专利名称：用于治疗中风的非神经毒性纤溶酶原激活剂的静脉注射的制作方法
技术领域：
本发明涉及非神经毒性纤溶酶原激活剂在静脉内的应用，尤其是用于治疗人类中风的经遗传学修饰的纤溶酶原激活剂和源自Desmodus rotundus唾液的纤溶酶原激活剂(DSPA)。由国际专利申请PCT/EP02/12204已知运用这些纤溶酶原激活剂治疗中风，该专利公开的内容全文引入作为参考。
中风的临床特征和生物化学将临床症状相关的不同临床现象概括为术语“中风”。根据各自的发病机理，这些临床现象可能首先区分为所谓的缺血性和出血性损伤。
缺血性损伤(缺血)的特征是，因动脉血供应匮乏而导致脑中血液循环的减少或中断。这常常是由动脉硬化而变窄的血管的血栓引起，或由动脉栓塞或心栓塞引起的。
出血性损伤归因于主要由动脉压过高而损伤形成脑供应动脉的穿孔。然而，在所有脑损伤中仅有大约20％是由出血性损伤引起的。因此，由血栓形成引起的中风更为相关。
与其他组织缺血相比，神经组织缺血普遍伴随着受影响细胞的坏死。神经组织中提高的坏死发生率可以用对“兴奋性毒性”现象的新理解来解释，该现象是一种包括众多反应步骤的复杂级联反应。该级联反应由缺氧的缺血神经元迅速丢失ATP并去极化引发。它导致突触后释放神经递质谷氨酸的增加，该神经递质激活调控阳离子通道的膜结合谷氨酸受体。然而，由于该谷氨酸释放的增加使得谷氨酸受体被过度激活。
谷氨酸受体调控由谷氨酸与受体的结合而开启的电压依赖型阳离子通道。它导致Na+和Ca2+大量流入细胞从而干扰Ca2+依赖型物质细胞代谢(包括能量代谢)。Ca2+依赖型分解代谢酶的激活尤其可以解释随后发生的细胞死亡(Lee，Jin-Mo等，″The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms″；Dennis W.Zhol″Glutamat neurotoxicity and diseases of the nervoussystem″)。
尽管谷氨酸介导的神经毒性机制还未被完全了解，但是人们都同意其在很大程度上促成了脑缺血后的神经细胞的死亡(Jin-Mo Lee，等)。
中风的治疗除保证重要机能的安全和稳定生理参数外，在急性脑缺血的治疗中，首先要重新疏通封闭的血管。该目的通过不同的方法进行。单纯的机械重新疏通方法，例如心肌梗塞情况下的PTCA术，迄今为止仍未获得令人满意的效果。只有成功的纤维蛋白溶解作用才能使病人的状况得到令人满意的改善。
自身的纤维蛋白溶解作用是以丝氨酸蛋白酶纤溶酶的蛋白水解活性为基础的，该酶由其未激活的前体纤溶酶原经催化(激活)形成。纤溶酶原的天然激活是通过自身的纤溶酶原激活剂u-PA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)和t-PA(组织纤溶酶原激活剂)进行的。与u-PA相反，t-PA与纤维蛋白和纤溶酶原一起形成一个所谓的激活剂复合体。因此，t-PA的催化活性是纤维蛋白依赖的，并且在纤维蛋白存在下增强约550倍。除纤维蛋白外，纤维蛋白原也能刺激由t-PA介导的纤溶酶原向纤溶酶转变的催化作用-即使在很小的范围内。在纤维蛋白原存在下，t-PA活性仅增强25倍。纤维蛋白的切割产物(纤维蛋白降解产物(FDP))也能刺激t-PA活性。
已知的治疗学途径a)链激酶对急性中风进行血栓溶解治疗的早期尝试可以追溯至二十世纪五十年代。用链激酶，一种源自β溶血性链球菌的纤维蛋白溶解剂，进行的首次广泛临床试验于1995年才开始。链激酶与纤溶酶原形成能将其他纤溶酶原分子转变为纤溶酶的复合体。
由于链激酶是一种细菌蛋白酶从而能在机体中激发变态反应，因此采用链激酶的疗法存在严重缺陷。在之前具有相应抗体产生的链球菌感染的情况下也可能出现所谓的链激酶抗性从而使得该疗法更难进行。除此之外，欧洲(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe(MAST-E)，Multicenter AcuteStroke Trial of Italy(MAST-I))和澳大利亚(Australien StreptokinaseTrial(AST))的临床试验表明，用链激酶治疗病人后呈现上升的死亡率风险以及更高的脑内出血(intracerebral hemorrhage，ICH)风险。这些试验不得不在早期就被终止。
b)尿激酶作为选择，也可采用尿激酶—它也是一种“经典的”纤溶蛋白溶解剂。与链激酶相反，由于它是一种天然存在于大量机体组织中的酶，因此，它不显示抗原特性。它是一种纤溶酶原激活剂，且不依赖于辅助因子。尿剂酶由肾细胞培养物产生。
c)重组体t-PA(rt-PA)已经获得用产自重组仓鼠细胞的组织型纤溶酶原激活剂—所谓的rt-PA-(参见EP 0 093 619，US 4,766,075)进行的治疗性血栓溶解的丰富的经验。除了急性心肌梗塞为主要指征之外，九十年代用t-PA在全世界范围内完成了一系列临床研究，得到部分无法理解且矛盾的结果。在所谓的欧洲急性中风试验(ECASS)中，在病人出现中风症状后6小时内于静脉内使用rt-PA进行治疗。90天后检查死亡率和Barthel指数作为病人的残疾或独立生活能力指标。未报道生活能力的显著改善，但是报道了—尽管不显著—死亡率的上升。因此可以推断，对根据各自病史个别选择出的病人在中风发作后即刻用rt-PA进行的血栓溶解治疗可能是有利的。然而，不推荐rt-PA在中风发作后6小时内的普遍使用，因为观察到在中风发作后仅几个小时内的应用会增加脑内出血(ICH)的危险(C.Lewandowski C和Wiliam Barsan，2001Treatment of AcuteStrocke；inAnnals of Emergency Medcine 372；S.202ff)。
中风的血栓溶解治疗后来也是美国National Institute of NeurologicDisorder and Stroke进行的临床研究(所谓的NINDS rtPA中风试验)课题。该试验的重点集中在出现症状后3小时内用rt-PA静脉内治疗的效果上，该效果基于三个月后患者的健康状况。由于观察到该治疗对病人生活力的积极效果，因此推荐在三个小时的时间段内用rt-PA进行治疗，尽管作者在此也发现了更高的ICH风险。
在另外两项研究中(ECASS II TrialAlteplase Thrombolysis for AcuteNoninterventional Therapy in Ischemic Stroke(ATLANTIS))调查了中风发作后三小时内用rt-PA治疗的积极效果是否能在六小时内的治疗中重现。然而，由于在升高的ICH风险外未曾观察到临床症状的改善或死亡率的任何降低，这个问题并不能得到肯定回答。
根据一份于1997年首次出版，2001年三月更新的关于各种中风试验的综述，所有的血栓溶解物治疗(尿激酶、链激酶、rt-PA或重组尿激酶)特别是由于ICH都导致中风后第一个10天内显著更高的死亡率，尽管在中风发作后六小时内的治疗降低了死亡或残疾病人的总数。因此，并不推荐血栓溶解物在治疗中风中的广泛应用。
