专利名称：肽经口输递的改进的制作方法
相关申请本申请基于2003年1月21日提交的第60/441,856号美国临时申请并要求上述申请的优先权。
背景技术：
本发明领域本发明涉及经口给药的肽类药品，其活性化合物包含多种氨基酸和至少一个在它们分子结构内的肽键，并涉及提高这种肽活性化合物经口给药的生物利用度的方法。
相关技术的描述许多人激素、神经递质、细胞因子、生长因子和其它重要的生物化合物都以肽作为它们分子结构的实质部分。许多疾病应答实际是提高患者体内这些肽化合物的水平。治疗有效量的这些生物相关肽可以通过许多方式施用于患者。然而，正如下面将要讨论的，优选的经口给药对于这种类型的活性化合物是很困难的。
例如，鲑鱼降钙素是一种肽类激素，它能够降低钙从骨骼的释放。当被用于处理骨相关疾病或钙疾病(比如骨质疏松症、佩吉特病(乳头乳晕湿疹样癌)、恶性高钙血症等)时，它有帮助维持骨密度的功效。已经分离到许多种降钙素(人降钙素、鲑鱼降钙素、鳗鱼降钙素、依降钙素(elkatonin)、猪降钙素和鸡降钙素)。在这些不同的降钙素类型之间具有显著的结构非同源性。比如、在构成人降钙素和鲑鱼降钙素的氨基酸之间只有50％的一致性。尽管在分子结构上有差异，鲑鱼降钙素能够被用于人类治疗上述钙应答疾病。
另外一种肽类激素的例子是甲状旁腺素(PTH)。PTH是由甲状旁腺产生的，是血钙水平的主要调节剂。PTH是一种多肽，合成的多肽可用Erickson和Merrifield披露的方法制备(The Proteins，Neurath等编，Academic Press，New York，1976，第257页)，并用Hodges等的方法(1988，Peptide Research 1，19)或Atherton，E.和Sheppard，R.C.的方法(Solid Phase Peptide Synthesis，IRL Press，Oxford，1989)修饰。
当血钙降至低于正常水平时，甲状旁腺释放PTH，并通过骨钙的再吸收、通过增加从肠吸收钙、以及通过增加从肾小管内的初生尿液中重吸收钙来提高血钙水平。尽管持续地注入低水平的PTH能够从骨骼中除掉钙，实际上间歇地注射同样的低剂量能够促进骨骼生长。
Tregear在美国专利第4,086,196号中描述了人PTH类似物，并声称，在体外细胞测试中前27到34位的氨基酸在刺激腺嘌呤环化酶上最有效。Rosenblatt在美国专利第4,771,124号中披露了hPTH类似物的性质，其中Trp23被苯丙氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、β-萘丙氨酸或者α-萘丙氨酸取代，可作为PTH拮抗剂。这些修饰过的hPTH类似物有2到6个末端氨基酸被除去，导致被用于治疗骨质疏松时失去最重要的拮抗活性。这些类似物被设计为PTH或者PTH相关的肽类的抑制剂。这些类似物被主张用于治疗与一些肿瘤相关的高钙血症。
Pang等(WO93/06845，1993年4月15日公开)描述了hPTH类似物，其涉及用众多氨基酸取代Arg25、Lys26、Lys27，包括丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或者缬氨酸。据称它们可有效治疗骨质疏松，且对血压和平滑肌的影响最小。
PTH通过激活两种第二信使系统起作用Gs蛋白活化的腺嘌呤环化酶(AC)和Gq蛋白活化的磷脂酶Cβ。后者导致激活膜结合蛋白激酶C(PKC)的活性。已知PKC的活性需要PTH残基29-32(Jouishomme等，(1994)J.Bone Mineral Res.9，(1179-1189))。已经证实骨骼生长的增加，即在骨质疏松的治疗中有用的效应，是与肽序列提高AC活性的能力关联的。天然的PTH序列被证实具有所有这些活性。人hPTH-(1-34)序列通常表示如下Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys HisLeu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys LeuGln Asp Val His Asn Phe-OH(SEQ ID NO1)美国专利5,955,425和6,110,892披露了不同的PTH类似物。下列线性类似物(平头hPTH)、hPTH-(1-31)-NH2只有AC刺激活性，并且被证实在切除卵巢的鼠模型的骨骼重建中是完全活跃的(Rixon，R.H.等，(1994)J.Bone Miner.Res.9，1179-1189；Whitfield等，(1996)，Calcified Tissue Int.58，81-87；和Willick等，美国专利5,556,940)。
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys HisLeu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys LeuGln Asp Val-NH2(SEQ ID NO2)。
在以前的技术中使用的肽类药物通常通过注射或者经鼻给药。胰岛素是一种通常通过经注射给药的肽类药物的例子。一种优选且更方便的经口给药的方式似乎存在问题，因为肽类活性化合物对胃肠的降解很敏感。例如，在以前的技术中报道了当鲑鱼降钙素和甲状旁腺素经口给药时可获得可重复的血药水平的能力，这样的水平是很低的。这被认为是因为这些肽类激素在胃肠道里缺乏足够的稳定性，并且透过肠壁转运到血液中的状况很差。然而注射和经鼻给药比起经口给药，显然更加不方便，且对患者造成更大不适。通常，这种不方便和不适导致患者对治疗方案不顺从。因此，有必要对像胰岛素、鲑鱼降钙素、甲状旁腺素以及其它肽类药物更有效和可重复的经口给药方式在这里更详细的讨论。
胃和肠的蛋白水解酶能够降解肽，使它们在吸收进入血管之前被失活。任何数量的在胃蛋白酶(代表性地具有酸性最适pH范围)水解降解下幸存的肽，后来将遭遇小肠蛋白酶和胰腺分泌的酶(代表性地具有中性至碱性的最适pH范围)。特殊的困难起因于像鲑鱼降钙素这样的肽具有相对大的分子量以及其携带电荷的分布。这可能使鲑鱼降钙素更加难以渗透沿肠壁分布的粘液，或者穿过肠刷状缘膜进入血液。
一种提高经口给药的肽的效力的方式是保护它们免遭胃肠蛋白水解酶，同时又提高它们从肠内的吸收，从而提高它们的生物利用度。改进口服效力在几个原因上是很重要的。首先，肽和蛋白质很贵，不管是用化学合成还是重组DNA技术生产。因此，越是能够增加生物利用度的方法，在治疗药物口服组合物中需要的剂量越少。
其次，口服肽的生物利用度越高，个体吸收的日剂量的变化就越小。
第三，口服肽的生物利用度越高，对于肽产品降解的担心就越少，因为这样的降解产物能够作为肽结合激发生物活性的受体的激动剂或者拮抗剂。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供一种治疗有效的口服药物组合物以便可靠输递药物肽，例如生理活性肽试剂，比如胰岛素、鲑鱼降钙素、甲状旁腺素、加压素或其类似物和这里讨论的其它物质。
本发明的另一个目的是提供提高这些肽的生物利用度的治疗方法。
本发明的再一个目的是提供通过口服施用鲑鱼降钙素或PTH 1-31NH2治疗骨相关疾病和钙疾病的方法。
在一方面，本发明提供一种药物组合物，用于经口输递一种在有生理活性的活性肽试剂，由所述在治疗有效量的活性肽组成，其中所述活性肽在一种非天然酰胺化的位点被酰胺化。
优选的肽活性剂包括但不仅限于胰岛素、加压素、鲑鱼降钙素、胰高血糖素样肽1或2、甲状旁腺素、促黄体素释放激素、促红细胞生成素及其类似物。特别优选的是甲状旁腺素及其类似物。
在另一方面，本方面提供一种提高一种经口输递的治疗性肽活性剂的生物利用度的方法，所述方法包括酰胺化所述肽试剂。
