专利名称：白蛋白溶液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗的病毒灭活的白蛋白及其制备方法。
背景技术：
白蛋白是血浆中比例最高的血浆蛋白。白蛋白可以将许多内源和外源物质结合到其分子上。这种结合能力也是其主要功能之一转运与白蛋白结合的物质的基础。
由于这种结合能力，白蛋白也是许多种类化合物的主要储存库，所述化合物如长链脂肪酸、胆红素、色氨酸、甲状腺素或金属离子。药物使用的活性物质，如华法令、洋地黄毒苷或萘普生也可以与白蛋白结合而被转运。
然而，就此而论，关键在于知道只有各药物活性物质的游离部分，即未与白蛋白结合的部分表现出药理作用。减少与白蛋白结合的部分就增加了游离部分，因而也增加了药理活性。
所有可商业购得的白蛋白制剂是通过改进的Cohn分级法制备的，该方法通常由几个分级步骤所组成。白蛋白浓缩物的巴氏灭菌(60℃下10小时)作为病毒灭活步骤已被应用了几十年。为了避免此步骤期间白蛋白的变性，使用了稳定剂。根据欧洲药典，使用辛酸钠或N-乙酰基色氨酸或二者的组合作为稳定剂。
为了获得病毒灭活的因子VIII制剂或其它血浆蛋白，采用例如EP-A-0 131 740所述的所谓SD方法。该公开(laid-open)说明书通过引用并入本文。
根据他们自己的研究，申请人认识到可商业购得的白蛋白的结合能力明显低于天然白蛋白。这被解释为用于巴氏灭菌法的稳定剂被白蛋白所结合，因而占据了重要的转运位点，由此结合能力下降。这意味着当施用药物活性物质时，获取该白蛋白制剂的患者暴露于浓度明显上升的游离活性物质，即未与白蛋白结合的物质，这自然意味着对于患者的过量药理作用和副作用风险增加。
本发明的目的在于提供没有该缺点的白蛋白制剂。
图1示出层析分离过程中不同来源的白蛋白的紫外吸收行为与洗脱时间的函数关系。
图2示出在不同浓度的苯基丁氮酮存在下不同来源的白蛋白的结合行为。
图3示出在不同浓度的华法令存在下不同来源的白蛋白的结合行为。
该目的通过可用于治疗的病毒灭活的白蛋白来实现，所述白蛋白具有与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比更高的物质结合能力。具体而言，根据本发明的白蛋白具有的结合能力与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比提高至少10％，通常提高20-500％，尤其是提高100-500％。在个别情况下，甚至可以得到更高的值，这取决于所结合的物质。
所述物质主要是由天然白蛋白所结合和转运的物质，具体包括低分子量的活性物质。具体而言，所述低分子量活性物质是分子量通常≤10000Da的有机或无机物质、核酸、多肽。
对于上述药物用途来说，根据本发明的白蛋白可以是液体溶液形式或固体状态，尤其是冻干形式。
根据本发明的白蛋白也可以通过特征为以下步骤的组合的方法来获得(a)在低于45℃的温度下，利用与SD试剂接触的SD方法，对第一白蛋白水溶液进行病毒灭活处理；(b)通过油提取和随后的疏水作用层析至少基本除去SD试剂，其中将疏水性基质，尤其是可任选结合疏水性基团的基质用于所述层析，前提条件是所述基团为多于24个碳原子的脂肪族基团，以得到第二白蛋白溶液；(c)任选向第二白蛋白溶液中加入选自糖、氨基酸和糖醇的一种或多种稳定剂，前提条件是不将吲哚稳定剂和C6-C10脂肪酸用作所述稳定剂；随之(d)将任选加入稳定剂的所述第二白蛋白溶液进行最终包装和除菌过滤，并且任选将其装入最终容器中。
术语“吲哚稳定剂”应该包括所有具有吲哚骨架的稳定剂，如N-乙酰基色氨酸。
已由EP-A-0 131 740得知病毒灭活的SD(＝溶剂/表面活性剂(solvent/detergent))方法。其说明书除了其它蛋白质之外也提及了白蛋白。