甚至之前，这样的结果使得其他一些作者给出了纯粹的讽刺言论中风病人必须选择要么死亡要么残废地活着(SCRIP 19972265，26)。
不过，迄今为止使用rt-PA的疗法仍然是美国食品药品监督管理局(FDA)唯一批准的急性脑缺血的治疗方法。然而，限制是在中风后3小时内使用rt-PA。
重组体纤溶酶原激活剂目前以名称Alteplase或以类似制剂Reteplase销售。后者是一种半衰期较短的具有治疗活性的t-PA片断。治疗剂量，Alteplase是约70-100mg，Reteplase是2×560mg，对于Alteplase主要通过点滴施用而Reteplase则是通过以大约30分钟的时间间隔两次快速推注施用(Mutschler″Arzneimittelwirkungen″，第八版，512-513页)。
t-PA的副作用神经毒性和兴奋性毒性对rt-PA的批准是在1996年。之前在1995年，公开了t-PA的神经毒性或兴奋性毒性作用的原因的第一份声明，其中为在三小时之外将t-PA应用于中风治疗时产生的剧烈效果提供了解释，据其所述海马小胶质细胞和神经细胞产生参与谷氨酸介导的兴奋性毒性的自身性t-PA。该结论是从一项关于t-PA缺陷型和野生型小鼠的研究推导得出的，其中将谷氨酸激动剂分别注射入它们的海马。t-PA缺陷型小鼠对外源(inthrathekal)施用的谷氨酸表现出显著更高的抗性(Tsirka SE等，Nature，Vol.377，1995，″Exzitoxin-induced neuronaldegeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator″)。这些结果在1998年得到证实，当时Wang等证明当静脉内注射t-PA时t-PA缺陷型小鼠中出现几乎两倍量的坏死神经组织。在野生型小鼠的情形下，外源t-PA的这一消极结果仅为约33％(Wang等，1998，Nature，″Tissue plasminogenactivator(t-PA)increases neuronal damage after focal cerebral ischemiain wild type and t-PA deficient mice″)。
2001年初Nicole等发表了对由t-PA引起的兴奋性毒性的进一步研究结果(Nicole O，Docagne F Ali C；Margaill I；Carmeliet P；MacKenzie ET，VivienD和Buisson A，2001The proteolytic activity of tissue-plasminogenactivator enhances NMDA receptor-mediated signaling；inNat Med 7，59-64)。他们可以证明由去极化皮质神经元释放的t-PA与所谓的NMDA型谷氨酸受体的NR1亚单位相互作用并将其分离。该修饰导致受体活性的升高，其致使在施用谷氨酸激动剂NMDA后通过引发的兴奋性毒性出现更大的组织破坏。因此，t-PA通过激活NMDA型谷氨酸受体表现出神经毒性。中风期间由于受影响的组织区域内血脑屏障崩溃，溶解性血浆蛋白样纤维蛋白原以及治疗施用的t-PA得以与神经组织接触，在那里被纤维蛋白原激活的t-PA通过激活谷氨酸受体显示了它的兴奋性毒性效应。
尽管t-PA具有神经毒性副作用以及上升的死亡率效应，它仍然得到了FDA的药物授权批准。这是因为缺乏无害而有效的替代物和非常实用的成本效益分析。然而一如继往地存在对于安全疗法的需求。如果不能完全排除血栓溶解作用，在开发新的血栓溶解药物的情况下出就必须考虑神经毒性问题(参见如Wang等a.a.O.；Lewandowski和Barsan 2001a.a.O.)。
出于该原因，尽管原则上所有血栓溶解药物都可能适用，还是终止了为开发中风治疗新药物而进行的对包括DSPA(Desmodus rotundus纤溶酶原激活剂)在内的已知血栓溶解药物的进一步研究。例如就DSPA而言，较早期就已经指出了它对该适应征的撒用性(Medan P；Tatlisumak T；Takano K；Carano RAD；Hadley SJ；Fisher MThrombolysis with recombinant Desmodus salivaplasminogen activator(rDSPA)in a rat embolic stroke model；inCerebrovasc Dis 19966；175-194(第四版International Symposium onThrombolic Therapy in Acute Ishemic Stroke))。DSPA是一种与t-PA高度同源(相似)的纤溶酶原激活剂，以致在意识到t-PA的神经毒性副作用的同时，也不对DSPA抱有希望。
替代的治疗学途径目前，替代的治疗学途径的研究例如集中在抗凝血剂，例如肝素、阿司匹林或安克洛酶—马来响尾蛇(Malayischen Grubenotter)毒液中的活性物质。然而尤其是两个检验肝素效果的临床研究(International Stroke Trial(IST)和Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Trea tment(TOAST))并未显示出对死亡率的显著改善或对中风再发的预防。
另一种的新疗法的焦点既非集中于血栓也非稀释血液或抗凝结作用，而是尝试提高因中断血液供应而受损的细胞的生命力(WO 01/51613 A1和WO01/51614A1)。为了达到该目的，使用了源自醌类、氨基糖苷类或氯霉素类的抗生素。基于相似原因，进一步建议从中风发作后立即施加胞磷胆碱开始。胞磷胆碱在体内被切割为胞苷和胆碱。切割产物形成神经元细胞膜的一部分并因此支持受损组织的再生(US 5,827,832)。
近期对安全治疗的研究基于新发现，即，中风的致命后果部分是仅仅由中断的血液供应间接导致而由在过度激活的谷氨酸受体的参与下的兴奋性毒性或神经毒性直接导致的。t-PA加强这一效应(参见上述)。因此一种降低兴奋性毒性的配方是应用所谓的神经保护剂。它们可以单独使用或与纤维蛋白溶解剂联合使用以减小神经毒性效应。它们能够或者例如作为谷氨酸受体拮抗剂直接地降低兴奋性毒性、或者通过阻断电压依赖型钠或钙离子通道间接地消弱兴奋性毒性(Jin-Mo Lee等a.a.O.)。
在此用例如2-氨基-5-膦酰戊酸盐(APV)或2-氨基-5-膦酰庚酸盐(APH)产生对NMDA型谷氨酸受体的竞争性抑制(拮抗作用)是可能的。可以用例如结合于通道苯环利定(Phencyclidin)端的物质来实现非竞争性抑制。这样的物质可以是苯环利定、MK-801、右啡烷或氯胺酮(ketamin)。
迄今为止，采用神经保护剂的治疗还未表现出所期望的成功，可能因为神经保护剂要表现它们的保护效应必须与血栓溶解剂结合。这适用于其它活性物质(参见
图10)。