确信本发明能够降低肽活性化合物被蛋白水解降解的可能性，这是通过同时保护肽被(1)胃蛋白酶，其通常在酸性pH下最具活力，(2)肠或者胰腺蛋白酶(通常在碱性至中性pH下最有活力)蛋白水解攻击。
同样，确信本发明由于酰胺化的存在能够促进肽通过肠刷状缘膜进入血液的过程，同时继续保护肽免受蛋白水解降解。
胶囊或者片剂的抗酸性保护涂层保护肽活性剂免遭胃中被酸活化的蛋白酶降解。其后，当药剂进入pH不那么酸性的肠后，肠溶衣溶解，药剂的内含物释放出来。大量的酸(肽活性剂与其混和)降低中性至碱性活化的蛋白酶(例如，鲁米诺或者消化性蛋白酶和刷状缘膜的蛋白酶)的活力，通过降低药剂释放位点的pH至低于它们的最适活力范围。
在下面的详细讨论中本发明其它的特点和优势将更加明显。
发明详述依照本发明，需要采用肽活性成分治疗的患者，被给予一种口服的药物组合物(以合适的剂量)，并非必须但优选地以医药工业的通常大小的片剂或者胶囊的形式。给药的剂量和频率将在下面详细讨论。受益的患者是任何对含肽化合物水平增加有良好反应的遭受疾病的患者。例如，依据本发明口服鲑鱼将钙素能够被用于治疗遭遇钙疾病或者骨骼疾病的患者。例如，通过口服降钙素、口服甲状旁腺素、更优选口服hPTH 1-31NH2和hPTH 1-34NH2本发明能够被用于治疗骨质疏松、佩吉特病、恶性高钙血症以及类似疾病。
依据本发明，鲑鱼降钙素由于众多原因是优选使用的优选活性成分。例如它甚至比人降钙素具有更多优势，即使作为治疗人类疾病的药物试剂。在利用鲑鱼降钙素取代人降钙素治疗人骨质疏松的众多优势包括增强的潜力、无痛觉以及提高的半寿期。鲑鱼降钙素在治疗上比人降钙素更有效，因为它比人降钙素需要的剂量更小。在鲑鱼和人降钙素之间具有明显的非同源性，两种降钙素的氨基酸序列只有50％一致性。
不囿于任何理论，本发明的药物组合物确信能够克服一系列困难和生物利用度不相关的天然屏障。药物组合物的不同成分作用通过适合于各自的机制来克服屏障，导致肽活性成分在生物利用度上的协同效应。
该肽活性化合物能够经口给药。依照本发明，至少一个酰胺基的存在能够保护肽或者蛋白质免受蛋白水解的降解，因此提高了生物利用度。酰胺基也能够提高蛋白质穿过肠内腔的膜渗透性。也可能有其它由于酰胺基的存在提高生物利用度的机制。
存在许多重组生产肽产品的技术，即分子结构中包含大量通过肽键连接的氨基酸的任何化合物。
优选表达载体的综述在美国专利6,210,925中描述了优选的表达载体，该文献被并入本文作为参考。一种优选的表达鲑鱼降钙素的载体的例子显示在美国专利6,210,925的图9中。对于其它肽产品的表达，一个编码目的肽产物的核酸被用于取代编码鲑鱼降钙素的核酸。
优选的表达载体由一个编码区和一个控制区构成。控制区可操纵地连接到编码区，由多个启动子和至少一个核糖体结合区构成，其中至少一个启动子选自tac和lac。
优选地，载体包含多个回文放置的转录盒，每个盒具有一个本发明的控制区和编码区。确信这样的双基因载体或者多基因载体能够比双顺反子或多顺反子表达载体提供更好的表达。这是对双顺反子或者多顺反子的另人惊讶的改进，确信这在以前的技术中没有被暗示。
载体还任选包含编码阻抑肽的核酸，它能够抑制与一个或多个控制区的启动子、一个转录中止子区域、一个选择性标记区域和/或一个编码至少一个分泌增强肽区域相关的操纵子。
许多商业上可获得的载体能够作为本发明优选的启动子的起始启动子。一些本发明的启动子的优选区域可能已经包含在起始启动子，这样获得本发明的启动子需要进行改进的次数相对适度。
控制区控制区可操纵地连接到编码区，由多个启动子和至少一个核糖体结合区构成，其中至少一个启动子是从由包含tac和lac的族群选出。在一个单个控制区前结合一个启动子显著增加编码区产生的产物的产量(正如在内将详细讨论的)。其它启动子在技术中已知，并且能够与一个tac或lac启动子结合使用。这样的启动子包括但不限于lpp、ara B、trp E、gal K。
优选地，控制区严密地由两个启动子构成。当其中一个是tac，那么优选tac启动子在控制区另一个启动子的5’。当其中一个启动子是lac，则lac启动子优选在控制区另一个启动子的3’。同样优选地，控制区由一个tac启动子和一个lac启动子构成，优选lac启动子在tac启动子的3’。
编码区编码区包含连接在编码信号肽的核酸下游阅读框内编码感兴趣的肽产物的核酸，因此编码区编码的肽从N末端到C末端分别包含信号和肽产物。不仅限于理论，确信该信号能够为肽产物提供一些保护，使其免遭蛋白水解降解，除此之外还参与它向周质的分泌。
许多肽信号序列是已知的并可用于本发明。其中包括已详细刻画的宿主细胞外膜蛋白信号序列，和任何能够把肽产物转位到周质的序列以及作为转移的结果被宿主细胞转译后切割的序列。有益的信号肽包括但不仅限于Omp A、pel B、Omp C、Omp F、Omp T、β-la、Pho A、Pho S和Staph A。
肽产物优选应该足够小，因为它利用以前工艺技术需要一种融合伴侣。通常，这样的肽产物的分子量应该小于10KDa。更优选地，肽产物的C-末端为甘氨酸，并且在酶催化反应中作为前体把C-末端的甘氨酸转化为其它酰胺基，这样导致一种酰胺化的肽。这样的转化将在一下更详细讨论。许多生物学上重要的肽类激素和神经递质是这种类型的酰胺化的肽。比如，编码区编码的肽产物可能是鲑鱼降钙素前体或者降钙素基因相关的肽前体，二者都具有C-末端甘氨酸，并且二者都可以酶催化酰胺化成为成熟的鲑鱼降钙素或者成熟的降钙素基因相关肽。
甲状旁腺素类似物也可以依照本发明生产。例如，一种具有甲状旁腺素前34个氨基酸的肽能够给予甲状旁腺素本身相似的功能，与34个氨基酸类似物酰胺化一样。依照这里描述的一种或多种表达系统，后者能够通过表达产生甲状旁腺素开始的34个氨基酸，接下来是第35位甘氨酸。这里讨论的酶催化酰胺化能够把甘氨酸转化为酰胺基。
本发明的优选载体或将在同一宿主中作为本发明载体阻抑物表达的其它载体的其它任选的方面任选地，优选的载体可能包含一种编码阻抑肽的核酸，能够通过至少一个启动子控制抑制表达。或者，然而，编码阻抑肽的核酸可以位于携带本发明的宿主细胞里分开的质粒上。对于许多操纵子在本技术中有适宜的阻抑物。更优选地，编码阻抑物的核酸编码在本发明的优选实体上编码一种lac阻抑物，因为它抑制包含tac和lac启动子的lac操纵子，至少其中一个操纵子是永远位于本发明的优选载体上。
选择性标记许多选择性标记基因中(比如编码卡那霉素抗性的基因)的任何一种位于载体上是优选的。这将允许进行适当的明确的筛选，得到那些有效的被本发明的新型质粒转化或转染的宿主细胞分泌增强肽编码至少一种分泌增强肽的核酸应该位于本发明的质粒上。或者，编码分泌增强肽的核酸可以位于同一宿主中与表达肽产物的质粒独立的质粒上。优选地，分泌增强肽选自SecY(prlA)或prlA-4。需要指出SecY和prlA是一致的，这两个词在本技术中用作同义词。PrlA-4是对prlA的众所周知的改进，并且具有相似的功能。另外一个优选的分泌增强肽是SecE，也被叫做“prlG”，这个词被用作“SecE”的同义词。最优选地，许多分泌增强肽可以被编码，至少其中一个是SecE，另外一个选自SecY(prlA)和prlA-4。据信这二者互相作用帮助肽产物从细胞质到周质的迁移。没有必要限于理论，这些分泌增强肽能够帮助保护肽产物免受细胞质蛋白酶作用，此外还提高它们的分泌功能。
肽和蛋白质的酰胺化，优选在C末端，在下文的示范中给予了口服生物利用度的显著提高。以前的技术指出有生物学活性肽的天然酰胺化能够帮助提高受体结合以及提高这些肽的稳定性(Eipper等，Annu.Rev.Neurosci.，1557-85，1992；Merkler，Enzyme Micob.Technol.，16450-456，尤其是第51页，1994)。通过这些肽的酰胺化给予的生物利用度的显著通过是意料之外的，因为目前的知识指出肽和蛋白质生物利用度起主要的决定性的是分子的位点、二级和三级结构和电荷。