事实上，从EP-A-0 366 946得知SD试剂可用植物油，例如大豆油除去，随后进行疏水作用层析。因而，由于与根据EP-A-0 366 946的方法部分一致，因此认为根据权利要求8的方法在一个方面类似于根据该发明的白蛋白制备方法。然而，对于层析而言，上述专利优选建议一种基质，例如结合疏水性侧链，即支化或非支化的C6-C24烷基链的二氧化硅基质。
令人惊奇的是，已经发现使用疏水性基质代替具有例如C18烷基链作为疏水性侧链的基质，得到更高的吸附洗涤剂的结合能力。因此，无需将其它疏水性基团结合到根据本发明采用的基质上。因此，本发明也涉及使用该基质的方法。
有利的是，病毒灭活在25-40℃的温度范围内完成。
在根据本发明的方法的优选实施方案中，病毒灭活在4-6小时的时间内完成。
甘氨酸非常适合作为稳定剂。
蓖麻油非常适合用于油提取法。
已经发现如果将聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或甲基丙烯酸酯基聚合物用作所述疏水性基质，则特别有利于纯化效果。
根据本发明使用的疏水性基质可以具有多于24个碳原子的支化或线性脂肪族基团。
根据所采用的起始材料不同，可能需要脱除所谓的前激肽释放酶活化因子(PKA)活性的步骤。已知PKA通过从高分子量激肽原(HMWK)释放血管活性物质血管舒缓激肽，导致在施用含PKA的制剂之后血压下降。
PKA通常在蛋白质制剂的巴氏灭菌期间失活。由于上述原因，根据先前的经验而知至少使PKA部分失活的热处理不利于根据本发明制备的白蛋白，因此如果需要可以通过特殊手段除去PKA。这包括与活性炭孵育，之后过滤，优选使用深度过滤器，或者通过含活性炭的过滤器直接过滤。
此外，离子交换剂，如阳离子或阴离子交换剂非常适合用来除去PKA。这可以通过使含白蛋白的溶液接触柱内基质，或通过技术人员所公知的间歇方法来实现。作为选择，硫酸葡聚糖或肝素基质可用来减少PKA。
在所得的含白蛋白溶液中，PKA得以减少，并且在最优情况下不再能被检测到。根据现有技术，PKA等同于产生自其酶原形式(FXII)的活化(凝血)因子XII(FXIIa)。这可以通过自催化或酶催化作用，例如激肽释放酶作用在表面发生。因此，同样可推荐脱除作为PKA前体的FXII(酶原)，但并非必需。然而，为了防止PKA从酶原形式的重新产生，也可以将酶原通过离子交换层析除去。可任选进行FXII的脱除以便能够长期保存液态白蛋白。将已经以冰冻状态储存的白蛋白溶液解冻之后，这也很重要。因此，在将白蛋白溶液装入最终容器之后可将其深度冷冻，但也可以将其冷却至液态或冻干状态并在至多40℃的温度下贮存。
因而，为了去除PKA或PKA前体物质，可以通过本身已知的方式除去存在于步骤(a)、(b)或(c)之前或之后的任何前激肽释放酶活化因子(PKA)的活性，其中具体是使白蛋白溶液A)与活性炭接触，随后从白蛋白溶液中除去活性炭；或B)进行离子交换层。
步骤(A)在白蛋白浓度为1-25重量％，尤其是5-10重量％下完成。
步骤(B)具体而言在白蛋白浓度为5-10重量％下进行。
在根据本发明的方法的另一实施方案中，离子交换剂是阴离子交换剂，并将白蛋白溶液用100-150mmol/l的乙酸钠缓冲，pH在5.0-6.0范围内，尤其是＜5.5。
此外，所述方法的特征在于所述离子交换剂是阳离子交换剂，并且将白蛋白溶液用20-30mmol/l的乙酸钠缓冲，pH在4.8-6.0的范围内，尤其是在4.8-5.2的范围内。
本发明还涉及可通过根据本发明的方法得到的白蛋白溶液。该方法可用于得自不同来源的白蛋白溶液，例如得自血浆或血清，得自分级血浆的含白蛋白级分，得自重组子制备之后从培养物上清液回收的白蛋白，或得自转基因制备的白蛋白，或得自含白蛋白的介质，如奶。
通过以下实施例进一步描述本发明的优选实施方案。