然而，甚至t-PA和神经保护剂的组合也仅导致有限的损伤。缺陷在于，未避免所使用的纤维蛋白溶解剂的神经毒性。
非神经毒性的纤溶酶原激活剂由国际专利申请PCT/EP02/12204获知用于治疗中风的纤溶酶原激活剂，其酶的活性被纤维蛋白高选择性地增强许多倍，即大于650倍。这一公开的内容全部引入作为参考。
纤溶酶原激活剂的特征和施用是基于以下知识，即组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的神经毒性归因于下列事实，那就是血脑屏障由于因中风导致的脑内组织损伤而受到损伤或破坏，于是，在血液中循环的纤维蛋白原能进入脑神经组织，在那里它激活了t-PA，通过激活谷氨酸受体或激活纤溶酶原间接导致了进一步的组织损伤。(参见上述)。
为了避免这种效应，应用一种纤溶酶原激活剂，它显示了一种增加的纤维蛋白选择性，并且作为一种相反的结果，显示了降低的纤维蛋白原可活化性。因此这些纤溶酶原激活剂并不会，或者与t-PA相比而言程度较低地，被由于血脑屏障受损而从血液进入神经组织的纤维蛋白原激活，因为t-PA的激活剂纤维蛋白由于其大小以及不溶性而不能进入神经组织。这些纤溶酶原激活剂是非神经毒性的。
a)经遗传学修饰的纤溶酶原激活剂根据本发明的一个优选实施方式，使用了非毒性纤溶酶原激活剂，其包括至少一种所谓的酶原三联体元件。一个类似的已知三联体是来自胰凝乳蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的催化中心，它由三个相互作用的氨基酸即天门冬氨酸194、组氨酸40和丝氨酸32组成。然而，该三联体并不存在于属于胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶家族的t-PA中。不过，已知向天然t-PA的适宜位点导入至少一个上述氨基酸的定向诱变导致在纤维蛋白存在下原酶活性(单链t-PA)减弱和成熟酶活性(双链t-PA)增强。因此，三联体中至少一个氨基酸，或具有对应于三联体中的功能的氨基酸的导入，能增强t-PA的酶原性(Zymogenitt)(也就是成熟酶活性与原酶活性的比率)。结果导致纤维蛋白特异性显著提高。这是由所导入的氨基酸残基和/或野生型序列氨基酸残基之间的构象相互作用引起的。
已知，t-PA中用His取代Phe305(F305H)和用Ser取代Ala 292(A292S)的诱变使酶原性增强20倍，而单纯的F305H变体就已经使酶原性增强5倍(ELMadison，Kobe A，Gething M-J；Sambrook JF，Goldsmith EJ 1993ConvertingTissue Plasminogen Activator to a ZymogenA regulatory Triad ofAsp-His-Ser；Science262，419-421)。存在纤维蛋白时，这些t-PA突变体活性分别增强30000倍(F305H)和130000倍(F305H，A292S)。另外，这两个突变体还包括将Arg275置换为R275E以防止纤溶酶在切割位点Arg275-Ile276的切割而将单链t-PA转变为双链形式。单一的突变体R275E使t-PA的纤维蛋白特异性增强6900倍(K Tachias，Madison EL 1995Variants of Tissue-typePlasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulationby Fibrin，inJournal of Biological Chemistry 270，3118319-18322)。
t-PA的位点305和292与胰凝乳蛋白酶中的丝氨酸蛋白酶的已知三联体的位点His40和Ser32同源。通过分别用组氨酸或丝氨酸进行的相应取代，这些氨基酸能与t-PA的天门冬氨酸477相互作用从而在t-PA突变体中产生已知的三联体功能(Madison等，1993)。
根据本发明，由于这些t-PA突变体因其增强的纤维蛋白特异性而不具有或—与野生型t-PA相比—仅具有显著降低的神经毒性，因此可将它们用于治疗中风。为公开已述及的t-PA单纯F305H；F305H；A292S突变体或与R275E的组合突变，引入Madison等(1993)的出版物，以及将Tachias和Madison(1995)的全文引作参考。
作为替代地，纤溶酶原激活剂纤维蛋白特异性的增强可通过Asp194(或同源位点的天门冬氨酸)的点突变实现。纤溶酶原激活剂属于胰凝乳蛋白酶家族中丝氨酸蛋白酶组，且因此它包含负责成熟蛋白酶的催化活性构象稳定性的保守氨基酸Asp194。已知在丝氨酸蛋白酶的酶原中Asp194与His40相互作用。通过酶原的激活性切割该相互作用被阻断，Asp194侧链旋转约170°以与Ile16形成一个新盐桥。该盐桥参与成熟丝氨酸蛋白酶的催化三联体的氧阴离子穴(Oxyanion-Tasche)的稳定性。它也存在于t-PA中。
Asp194的点突变首先阻碍丝氨酸蛋白酶催化构象的形成或稳定性。尽管如此，该突变的纤溶酶原激活剂在它们的辅因子纤维蛋白的存在下显示出显著增强的活性(特别是与成熟野生型相比)，这只能解释为与纤维蛋白的相互作用允许促进催化活性的构象变化(L Strandberg，Madison EL，1995Variants ofTissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Responseand Selectivity towards Fibrin co-factors，inJournal of BiologicalChemistry 270，402344-2349)。由此显示纤溶酶原激活剂的Asp194突变体在纤维蛋白存在下其活性高度增强，这使其作为非神经毒性的纤溶酶原激活剂的应用成为可能。
在这类非神经毒性的纤溶酶原激活剂的一个优选实施方式中，使用了t-PA突变体，该突变体中Asp194被谷氨酸(D194E)或天冬酰胺(D194N)取代。这些突变体中的t-PA活性在无纤维蛋白时减少1-2000倍，而当纤维蛋白存在时其活性增强可达到498000-1050000倍。这些突变体可进一步包含Arg15至R15E的取代，它防止纤溶酶在肽键Arg15-Ile16处切割单链t-PA而形成双链形式的t-PA。该单一突变将纤维蛋白对t-PA的激活增强12000倍。为公开在位点194和15的t-PA突变，引入Strandberg和Madison(1995)全文作为参考。
