专利名称：由源于动物的虹彩色素上皮细胞的多能性干细胞生产组织细胞的方法、以及利用该方法 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由动物的虹彩色素上皮细胞生产多能性干细胞并由该多能性干细胞生产组织细胞的方法、以及利用该方法得到的组织细胞。
背景技术：
近年来，利用源于脑、脊髓的神经干细胞或ES细胞(胚胎干细胞)的多分化功能来生产细胞并对其进行移植的再生治疗技术为人所关注。
在考虑上述神经干细胞或ES细胞应用于治疗时，将产生因细胞移植引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞源的供需失衡等许多问题。
于是，若源于将成为移植对象的个体自身的细胞可以作为移植源使用，则自我移植将成为可能，上述的问题就可以得到解决。
作为被期待用于上述移植源的细胞，眼球的虹彩色素上皮细胞是其中一种。
虹彩色素上皮细胞是一种构建虹彩的细胞。其中，虹彩是用于根据光量而张开或收缩瞳孔从而来调节到达视网膜的光量的组织。
本发明人在此前成功地分离培养了鸡雏的虹彩色素上皮细胞，本发明人在非专利文献1(Experimental Cell Res.(1998)245，245-251)中已经对此作了报告。
进而，本发明人通过对上述非专利文献1中的方法进行变更，使哺乳动物(小鼠、大鼠、人胚胎)的虹彩色素细胞的分离培养变成了可能(参照非专利文献2(nature neuroscience(2001)4(12)，1163)。
关于虹彩色素上皮细胞，由于能够从患者本人身上采集一部分细胞，所以，如果能够由虹彩色素上皮细胞来生产组织细胞，则可以实现采用了患者自身细胞的再生治疗(在本发明人检索的范围内，没能发现涉及本发明的由源于动物的虹彩色素上皮细胞的干细胞生产组织细胞的方法以及由该方法得到的组织细胞的现有技术文献。)。
但是，由动物的虹彩色素上皮细胞生产神经系以外的组织细胞的方法，还未得到确立。
本发明是鉴于上述现有技术的问题而开发的，其目的在于提供一种能够解决因细胞移植所引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞源供需失衡等问题的、源于动物动物的虹彩色素上皮细胞的组织细胞的生产方法以及由该方法得到的组织细胞。
发明内容
本发明人通过对上述课题进行潜心研究，结果发现通过浮游凝集块培养方法对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养而得到干细胞，在特定的培养条件下维持该干细胞时，可以得到凝集块，并且，该凝集块形成胚状体(embryoid body)构造，在此胚状体中含有比如肌细胞、血管内皮样细胞等的各种组织细胞，从而完成了本发明。即，本申请发明人发现通过浮游凝集块培养方法对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养所得到的干细胞是具有向各种组织分化的能力的多能性干细胞。
为了解决前述课题，本发明的组织细胞的生产方法的特征在于，包括下述步骤，即通过浮游凝集块培养方法对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养，从而得到多能性干细胞的步骤；以及培养上述多能性干细胞，由该多能性干细胞得到组织细胞的步骤。
根据上述的结构，以现有公知的动物成体的虹彩色素上皮的分离方法，从动物的眼球取出虹彩组织，从虹彩组织分离虹彩色素上皮，将分离后的虹彩色素上皮，以浮游凝集块培养方法进行有选择性的培养，能够得到多能性干细胞。
进而，通过培养上述多能性干细胞，能够形成胚状体(embryoidbody)构造。
上述胚状体是，主要是由ES细胞诱导分化所产生的包含有象胚胎那样的组织的构造体。此胚状体由于包含了三胚叶性细胞，可以考虑源于虹彩的干细胞保有与ES细胞相似的全能性。因此，在本发明中，将该源于虹彩上皮细胞的被包含在胚状体构造中的细胞称为源于动物的虹彩色素上皮细胞的组织细胞。
此外，在本发明的组织细胞的生产中途所得到的多能性干细胞，具有能够相对简便地并且低侵袭性地从自身组织上采集、制作的优越性。也就是说，本发明不象现有ES细胞那样存在因来源于胎儿胚所导致的伦理性或免疫排斥的问题，另外，也不必象多能性成体干细胞(multipotent adult progenitor/stem cellsMAPC)那样采用诸如骨髓穿刺的高侵袭性的收集方法。