通常，真核细胞的质膜对于大的肽或蛋白是不能渗透的。然而，某些疏水性的基元，如氨基酸、脂肪酸和胆汁酸、以不同名称称为摆渡肽或膜转位序列或基元，当与有功能的蛋白质或肽融合，特别是与N或C末端，能够作为膜转运蛋白，并介导这些蛋白进入活细胞的运输。在本发明中这些膜转运蛋白(MTs)能够至少部分被血液或者淋巴系统的蛋白酶切割。
依据本发明的另一方面，至少一种膜转运蛋白的存在，优选两种MT，更优选两种肽MT能够与MT融合的肽越过肠内腔的膜渗透性并给予改进的生物利用度。既然与MT连接的活性肽能够被血液或者淋巴系统的酶切割，留下的活性肽自由地达到靶点。
同样，依据本发明，肽和膜转运蛋白被胃酶(其中大多数在酸性pH范围有活性)或者胰腺蛋白酶(其中大多数在中性至碱性pH范围有活性)水解降解减少。
再次，不仅限于理论，看起来应该是，依据本发明，肽在适合的抗酸性的保护性媒介物的保护下运输通过胃，充分防止鲑鱼降钙素活其它活性肽与任何可能降解它的胃蛋白酶接触。一旦本发明的药物组合物通过了胃进入肠区域，其中中性至碱性pH占优势，在那里的蛋白酶趋向于碱性至中性pH最适合，肠溶衣活其它媒介物释放肽和酸或者蛋白酶抑制剂(互相之间非常接近)。
酸被认为能够降低肠局部pH(活性剂释放的地方)至低于许多蛋白酶和其它肠酶最合适的范围。pH的降低减少了肠酶的蛋白水解活性，从而为肽和膜转运蛋白提供保护，免遭潜在的降解。这些蛋白酶的活力被本发明提供的暂时的酸性环境降低。提供足够的酸性是优选的，使肠局部的pH暂时降至5.5或更低，优选降至4.7或更低，优选降至3.5或更低。下面描述的碳酸氢钠测试(在标题为“pH降低剂”的部分中)，是对所需酸的量的指示。优选地，降低肠pH的情形要持续一段足够的时间，保护肽试剂和膜转运蛋白免受蛋白水解降解，直至至少其中一些肽试剂有机会穿越肠壁进入血流。对于鲑鱼降钙素，试验证明当活性组分直接注射进鼠的十二指肠、回肠和结肠，鲑鱼降钙素在血液中达到水平的Tmax为5-15分钟。
或者，蛋白酶抑制剂被认为能够降低肠蛋白酶的蛋白水解活性，从而为肽和膜转运蛋白免遭未成熟的潜在降低提供保护。
本发明的组合物能够任选包含吸收增强剂。本发明的吸收增强剂，在降低蛋白水解活力的情形下，能够协同促进肽吸收进入血液。
本发明的机制，被认为是完成提高生物利用度的目标，是通过与药物组合物尽可能同时释放有活性组分实现。到最后，优选的是保持肠溶衣的体积尽可能低，这与提供保护免遭胃蛋白酶一致。从而肠溶衣较少可能干扰肽释放，或者干扰在时间上接近肽释放的其它组分的释放。通常肠溶衣的存在量应该少于剩余的药物组合物(也就是说，除肠溶衣之外的其它药物组合物)的30％。合适的，它应该少于20％，更合适的，肠溶衣添加应该占未涂层的成分重量10％至20％之间。
吸收增强剂应当是一种溶解性增强剂和/或运输增强剂(如下文将要详细描述的)，帮助肽试剂从肠运输进入血液，并能够促进这个过程，所以它最好在降低肠pH和降低肠蛋白水解活力的时间出现。许多表面活性剂能够即作为溶解增强剂，又作为运输(摄取)增强剂。再次如果不仅限于理论的话，确信增强溶解性能够提供(1)本发明活性组分更同时地释放进入肠的水性部分，(2)使肽在肠粘膜层更好地溶解和转运。一旦肽活性成分达到肠壁，一种吸收增强剂能够提供更好地穿越肠的刷状缘膜进入血液，经由细胞间或细胞旁运输。
本发明的药物化合物的每个优选的成分将在下文分开讨论。可以使用多个pH降低剂或者多个增强剂的组合，也可以只使用单一的pH降低剂和/或增强剂。一些优选的组合也将在下文讨论。
肽活性成分依据本发明那些将在经口输递中受益的肽活性称分，包括任何有生理活性的治疗性试剂，和大量氨基酸，并且至少一个肽结合在分子结构上，一个位点能够被酰胺化。肽的酰胺化能够通过化学或者酶方法达到，或者通过二者的组合。酰胺化的优选方法是通过单加氧酶的肽-甘氨酸酰胺化行为。
更优选地，肽当通过重组技术生产时在肽的C末端延伸加上一个甘氨酸，C末端通过酶反应被酰胺化。或者，也可以通过化学反应用合适的氨基酸侧链进行酰胺化。
同样优选地，这些肽活性成分被连接到一个MT序列，促进它们从肠内的吸收。这些MT在被吸收之前必须被保护免遭胃和肠蛋白酶的切割。然而一旦被吸收，MT应该能够至少部分被蛋白酶除去以便让活性肽获得自由。
MT可以由一个氨基酸序列组成，优选由一个信号肽或信号序列。“信号肽”在这里是一个通常、但非必须是大约10到50或更多的氨基酸残基，其中许多(通常大约55-60％)残基是疏水性的，这样它们具有一个疏水的、脂溶性部分。这个脂溶性部分是信号肽共同的、主要部分，从细胞中分泌时经常是信号肽的中心部分。信号肽是一段氨基酸序列，能够促进细胞质蛋白的输出。本发明的信号肽，像这里发现的，同样是“适合进入的”，即能够细胞外部穿透细胞膜进入细胞内部。氨基酸残基能够被变异和/或修饰(也就是能够形成拟态物)，只要修饰不影响肽的转位-媒介功能。因此“肽”这个词包括拟态物，“氨基酸”这个词包括修饰的氨基酸，正如这里使用的，不平常的氨基酸，和D-构型的氨基酸。本发明中所指所有胜任进口的信号肽具有调节从细胞外至细胞内跨膜转运的功能。它们也保持了它们允许蛋白质从细胞输出进入外部环境的能力。一种公认的信号肽能够根据下边这里提供的技术容易对进口活力进行测试，包括测试任何细胞类型的特异性。
下面的表1列举的氨基酸序列，其中每个都能够用作MT。
表1一些MT肽的氨基酸序列及其来源
MT同样能够由脂肪酸和/或胆汁酸组成。这样的分子，使用的时候，与活性肽通过可以被血浆中蛋白酶切割的氨基酸桥连接。或者，MT能够通过非肽连接方式与活性肽连接，在这样的情况下在体内且可连接的酶可以是不同于蛋白酶的酶。氨基酸桥必须是至少一个血浆蛋白酶的切割靶点。血浆蛋白酶以及它们的靶点序列在技术中已知。表2举例说明这些酶中的一些以及它们的具体靶点。
表2血浆蛋白酶和它们的特异靶点
*粗体氨基酸的N末端是蛋白酶的特异切割位点。
本发明通过几种机制，抑制活性组分被蛋白酶降解，而该蛋白酶将可能切割活性肽的一个或多个肽键。
依据本发明，合成的和天然的肽都能够经口输递。本发明中包含的肽活性化合物，包括但不是仅限于胰岛素、加压素、降钙素(不但包括优选的鲑鱼降钙素，也包括其它降钙素)和甲状旁腺素以及它的类似物。其它例子包含降钙素基因相关的肽、黄体生成素释放因子、红细胞生成素、组织血纤维蛋白溶酶原催化剂、人生长激素、促肾上腺皮素(adrenocorticototropin)、各种白细胞介素、脑啡肽胰高血糖素样肽1以及所有类似物。
当使用鲑鱼降钙素时，它更适合由整个药物组合物(除肠溶衣外)总重的0.02-0.2％的相对重量构成。鲑鱼降钙素可以从商业渠道获得(例如从BACHEM、Torrence、Calif.)。或者，它也可以用已知的方法合成，其中一些方法将在下面简要的论述。其它活性肽应该给予更高或更低的浓度，依赖活性化合物目标靶点在血液中浓度，和它在本发明经口输递系统中的生物利用度。
鲑鱼降钙素可以用化学方法或者技术中的重组合成方法制造。其它酰胺化活性肽的前体可以用类似的方式制造。重组细胞生产被认为具有明显的性价比。同样通过技术中已知的方法通过酰胺化反应前体被转化为有活性的鲑鱼降钙素。例如，酶的酰胺化在美国专利4,708,934和欧洲专利申请0 308 067和0 382 403中有描述。重组细胞生产对前体和催化前体成为鲑鱼降钙素的酶都是优选的。这样的重组细胞生产在Biotechnology，卷11(1993)pp.64-70进行了讨论，并进一步描述了把一个前体转化为一种酰胺化的产物。这里报道的重组细胞产物与天然鲑鱼降钙素以及用溶液和固相化学肽合成是一致的。
当MT被连接到本发明的活性肽时，它能够通过化学合成或者技术中已知的重组细胞合成完成。这里采用的“键合”意思是生物活性肽与MT以这样的方式连接，当MT穿过细胞膜时，活性肽也能够穿越细胞膜。这样的连接方式的例子包括(A)通过肽键把MT与活性肽键合在一起，也就是，两个肽(MT的肽部分合活性肽)能够合成在一起；(B)通过非肽共价键把MT键合到活性肽(例如用交联试剂把信号肽与蛋白质结合在一起)；(C)使用化学结合方法在活性肽和像信号肽这样的MT羧基末端之间产生共价键。