也可以通过在所谓的“自溶环(Autolyse-Schleife)”中导入点突变来增强纤溶酶原激活剂对纤维蛋白的依赖性。该氨基酸片断已知源于胰蛋白酶；在丝氨酸蛋白酶的同源片断中也能发现该成分，且尤以三个疏水氨基酸(Leu、Pro和Phe)为特征。纤溶酶原激活剂中的自溶环负责与纤溶酶原的相互作用。该区域中的点突变使纤溶酶原与纤溶酶原激活剂间不再有效形成蛋白质-蛋白质相互作用。这些突变仅在缺少纤维蛋白时是功能相关的。相反在存在纤维蛋白时，它们负责纤溶酶原激活剂活性的增强(K Song-Hua，Tachias K，Lamba D，BodeW，madison EL，1997Identifikation of a Hydrophobic exocite on TissueType Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen，InJournal of Biological Chemistry 272；3，181-1816)。
在一个优选实施方式中，使用在位点420至423间具有点突变的t-PA。若这些残基经定向点突变取代，其使得t-PA的纤维蛋白依赖性增强直至61000倍(K Song-Hua等)。Song-Hua等检测了点突变L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。为公开根据本发明的用途将这些出版物全文引入作为参考。
根据进一步的有利实施方式，使用具有SEQ ID Nr.1(附图13)所示氨基酸序列的经修饰的组织纤溶酶原激活剂。该经修饰的t-PA与野生型t-PA的区别在于，其自溶环中位点420至423间的疏水氨基酸的替换如下His420、Asp421、Ala422和Cys423。该t-PA优选在位点194具有一个苯丙氨酸。进一步，位点275可为谷氨酸。有利的是，位点194为苯丙氨酸。
进一步，根据本发明可使用经修饰的尿激酶。根据本发明，尿激酶可以具有根据SEQ ID Nr.2(附图14)所示的氨基酸序列，其中自溶环的疏水氨基酸被Val420、Thr421、Asp422和Ser423取代。有利的是，尿激酶带有一个Ile275和一个Glu194。该突变体具有与野生型尿激酶相比增强500倍的纤维蛋白特异性。
该两种突变体—尿激酶与t-PA—都进行了半定量试验分析，且与野生型t-PA相比都显示增强的纤维蛋白特异性。
b)源自吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)的纤溶酶原激活剂(DSPA)源自吸血蝙蝠唾液的纤溶酶原激活剂(DSPA)在纤维蛋白存在时也表现出高度增强的活性—增强100000倍，其因此可被用于非毒性纤溶酶原激活剂。术语DSPA包括四种不同的蛋白酶，它们完成吸血蝙蝠的基本需求即猎物伤口流血时间的延长(Cartwright，1974)。这四种蛋白酶(DSPAα1、DSPAα2，DSPAβ、DSPAγ)相对于人t-PA呈现一致的高度的相似性(同源性)。它们也表现出相似或一致的生理活性，使它们合理地被概括于上位术语DSPA下。DSPA公开于专利EP 0 352 119 A1和US 6 008 019和5 830 849中，因此为满足公开将它们全文引入作为参考。
迄今为止，DSPAα1是该组中最彻底分析的蛋白酶。其氨基酸序列与已知的人t-PA氨基酸序列具有大于72％的同源性(Krtzschmar等，1991)。然而，t-PA和DSPA间有两个本质性的区别。首先，DSPA作为单链分子对于肽底物表现为完全活性的分子，其与t-PA相反，不转变为双链形式(Gardell等，1989；Krtzschmar等，1991)。其次，DSPA的催化活性几乎完全依赖于纤维蛋白(Gardell等，1989；Bringmann等，1995；Toschi等，1998)。例如，在纤维蛋白存在下，DSPAα1的活性增强100000倍而t-PA的活性仅增强550倍。相反，纤维蛋白原对DSPA活性的诱导显著较弱，其活性仅增强7-9倍(Bringmann等，1995)。DSPA比仅被纤维蛋白激活550倍的野生型t-PA显著更依赖于纤维蛋白且更为纤维蛋白特异性。
由于其纤维蛋白溶解性以及与t-PA极大相似，DSPA成为血栓溶解试剂开发中一种令人感兴趣的候选物。尽管如此，DSPA作为血栓溶解试剂的医疗用途过去被限制于对心肌梗死的治疗，由于t-PA参与谷氨酸诱导的神经毒性，人们不能合理预测与t-PA高度近似的纤溶酶原激活剂可被成功应用于急性中风的治疗。
令人惊讶的是，即使DSPA显示出与t-PA高度相似(同源)并且其生理效应在很大程度上也与t-PA类似，DSPA却没有神经毒性效应。上述结论导致产生这样一种认识，DSPA也许可以在中风治疗中成功用作血栓溶解试剂而不造成神经组织损伤的严重危险。这特别意味着，DSPA也可以在出现中风症状3小时后使用。
DSPA不具有神经毒害性的试验证明对于这种纤溶酶原激活剂不具有神经毒性的新认识是以基于一方面t-PA和另一方面DSPA的神经变性效应的体内对比实验为基础的。该实验是借助于所谓的“红藻氨酸-模型”以及用于检测NMDA诱导的纹状体损伤的模型进行的。
红藻氨酸模型(也称为红藻氨酸损伤模型)以通过外部应用红藻氨酸(KA)作为红藻氨酸型(KA型)谷氨酸受体以及NMDA和AMPA谷氨酸受体的激动剂刺激神经毒性谷氨酸级联反应为基础。以t-PA缺陷型小鼠脑干作为试验模型，可以显示只有在补加外源t-PA后实验动物对红藻氨酸的敏感性才能达到野生型小鼠的水平。相反，相同实验条件下输注等摩尔浓度的DSPA不能恢复对红藻氨酸(KA)的敏感性。得出结论，t-PA的神经毒性效应不能由DSPA替代。这些结果的总结见图15(表1)。
基于该模型的定量研究显示，甚至10倍的DSPA浓度增长也不能恢复t-PA缺陷型小鼠对KA处理的敏感性，而降低10倍的t-PA浓度就已经导致KA诱导的组织损伤。由此得出结论，就促使KA处理后的神经变性刺激而言，DSPA具有比t-PA至少低100倍的活性(同时参见附图11和12)。
在第二个神经变性模型中，用野生型小鼠比较了t-PA以及DSPA促使NMDA依赖型神经变性的可能效应。为此目的，向野生型小鼠单独注射NMDA，或者与t-PA或DSPA组合注射NMDA(用作NMDA型谷氨酸受体的激动剂)。该模型可以在最终会导致神经变性和因血脑屏障被破坏而血浆蛋白质流入的条件下检测这些蛋白酶的效果(Chen等，1999)。
该模型的操作使NMDA的注射导致小鼠纹状体的可重复性损伤。t-PA和NMDA的联合注射使损伤量增加至少50％。相反，用DSPAα1的共注射不会导致由NMDA引起的损伤扩大的增强。甚至在能够扩散于由NMDA引起的损伤区域中的血浆蛋白质存在下，DSPA也不会导致神经变性的增强。这些结果的总结见图16(表2)。
首个临床试验结果显示这些结果也适用于人类中风治疗。已经确认成功灌注后患者得到显著改善(改善8个点NIHSS或HIHSS值0到1)。附图17(表3)表明了这一情况。
在进一步的试验中检验静脉注射给药时，t-PA和DSPA是否能够透过受损的血脑屏障并增加脑中的组织损害。对此，将NMDA立体定向(stereotaktisch)注射到小鼠用于在纹状体产生组织损伤，在NMDA注射后6或24小时静脉内施用t-PA或DSPA。与阴性对照相比，当在NMDA注射后24小时输注t-PA时，实验动物显示出被NMDA注射损伤的组织面积增加了约30％，而用DSPA不引发这样的一种组织损伤的增加，尽管可以通过一种抗体染色法证实它进入到受损组织的区域(参见附图18、19)。在NMDA注射后6小时以相应方式静脉内注射t-PA或DSPA，仍未确定受损组织面积的增加。这可能归因于，当注射t-PA或DSPA时，血-脑屏障仍具有足够的屏障作用。