实施例向通过Cohn方法(透滤/超滤之后)得到的蛋白质含量约23％的1000g白蛋白水溶液中各加入Triton X-100和三-正丁基磷酸酯(TNBP)至浓度为1％。随后，将该白蛋白溶液在30℃下搅拌4小时。
为了除去SD试剂，首先在搅拌下加入蓖麻油直至浓度为5％，同时使溶液温度为20-25℃。之后，搅拌该混合物30分钟。搅拌后，使该混合物静置60分钟形成重水相和轻相。分离出重相并经孔径＜1μm和＜0.45μm的膜的过滤器过滤。将含有TNBP的轻相(油相)弃去。
为了分离出Triton X-100，使经过滤的溶液流过固相抽提柱。将没有疏水性侧链的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物(Amberchrome CG 161)用作疏水性基质。使用注射用水来清洗柱子，该过程通过测量280nm处的紫外吸收来监控。所述柱在使用后进行再生。
以下物质可作为稳定剂加入甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、麦芽糖、山梨糖醇或这些物质的混合物。
将所得溶液调节至pH7.0，并调节蛋白质含量至200g/l，钠含量至80mmol/l Na+。随后，将该溶液通过孔径≤0.2μm的膜过滤器进行除菌过滤。
在无菌条件下，将经除菌过滤的溶液装入无菌且无致热原的PVC袋中，并在袋上作标记。
将作有标记的袋在＜-60℃的温度下深度冷冻，使袋内温度达到＜-30℃。在该温度(≤-30℃)贮存所述袋。
前激肽释放酶的脱除脱除PKA时，可以采用以下程序变换方式a)将蛋白质浓度为1-25重量％、尤其是5-10重量％的白蛋白溶液与3-10重量％、尤其是5重量％的活性炭在pH＝5的条件下搅拌一小时。随后，滤除活性炭。
b)使蛋白质浓度为5-10重量％的白蛋白溶液在用100-150mM的乙酸钠缓冲的pH5-6、尤其是＜5.5的体系中进行离子交换层析(DEAE Sepharose，QSepharose)。由于高离子强度，从而在滤液中得到不含PKA的白蛋白溶液。
c)将蛋白质浓度为5-10重量％的白蛋白溶液在用20-30mmol/l乙酸钠缓冲的pH5-6、优选4.8-5.2的体系中进行离子交换层析(SP Toyopearl，CMSepharose)。在滤液中得到不含PKA的白蛋白溶液。
最终配方将各所得溶液调节至pH＝7.0，并调节蛋白质含量至200g/l，钠含量至80mmol/lNa+。随后，将该溶液通过孔径＜0.2μm的膜过滤器进行除菌过滤。
在无菌条件下，将经除菌过滤的溶液装入无菌且无致热原的PVC袋中，并在袋上作标记。
将作有标记的袋在温度＜-60℃的温度下深度冷冻，以使袋内温度达到＜-30℃。在该温度(≤-30℃)贮存所述袋。
物质对不同白蛋白制剂的结合的测量确定物质对白蛋白的结合性质的直接方法是根据Hummel和Dreyer(BiochimBiophys Acta 1962；63530-532)的尺寸排阻层析(size-exclusion chromatography，SEC)。
因而，SEC柱使用含结合配体(例如苯基丁氮酮或华法令)的缓冲溶液进行平衡。连续监测在紫外区域的吸收。将蛋白质加到柱上并在平衡缓冲液中进行洗脱。结合配体与白蛋白一道被洗脱，而大多数情况下更小的未结合配体较迟得以洗脱。结合配体的吸收常常干扰白蛋白和可能的伴随物质如稳定剂的吸收。较迟洗脱的“负向”或所谓的“空白”峰是由随后的缓冲液中的配体耗尽所致的，其占据的表面积越大，与先洗脱的白蛋白发生结合越多。Koizumi等人(Biomed Chromatogr 1998；12203-210)对该方法稍加改进，用来检验物质对白蛋白的结合能力或其亲合力，例如通过在独立试验中向恒定浓度的白蛋白中加入增加量的配体，由此结合能力可以通过白蛋白物质的比率来确定。