方法(A)的例子下面有显示，其中一个肽是采用技术中已知的标准方法合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963；和Lin等，Biochemistry275640-5645，1988)，并以线性方式从氨基末端开始包含一种信号肽(MT)、能够被血浆蛋白酶切割的氨基酸序列和一个生物活性氨基酸序列。这样的肽同样能够通过重组细胞技术生产，从编码所述氨基酸的重组构建表达产生肽(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
对方法(B)，或者利用像所述肽键，或者使用非肽共价键，把MT与生物活性肽、多肽或蛋白质连接。这个非肽共价键可以通过技术中的标准方法形成，例如把MT与肽、多肽或蛋白质通过一种交联试剂，如戊二醛，连接起来。这样的方法在技术中是标准的(Walter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 775197；1980)。
对于方法(C)，标准的化学结合方法，例如化学交联剂，能够被用来与信号肽的羧基末端互相作用。这样的方法在技术中是标准的(Goodfriend等，Science1431344；1964，用水溶性的二酰亚胺作为结合试剂)，能够容易地把信号肽的羧基末端与任何选出的生物活性分子连接。
例如，优选的重组细胞鲑鱼降钙素(rsCT)可在大肠杆菌中用谷胱甘肽-S-转移酶生产作为可溶性融合蛋白的甘氨酸延伸的鲑鱼降钙素前体与来制造。甘氨酸延伸的前体分子结构，除C-末端外与活性鲑鱼降钙素一致(鲑鱼降钙素以-pro-NH2结束，而前体以-pro-gly结束。所述出版物中描述的α-酰胺化酶催化前体转化成鲑鱼降钙素。该酶更适合以重组方法生产，例如在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞里)，正如在上面引用的生物工艺学文章里提到的。其它的气体到其它的酰胺化肽也可以用类似方法生产。
未天然酰胺化的肽也能够用类似的方式生产，依照本发明以类似的方式酰胺化。
pH降低剂和蛋白酶抑制剂每次施用鲑鱼降钙素时给予的pH降低化合物的总量优选是，当它被释放进入肠时，应该足以把肠pH显著降至低于那里的蛋白酶的最适pH。需要的量应该必要根据几个因素变化，包括使用的pH降低剂的类型(将在下面讨论)和特定的pH降低剂提供的等价的质子。试剂上，所需的能够提供良好生物利用度的量应该是，当加入10ml0.1M碳酸氢钠溶液中，碳酸氢钠溶液的pH降至不高于5.5，优选降至不高于4.7，更优选降至不高于3.5。在前述测试中，在有些实施方案中也许要用足够的酸使pH降至不高于2.8。在本发明中，药物化合物中使用的pH降低剂优选至少300mg，更优选至少400mg。前述的参数选择与所有pH降低剂总重量相关，这样的试剂可能是两到更多种联合使用的。口服的组合物不应该包含任何量的碱，当其与pH降低化合物一起释放时将阻止所述碳酸氢钠测试的pH降至5.5或更低。
本发明的pH降低剂应该是任何制药学上可接受的化合物，在胃肠道种无毒，并能够输递氢离子(一种传统的酸)或降低局部环境的高氢例子含量。也可以是这些化合物的组合。在本发明种优选的至少一种pH降低剂的pKa不高于4.2，优选不高于3.0。在室温下pH降低剂在水中的溶解度至少为每30g/100ml水是合适的。
导致较高氢离子含量的化合物的例子包括氯化铝和氯化锌。制药学上可以接受的传统酸包括、但不仅限于氨基酸的酸式盐(例如，氨基酸盐酸盐)或者相关衍生物。这些例子有下列的酸式盐乙酰谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甜菜碱、肉碱、肌肽、瓜氨酸、肌氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、亚牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲基组氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、丝氨酸、氨基乙磺酸(taurine)、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
其它包括羧酸的有用的pH降低化合物如乙酰水杨酸、乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、延胡索酸、葡糖醛酸、戊二酸、甘油酸、羟乙酸(glycocolic acid)、乙醛酸、异柠檬酸、异戊酸、乳酸、马来酸、草酰乙酸、草酰琥珀酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸、戊酸等。
其它有用的pH降低剂有，可能在技术中通常不被称为“酸”，尽管如此但是它们依据本发明是有用的，磷酸酯(举例说，果糖1，6二磷酸、葡萄糖1，6二磷酸、磷酸甘油酸和二磷酸甘油酸)、CARBOPOL(BF Goodrich的商标)和像聚卡波菲这样的聚合体也能够用于降低pH。
任何pH降低剂的组合，能够在所述碳酸氢钠测试中把要求pH降至不高于5.5，都可以使用。一种优选的实施方案，利用至少一种药物组合物里的pH降低剂，一种选自柠檬酸、酒石酸和氨基酸盐的酸。
当鲑鱼降钙素作为肽活性剂，确定比率的pH降低剂和鲑鱼降钙素被证实特别有效。优选的pH降低剂跟鲑鱼降钙素的重量比超过200∶1，优选为800∶1，更优选为2000∶1。
作为使用pH降低剂的可供选择的方法或补充是使用蛋白酶抑制剂，特别是肠蛋白酶的抑制剂。下列表3列举一些已知的肠蛋白酶抑制剂。
表3肠蛋白酶和它们的特异位点
任选成分-吸收增强剂当使用时，吸收增强剂在量上最好占重量的0.1-20％，相对于药物组合物的全部重量(除肠溶衣外)。优选的吸收增强剂时表面活性剂，既能够作为溶解性增强剂有能够作为吸收增强剂。一般来说，“溶解性增强剂”既提高本发明中组分在它们最初释放的水环境又提高在肠壁的粘膜外层的亲脂性环境的溶解，或者二者皆提高。“运输(摄取)增强剂”(通常跟作为溶解性增强剂一样的表面活性剂)是那些能够帮助肽试剂穿越肠壁的。
一种或多种的吸收增强剂只能执行一项功能(例如溶解性)，或者一种或多种的吸收增强剂只能执行一项功能(例如摄取)，不超出本发明的范围。同样可能的是若干化合物的混合物，其中一些提供改进的溶解性，一些提供改进的摄取和/或一些完成这两项任务。如果不仅限于理论，相信摄取增强剂作用是(1)提高肠壁外膜的疏水区紊乱，允许增加的细胞间运输；或(2)滤去膜蛋白导致增加的细胞间运输；或(3)扩展细胞间孔的半径增加细胞旁运输。
表面活性剂被认为既可以作为溶解性增强剂又可作为吸收增强剂。例如，去垢剂用于(1)使所有活性组分快速溶解到它们最初释放的水性环境里，(2)提高本发明的组分的亲脂性，特别是肽活性剂，帮助它进入和穿越肠粘膜，(3)提高正常极性肽活性剂穿越刷状缘膜上皮屏障的能力，(4)提高细胞间或细胞旁运输，如上文所述。
当表面活性剂被作为吸收增强剂时，最好它们是自由流动的粉末，在制造过程中促进混和与胶囊的装填。由于鲑鱼降钙素和其它肽的固有特性(举例来说，它们的等电点、分子量、氨基酸组成，等等)，最好某些表面活性剂与某些肽互相作用。确实，有些能够不合需要地与鲑鱼降钙素的带电荷部分互相作用，阻止其吸收，因此意想不到的导致生物利用度的降低。最好在尝试提高鲑鱼降钙素和其它肽的生物利用度时，任何作为吸收增强剂的表面活性剂从这些构成的组中选出(1)是阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂是胆固醇衍生物(如胆汁酸)；(2)阳离子表面活性剂(如酰基肉碱、磷脂以及类似物)；(3)非离子性表面活性剂；和(4)阴离子表面活性剂(特别是那些具有直链烃区域的)与负电荷中和剂的化合物。负电荷中和剂包括但不限于酰基肉碱、十六烷基吡啶盐酸以及类似物。同样优选的是吸收增强剂在酸性pH下能够溶解，特别是在3.0-5.0范围内。