这些结果显示了，DSPA在哺乳动物(也可以是人)的中枢神经系统中主要表现为一种惰性蛋白酶，与t-PA相反，并不会引起经KA或NMDA所诱导的神经毒性的增强。这种神经毒性的缺乏使得DSPA与所预期的相反成为一种适宜的治疗急性中风的血栓溶解剂。
非神经毒性纤溶酶原激活物的治疗潜能DSPA和其它非神经毒性纤溶酶原激活剂的神经毒性缺乏特征(参见上述)为中风治疗提供了特别的优势，这些纤溶酶原激活剂的使用-与野生型t-PA相反-并不受限于中风发作后最长为3小时的时间段。相反，治疗可以迟些开始-例如6小时后或者更迟，而不会如同t-PA引发兴奋性毒性反应的危险。首次用DSPA进行的临床试验证明了中风发作后在甚至超过6或9小时的时间范围对病人的安全治疗。
用非神经毒性激活剂进行的这一无时间限制的治疗选择方案特别重要，因为它第一次可以毫无顾虑地治疗中风发作时在时间上没有足够安全地治疗的急性中风症状的病人。这组病人至今由于不利的风险评估而被排除在采用纤溶酶原激活剂的血栓溶解疗法之外的。因此，消除了血栓溶解试剂用于中风治疗的禁忌。
纤溶酶原激活物的施用与已经确立的中风治疗剂rt-PA相反，用非神经毒性均纤溶酶原激活剂治疗中风还没有获得对于可能的施用方式可靠的认识。
因此，本发明的目的在于提供一种对于这些非神经毒性的纤溶酶原激活物的有利的施用方式。
根据本发明，静脉内施用纤溶酶原激活剂来治疗中风，在纤维蛋白存在的情况下，其活性的增加超过650倍。
静脉给予这些非神经毒性纤溶酶原激活剂以治疗中风已经在临床试验中得以确定。其中，DSPA-作为这组纤维蛋白溶解剂的一个实例-静脉施用于这些病人，仅造成一些比较小的副作用。
这些临床研究的结果是意料之外的，因为众所周知，静脉内施用t-PA和其它普通的纤维蛋白溶解剂与大脑出血的严重危险有关(参见上述)。
为了减少大脑内出血，新近发展的策略，不再将这些物质静脉内施用，而是通过导管经动脉内途径直接施用于血管内的血栓附近。为此，这种实际的实验已经用于重组体产生的尿激酶(PROCAT作为与前尿激酶相关的一种研究)。由于这种施用方式使总剂量显著减少，所以实现了剂量依赖的副作用的减少-这样大脑出血也会减少。
然而这些动脉内施用的显著优势被两个可能存在的缺点所破坏。首先，这种治疗的先决条件是需要时间做好病人的准备工作，但在中风的治疗中在给定的仅仅3小时内这不可能实现。另一方面人们确信能够达到一个较低的总剂量，然而较高的药物浓度将局部抵达末端动脉血管。由于在中风情况下，血管内皮屏障功能削弱的缘故，药物也将以局部高浓度抵达周围的组织。这样将会产生不想要的副作用。
较之而言，如果是静脉内施用，药物的浓度将会被静脉血流所稀释。因此，如果药物具有组织破坏的潜在性，如t-PA，那动脉内注射就是有问题的(Forth，Henschler，Rummel，Starke“Pharmakologie und Toxikologie”，第六版，1992，29页)。
然而，这种使动脉内施用变复杂的局限性-时间范围窄-和损伤组织的副作用-不存在于根据本发明在纤溶酶原激活剂的施用。因此，这种动脉内施用由于其不可否认的优势(参见上述)原则上形成了非神经毒性纤溶酶原激活剂非常有用的一种施用方式。因此，很明显的可以沿循这种途径寻找这些药物的优选施用方式。
然而，申请人也选择将非神经毒性的纤溶酶原激活剂采用有争议的静脉内施用，其惊人的被证实了是有利的。
此外，本发明的施用方式还不同于常规治疗惯例，为了给予具有高免疫潜能的蛋白质药物，主要使用肌肉注射或静脉点滴，其目的在于降低过敏性休克的危险(Mebs“Gifttiere”，第二版，2000)。
本发明所应用的纤溶酶原激活剂与自身的t-PA相反或者是源于动物的异种蛋白(例如DSPA)或者是遗传学修饰的自身蛋白，由于其结构上的不同具有新的抗原决定部位。伴随的过敏反应问题-尤其是当施用高治疗剂量时，比如在静脉内应用通常是必须的-还同样存在于其它的含有异种蛋白例如链激酶的溶纤维蛋白药。
在一个特别有利的实施方式中，根据本发明使用的纤溶酶原激活剂可以通过一种快速推注(静脉快速注射)的方式给予，也可以作为一种含有全部治疗剂量的单独的静脉快速注射方式给予。
在临床研究的范围内证实，甚至惊人的低治疗剂量静脉内施用也会产生有利的结果。例如，当剂量在90μg/kg和230μg/kg之间能够达到优选的治疗结果。当剂量在62.5到90μg/kg之间能够达到特别优选的治疗结果。在所调查的病人当中，中风和施用药物的时间间隔在3到9小时之间。通过合适的检测方法可以确定起效的治疗效果(参见附图20-29)。
DSPA和其它的非神经毒性纤溶酶原激活剂本身不表现神经毒性副作用。然而，为尽可能限制有自身谷氨酸引起的组织损伤，将它们与神经保护试剂联合应用于中风治疗是有利的。可以使用竞争性或非竞争性抑制谷氨酸受体的神经保护试剂。有效的组合是使用例如已知的NMDA型、红藻氨酸型或使君子氨酸型谷氨酸受体抑制剂，例如APV、APH、苯环利定、MK-801、右啡烷或氯胺酮。
进一步，与阳离子联用是有利的，因为阳离子尤其是Zn离子会阻断由谷氨酸受体调控的阳离子通道从而能够降低神经毒性效应。
在进一步有利的实施方式中，非神经毒性纤溶酶原激活剂可以与至少一种进一步的治疗性试剂或与药学可接受载体联用。尤其有利的是与通过活化细胞来有助于避免组织损伤的治疗性试剂的联用，以促使已受损组织的再生或在防止继发性中风。有利的是与抗生素如醌类、抗凝血剂如肝素或水蛭素以及与胞磷胆碱或乙酰水杨酸的联用。
与至少一种凝血酶抑制剂的联用也是有利的。优选，也可以使用血栓调节蛋白和血栓调节蛋白类似物例如Solulin、Triabin或Pallidipin。进一步与抗炎症物质的联用是有利的，因为它们影响白细胞浸润。
下面通过个别的治疗实例概述本发明的施用方式和制剂。
实施例t-PA和DSPA的对比研究A.方法1、动物野生型小鼠(c57/Black 6)和t-PA缺陷型小鼠(t-PA-/-小鼠)(c57/Black6)(Carmeliet等，1994)由Dr.Peter Carmeliet，Leuven，Belgien提供。
2、脑组织蛋白抽提t-PA或DSPAα1输注后用酶谱分析进行脑组织中蛋白水解活性的测定(Granelli Piperno和Reich，1974)。对海马进行七天输注后麻醉小鼠，然后用PBS经心脏灌流，取脑。切下海马区域，转入Eppendorf管并培养于等体积(w/v)(约30-50μm)不合蛋白酶抑制剂的0.5％NP-40裂解缓冲液(0.5％NP-40，10mM Tris-HCl pH7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，1mM EDTA)中，用手动式玻璃匀浆机匀浆脑提取物并将其置于冰上30分钟。随后离心样品，取得上清液。检测存在的蛋白质含量(Bio-Rad试剂)。
