强百分数计算，所述电流振幅增强定义为100(Im-Ic)/Ic，其中Im是调节剂存在下的电流振幅，而Ic是不存在调节剂下的电流振幅(图1)。
(2)、以激动剂踪迹“曲线下面积”增效百分数计算。曲线下面积是通过通道的总离子流量的一般表示方法(图2)。在图2所显示的实例中，尽管电流振幅不增加，但在激动剂应用的持续时间内，曲线下面积大约超过对照组100％。
(b)Ca2+流量成像将在细胞系中瞬时表达的nAChRα7受体中流过的Ca2+流量成像，是评价调节剂活性的另一方法。
将表达α7受体的细胞(例如HEK-293细胞或细胞培养的神经元)在96孔培养皿中培养，并加入荧光钙指示剂fluo-3。为了筛选α7的调节活性，将96孔培养皿放在荧光成像板读数器(FLIPR)上，并将试验化合物与α7激动剂一起同时加于所有孔中。通过流入细胞中的钙来测定受体的激活作用，其中所述流入细胞中的钙是由各孔中荧光强度的增强来定量的。同时由FLIPR进行记录。通过超过单独应用激动剂的荧光增强来测定调节剂作用。类似地，为了测定nAChRα7激动剂的活性，将试验化合物与α7调节剂一起同时加于所有孔中。通过流入细胞中的钙来测定受体的激活作用，其中所述流入细胞中的钙是由各孔中荧光强度的增强来定量的。同时由FLIPR进行记录。通过超过单独应用调节剂的荧光增强来测定激动剂的作用。
按照下列方法制备细胞培养的神经元将18天龄的Sprague-Dawley鼠胎儿(E-18)从怀孕雌性鼠的体内无菌取出，处死，取出脑的额皮质，将脑膜剥离，并将干净的皮质放到冷却的HBSS中。如果想要海马，将海马从所述皮质中切下来，然后放到冷却的HBSS中。通过机械操作将组织分散开，在HBSS中洗涤一次(在4℃下，200g 30分钟)，重新悬浮在其中补加了谷氨酰胺、抗生素、氯化钾、胰岛素、转铁蛋白、硒和5％加热灭活胎牛血清(FBS；不含内毒素)的改良Sato氏培养基中，并放入24孔培养皿的各孔(涂布聚L-赖氨酸)中。各孔上也可能包括涂布了PLL的条状玻璃盖板。将培养皿在37℃下的CO2恒温箱中培养。24小时后除去培养基，加入新鲜的培养基，并让细胞再生长至少11天，必要时供给细胞养料。


图1由激动剂激起的电流踪迹模型，它表示通过测定电流振幅来测定激动剂功效的提高。横杠表示施用化合物的持续时间。
图2由激动剂激起的电流踪迹模型，它表示通过测定“曲线下面积”来测定激动剂功效的提高。箭头表示ACh电流和ACh+调节剂电流重迭部分。横杠表示施用化合物的持续时间。
图35-羟基吲哚对α7-烟碱受体的ACh活性的影响。100％的电流值是由ACh曲线外推到的最大值。
(●)Ach(O)Ach+0.5mM 5-羟基吲哚图45-羟基吲哚对以非洲蟾蜍属卵母细胞表达的α7-烟碱受体(人、鼠和小鸡)的ACh活性的影响。
图55-羟基吲哚对以非洲蟾蜍属卵母细胞表达的α7-烟碱受体的Ach(公开出售的产品)和(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮(提供的产品)活性的影响。
图6nAChRα7调节剂对激动剂活性的影响，它是由Ca2+通过以HEK-293细胞表达的nAChRα7的流量测定的。所述激动剂由(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮表示。
具体实施例方式
实施例1通过测定烟碱受体激动剂与试验化合物的联合作用来评价烟碱受体激动剂功效的改变。一般地，实验方法由下列两步组成，即用试验化合物预处理并一同使用激动剂和试验化合物。进行5-羟基吲哚在500μM浓度下对ACh的浓度范围的实验。首先试验ACh本身以便确定EC50和最大反应。然后与5-羟基吲哚一起使用相同浓度的ACh。结果(见图3)是ACh的最大反应增加(增加的最大幅度为2倍)。
确定5-OHi(0.5mM)对饱和浓度激动剂(3mM ACh)的“曲线下面积”的影响。5-OHi引起曲线下面积的明显增加(增加～400％)(见图4)。
使用5-羟基吲哚本身不诱导注射α7烟碱受体cRNA的卵母细胞产生电流。
实施例2试验5-羟基吲哚对各种烟碱激动剂的影响。由5-羟基吲哚所产生的效果增加见之于所有试验的烟碱激动剂，如(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮(图5)。在有(+)和无(-)调节剂下，ACh(3mM)产生断续的箱式电流。在有(+)和无(-)调节剂下，称为AR-R 17779(μM)的烟碱激动剂产生连续的箱式电流。在该例中调节剂为1mM5-Ohi。
具有类似结果的试验化合物包括(-)烟碱和胆碱(数据未显示)。所以效果对任何胆碱能激动剂来说似乎是普遍的。
实施例3由5-羟基吲哚产生的功效的提高在任何其它烟碱受体，例如，小鼠肌肉型烟碱受体上未观察到。
实施例4试验一系列相关化合物对ACh活性的正调节作用。仅仅有少数化合物保留增强功效的活性。具体来说，5-羟色胺不增强功效。极为相近的类似物的初步分析表明，有相当密切的结构效果关系，暗示该作用有选择性位点。
实施例5通过Ca2+在HEK-293细胞中表达的nAChRα7中的流量，测量nAChRα7调节剂对激动剂活性的影响。使用烟碱激动剂(-)-螺[1-氮杂二环[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。结果显示在图6中。仅仅存在激动剂(没有调节剂)未获得可见的信号。在激动剂和调节剂同时存在时，可见激动剂活性明显增加。
权利要求
1.一种识别烟碱受体激动剂化合物的方法，所述方法包括步骤(a)在细胞表面表达烟碱受体；(b)在烟碱受体激动剂的正性调节剂存在下，将所述烟碱受体与准备测定其烟碱受体激动剂活性的化合物接触；(c)测定是否所述待测化合物显示烟碱受体激动剂活性。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞是非洲蟾蜍属卵母细胞，HEK-293细胞或细胞培养的神经元。
3.权利要求1的方法，其中所述烟碱受体是α7-烟碱受体。
4.权利要求1的方法，其中所述烟碱受体是人、大鼠、鸡、小鼠或牛的烟碱受体。
5.一种可通过权利要求1的方法识别的化合物。
全文摘要
本发明涉及含烟碱受体激动剂正性调节剂的药物组合物，所述正性调节剂具有增强所述烟碱受体激动剂功效的能力。
文档编号A61K45/00GK1637149SQ20041008806
公开日2005年7月13日 申请日期1999年4月28日 优先权日1998年5月4日
发明者D·古尔利, T·兰托恩 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司