一个效果很好的特别适合的组合是将鲑鱼降钙素与阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂(所述阴离子表面活性剂是胆固醇衍生物)混和，二者在酸性pH都是可溶性的。
一个特别适合的组合是酸溶解的胆汁酸与一种阳离子表面活性剂。酰基肉碱和蔗糖酯是一种好的组合。当使用一种单独的吸收增强剂时，它最好是一种阳离子表面活性剂。酰基肉碱(如十二烷基肉碱)、磷脂和胆汁酸都是特别好的吸收增强剂，特别是酰基肉碱。在有些实施方案中也使用胆固醇衍生物这样的阴离子表面活性剂。这些参数选择的目的是避免与肽试剂的相互作用，干扰肽试剂进入血液的吸收。
为降低副作用的可能性，优选的去垢剂，当作为本发明的吸收增强剂时，应当或者生物可降解、或者可再吸收(例如，生物学上可再循环的化合物如胆汁酸、磷脂和/或酰基肉碱)，更优选的是生物可降解的。酰基肉碱被认为在提高细胞旁运输中特别有用。当胆汁酸(或者另外的缺乏直链烃的阴离子去垢剂)与一种阳离子去垢剂结合使用，鲑鱼降钙素能够更好地被运输运输进入和穿过肠壁。
优选的吸收增强剂包括(a)水杨酸类，如水杨酸钠、3-甲氧基水杨酸、5-甲氧基水杨酸和高香兰酸盐(homovanilate)，(b)胆汁酸类，如牛磺胆汁酸、牛磺脱氧胆汁酸、脱氧胆汁酸、胆汁酸、羟乙酸(glycholic)、石胆汁酸、鹅胆汁酸、熊去氧胆汁酸、熊胆汁酸、脱氢胆汁酸、梭链孢酸等等，(c)非离子表面活性剂，如聚氧乙烯醚(如Brij36T，Brij52，Brij56，Brij76，Brij96，Texaphor A6，Texaphor A14，Texaphor A60等等)、p-t-辛基酚聚氧乙烯(Triton X-45，Triton X-100，TritonX-114，Triton X-305等等)、壬基苯氧基聚氧乙烯(如Igepal CO系列)、聚氧乙烯山梨醇酯(如Tween-20，Tween-80等)，(d)阴离子表面活性剂，如二辛基磺基琥珀酸钠，(e)溶血磷脂，如溶血卵磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺，(f)酰基肉碱、酰基胆碱和酰基氨基酸，如月桂酰基肉碱、肉豆蔻酰基肉碱、棕榈酰基肉碱、月桂酰胆碱、肉豆蔻酰胆碱、棕榈酰胆碱、十六烷基赖氨酸、N-酰基苯基丙氨酸、N-酰基甘氨酸等等，(g)水溶性磷脂，(h)中链甘油酯，是单、二、三甘油酯的混合物，含有中等链长度的脂肪酸(辛酸、癸酸和月桂酸)，(i)乙二胺四乙酸，(j)阳离子表面活性剂，如十六烷基吡啶胆碱，(k)聚乙二醇的脂肪酸衍生物，如Labrasol、Labrafac等等，(l)烷基糖，如月桂醇麦芽糖苷、月桂酰蔗糖、肉豆蔻酰蔗糖、棕榈酰蔗糖等等。
在一些优选的实施方案中，没有必要限于理论，阳离子离子交换试剂(如去垢剂)被包含进来，通过另外可能的机制提供溶解性增加。特别地，它们可能阻止鲑鱼降钙素或者其它肽活性剂结合到粘液。优选的阳离子离子交换试剂包括精蛋白氯化物或任何其它的聚阳离子。
其它任选的成分优选地，一种水溶性屏障把蛋白酶抑制剂和/或pH降低剂与抗酸性保护载体隔开。一种常规的药物胶囊能够用于此目的，提供这个屏障。许多文中已知、但不仅限于这些的水溶性屏障包括羟基丙基甲基纤维素和常规的药用凝胶。
在一些优选的实施方案中，另外的肽(例如白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、其它植物或动物性蛋白以及类似物)被包含进来以降低非特异性吸收(举例来说，肽结合到肠粘液屏障上)，在这方面降低了昂贵的肽活性剂的必须浓度。当添加时，肽最好占药物组合物总重的相对重量的1.0-10.0％之间(不包括保护性载体)。第二个肽更优选是没有生理活性的，最好是一种食物性肽，如大豆肽或者类似的。并非仅限于理论，第二个肽也可能增强生物利用度，通过作为蛋白酶清道夫，在与蛋白酶的相互作用中与肽活性剂竞争。第二个肽也可以帮助活性化合物通过肝脏。
本发明的所有药物组合物能够任选包含普通药物稀释剂、助流剂、润滑剂、凝胶胶囊、防腐剂、着色剂以及类似物，以它们通常的尺寸和量。
保护性载体任何运载器或载体，它能够帮助肽活性剂与胃蛋白酶隔离，然后溶解，所以本发明的其它成分能够释放到肠中，都是合适的。在技术中已知许多肠溶衣，并且根据本发明是有用的。这些例子包括醋酸纤维素酞酸酯、羟丙基甲基乙基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、羧甲基乙基纤维素和甲基丙稀酸-甲基异丁烯酸酯的共聚物。在一些实施方案中，活性酞、吸收增强剂如溶解和/或摄取增强剂以及pH降低化合物，包含在一种足够粘稠的保会性糖浆，允许本发明的组分保护性通过胃。
适当的肠溶衣，用于保护肽试剂接触胃蛋白酶，比如，应该在本发明中剩余的组分装填胶囊以后应用于胶囊。在其它实施方案中，肠溶衣涂在片剂的外面，或者涂在活性组分颗粒的外表面，然后压制成片剂状或装填到胶囊，而它最好也涂上一层肠溶衣。
非常想要的效果是本发明的所有组分尽可能同时从运载器或载体释放、并且在肠环境中溶解。优选的是载体或运输器在小肠释放活性组分，在这里提高细胞间或细胞旁运输的摄入增强剂，比同样的摄入增强剂在结肠内释放引起不必要副反应的可能性小。无论如何，要强调的是本发明被证实在结肠内和在小肠内同样有效。许多的载体或运输器，除所述之外，在本文中已知。保持肠溶衣低是令人期待的(特别是在最优化本发明的组分同时释放时)。优选地，添加的肠溶衣不超过剩余药物组合物重量的30％(“剩余”指排除肠溶衣自身的药物组合物)。更优选地，添加不超过20％，特别是占未涂层的组合物的12％至20％。肠溶衣应该是足够的，以防止本发明的药物组合物在0.1N HCl两种小时后崩解，然后当pH在溶解水浴中升高到6.3、在水浴中所述组合物以100rpm的速度旋转，能够允许药物组合物的所有内含物在30分钟释放。
其它参数最好pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂与吸收增强剂(当有的话)的重量比在3∶1到20∶1，更好的是4∶1至12∶1，最好在5∶1至10∶1。在特定的药物组合物中所有pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂的总重和所有吸收增强剂的总重，包含在前述的适宜比例里。例如，如果一种药物组合物包括两种pH降低剂和三个吸收增强剂，所述比例将按两种pH降低剂结合的重量以及三个吸收增强剂结合的总重计算。
最好pH降低和/或蛋白酶抑制剂、肽活性剂和吸收增强剂(当存在的话)(不管是单一化合物还是每个种类的许多化合物)，均匀分布在药物组合物内。在一种实施方案中，药物组合物由包含一种药物粘合剂的颗粒组成，肽活性剂、pH降低剂和吸收增强剂均匀混合在所述粘合剂内。优选的颗粒同样应该由一种酸性核心组成，环绕一层均匀的有机酸，一层增强剂和一层肽被外面的有机酸环绕。颗粒可以从水性混合物制造，混合物由药物粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素与本发明的pH降低、吸收增强剂和肽活性剂一起构成。
制造过程本发明优选的药物组合物包含一种OO大小的胶囊，用与MT连接的0.25mg鲑鱼降钙素、400mg颗粒状柠檬算(例如可从Archer Daniels Midland Corp获得)、50mg牛脱氧胆汁酸(例如可从SIGMA获得)、50mg酰基肉碱(SIGMA)填充。