3、蛋白酶的酶谱分析根据Granelli-Piperno和Reich(1974)的方法用酶谱分析检测样品或脑组织提取物中的蛋白水解活性。在非还原条件下对含重组蛋白质(至多100nmol)的样品或脑组织提取物(20μg)进行10％的SDS-PAGE。将凝胶从盘中取出，在1％Triton×100中洗涤2小时，之后覆盖在一块含有聚合纤维蛋白原和纤溶酶原的琼脂糖凝胶上(Granelli，Piperno和Reich，1974)。于37℃下将胶在湿润容器中温育直到蛋白水解条带可识别。
4、t-PA、DSPA向海马内的输注以及随后的红藻氨酸注射红藻氨酸损伤模型是以Tsirka等的研究(1995)为基础的。向动物腹腔内(i.p.)注射阿托品(4mg/kg)，之后通过腹腔注射戊巴比妥钠(70mg/kg)麻醉。然后将小鼠置于脑立体定位框架(stereotaktischen Rahmen)中，并将一个含有100μl PBS或重组人t-PA(0.12mg/ml，1.85μM)或DSPAα1(1.85μM)的微渗泵(Alzet型号1007D，Alzet CA.USA)皮下植入肩胛骨间。为了在中线附近导入液体，将泵经无菌管与脑套管针连接，并从穿越坐标为前囟-2.5mm，中侧(midolateral)0.5mm和背腹侧1.6mm的颅骨开孔插入。将套管针固定在合适的位点，并开启泵，以每小时0.5μl的流速灌注相应溶液共7天。
输注蛋白酶两天后，再次麻醉小鼠并再将其置于脑立体定位框架中。然后，向海马单侧注射溶于0.3μl PBS中的1.5nmol红藻氨酸(KA)。坐标为前囟-2.5mm，中侧1.7mm和背腹侧1.6mm。将兴奋性毒素(KA)以30秒注入。红藻氨酸处理后，为防止液体倒流将注射针头在该坐标再保持2分钟。
5、脑研究KA注射5天后，麻醉动物并用30ml PBS经心脏灌流，接着用70ml 4％的多聚甲醛溶液经心脏灌流，用相同的固定剂中固定24小时，随后在30％的蔗糖中进一步温育24小时。之后在冷冻切片机上切制冠状脑片(40μm)，然后或者用硫堇(BDH，澳大利亚)复染或者如下述进行免疫组织化学检测处理。
6、定量海马内神经元的损失率如前人所述进行对海马CA1-CA3子域内神经元损失的定量(Tsirka等，1995；Tsirka等，1996)。从所有处理组制备背侧海马的五个连续切片，所述切片确保带有KA注射和损伤区域。对这些切片的海马子域(CA1-CA3)进行照相扫描作图(Camera lucida Zeichnungen)。与相同放大数倍下作图的1mm标准进行比较以测定出子域全长。测定了含有有活力锥体神经元(呈正常形态)的组织长度和无神经元(不含细胞，无硫堇染色)的组织长度。对这些代表各海马子域完整神经元和神经元损失的长度取脑片平均值，并计算标准差。
7、使用或不使用t-PA或DSPA的纹状体内NMDA兴奋性毒性损伤麻醉野生型小鼠(c57/Black 6)并将其置于脑立体定位框架内(参见上述)。单独或与46μM rt-PA或46μM DSPAα1联合用50nmol NMDA单侧注射小鼠左侧纹状体。单独注射t-PA和DSPAα1作为对照(浓度均为46μM)。注射坐标为前囟-0.4mm、midolateral 2.0mm和背腹侧2.5mm。以0.2μl/分钟的速率5分钟转移溶液(对全部处理组总体积均为1μl)，注射后将针头在原位再保留2分钟以使液体回流降到最少。24小时后麻醉小鼠，用30ml PBS经心脏灌注，接着用70ml 4％多聚甲醛溶液经心脏灌注，用相同的固定剂固定24小时，之后在30％的蔗糖中进一步温育24小时。然后在冷冻切片机上切制脑片(40μm)，并置于明胶包被的载玻片上。
8、对注射NMDA后损伤体积的定量用Callaway等(2000)描述的方法完成对纹状体损伤体积的定量。制备跨越损伤区域的10个连续冠状切片。根据Callaway的方法使损伤区域可视化，并通过使用一台微电脑成像装置来定量损伤体积(MCID，Imaging Research Inc.，Brock University，Ontario，Canada)。
9、免疫组织化学根据标准方法完成免疫组织化学。将冠状切片在3％H2O2/10％甲醇中浸泡5分钟，之后在5％正常山羊血清中温育60分钟。将切片用抗-GFAP抗体(1∶1000；Dako，Carpinteria，CA，USA)孵育过夜以检测星形胶质细胞，或用抗-MAC-1抗体(1∶1000；Serotec，Raleigh，NC，USA)孵育过夜以检测小胶质细胞或用抗-DSPA多克隆抗体(Schering AG，Berlin)孵育过夜。漂洗后，将切片用适当的生物素化二抗(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)一起孵育。接着在用3，3′-Diaminobebzidin/0.03％H2O2最终染色之前用抗生物素蛋白/生物素一复合体(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)孵育60分钟。然后将切片置于明胶包被的载玻片上、干燥、脱水以及封上盖玻片。
10、静脉内给药t-PA或DSPA后被NMDA注射所诱导的组织损伤的扩大为了诱导纹状体的组织损伤，将小鼠立体定向注射NMDA。NDMA注射六小时后通过尾部静脉注射t-PA或DSPA(100μl；10mg/kg)。作为对照注射100μl0.9％NaCl随后灌注PBS。再经过24小时后将动物杀死测定损伤体积。
在第二次试验中多达15只小鼠的测试组用NDMA注射，NDMA注射24小时后输注t-PA或DSPA，并测定相应的组织损伤的扩大。为了证明脑内存在DSPA根据标准方法用抗-DSPA抗体对冠状切片染色。
B.结果1、输注的t-PA或DSPA经t-PA-/-小鼠的海马分布，并保持其蛋白水解活性最初的试验是为了证实DSPA和t-PA在7天灌注期间都保持它们的蛋白水解活性而设计的。为该目的，将等分量的t-PA和DSPA(100nmol)在37℃和30℃水浴中孵育7天。为检测蛋白水解活性，在非还原条件下将探针的5倍连续稀释液进行SDS-PAGE，用酶谱分析来评估蛋白水解活性。用一份冷冻保存7天的等分量t-PA和DSPA作对照。正如可从附图1看到的，在25℃和37℃下孵育这段时间仅造成微弱的DSPA或t-PA活性丧失。
2、输注后在t-PA-/-小鼠的海马提取物中可鉴定到t-PA和DSPA活性首先必须证实所输注的蛋白酶出现在被输注动物脑中，且在该区室中也仍然保持它们的蛋白水解活性。为此用t-PA或DSPA灌注t-PA-/-小鼠7天(参见上述)。然后用PBS经心脏灌注小鼠，并切除脑。分离海马同侧和对侧区以及小脑区(用作阴性对照)。将组织样品(20μg)进行SDS-PAGE，以及根据方法部分的说明作酶谱分析。正如可从附图2看到的，t-PA和DSPA活性在海马同侧区都被检测到了，但在对侧区也检测到一些活性。这表明，所注入的蛋白酶不仅在脑中保持了它们的活性，而且还扩散进了海马区。作为对照，从小脑制备的提取物中没有检测到活性。