在本发明中，上述动物是比如鸡、小鼠、大鼠、人的任意一者。另外，本发明既可以使用上述动物在胎儿期的个体，也可以使用其出生以后的个体。上述出生以后的个体，指的是除出生前的胎儿之外的个体。作为出生后的个体，无论是性成熟后的成体，还是刚出生的幼体，任何时期的个体都可以被使用。
另外，上述多能性干细胞具有以下(1)、(2)的至少一种性质(1)为Oct-3/4阳性；(2)有三胚叶性分化能力。
关于上述(1)、(2)，将在实施例中加以说明。
另外，在本发明的组织细胞的生产方法中，在上述的从多能性干细胞得到组织细胞的步骤中，在分化条件下的培养中，使上述多能性干细胞分化为1种或1种以上的组织细胞。
在此，上述分化条件下的培养为，包括以分化细胞为目的的现有公知的所有条件下的培养。具体来讲，是指用添加了血清或各种生长因子(FGF、EGF、CNTF、RA等)的培养基，在由各种细胞外基质成分所包被的培养皿中进行的培养方法。如此，上述多能性干细胞具有通过分化条件下的培养而分化成1种或数种组织细胞的分化能力。
上述分化条件下的培养，优选使用血清进行培养。上述血清是例如牛胚胎血清或者鸡血清。
此外，关于上述分化条件下的培养，还可以更进一步的使用生长因子。上述生长因子可以使用比如EGF(epidermal growth factor上皮生长因子)、FGF(fibroblast growth factor成纤维细胞生长因子)等。
本发明的上述组织细胞来源于能够从患者本人采取到其细胞的一部分的虹彩色素上皮细胞。因此，根据本项发明，能够由动物的虹彩色素上皮细胞生产在再生治疗中可以用作移植源的组织细胞。
另外，本发明的组织细胞的生产方法的特征为，上述虹彩色素上皮细胞是通过虹彩组织取出工序和虹彩色素上皮分离工序来分离的，其中，所述虹彩组织取出工序为从动物的眼球取出虹彩组织，所述虹彩色素上皮分离工序为从取出后的上述虹彩组织中分离出虹彩色素上皮。
根据上述，通过有效地分离动物的虹彩色素上皮细胞，能够有效地生产本发明的组织细胞。
另外，本发明的特征为，上述虹彩组织取出工序包括下述阶段，即虹彩组织切除阶段，从动物的眼球仅仅切除虹彩组织；酶处理阶段，对上述切除的虹彩组织实施酶处理；以及虹彩组织恢复阶段，使上述酶处理后的虹彩组织恢复。
根据上述，通过从动物的眼球有效地仅仅取出虹彩组织，能够更有效地生产本发明的组织细胞。
本发明的上述组织细胞是根据本发明的组织细胞的生产方法所得到的，如上所述，来源于动物的虹彩色素上皮细胞。因此，能够将本发明的组织细胞作为能够解决因细胞移植引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞的供需失衡等问题的移植细胞源来提供。
此外，本发明的上述组织细胞是外胚叶细胞或源于外胚叶的细胞、中胚叶细胞或源于中胚叶的细胞、内胚叶细胞或源于内胚叶的细胞中的任意一者。进而，本发明的组织细胞形成用于构成生体内的器官的组织。该“构成生体内的器官的组织”，具体而言，是指构成诸如神经系器官、肌系器官、心脏、血管等的各器官的神经组织的神经组织、肌组织、心脏组织、血管组织等。
本发明的其他目的、特征和优点在以下的描述中会变得十分明了。此外，通过以下的说明来明确本发明的优点。
图1是表示本发明的组织细胞的生产方法的一个例子的概略步骤图。
图2是表示实施例1的干细胞的状态的图。
图3(a)以及图3(b)是表示在实施例1中，以结蛋白(肌细胞标记)抗体以及DAPI染色(核)进行标记后的凝集块的图。
图4是表示在实施例2中，由虹彩色素上皮细胞诱导各组织细胞的各阶段中的心肌细胞的出现情况的图。
图5是说明在小鼠初期发育过程中的Oct-3/4表达模式的图。
图6(a)以及图6(b)是表示在实施例3中，通过Oct-3/4抗体染色及DAPI染色对从大鼠得到的干细胞进行标记的结果的图。
具体实施例方式
以下，根据图1来说明本发明的一个实施方式。本发明并不限于此。
本发明人为了解决因细胞移植引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞的供需失衡等问题，生严了源于动物的虹彩色素上皮细胞的组织细胞。