所有的组合物最好最后封装进明胶胶囊，并且最好是粉末状以便以任何状态添加到搅拌机。其后，搅拌机开启三分钟，直至粉末彻底混合。然后混合的粉末装填进明胶胶囊的大的一端。然后添加另一端，接着快速关闭胶囊，500个或者更多的胶囊可以加入到一种涂层装置(例如，Vector LDCS 20/30 Laboratory DevelopmentCoating System(可获自Vector Corp.，Marion，Iowa))肠溶衣溶液按下列方法制备称量500g EUDRAGIT L30 D-55(一种甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的共聚物，一种肠溶衣，可从RHM Tech Inc.，Maidan，Mass获得)。添加411g蒸馏水，15g三乙基柠檬酸和38g滑石粉。这样量的料足够500个OO大小的胶囊涂层。
胶囊称重然后置于涂层机器的鼓室。开启机器以24-28rpm转动鼓室(现在包含胶囊在里面)。入口喷嘴的温度最好在大约45℃。排气温度在大约30℃。未涂层的胶囊温度最好在25℃左右。空气流量为每分钟38立方英尺。
然后从机器伸出一根管子插入所述方法制备的涂层溶液。开启泵为涂层装置供应溶液。然后自动进行涂层。机器可以在任何时候停止，称量胶囊决定料的量是否足够。通常涂层被允许进行60分钟。然后关闭泵大约5分钟，而机器仍在运转以帮助干燥涂层的胶囊。然后关闭机器，胶囊的涂层完成，虽然推荐胶囊在空气中干燥两天。
由于本发明提供的增强的生物利用度，本方面药物组合物中昂贵的鲑鱼降钙素的浓度可以保持相对较低。特定制剂的例子将在下文示出。
患者的治疗当选择鲑鱼降钙素作为治疗骨质疏松的活性组分，推荐采用周期给药。在男子中经皮下给药后鲑鱼降钙素被快速代谢，半寿期大约为20-40分钟。然而它在破骨细胞上有益的效果持续时间长的多，能够持续超过24h，尽管血液中水平下降迅速。通常以常规剂量注射鲑鱼降钙素超过两小时将检测不到血药水平。因此优选的剂量是每周5天的给药周期。皮下给药鲑鱼降钙素(100IU)常常导致在血浆中峰值浓度为250pg/ml。经鼻给药降钙素(200IU)被证明在峰值低至10pg/ml时对骨质疏松症有效。有些患者报告在高峰值水平上(例如，在或超过200pg/ml)有一些胃肠不适。因此，血浆中鲑鱼降钙素的峰值优选在10-150pg/ml之间，更优选在10-50pg/ml之间。血浆水平可以用已知的放射性免疫测定技术测量。主治医生应该检测患者的反应、鲑鱼降钙素水平、或者骨骼疾病的取代标记(如尿的吡啶啉或脱氧吡啶啉)，特别是治疗的初始阶段(1-6个月)。他应该根据个别患者的代谢和反应稍微改变剂量。
最好每次施用一种单一的胶囊，因为单一的胶囊能够最好地给予多肽、pH降低剂和吸收增强剂的同时释放。这是很值得的，因为当酸在时间上与多肽的释放很接近时，能够最好地降低对多肽的不必要的蛋白水解攻击。接近同时的释放，能够通过把本发明的所有组分在单一的药丸或胶囊中给药最好地实现。然而，本发明还包括，例如，当使用时将酸和增强剂的所需量分置在两个或多个胶囊内，这些胶囊可一起施用，这样它们便可提供所有成分的需要量。“药物组合物”在这里包括一种尤其适合给予人类患者的完整的剂量，它可随意细分，只要实际上可同时施用即可。
实施例1-羧基末端酰胺化对口服鲑鱼降钙素(sCT)生物利用度的影响在一种狗模型上进行了一项研究以比较口服输递甘氨酸延伸的sCT(sCTgly)与酰胺化的sCT(sCT-NH2)的药代动力学参数。
8只体重在12-16千克之间的成年雄性小猎犬被用于该研究。狗在口服给药测试的肽前晚禁食，但允许自由接近水。每只狗在进行试验前的洗胃时间至少为1周。每只狗经口给予有肠溶衣的明胶胶囊，第1周其中包含1.11mg sCTgly，第二周为1.11mg sCT-NH2。每个胶囊的总的成分显示在表4中。在给予胶囊之前，用一种20规格的静脉内(IV)导管插入臂静脉收集血样。从臂静脉收集每只狗两次服药前3ml的血样。
表4sCT-gly和sCTNH2胶囊的成分
给予胶囊后，以15分钟的间隔从臂静脉收集3ml血样，直至给药后240分钟。血液样品收集进新的肝素化的Monovette取样注射器。样品置于冰上，然后在2-8℃约2750rpm离心10分钟。血浆上清转至色彩编码的小离心管中，贴上时间点的标签，在分析确定sCTgly或sCT-NH2的浓度前冷冻储存在-20℃。
血浆中sCTgly的浓度使用Peninsula实验室的RIA试剂盒用放射性免疫测定方法确定。血浆中sCT-NH2的浓度使用Diagnostic Systems Laboratories公司的试剂盒用夹心ELISA免疫测定方法测定。从血浆中sCTgly或sCT-NH2的药物代谢动力学曲线，Cmax(血浆浓度峰值pg/ml)和AUC(曲线下面积)被确定。所有测定的数值对于两种肽中任何一种在1mg剂量上规格化。这些参数中每个的平均值显示在表5。
表5
C末端为酰胺基的sCT的平均Cmax是sCTgly的6.6倍。平均AUC，是生物利用度的间接测量，对于sCT-NH2是sCTgly的5.9倍。所以，对这两种肽，它们除在C末端存在一种甘氨酸或一种酰胺基外是一致的，在经口输递以后血浆中测定到的肽的量具有很大的差异，这可以直接规因于C末端酰胺基的存在。
实施例2-甲状旁腺素酰胺化和非酰胺化类似物生物利用度的比较在一种狗模型上进行两个分开的研究，确定经口输递PTH类似物的药代动力学参数。在第一个试验中采用PTH1-34-OH。在第二个试验中，采用一种较小的类似物PTH1-31NH2。除在大小上的小差别，这两种分子主要的区别是那个1-34肽在C末端具有游离酸，而1-31肽在C末端被酰胺化。
8只重量在12-16千克之间的成年雄性小猎犬被用于PTH1-34-OH试验。在PTH1-31NH2试验中，使用6只同样的狗。狗在口服给药测试的肽前晚禁食，但被允许自由接近水。每只狗在进行试验前的洗胃时间至少为1周。每只狗经口给予有肠溶衣的明胶胶囊，其中在第一个试验中包含2.64mg PTH1-34-OH，在第二个试验中包含2.38mg PTH1-31NH2。每个胶囊的所有成分显示在表6。在给予胶囊前，一种20规格的静脉内支架插入臂静脉以收集血样。从臂静脉中收集两次给药前的每个3ml样品。
表6PTH1-34-OH和PTH1-31NH2胶囊的成分
给予胶囊后，以15分钟的间隔从臂静脉收集3ml血样，直至给药后240分钟。血液样品收集进新的肝素化的Monovette取样注射器。样品置于冰上，然后在2-8℃约2750rpm离心10分钟。血浆上清转至色彩编码的小离心管中，贴上时间点的标签，在分析确定PTH1-34-OH或PTH1-31NH2的浓度前冷冻储存在-20℃。
血浆中PTH1-34-OH的浓度使用Peninsula实验室的RIA试剂盒用放射性免疫测定方法确定。血浆中PTH1-31NH2的使用Unigene Laboratories开发的竞争ELISA免疫测定方法定量。从血浆中PTH1-34-OH或PTH1-31NH2的药物代谢动力学曲线，Cmax(血浆浓度峰值pg/ml)和AUC(曲线下面积)被计算出来。这些参数中每个的平均值显示在表7。
表7
*调整至1mg剂量PTH1-31NH2的Cmax平均值是PTH1-34-OH的6.25倍。平均AUC，是生物利用度的间接测量，对于PTH1-31NH2来说大9.8倍。尽管PTH1-31NH2的分子比PTH1-34-OH小3个氨基酸，这两种肽在分子量上的小差异(分别是3718Daltons和4118Daltons)并不能解释它们在生物利用度上的差别。因此，这两种肽之间的重要区别是C末端酰胺基的存在与否。
