重组润滑素分子及其用途的制作方法

专利名称：重组润滑素分子及其用途的制作方法
专利说明重组润滑素分子及其用途 本发明涉及新的重组润滑素分子及其作为润滑剂、抗粘连剂和/或关节内补充物应用于例如，滑膜关节、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜的用途。
背景技术：
滑膜关节的最佳功能性依赖于关节组织间极低的摩擦系数。通常，关节软骨上保持了一个邻接且润滑良好的表面。但在骨关节炎(OA)期间，润滑程度的降低促使了软骨基质降解和原纤维形成；这随后促成了关节功能异常和疼痛。润滑程度的降低也可以导致包括风湿性关节炎(RA)在内的关节功能障碍和其它关节炎形式的疼痛。润滑表面也有助于其它组织(例如腱)实现最佳功能性。正常腱功能除必需润滑表面外，还必需防止腱表面的细胞粘连。例如，在屈肌腱的损伤和修复中，腱粘连的形成是最常见的并发症。天然润滑素蛋白与巨核细胞刺激因子(MSF)前体蛋白相关。PRG4(蛋白聚糖4)是对MSF的命名，已被UCL/HGNC/HUGO人基因命名数据库采用。US6433142和US20020137894(本文所引用的全部专利和专利申请均被完整引入作为参考)描述了PRG4蛋白(即MSF前体蛋白)。由PRG4基因的外显子6编码的多肽被强糖基化后，似乎对PRG4-相关蛋白在例如，关节软骨表面之间充当润滑剂而言必不可少。有研究指出覆盖腱鞘的内膜滑膜细胞也可合成PRG4糖蛋白；该糖蛋白也很可能来源于腱细胞(Rees et al.，2002)。该糖蛋白主要存在于腱的纤维软骨区。作为对其滑液功能的补充，该糖蛋白可能通过阻止细胞粘连腱表面，以及通过在腱行使正常功能期间提供润滑，从而对腱起重要的细胞保护作用。PRG4(也被称为“润滑素”)基因的外显子6编码大约76-78个重复的KEPAPTT样序列和6个重复的XXTTTX样序列。改变本发明所述重组润滑素蛋白中可比重复序列的数目有助于研发在提高关节内润滑程度和抵消组织间不良粘连方面有所修饰的生物疗法。
发明概述
本发明涉及新的重组润滑素(lubricin)分子及其作为润滑剂、抗粘连剂和/或关节内补充物的用途。为了最优化表达参数和研究全部大约76-78个KEPAPTT样序列的功能必要性，设计了能够使得能够合成具有不同O-连接的寡糖取代程度的重组润滑素蛋白的润滑素表达构建体。该设计是通过将可变数目的KEPAPTT样序列整合进包括外显子1-5、外显子6的5′-和3′-侧翼区以及外显子7-12在内的“核心”cDNA构建体中而得以实现。重复插入编码多个KEPAPTT样序列的“合成cDNA盒”有助于生成不同大小的重组润滑素构建体。这些研究最初集中在构建体PRG4-Lub1(含合成“cDNA盒-1”的DNA(SEQ ID NO1)，编码4个KEPAPTT序列)。本发明重组润滑素蛋白与若干种天然人润滑素同工型共有一级结构(参见US6743774、US20040072741和WO0064930)。在已表征的同工型中，编码同工型一级结构的PRG4基因外显子的组成各不相同。例如，PRG4基因的外显子1-12编码V0同工型，即全长同工型，外显子1-4和6-12则编码V1同工型，该同工型仅缺少由外显子5编码的片段。外显子1-3和6-12编码V2同工型，该同工型缺少由外显子4和5编码的片段。最后，外显子1、3和6-12则编码V3同工型，该同工型缺少由外显子2、4和5编码的片段。也可能存在其它同工型，已有报道公开了若干种相关的突变蛋白(参见US20020086824)。具体而言，本发明提供了具有重复的KEPAPTT样序列的重组润滑素蛋白。在优选实施方案中，本发明提供了包括SEQ IDNOS9、13、17、21或25所示序列的分离蛋白。在相关实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NOS7、11、15、19或23所示序列的分离蛋白。在进一步的相关实施方案中，本发明提供了含有重组润滑素蛋白的编码核酸序列的分离的多核苷酸。在优选实施方案中，本发明提供了含有上述蛋白的编码核酸序列的分离的多核苷酸。