本实施方式的组织细胞的生产方法包括以下步骤通过浮游凝集块培养方法对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养，从而得到多能性干细胞的步骤；以及培养上述多能性干细胞，从而由该多能性干细胞得到组织细胞的步骤。
换言之，本实施方式的组织细胞的生产方法，如图1所示，至少包括下述步骤从动物的眼球分离虹彩色素上皮细胞的虹彩色素上皮细胞分离步骤(步骤1，以下将步骤简称为S)；通过浮游凝集块培养方法对分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养，从而得到多能性干细胞的步骤(以下，称之为干细胞生产步骤)(S2)；以及用血清等培养上述多能性干细胞，从而由该多能性干细胞得到组织细胞的步骤(以下，称之为干细胞培养步骤)(S3)。另外，本发明的组织细胞的生产方法并不限于此，还可以包括其它的步骤。另外，S3的干细胞培养步骤还可以被称为组织细胞诱导步骤。
关于上述动物，如果是出生后的个体，自幼体到成体的任何一个时期的个体均可。换言之，根据本实施方式的组织细胞的生产方法，当然能够生产源于动物幼体的虹彩色素上皮细胞的组织细胞，也能够生产来源于动物成体的虹彩色素上皮细胞的组织细胞。
关于S1的虹彩色素上皮细胞分离步骤，只要能够分离虹彩色素上皮细胞即可，其具体方法等并不受限制。一般来说，利用现有公知的方法，从动物的眼球取出虹彩组织，从取出的虹彩组织中分离虹彩色素上皮细胞即可。作为从动物眼球取出虹彩组织的方法，优选采用上述非专利文献2(nature neuroscience(2001)4(12)，1163)中记载的方法。
关于S2的干细胞生产步骤，能够仅仅对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性的培养即可，其具体方法等并不受限制。一般来说，利用现有公知的方法，仅仅对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性的培养即可。
在干细胞生产步骤(S2)中，包括作为工序6(以下，将工序简称为P)，将上述虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)中分离的虹彩色素上皮细胞从凝集状态解离为一个一个的细胞的细胞解离阶段；作为P7，仅仅对分离的虹彩色素上皮细胞进行有选择性的培养的细胞培养阶段。
以下，详细说明干细胞生产步骤(S2)的各阶段P6以及P7。首先，在P6的细胞解离阶段中，将分离后的虹彩色素上皮的片状的细胞解离成一个一个的细胞。
比如，在P6的细胞解离阶段中，使用市面上销售的胰蛋白酶溶液，将分离后的虹彩色素上皮的片状的细胞解离成一个一个的细胞。另外，比如，细胞解离阶段(P6)，不使用胰蛋白酶溶液，而是用市面上销售的移液器进行移液操作，也可以将分离后的虹彩色素上皮的细胞解离成一个一个的细胞。
进而，在P6的细胞解离阶段中使用的试剂和器材，并无特别限定，可以使用现有公知的、能够将分离后的虹彩色素上皮细胞从凝集状态解离为一个一个的细胞的试剂和器材。
在细胞培养步骤(P7)中，以单独或组合添加FGF(fibroblastgrowth factor成纤维细胞生长因子)、LIF(leukemia inhibitoryfactor白血病抑制因子)或SCF(human SCF(Stem Cell Factor人干细胞因子)的无血清培养基，在浮游状态下对分离后的虹彩色素上皮细胞实施培养。由此，可以使上述虹彩色素上皮细胞在未分化状态下增加。其结果是，得到的组织细胞也将增多。在此阶段中，优选使用“Science 1992225；1707-1710”中记载的浮游凝集块培养法(neurosphere法)对从动物的眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行有选择性的培养。
比如，在P7的细胞培养阶段中，在市面上销售的无血清培养基中添加市面上销售的N2添加剂并将其用作浮游凝集块培养用的培养液。一边用市面上销售的摇床进行旋转，一边在上述浮游凝集块培养用的培养液中对P6的细胞解离阶段所解离的上述虹彩色素上皮细胞进行培养。由此，可以有选择性地分离、收集其中含有较多的多能性干细胞的细胞团。