实施例3-用十二指肠内给药的鼠比较有或无氨基末端的甲状旁腺素PTH1-34类似物的生物利用度雌性Sprague-Dawley鼠(250-275g)(对于PTH1-34-OH n＝6，对于PTH1-34NH2n＝7)在颈动脉插入套管前用克他命和甲苯噻嗪麻醉。套管被装到一种三通的阀门，通过它可以采集血液并用生理盐水代替。在腹部做中线切开，0.5ml药剂被直接注射进暴露的十二指肠。每个肽制剂中含有柠檬酸(0.5M)、月桂酰基肉碱(10mg/ml)、鲑鱼降钙素(作为内部标记)和PTH1-34-OH或PTH1-34NH2(0.5mg/ml)。在给药前和给药后5、15、30、60和120分钟收集血液(0.5ml)。血液样品2600g离心10分钟，得到的血浆上清贮存于-20℃。血浆中肽的浓度用竞争性酶联免疫测定法(ELISA)测定。绝对生物利用度(即相对于每个肽的静脉内剂量)从PTH1-34-OH和PTH1-34NH2血浆浓度功能时间获得的曲线的曲线下面积计算得到。
PTH1-34-OH和PTH1-34NH2在给药5分钟后从鼠十二指肠快速吸收。PTH1-34-OH的最大浓度是3.05ng/ml，PTH1-34NH2的是26.7ng/ml，是PTH(1-34)游离酸形式的接近9倍。60分钟后，PTH 1-34NH2的浓度仍然是PTH1-34-OH的接近9倍(表8)。PTH1-34NH2的绝对生物利用度是3.68％，PTH 1-34-OH的是0.45％。这些结果显示C末端的OH基团被酰胺基代替后，血浆中最大肽浓度提高了8.75倍，而PTH1-34的绝对生物利用度提高8.2倍。
表8C末端酰胺化对PTH1-34药代动力学曲线的影响
实施例4-C末端氨基对LHRH在鼠十二指肠吸收的影响对于C末端酰胺化对促黄体素释放激素(LHRH-NH2)在被麻醉鼠十二指肠的吸收进行检验。在这个试验中比较LHRH-NH2(一种天然产生的C末端酰胺化的十肽)和LHRH-COOH(一种与LHRH-NH2氨基酸序列除C末端外相同的十肽，但LHRH-COOH的C末端是gly-COOH而不是gly-NH2)的吸收特征。十二只鼠被麻醉并在颈动脉植入一个套管，用于在不同时间采集血样。6只鼠用27号针在十二指肠注射0.5M柠檬酸和酰基肉碱(10mg/mL)中的LHRH-NH2(5mg/mL)，6只鼠用同样的配方注射0.5mLLHRH-COOH)(5mg/mL)。血样在给予LHRH-NH2或LHRH-COOH前和给药后5、15、30、60和120分钟收集。得到的血浆样品分析LHRH-NH2或LHRH-COOH，用装备荧光检测器的HPLC检测血浆中肽浓度。给药5分钟后血浆中检测到酰胺化和未酰胺化LHRH的最大浓度(Cmax)。尽管两种形式的LHRH以相同的量给药小鼠，在5分钟后在血浆中检测到比游离酸形式LHRH-COOH多5倍的酰胺化LHRH，LHRH-NH2(表9)。曲线下面积(AUC)，对肽吸收程度和生物利用度的衡量，酰胺化的LHRH比游离酸形式的LHRH大6倍(表9)。这些结果表明酰胺化的制剂，包含一种酸和一种增强剂，比非酰胺化肽的生物利用度大。
表9C末端酰胺化对鼠十二指肠吸收LHRH的影响
尽管已根据特定的实施方案描述了本发明，但许多其它的变更和修饰和其它的用途对于那些熟练的操作者是很明显的。因此本发明并不仅限于这里明确的揭示，而只限于权利要求。
权利要求
1.一种经口输递生理活性肽试剂的药物组合物，其包含治疗有效量的所述活性肽，其中，所述活性肽在一个非天然酰胺化的位点被酰胺化。
2.如权利要求1所述的药物组合物，进一步包含至少一种药学上可接受的pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂。
3.如权利要求2所述的药物组合物，进一步包含一种抗酸性保护性载体，该载体可有效运输所述药物组合物通过患者的胃，同时防止所述活性肽试剂与胃蛋白酶接触。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述活性肽试剂在C末端被酰胺化。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中，所述肽被制备成甘氨酸延伸的前体且随后被转化成C末端酰胺基团。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述活性肽包含一种含有酰胺化侧链的氨基酸。
7.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述pH降低剂在所述药物组合物中以一定量存在，如果在所述组合物中加入10毫升0.1M的碳酸氢钠溶液，所述量足以使所述溶液的pH降至不高于5.5。
8.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述pH降低剂在所述药物组合物中以一定量存在，如果在所述组合物中加入10毫升0.1M的碳酸氢钠溶液，所述量足以使所述溶液的pH降至不高于3.5。
9.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述蛋白酶抑制剂是一种胃和/或肠蛋白酶抑制剂。
10.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述蛋白酶抑制剂抑制一种选自下列酶的酶胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶和羧肽酶。
11.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述活性肽试剂连接到至少能够在体内被酶部分切割的膜转运蛋白。
12.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述保护性载体的存在量不超过所述剩余药物组合物重量的30％。
13.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述保护性载体的存在量不超过所述剩余药物组合物重量的20％。
14.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述保护性载体的存在量在所述剩余药物组合物重量的10％至20％之间。
15.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述保护性载体足以防止所述药物组合物在至少2小时内在0.1N HCl中崩解，但是允许所述药物组合物所有内含物在所述组合物以每分钟100转旋转的分解水浴中在pH上升到6.3后在45分钟内全部释放。
16.如权利要求3所述的药物组合物，进一步包含至少一种有效促进所述活性剂生物利用度的吸收增强剂。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述吸收增强剂是表面活性剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中，所述表面活性剂是可吸收或可生物降解的。
19.如权利要求17所述的药物组合物，其中，所述表面活性剂选自酰基肉碱、磷脂和胆汁酸。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述增强剂是酰基肉碱。
21.如权利要求20所述的药物组合物，进一步包含一种蔗糖酯。
22.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述吸收增强剂选自(i)一种阴离子试剂，所述阴离子试剂是胆固醇衍生物，(ii)一种负离子中和剂和阴离子表面活性剂的混合物，(iii)非离子表面活性剂，和(iv)阳离子表面活性剂。
23.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述吸收增强剂选自阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂是胆固醇衍生物。