在进一步的相关实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NOS6、1O、14、18或22所示序列在序列的全长上具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的分离的多核苷酸。本发明的相关方面还提供了包含与SEQ ID NO27的(N-2)个重复连接的SEQ ID NO26的分离的蛋白，其中N为3-200的整数。在进一步的相关实施方案中，本发明提供了分离的蛋白，包含SEQ IDNO26加SEQ ID NO2加[SEQ ID NO27的(N-2)个重复]加SEQ IDNO29，其中N为3-200的整数。在该节所指出的本发明相关方面的实施方案中，N更优选地为5-50的整数，还要更优选的是N为10-30的整数。表1.对具有序列标志符的序列的鉴定 本发明的相关实施方案还提供了含有药学可接受载体中的治疗有效量的重组润滑素蛋白组合物。在某些实施方案中，该组合物还含有乙酰透明质酸或hylan。本发明进一步提供了治疗被试者的方法，包括获得重组润滑素蛋白组合物；并将该组合物施用于被试者的组织。在本发明该方法的相关实施方案中，所述组织选自软骨、滑膜、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜。在本发明该方法的进一步相关实施方案中，该方法还包括选自下列的步骤向被试者提供麻醉剂；向被试者提供抗炎症药物；向被试者提供抗生素；从被试者抽吸液体；清洗被试者的组织；并对被试者的组织成像。在其它相关实施方案中，所述被试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、马和人。在其它实施方案中，本发明还提供了含有编码重组润滑素蛋白的多核苷酸的表达载体，其中该多核苷酸与表达控制序列可操作连接。在相关实施方案中，本发明提供了制备重组润滑素蛋白的方法，包括在液体培养基内培养由所述表达载体转化的细胞；和从该培养基中收集重组润滑素蛋白。蛋白收集步骤可进一步包括通过膜过滤培养基使所述蛋白浓缩；收集被截留在膜上的蛋白；和将收集到的蛋白溶解在含有浓度范围为0.1-2.0M的L-精氨酸盐酸盐的缓冲盐溶液中。在另一种相关实施方案中，本发明提供了对重组润滑素蛋白具有特异性的分离抗体。下述优选实施方案和权利要求的内容有助于理解本发明的其它特征和优势。
发明详述
被用于生成重组润滑素蛋白的碱基DNA构建体可能在PRG4基因外显子6的5′和3′具有可变排列的序列。例如，该碱基DNA构建体可能包括编码生长调节素B样结构域(外显子2-4)或血红素结合蛋白样结构域(外显子7-9)的序列的可变排列。在外显子6的3’具有不同外显子排列的碱基DNA构建体的实施方案可能包括分别仅具有外显子7、8、9、10、11或12，或外显子对(7和8)、(7和9)、(7和10)、(7和11)、(7和12)、(8和9)、(8和10)、(8和11)、(8和12)、(9和10)、(9和11)、(9和12)、(10和11)、(10和12)或(11和12)，或外显子三联体(7、8和9)、(7、8和10)、(7、8和11)、(7、8和12)、(7、9和10)、(7、9和11)、(7、9和12)、(7、10和11)、(7、10和12)、(7、11和12)、(8、9和10)、(8、9和11)、(8、9和12)、(8、10和11)、(8、10和12)、(8、11和12)、(9、10和11)、(9、10和12)、(9、11和12)或(10、11和12)，或外显子四联体(7、8、9和10)、(7、8、9和11)、(7、8、9和12)、(7、8、10和11)、(7、8、10和12)、(7、8、11和12)、(7、9、10和11)、(7、9、10和12)、(7、9、11和12)、(7、10、11和12)、(8、9、10和11)、(8、9、10和12)、(8、9、11和12)、(8、10、11和12)或(9、10、11和12)，或外显子五联体(7、8、9、10和11)、(7、8、9、10和12)、(7、8、9、11和12)、(7、8、10、11和12)、(7、9、10、11和12)或(8、9、10、11和12)或外显子六联体(7、8、9、10、11和12)的碱基DNA构建体。