另外，在P7的细胞培养阶段中使用的培养液和试剂，并无特别限定，可以使用现有公知的、能够得到上述干细胞的培养液和试剂。
此外，在本实施方式中，P7的细胞培养阶段的培养期间，可根据需要进行适当的设定。但是，此时，若培养时间过长，则可能造成所得到的凝集块过大而分化。所以，在本实施方式中，优选在3～4天解离并传代培养。
然后，在S3的干细胞培养步骤中，使用血清来培养在P7的细胞培养阶段中得到的干细胞。在S3的干细胞培养步骤中，能够使用血清培养上述干细胞即可，其具体方法等并不受限制。一般来说，使用现有公知的方法培养上述干细胞即可。由此，比如，可以通过使用市面上销售的移液器，将上述干细胞转移到含有血清的培养基中进行培养。
上述血清，比如，可以是牛胚胎血清或者鸡血清，但并不特别限定于此。另外，在本实施方式下，可以使用1种上述血清，也可以根据需要使用2种或2种以上。
另外，上述血清的浓度优选5％～30％，尤其优选10％～20％，若能以该血清浓度进行培养，可以得到良好的结果。但是，即使高于或者低于上述浓度也能够实施本发明，所以，并不限于上述血清浓度。
本实施方式中，除上述血清之外，还可以使用生长因子来培养上述干细胞。上述生长因子，具体来说为，比如，EGF(epidermal growthfactor上皮生长因子)、FGF(fibroblast growth factor成纤维细胞生长因子)等。在本实施方式中，可以使用1种上述生长因子，也可以根据需要使用2种或2种以上。
另外，上述生长因子的浓度，并不受特殊限制，可以根据需要做适当的设定。
另外，在本实施方式中，虽然未进行特别限制，但在S3的干细胞培养步骤中，上述干细胞的培养期间优选1～3个月。在上述S3的干细胞培养步骤中，如果培养期间小于或等于1个月(特别是小于或等于2周)，则诱导分化的效率将会下降，因此，并不理想；相反地，如果培养期间大于或等于3个月，则在凝集块内部的细胞生存将会变得困难，所以，并不理想。
在本实施方式中，通过进行上述S3的干细胞培养步骤而得到胚状体。该胚状体源于动物的虹彩色素上皮细胞，而该虹彩色素上皮细胞是外胚叶性的细胞。因此，在本实施方式中得到的上述胚状体中含有神经干细胞，除此以外，在上述胚状体中例如还含有肌细胞、血管内皮样细胞等的各种组织细胞。像这样，根据本实施方式，通过S3的干细胞培养步骤，能够得到源于动物的虹彩色素上皮细胞的组织细胞。
本实施方式的组织细胞的生产方法是通过虹彩组织取出工序和虹彩色素上皮分离工序来分离上述虹彩色素上皮细胞的方法，其中，该虹彩组织取出工序为从动物的眼球取出虹彩组织，该虹彩色素上皮分离工序为从上述取出的虹彩组织中分离出虹彩组织上皮。此外，本发明的组织细胞的生产方法并不仅限于此，也可以包括其他的工序。
也就是说，如图1所示，本实施方式的组织细胞的生产方法至少包括虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)、干细胞生产步骤(S2)以及干细胞培养步骤(S3)。进而，上述虹彩色素上皮细胞分离步骤(S1)还包括下述的虹彩组织取出工序(P1)和虹彩色素上皮分离工序(P2)。另外，本发明的组织细胞的生产方法并不限于此，还可以包括其他的步骤。
关于上述虹彩组织取出工序(P1)，只要能够从动物的眼球取出虹彩组织即可，其具体方法等并不受限制。一般来说，使用现有公知的方法，从动物的眼球取出虹彩组织即可。优选的是，使用上述非专利文献2(nature neuroscience(2001)4(12)，1163)中记载的方法，从动物的眼球取出虹彩组织即可。
在此，如图1所示，上述虹彩组织取出工序(P1)包括，作为P3的从动物的眼球仅仅切除虹彩组织的虹彩组织切除阶段；作为P4的对切除后的虹彩组织进行酶处理的酶处理阶段；以及作为P5的使上述酶处理后的虹彩组织恢复的虹彩组织恢复阶段。另外，本发明的组织细胞的生产方法并不仅限于此，还可以包括其他的阶段。
以下，对虹彩组织取出工序(P1)的各个阶段P3～P5进行详细的说明。首先，在P3的虹彩组织切除阶段中，只要从动物的眼球仅仅取出虹彩组织即可，其具体的方法并不受限制。一般来说，使用现有公知的方法，从动物的眼球仅仅切除虹彩组织即可。
比如，虹彩组织切除阶段(P3)，使用市面上销售的微型手术剪从动物的眼球仅仅切除虹彩组织即可。