3、DSPA的免疫组织化学评价为进一步证实DSPA确实已经扩散进入了海马区，输注DSPA后对t-PA-/-小鼠的冠状脑切片进行免疫组织化学分析。在海马区检测到了DSPA-抗原，其中输注区域的染色最深。这一结果证实所注入的DSPA是可溶的并确实出现在海马中。
4、DSPA输注不能恢复体内由红藻氨酸依赖的神经变性t-PA-/-小鼠表现对红藻氨酸依赖的神经变性的抗性。然而，rt-PA在海马内的输注完全恢复对红藻氨酸-依赖的损伤的敏感性。为判定该模型中DSPA是否可以替代t-PA，用微渗泵将t-PA或DSPA输注至t-PA-/-小鼠海马内。两组都测试了12只小鼠。2天后给动物注射红藻氨酸，随后是静养期。5天后杀死动物，取脑并处理(参见上述)。作为对照，用KA处理前还对t-PA-/-小鼠进行了PBS注入(n＝3)。
制备冠状脑切片，并用Nissl染色法检测神经元。如附图4a和4b所示，用PBS灌注的t-PA-/-小鼠对KA有抗性。然而，输注重组t-PA恢复了对KA处理的敏感性。相反，海马区输注相同浓度的DSPA不改变动物对KA的敏感性。
那些结果的定量是以获自各组12只小鼠的数据为基础的。在注入DSPA的12只小鼠中有两只观察到了轻微的神经变性。其原因尚不清楚，可能与DSPA的存在无关。综合数据已考虑了对这两只动物中观察到的这一轻微下效应。用t-PA处理的所有12只小鼠都对KA处理敏感。这些结果显示，当输注等摩尔浓度的t-PA或DSPAα1时，只有t-PA给药导致对KA诱导的神经变性的敏感性的恢复。
5、DSPA输注不导致小胶质细胞激活由t-PA输注产生的t-PA-/-小鼠KA敏感性的修复也导致小胶质细胞激活(Rogove等，1999)。为确定在t-PA-或DSPA输注及随后的KA处理后小胶质细胞激活的程度，用Mac-1抗体对小鼠冠状切片进行免疫组织化学染色以确定激活的小胶质细胞。t-PA输注后对KA敏感性的恢复导致Mac-1阳性细胞的明显增多。在用DSPA输注的小鼠中未观察到该现象。因此，KA处理后在DSPA的存在不导致小胶质细胞的激活。
6、小鼠海马区的DSPA和t-PA滴定用于输注的t-PA浓度是以Tsirka等(1995)所述浓度为基础的(100μl0.12mg/ml[1.85μM])。用低10倍量的t-PA(0.185μM)和高10倍量的DSPA(18.5μM)重复KA损伤试验。较低的t-PA浓度仍然能够恢复对KA处理的敏感性(n＝3)。尤其值得注意的是KA处理后输注浓度提高10倍的DSPA仅导致极少神经元的损失。这些数据有利地表明，DSPA不导致对KA敏感性的增强。
7、t-PA和DSPA对野生型小鼠中NMDA-依赖型神经变性的效应还检测了t-PA和DSPA在野生型小鼠神经变性模型中的效应。向这些小鼠纹状体中注射t-PA确定地导致由谷氨酸类似物NMDA引起的神经变性效应的增强(Nicole等，2001)。
在t-PA或DSPA(各46μM)存在下向野生型小鼠纹状体区注射总体积为1μl的NMDA。24小时后取脑，并根据Callaway的方法(Callaway等，2000)对损伤大小进行定量(参见上述)。正如可从附图7看到的，单独注射NMDA在所有处理小鼠(n＝4)中产生可重复性损伤。当联合使用t-PA和NMDA时，损伤大小提高大约50％(P＜0.01，n＝4)。明显相反的是，NMDA和相同浓度的DSPA的共同注射与单独注射NMDA相比不导致损伤大小的增加。
单独注射t-PA或DSPA不导致可检测的神经变性。单独给药时t-PA缺乏效应与Nicole等(2001)的结果一致。这些数据显示，DSPA的存在甚至在神经变性事件过程中也不增强神经变性。
为证实DSPA注射确实已经扩散进入了海马区，用DSPA抗体对冠状切片进行了免疫组织化学分析，检测表明，DSPA确实进入了纹状体区。
用间接色原体测试进行的纤溶酶原激活的动力学分析根据Madison E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.-J.，Sambrook J.F.(1989)Nature 339 721-724；Madison E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Bassel-Duby R.S.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 87，3530-3533以及Madison E.L.，GoldsmithE.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Gerard R.D.(1990)J.Biol.(Chme265，21423-21426用底物Lys-纤溶酶原(American Diagnostica)和Spectrozyme PL(American Diagnostica)进行对t-PA活性的间接色原体测试。在有或无辅因子DESAFIB(American Diagnostica)存在下都进行了测试。DESAFIB是用蛋白酶蛇毒凝血酶(Batroxobin)对高纯度人纤维蛋白原进行切割获得的可溶性纤维蛋白单体制剂。蛇毒凝血酶切割在纤维蛋白原Aα-链中的Arg16-Gly17结合位点从而释放纤维蛋白肽A。肽Gly-Pro-Arg-Pro不存在时，所产生的代表纤维蛋白I单体的des-AA-纤维蛋白原是可溶的。Lys-纤溶酶原的浓度变化范围在DESAFIB存在时为0.0125-0.2μM以及在无辅因子存在时为0.9-16μM。
不同刺激物在下的间接色原体测试。
根据上述引用的出版物完成标准间接色原体测试。使用了含有0.25-1ng酶、0.2μM Lys-纤溶酶原和0.62μM Spectrozym PL且总体积为100μl的探针。测试在存在缓冲液、25μg/ml DESAFIB、100μg/ml纤维蛋白原溴化氰片断(American Diagnostica)或100μg/ml刺激性13氨基酸肽P368下进行。在微量滴定板中进行分析，并持续1小时在“Molecular Devices Thermomax”中于波长405nm处每30秒检测一次光学密度。反应温度为37℃。
8、DSPA在静脉内应用时也不会造成神经组织损伤的增加在小鼠的纹状体中，组织损伤是通过注射NMDA诱导，接下来在其注射之后6或24小时静脉内施用t-PA或DSPA。与阴性对照相比，当NMDA-注射后24小时静脉输注t-PA时，实验动物被NMDA-注射所诱导的损伤组织扩大了约30％；相比较而言，DSPA并不会引起这样的组织损伤的增加(参见附图18)。通过用抗-DSPA-抗体染色冠状切片可以证明在NMDA注射后24小时静脉施用的DSPA可以进入到损伤的组织区域内(参见附图19)。而在NMDA-注射后6小时相应地静脉施用t-PA或DSPA，并不能检测到损伤组织的增加。其原因可能是在施用t-PA或DSPA的这一时刻血脑屏障仍然能够具有足够的屏障作用。因此，DSPA在静脉内施用时也不会显示出神经毒性的副作用。