此外，在外显子6的5’具有不同外显子排列的碱基DNA构建体的实施方案可能包括分别仅具有外显子1、2、3、4或5，或外显子对(1和2)、(1和3)、(1和4)、(1和5)、(2和3)、(2和4)、(2和5)、(3和4)、(3和5)或(4和5)，或外显子三联体(1、2和3)、(1、2和4)、(1、2和5)、(1、3和4)、(1、3和5)、(1、4和5)、(2、3和4)、(2、3和5)、(2、4和5)或(3、4和5)，或外显子四联体(1、2、3和4)、(1、2、3和5)、(1、2、4和5)、(1、3、4和5)或(2、3、4和5)，或外显子五联体(1、2、3、4和5)的碱基DNA构建体。本发明还包括由碱基DNA构建体编码的蛋白质，即其中缺失了外显子6序列-编码多肽的部分或全部，并且未加入由合成cDNA盒来源的插入片段所编码的任何氨基酸。本发明还包括与本文所述的特定实施方案具有同源性的多核苷酸，例如，与所述特定DNA序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。本发明进一步包括具有特定核酸序列的多核苷酸，该核酸序列能够在高严格性条件下以其功能结构域长度与上述特定DNA序列的互补序列杂交。本发明还包括由上述同源或杂交多核苷酸编码的蛋白质。为了更清楚地描述本发明实施方案，下文提供了若干相关定义。定义.短语“重复的KEPAPTT样序列”指与(a)“APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK”(SEQ ID NO26；45个氨基酸)并具有至少一个O-连接的取代的序列；(b)“KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO27；31个氨基酸)并具有至少一个O-连接的取代的序列；或(c)“EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO28；22个氨基酸)并具有至少一个O-连接的取代的序列，具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。重复的KEPAPTT样序列可能优选具有2、3、4个或更多O-连接的取代。有很多方法可测定两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，术语“同一性”是技术人员熟知的，并具有与特定方法对应的确定意义。本文所述的序列同一性是利用可通过NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih，gov/blast/；也可参考Tatusova和Madden(1999)的报道)获得的BLAST 2 SEQUENCES工具测定的。对氨基酸序列而言所用的参数为预期值＝1000；字长＝2；过滤器＝关；其它参数设定为默认值。这三个参数也被应用于核酸序列同一性的测定，但字长＝8。被用于比较氨基酸序列的默认值为矩阵＝BLOSUM62；开放空位＝11；延伸空位＝罚1分；和gap×dropoff＝50。被用于比较核酸序列的默认值为匹配奖分＝1；错配罚分＝-2；链选择＝两条链；开放空位＝5；延伸空位＝罚2分；和gap×dropoff＝50。重组润滑素的O-连接的取代可以是用润滑寡糖β-(1-3)-Gal-GalNac或其它部分，包括人工或天然存在的糖部分(诸如硫酸角质素或硫酸软骨素)进行的取代。在某些实施方案中，O-连接的取代可以是对重组润滑素充当表面活性磷脂(SAPL)或表面活性剂的载体的能力起作用的部分(Hills，2002)。糖基化或取代百分比根据重量(干重)确定。在与DNADNA杂交有关的内容中应用的高严格性条件包括与下述条件等同的条件，即当所用探针长度约为500个核苷酸长时，于42℃在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/lEDTA、用NaOH将pH调整为7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中进行结合或杂交后，于42℃在含有0.1X SSPE，1.0％SDS的溶液中进行洗涤。本文所述多肽或其它化合物在制剂中所占重量(干重)百分比至少为50％时被描述为是“分离的”。