在P4的酶处理阶段，为了能够容易地从虹彩组织分离虹彩色素上皮而对虹彩组织进行酶处理，其具体的方法并不受限制。一般来说，使用现有公知的方法，为了能够容易地从虹彩组织分离虹彩色素上皮而对虹彩组织进行酶处理即可。
比如，在从鸡的眼球分离虹彩色素上皮时，在P4的酶处理阶段中，使虹彩组织在含有市面上销售的分散酶的分散酶溶液中反应15～40分钟之后，使其在含有市面上销售的EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸)的EDTA溶液中反应20～30分钟。另外，对用于P4的酶处理阶段的酶和试剂，并没有特别的限制，可以使用现有公知的能够容易进行从虹彩组织分离虹彩色素上皮处理的酶和试剂即可。
在P5的虹彩组织恢复处理阶段中，使因酶处理而变得衰弱的虹彩组织恢复，其具体的方法并不受限制。一般来说，使用现有公知的方法，使因酶处理而变得衰弱的虹彩组织恢复即可。
比如，在P5的虹彩组织恢复阶段中，在P4的酶处理阶段的反应后，使虹彩组织在含有市面上销售的牛胚胎血清的培养液中反应20～30分钟，从而使虹彩组织恢复。此外，在P5的虹彩组织恢复处理阶段中使用的含有血清的培养液和试剂，并没有特别的限制，可以使用现有公知的能够使因酶处理而变得衰弱的虹彩组织恢复的含有血清的培养液。
另外，在虹彩组织取出工序(P1)中，P4的酶处理阶段以及P5的虹彩组织恢复处理阶段的反应时间尤为重要。通过调整P4的酶处理阶段的上述虹彩组织在分散酶溶液中的反应时间及在上述EDTA溶液中的反应时间、P5的虹彩组织恢复处理阶段的在上述含有牛胚胎血清的培养液中的反应时间，不但能够从鸡的眼球分离虹彩色素上皮，而且，还能够从诸如小鼠、大鼠、人等的哺乳类的眼球分离虹彩色素上皮。
在从小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用25-37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应15-40分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05-0.1％使其反应16-40分钟，用含有8-10％牛胚胎血清的培养液使其反应30-120分钟。
另外，在从出生后10天的小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应16分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应20分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应90分钟。
此外，在从出生后12天的小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应20分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应25分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应60分钟。
此外，在从出生后2个月的小鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应40分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应30分钟。
在从大鼠的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应15-40分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应15-60分钟，用含有8-10％牛胚胎血清的培养液使其反应30-120分钟。
在从人胎儿的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，优选的是，用25-37℃的上述分散酶溶液500-1000U/ml使上述虹彩组织反应15-30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05-0.1％中使其反应15-40分钟，用含有8-10％牛胚胎血清的培养液使其反应10-60分钟。