24.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含至少两种吸收增强剂，其中一种是阳离子表面活性剂，另外一种是阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂是胆固醇衍生物。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其中，所述阴离子表面活性剂是酸可溶的胆汁酸。
26.如权利要求1所述的药物组合物，进一步包含一定量的第二种肽，该肽不是有效提高所述肽活性剂生物利用度的生理活性肽。
27.如权利要求3所述的药物组合物，进一步包含一种能够隔离所述pH降低剂和所述保护性载体的水溶性屏障。
28.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述组合物包含至少一种pKa不高于4.2的pH降低剂。
29.如权利要求2所述的药物组合物，其中，至少一种pH降低剂在水中的溶解度为室温下每100ml水至少溶解30g。
30.如权利要求3所述的药物组合物，其中，除保护性载体外所有成分均匀分布。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含含有药物粘合剂的颗粒以及均匀分布在所述粘合剂中的所述pH降低剂、所述吸收增强剂和所述肽活性剂。
32.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述组合物呈固体剂型，其中，所述pH降低剂与所述吸收增强剂的重量比在3∶1至20∶1之间。
33.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述组合物呈固体剂型，其中，所述pH降低剂与所述吸收增强剂的重量比在5∶1至10∶1之间。
34.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述pH降低剂选自柠檬酸、酒石酸和氨基酸的酸式盐。
35.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述pH降低剂在量上不少于300mg。
36.如权利要求35所述的药物组合物，其中，所述pH降低剂在量上不少于400mg。
37.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽试剂是人胰高血糖素样肽1、人胰高血糖素样肽2或其类似物。
38.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽试剂是鲑鱼降钙素。
39.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽试剂是胰岛素。
40.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽试剂是人甲状旁腺素或其类似物。
41.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽试剂是人甲状旁腺素类似物PTH 1-31NH2。
42.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述肽试剂是人甲状旁腺素类似物PTH 1-34NH2。
43.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述保护性载体是粘稠的保护性糖浆。
44.如权利要求34所述的药物组合物，其中，一种水溶性屏障把所述pH降低剂和所述保护性载体分开。
45.一种提高经口输递的生理活性肽试剂的生物利用度的方法，所述方法包括(A)酰胺化所述肽试剂；和(B)经口施用所述肽试剂。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述肽活性剂，在所述肽活性剂、pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂在能够充分阻止胃蛋白酶和所述肽试剂接触的抗酸性保护载体的保护下通过所述患者的口腔和胃后，与至少一种pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂一起选择性释放到患者肠内。
47.如权利要求45所述的方法，其中，所述活性肽试剂在C末端被酰胺化。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述甘氨酸被制备成甘氨酸延伸前体且随后被转化成C末端酰胺基。
49.如权利要求45所述的药物组合物，其中，所述活性肽在氨基酸侧链酰胺化。
50.如权利要求46所述的方法，其中，所述pH降低剂在所述药物组合物中以一定量存在，如果在所述组合物中加入10毫升0.1M的碳酸氢钠水溶液，所述量足以使所述溶液的pH降至不高于5.5。
51.如权利要求46所述的方法，其中，所述pH降低剂在所述药物组合物中以一定量存在，如果在所述组合物中加入10毫升0.1M的碳酸氢钠水溶液，所述量足以使所述溶液的pH降至不高于3.5。
52.如权利要求46所述的方法，其中，所述蛋白酶抑制剂是一种胃和/或肠蛋白酶抑制剂。
53.如权利要求46所述的方法，其中，所述蛋白酶抑制剂抑制一种选自下列酶的酶胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶和羧肽酶。
54.如权利要求46所述的方法，其中，所述肽活性剂释放到患者肠内是在至少一种有效促进所述肽活性剂的生物利用度的吸收增强剂存在时进行的。
55.如权利要求45所述的方法，其中，所述活性肽是人胰高血糖素样肽1、人胰高血糖素样肽2或其类似物。
56.如权利要求45所述的方法，其中，所述肽试剂是鲑鱼降钙素。
57.如权利要求45所述的方法，其中，所述肽试剂是胰岛素。
58.如权利要求45所述的方法，其中，所述肽试剂是人甲状旁腺素或其类似物。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述肽试剂是人甲状旁腺素类似物PTH1-31-NH2。
60.如权利要求58所述的方法，其中，所述活性肽是人甲状旁腺素类似物PTH1-34-NH2。
61.如权利要求45所述的方法，其中，所述活性肽是促黄体素释放激素。
62.如权利要求45所述的方法，其中，所述酰胺化在非天然酰胺化的位点进行。
63.如权利要求45所述的方法，其中，所述生物利用度的提高是肠内吸收增强的结果。
64.一种经口输递生理活性促黄体素释放激素的药物组合物，其包含(a)治疗有效量的所述激素；(b)至少一种药物学上可接受的pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂；和(c)一种有效运输所述药物组合物通过患者的胃同时防止所述活性肽试剂与胃蛋白酶接触的抗酸性保护载体。
65.一种经口输递人甲状旁腺素类似物PTH 1-34-OH的药物组合物，其包含(a)治疗有效量的所述激素；(b)至少一种药物学上可接受的pH降低剂和/或蛋白酶抑制剂；和(c)一种有效运输所述药物组合物通过患者的胃同时防止所述活性肽试剂与胃蛋白酶接触的抗酸性保护载体。
全文摘要
通过一种提供在非天然酰胺化位点被酰胺化的活性肽的药物组合物提高经口给药的活性肽生物利用度。
文档编号A61K38/23GK1738606SQ200480002372
公开日2006年2月22日 申请日期2004年1月21日 优先权日2003年1月21日
发明者N·M·梅达, W·斯特恩, J·P·吉力干 申请人:尤尼金实验室股份有限公司