将装在Shimadzu HPLC装置上的Biosep-SEC-s 4000柱，300×4.6mm微米(Phenomenenx)用于这些检测。缓冲液流速为0.35ml/min，使用50mM pH7.4的磷酸钾缓冲液来平衡所述柱。蛋白质浓度为50μM，注射体积为80μl。在263nm检测苯基丁氮酮，在308nm处检测华法令。预先确定线性吸收区域。
使用如本申请所述的白蛋白(1)以及两种商业可得(稳定的)的白蛋白制剂(2，3)。它们均为20％的白蛋白溶液。
图1示出四种不同层析图谱的叠加，柱子已用50mM的苯基丁氮酮(溶于磷酸盐缓冲液中)进行平衡。在保留时间11分钟时，白蛋白首先被洗脱出来，该峰表明蛋白质吸光度的总量和结合物质的总量。在14.5分钟，通常在商用白蛋白中发现N-乙酰基色氨酸(稳定剂)峰。18.5分钟后，出现相对于包括所述物质的平衡缓冲液浓度“负向”表示吸收的“空白”峰。该峰越高(在负向上)或峰面积越大，则与先洗脱的白蛋白结合的物质就越多。
图2示出结合白蛋白的三种浓度的苯基丁氮酮的紫外吸收(减去缓冲液峰)。因而，将两种商业可得的白蛋白(含有辛酸盐和N-乙酰基色氨酸)和由本发明所述方法制备的白蛋白进行层析，并比较结合性质。对于和白蛋白摩尔浓度相当的苯基丁氮酮而言，明显发现在新白蛋白的情况下峰在高度和面积上明显较大。类似地，这也适用于第二实施例，即华法令，如图3所示。
这些结果强调商用白蛋白在结合性质上不如本文所述的白蛋白。
RP-18柱与苯乙烯二乙烯基苯聚合物(Amberchrome 161M)的结合能力的比较测试体系柱容积44ml流速4ml/分钟所述柱充入1％的Triton X-100溶液。利用反相HPLC在每淋洗柱体积之后测量洗脱液中Triton X的含量。如果可以在洗脱液中检测出Triton，则凝胶的容量被耗尽。
结果RP-18凝胶结合140mg Triton X-100/ml凝胶，Amberchrome凝胶结合160mg TritonX-100/ml凝胶。
权利要求
1.一种可用于治疗的病毒灭活的白蛋白，所述白蛋白的物质结合能力与通过巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比得以提高。
2.根据权利要求1的白蛋白，其中所述结合能力与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比提高至少10％。
3.根据权利要求1和/或2的白蛋白，其中所述结合能力与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比提高至少20％-500％。
4.根据权利要求1-3中至少一项的白蛋白，其中所述物质是低分子量的活性物质。
5.根据权利要求1-4中至少一项的白蛋白，其中所述低分子量的活性物质是分子量至多为10000Da的有机物质、核酸、多肽。
6.根据权利要求1-5中至少一项的白蛋白，为液体溶液或固态形式。
7.根据权利要求6的白蛋白，为冻干形式。
8.一种制备白蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤(a)通过在低于45℃的温度下，利用与SD试剂接触的SD方法，对第一白蛋白水溶液进行病毒灭活处理；(b)通过油提取和随后的疏水作用层析来至少基本除去SD试剂，其中将疏水性基质，尤其是可任选结合疏水性基团的基质用于所述层析，前提条件是所述基团为多于24个碳原子的脂肪族基团，以得到第二白蛋白溶液；(c)任选在第二白蛋白溶液中加入选自糖、氨基酸和糖醇的一种或多种稳定剂，前提条件是不将吲哚稳定剂和C6-C10脂肪酸用作所述稳定剂；随之(d)将任选加入稳定剂的所述第二白蛋白溶液进行最终包装和除菌过滤，并且任选将其装入最终容器中。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述病毒灭活在25-40℃的温度下进行。