另外，在从出生后19周的人胎儿的眼球分离虹彩色素上皮的情况下，特别优选的是，用37℃的上述分散酶溶液1000U/ml使上述虹彩组织反应30分钟，在室温下用上述EDTA溶液0.05％使其反应30分钟，用含有8％牛胚胎血清的培养液使其反应60分钟。
此外，作为上述培养液，例如，可以使用由INVITROGEN公司生产的DMEM培养基，再适量添加在市面上销售的牛胚胎血清即可。
在P2的虹彩色素上皮分离工序中，只要能够从在虹彩组织取出工序(P1)取出的虹彩组织中仅仅分离虹彩色素上皮即可，并不对其具体的方式进行限定，其中，上述虹彩组织是由虹彩基质和虹彩色素上皮构建的。一般而言，利用现有公知的方式，从虹彩组织中仅仅分离虹彩色素上皮即可。
在P2的虹彩色素上皮分离工序中，例如，可以利用在市面上销售的微型镊子，从恢复后的上述虹彩组织中仅仅剥离并收集虹彩色素上皮，由此，来分离虹彩基质和虹彩色素上皮。
像这样，根据本实施方式，通过P1的虹彩组织取出工序和P2的虹彩色素上皮解离工序来分离上述虹彩色素上皮细胞，能够有效地分离上述虹彩色素上皮细胞，由此有效地生产上述组织细胞。
如上所述，本实施方式的组织细胞来源于可从患者本人采集其一部分细胞的虹彩色素上皮细胞。因此，根据本实施方式，能够由患者本人的虹彩色素上皮细胞生产具有向各种组织细胞分化的能力的多能性干细胞。并且，通过在各种分化条件下培养该多能性干细胞，能够生产在再生治疗中使用的移植源的各种组织细胞。另外，将本实施方式的组织细胞作为移植细胞源来使用，能够解决因细胞移植引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞源的供需失衡等问题。
<实施例>
以下，根据实施例以及图2～图6(b)更具体的说明本发明，但是本发明并不限于此。
<实施例1>
(虹彩色素上皮细胞的分离)使用市面上销售的微型手术剪从鸡雏的眼球仅切除虹彩组织。使该虹彩组织在37℃的分散酶溶液(“ディスパ一ゼ(dispase)”，合同清酒公司生产)1000U/ml中反应15-40分钟，然后，在室温下使其在0.05％EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸)溶液中反应20-30分钟。
在反应后，使上述虹彩组织在含有8％牛胚胎血清的培养液(“DMEM培养基”，INVITROGEN公司生产)中反应30-60分钟，使上述虹彩组织恢复。之后，利用在市面上销售的微型镊子，从上述虹彩组织中仅仅剥离并收集虹彩色素上皮，从而分离虹彩基质和虹彩色素上皮。
(浮游凝集块培养法)上述分离后的虹彩色素上皮细胞，通过市面上销售的胰蛋白酶溶液来解离。然后，用“Science 1992225；1701-1710”中所述的浮游凝集块培养法(neuroshpere法)对该解离后的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养。
作为浮游凝集块培养的培养基，在无血清培养基(“DMEM/F12培养基”INVITROGEN公司生产)中添加100分之1量的N2添加剂，进而，添加20ng/mL的FGF2(fibroblast growth factor-2成纤维细胞生长因子-2，PeproTech公司生产)或1000U/mL的LIF(leukemiainhibitory factor白血病抑制因子，ESGRO，Chemicon公司生产)及10ng/mL的SCF(human SCF(Stem Cell Factor人干细胞因子)，DIACLONE公司生产)。
一边使用市面上销售的摇床进行旋转，一边用上述浮游凝集块培养基，在二氧化碳培养机中将胰蛋白酶处理后的上述虹彩色素上皮细胞培养3～7天，从而得到干细胞。所得到的干细胞的状态如图2(a)所示。
(通过干细胞培养来形成凝集块)对上述从鸡雏的眼球分离的虹彩色素上皮细胞实施了上述浮游凝集块培养后，如下所述地进行干细胞培养。
利用市面上销售的移液器，将通过上述浮游凝集块培养法得到的源于上述鸡雏的虹彩色素上皮细胞的干细胞移至下述(b)和(c)所示的组分的培养基中。
(b)含有牛胚胎血清(8％)和鸡血清(2％)的DMEM培养基(INVITROGEN公司生产)。