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权利要求
1.纤溶酶原激活因子在制备用于治疗人类中风的静脉内施用的治疗剂中的用途，纤溶酶原激活因子的活性在纤维蛋白存在下至少增强650倍。
2.根据权利要求1的纤溶酶原激活因子的用途，其特征在于使用吸血蝙蝠的纤溶酶原激活因子(DSPA)或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1的纤溶酶原激活因子的用途，其中纤溶酶原激活因子至少含有组氨酸或丝氨酸残基，所述组氨酸或丝氨酸残基与天冬氨酸残基一起形成酶原三联体的至少一部分。
4.根据权利要求3的纤溶酶原激活因子的用途，其中丝氨酸残基位于与t-PA的位点292至少部分同源的位点、组氨酸残基位于与t-PA的位点305至少部分同源的位点和天冬氨酸残基位于与t-PA的位点447至少部分同源的位点。
5.根据权利要求4的纤溶酶原激活因子的用途，其中纤溶酶原激活因子选自以下t-PA突变体组t-PA/R275E；t-PA/R275E，F305H；t-PA/R275E，F305H，A292S。
6.根据权利要求1的纤溶酶原激活因子的用途，其中纤溶酶原激活因子带有Asp194上的点突变或在同源位点上的天冬氨酸的点突变，致使在纤维蛋白不存在的情况下纤溶酶原激活因子的催化活性构象的稳定性降低。
7.根据权利要求6的用途，其中Asp194被谷氨酸或天冬酰胺取代。
8.根据权利要求7的用途，其特征在于，t-PA中Asp194被Glu194或Asn194所取代。
9.根据权利要求1的纤溶酶原激活因子的用途，其中纤溶酶原激活因子在自溶环中含有至少一个突变，该突变导致在不存在纤维蛋白的情况下纤溶酶原与纤溶酶原激活因子间的功能性相互作用降低。
10.根据权利要求9的用途，其中在自溶环中的至少一个突变于野生型t-PA的氨基酸位点420至423或同源位点。
11.根据权利要求10的用途，其中突变选自由以下突变体组成的组L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。
12.根据权利要求1的纤溶酶原激活因子的用途，其中纤溶酶原激活因子是含有至少一个防止纤溶酶催化的点突变的酶原。
13.根据权利要求12的纤溶酶原激活因子的用途，其中点突变位于t-PA的位点15或275或在与之同源的位点上。
14.根据权利要求13的用途，其中谷氨酸在位点15或275处。
15.根据权利要求1的用途，其中组织纤溶酶原激活因子含有一个含有His420、Asn421、Ala422和Cys423的自溶环。
16.根据权利要求1的用途，其中纤溶酶原激活因子的特征在于具有位点194的点突变，该点突变导致在不存在纤维蛋白的情况下纤溶酶原激活因子催化活性构象稳定性降低。
17.根据权利要求16的用途，其中组织纤溶酶原激活因子的特征在于Phe194。
18.根据权利要求1的用途，其中纤溶酶原激活因子的特征在于具有防止纤溶酶催化的至少一个点突变。
19.根据权利要求18的用途，其中组织纤溶酶原激活因子含有Glu275。
20.根据权利要求1的用途，其中组织纤溶酶原激活因子含有根据Seq.IDNo.1所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求1的用途，其中纤溶酶原激活因子是具有含有Val420、Thr421、Asp422和Ser423的自溶环的尿激酶。
22.根据权利要求21的用途，其中尿激酶的特征在于具有在位点194上的点突变，该点突变导致在不存在纤维蛋白的情况下尿激酶的催化活性构象的稳定性降低。
23.根据权利要求22的用途，其中尿激酶含有Glu194。
24.根据权利要求21到23的一项的用途，其中尿激酶的特征在于具有防止纤溶酶催化的至少一个点突变。
25.根据权利要求1的用途，其中纤溶酶原激活因子是含有Seq.ID No.2所示的氨基酸序列的尿激酶。
26.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，其特征在于点滴输注。
27.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，其特征在于快速推注。
28.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，其特征在于单次快速推注。
29.含有Ile275的尿激酶用于制备治疗中风的药剂的用途，其中尿激酶是静脉内施用的。
30.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，用于中风发作3小时后治疗人类中风。
31.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，用于在中风发作6小时后治疗人类中风。
32.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，用于在中风发作9小时后治疗人类中风。
33.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，用于治疗中风发作时间不确定的中风病人。
34.根据上述权利要求中一项的纤溶酶原激活因子的用途，其在避免野生型t-PA神经毒性的情况下用于中风治疗。
35.用于根据上述权利要求中一项的用途的药物组合物，其含有在上述权利要求中所述的纤溶酶原激活因子以及至少一种额外的治疗活性成分或其药学可接受的盐。
36.根据权利要求35的药物组合物，其特征在于含有神经保护试剂。
37.根据权利要求36的药物组合物，其特征用于含有谷氨酸受体拮抗剂。
38.根据权利要求37的药物组合物，其特征在于含有竞争性或非竞争性拮抗剂。
39.根据权利要求35的药物组合物，其特征在于含有至少一种凝血酶抑制剂，优选选自下列血栓调节蛋白、血栓调节蛋白类似物、Triabin、Pallidipin或Solulin。
40.根据权利要求35的药物组合物，其特征在于含有至少一种抗凝血试剂，优选选自下列抗凝血试剂水蛭素、肝素、乙酰水杨酸或安克洛酶。
41.根据权利要求35的药物组合物，其特征在于含有抗炎症物质。
42.根据权利要求35的药物组合物，其特征在于含有抗生素。
43.根据权利要求35的药物组合物，其特征在于含有胞磷胆碱。
全文摘要
本发明涉及非神经毒性纤溶酶原激活因子的用途，例如，源自Desmodus rotundus(DSPA)或经遗传学修饰的纤溶酶原激活因子，尤其是人源的，用于制备注射用治疗人类中风的药物。
文档编号A61P7/02GK1849133SQ200480011863
公开日2006年10月18日 申请日期2004年4月30日 优先权日2003年5月2日
发明者M·索恩根, W·索恩根, W-D·施乐宁, R·麦德卡夫 申请人:帕昂德国有限公司