10.根据权利要求8和/或9的方法，其特征在于所述病毒灭活在4-6小时的时间内完成。
11.根据权利要求8-10中任一项的方法，其特征在于将甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸或其组合用作所述稳定剂。
12.根据权利要求8-10中任一项的方法，其特征在于将麦芽糖和/或山梨糖醇用作所述稳定剂。
13.根据权利要求8-12中任一项的方法，其特征在于将蓖麻油用于油提取。
14.根据权利要求8-13中任一项的方法，其特征在于将聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或甲基丙烯酸酯基聚合物用作所述疏水性基质。
15.根据权利要求8-14中任一项的方法，其特征在于将具有多于24个碳原子的支化或线性脂肪族基团结合至所述基质。
16.根据权利要求8-15中任一项的方法，其特征在于将所述白蛋白溶液在装入最终容器之后进行深度冷冻。
17.根据权利要求8-16中任一项的方法，其特征在于通过本身已知的方式除去存在于步骤(a)、(b)或(c)之前或之后的任何前激肽释放酶活化因子(PKA)的活性。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于使所述白蛋白溶液a)与活性炭接触，随后从所述白蛋白溶液中除去活性炭；或b)进行离子交换层析；以除去存在的所述前激肽释放酶活化因子的活性。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于步骤a)在白蛋白浓度为1-25重量％下进行。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于所述白蛋白浓度为5-10重量％。
21.根据权利要求18的方法，其特征在于步骤b)在白蛋白浓度为5-10重量％下进行。
22.根据权利要求18或21中任一项的方法，其特征在于所述离子交换剂是阴离子交换剂，并且将所述白蛋白溶液用100-150mmol/l的乙酸钠缓冲，并且pH为5.0-6.0。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于所述pH＜5.5。
24.根据权利要求18或21中任一项的方法，其特征在于所述离子交换剂是阳离子交换剂，并且将所述白蛋白溶液用20-30mmol/l的乙酸钠缓冲，并且pH为4.8-6.0。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于所述pH为4.8-5.2。
26.一种可由根据权利要求1-25中任一项的方法得到的白蛋白溶液。
全文摘要
本发明涉及可用于治疗的病毒灭活的白蛋白以及生产可用于治疗的病毒灭活的白蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤(a)根据使所述白蛋白水溶液在低于45℃的温度下与SD试剂接触的SD方法对第一白蛋白水溶液进行病毒灭活处理；(b)利用油提取和随后的疏水作用层析，至少基本上将所述SD试剂除去，将疏水性基质、尤其是可以结合任选的疏水性基团的基质用于所述层析方法，前提是所述基团为C＞24的脂肪族基团，以得到第二白蛋白溶液；(c)任选向第二白蛋白溶液中加入选自糖、氨基酸和糖醇的一种或多种稳定剂，前提条件是不将吲哚稳定剂和C
文档编号A61K38/38GK1798573SQ200480003864
公开日2006年7月5日 申请日期2004年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者维尔纳·格林格, 卡塔琳娜·波克, 于尔根·勒米施, 托尔·艾纳·斯韦, 克里斯托夫·坎尼希特 申请人:奥克塔法马股份有限公司