(c)含有牛胚胎血清(8％)和生长因子EGF及FGF2(各20ng/mL)的DMEM培养基(INVITROGEN公司生产)。
分别使用上述(b)和(c)的培养基对上述干细胞培养1～2个月。其结果为，分别得到如图2(b)、2(c)所示的凝集块。
以结蛋白(肌细胞标记)抗体、DAPI染色(核)来标记分别用(b)、(c)的培养基进行培养所得到的凝集块。其结果如图3(a)以及图3(b)所示。图3(a)表示用图2(b)所示的培养基培养干细胞所得到的凝集块，图3(b)表示用图2(c)所示的培养基培养干细胞所得到的凝集块。在图3(a)及图3(b)中，白色部分表示由结蛋白标记的凝集块的图像，灰色部分表示由DAPI染色(核)标记的凝集块的图像。
<实施例2>
以无血清培养基(“DMEM/F12培养基”INVITROGEN公司生产)、100分之1量的N2添加剂(INVITROGEN公司生产)、20ng/mL的FGF2(fibroblast growth factor-2成纤维细胞生长因子-2，PeproTech公司生产)对与实施例1同样地进行解离的虹彩色素上皮细胞实施3天的培养，然后，在含有下述(1)～(3)的组分的3种培养基中，以浮游凝集块培养法进行1～2个月的培养。
(1)牛胚胎血清(8％)、EGF(20ng/mL)及FGF2(20ng/mL)。
(2)牛胚胎血清(8％)及鸡血清(2％)。
(3)牛胚胎血清(8％)、鸡血清(2％)、EGF(20ng/mL)及FGF2(20ng/mL)。
从所得到的凝集块中提取RNA，用RT-PCR法确认作为外胚叶标记的α胎蛋白(fetoprotein)、作为中胚叶标记的鸡球蛋白(myosin)及MEF2、作为内胚叶标记的pas6及微管蛋白J是否有基因表达。其结果，在上述(1)～(3)的任一条件下，上述标记基因的表达都得到了确认。据此，可知在所得到的凝集块中包含有已分化为三胚叶所有组织系列的细胞。
由此结果可知，上述凝集块主要由ES细胞诱导分化而形成，具有与被称为胚叶体的细胞构造体同样的性质，其中，该胚叶体象胚胎那样地包含有各种分化细胞。虹彩色素上皮细胞是外胚叶性的细胞，但通过本实施例显示出，可由源于动物的虹彩色素上皮细胞的干细胞进行超出胚叶性的分化。也就是说，通过干细胞生产步骤所得到的细胞是具有能够分化为中胚叶、内胚叶、外胚叶的任一者的三胚叶分化能力的多能性干细胞。
另外，图4表示分别对用无血清培养基进行了3天时间的培养的培养阶段(即，干细胞生产步骤S2)和其后1～2个月的培养的阶段(干细胞培养步骤S3)中的培养细胞提取RNA，并用RT-PCR法确认了心肌细胞特异性基因的表达诱导的结果。
泳道(lane)1为在S2的干细胞生产步骤的细胞培养阶段(S7)中培养第2天的样本的结果。另外，泳道2为在S3的干细胞培养步骤中在上述(3)的条件下培养2个月后的样本的结果。由该图所示的结果可知，在泳道1的干细胞生产步骤中是多能性干细胞向组织细胞分化以前的状态，在泳道2的干细胞培养步骤中正向心肌细胞分化的状态。
<实施例3>
Oct-3/4是在全能性未分化细胞中进行特异性表达的分子，其表达得以确认的细胞非常有限(参考图5所示的“小鼠初期发育过程中的Oct-3/4表达模式”))。在出生后，仅仅在作为生殖干细胞的精原细胞中进行表达，在其它的体细胞组织中不进行表达。
在本实施例中，研究了Oct-3/4在出生后的小鼠及大鼠的各自的虹彩组织以及从虹彩组织得到的干细胞的一部分中的表达。其结果如图6(a)、图6(b)所示。图6(a)、图6(b)表示，以Oct-3/4抗体染色及DAPI染色对根据本发明的方法分别从出生后第11天、第3周的大鼠取得的干细胞进行标记后的结果，表示了被标记为白色的部分。从图6(a)、图6(b)的结果可知，在出生后的小鼠和大鼠的虹彩组织以及从该组织中得到的干细胞的一部分中存在Oct-3/4基因的表达和基因产物(Oct-3/4蛋白质)的表达(即，为Oct-3/4阳性)。
该结果强烈暗示了在虹彩这种体细胞组织中也可能含有维持未分化全能性的细胞，如果能对该细胞实施提纯、培养，并在适当的条件下进行诱导分化，就能够生产各种组织细胞。目前进行了很多应用ES细胞的再生治疗的研究，但是伦理问题却是一个很大的问题。如果应用虹彩组织，就可以使用患者本人的细胞，则有望实现自我移植的再生治疗。
另外，在用于实施本发明的最佳方式中所说明的具体实施方式
或实施例仅仅是用来阐明本发明的技术内容的示例。本发明并不限于上述具体示例，不应对本发明进行狭义的解释，可在本发明的精神和权利要求的范围内进行各种变更来实施之。
工业可利用性如上所述，根据本发明的组织细胞的生产方法，可以获得下述效果，即能够由动物的虹彩色素上皮细胞生产具有向各种组织细胞分化的能力的多能性干细胞，并进而由该多能性干细胞生产各种组织细胞。该组织细胞能够在再生治疗中作为移植源来使用。
此外，通过本发明的生产方法得到的组织细胞可以作为能够解决因细胞移植引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞的供需失衡等问题的移植源来提供。
权利要求
1.一种组织细胞的生产方法，其特征在于，包括下述步骤按照浮游凝集块培养方法对从动物眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养，由此得到多能性干细胞的步骤；以及培养上述多能性干细胞，从该多能性干细胞得到组织细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的组织细胞的生产方法，其特征在于上述动物是鸡、小鼠、大鼠、人的任意一者。
3.根据权利要求1或2所述的组织细胞的生产方法，其特征在于上述动物为出生后的个体。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的组织细胞的生产方法，其特征在于上述多能性干细胞为Oct-3/4阳性、和/或具有三胚叶性分化能力。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的组织细胞的生产方法，其特征在于上述虹彩色素上皮细胞是通过从动物的眼球取出虹彩组织的虹彩组织取出工序、和从取出的上述虹彩组织分离虹彩色素上皮的虹彩色素上皮分离工序来分离的。
6.根据权利要求5所述的组织细胞的生产方法，其特征在于，上述虹彩组织取出工序包括下述阶段虹彩组织切除阶段，从动物的眼球仅仅切除虹彩组织；酶处理阶段，对上述切除的虹彩组织进行酶处理；以及虹彩组织恢复阶段，使上述进行了酶处理的虹彩组织恢复。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的组织细胞的生产方法，其特征在于在上述从多能性干细胞得到组织细胞的步骤中，在分化条件下的培养中，使上述多能性干细胞分化为1种或1种以上的组织细胞。
8.根据权利要求7所述的组织细胞的生产方法，其特征在于在上述分化条件下的培养中使用血清进行培养。
9.根据权利要求8所述的组织细胞的生产方法，其特征在于上述血清为牛胚胎血清或鸡血清。
10.根据权利要求8或9所述的组织细胞的生产方法，其特征在于在上述分化条件下的培养中，进而使用生长因子。
11.根据权利要求10所述的组织细胞的生产方法，其特征在于上述生长因子是EGF或FGF。
12.一种组织细胞，其特征在于该组织细胞是根据权利要求1至11中的任一项所述的组织细胞的生产方法所得到的。
13.根据权利要求12所述的组织细胞，其特征在于上述组织细胞是外胚叶细胞或源于外胚叶的细胞、中胚叶细胞或源于中胚叶的细胞、内胚叶细胞或源于内胚叶的细胞的任意一者。
14.根据权利要求12或13所述的组织细胞，其特征在于上述组织细胞形成用于构成生体内的器官的组织。
全文摘要
本发明提供一种能够解决诸如因细胞移植引起的免疫排斥问题、伦理问题、移植细胞源的供需失衡等问题的、源于动物的虹彩色素上皮细胞的组织细胞的生产方法以及利用该方法所得到的组织细胞。在本发明的组织细胞的生产方法中，首先，通过浮游凝集块培养方法对从动物眼球分离的虹彩色素上皮细胞进行选择性培养从而得到多能性干细胞。接着，使用血清等对该多能性干细胞实施培养，由此生产各种组织细胞。
文档编号A61K35/12GK1798833SQ20048001500
公开日2006年7月5日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月11日
发明者小阪美津子 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构