本文所述多肽或其它化合物在制剂中所占重量(干重)百分比至少为80％时被描述为是“基本上纯的”。本文所述多肽或其它化合物在制剂中所占重量(干重)百分比至少为95％和优选99％时被描述为是“均质的”。纯度通过下述步骤测定，即进行还原聚丙烯酰胺凝胶电泳和增强考马斯蓝染色后，对条带进行光密度描迹(即通过光密度测定法测定蛋白纯度)。“无致热原”指不含可导致发热的污染物，包括内毒素。对污染物的测定可通过美国食品药物管理局制订的适用标准检验方法进行。本文所用术语“治疗有效量”指相关药物组合物或方法中的各活性成分足以对患者产生具有意义的益处，即治疗、治愈、预防或改善所述相关医学状况或加快了治疗、治愈、预防或改善所述状况的速度的量。当该术语被应用在单独施用单个有效成分的情况中时，则仅与该有效成分有关。当被应用在组合施用情况中时，该术语指可导致获得疗效的有效成分的组合量，而不考虑该组合中各有效成分的施用顺序是序贯还是同时。本发明的实施方案可被用作关节内补充物。用并非来源于润滑素的化合物进行关节内补充已被作为关节疗法获得了实践。例如，利用聚合乙酰透明质酸(HA)和更高分子量的hylans(诸如SYNVISC弹粘性液″Hylan G-F 20″--由WYETHPharmaceuticals分销)进行的“粘度补充疗法”在临床上被用于治疗与OA有关的膝关节疼痛。该粘度补充疗法尤其是在缓解患者负重疼痛方面已显示具有重要的治疗价值(Wobig et al.，1998)。Hylan G-F 20是通过将从公鸡或小鸡鸡冠获得的若干种HA分子交联而得以生成。与利用较低分子量HA进行的粘度补充疗法相比，利用Hylan G-F 20进行的粘度补充疗法可更显著地有效缓解疼痛(Wobig et al.，1999)。此外，在缓解疼痛方面，不耐受NSAIDs的患者尤其优选利用Hylan G-F 20进行的粘度补充疗法，而不施用NSAIDs(例如，在具有胃肠并发症高风险的患者中；Espallargues and Pons，2003)。尽管Hylan G-F 20粘度补充疗法是安全和易耐受的疗法，可短期(即治疗后维持3-6个月)减轻疼痛症状的同时还可改善关节功能，但该疗法并不能显著地使OA患者避免最终更换膝关节的需要(Espallargues and Pons，2003)。
实施例1重组润滑素的克隆
构建体.在某些实施方案中，被用于生成重组润滑素 分子的碱基DNA构建体包括SEQ ID NO6中从蛋氨酸密码子(ATG)到BssHII限制位点(G^CGCGC)的序列(即碱基1-1123)和从SEQ IDNO6的BspEI限制位点(T^CCGGA)到终止密码子(TAA)的序列(即碱基1269-2946)。这些序列，即SEQ ID NO6中的碱基1-1123和1269-2946编码天然全长润滑素(即PRG4)中的氨基酸M1-S373(由外显子1-5和位于外显子6中5′-密码子侧翼的大约174个碱基编码)和E848-P1404(由位于外显子6中3′-密码子侧翼的大约293个碱基和外显子7-14编码)。外显子6在该碱基DNA构建体中被缺失的部分与编码天然PRG4中的氨基酸A374-P847的DNA序列对应(由外显子6编码的大约940个氨基酸中缺失了474个氨基酸)。该缺失氨基酸序列富含KEPAPTT样序列。将合成cDNA盒-1的DNA序列(SEQ ID NO1)加至所述碱基构建体的BssHII/BspEI(位点)，可获得重组PRG4-Lub1 cDNA构建体(SEQ ID NO6)。SEQ ID NO6包括位于两个特定DNA序列之间的Lub1 DNA插入片段(SEQ ID NO8；其编码具有4个KEPAPTT序列的SEQ ID NO9的51个氨基酸)，其中一个DNA序列编码天然PRG4中的氨基酸M1-S373，另一个DNA序列则编码天然PRG4中的E848-P1404。换言之，重组润滑素PRG4-LUB1包括了可形成4个完全KEPAPTT序列和大约3个不完全KEPAPTT序列的51个氨基酸，取代了天然PRG4中从A374到P847(474个氨基酸)的序列。将合成cDNA盒-2的DNA序列(SEQ ID NO3)加至PRG4-Lub1构建体的Bsu36I/BspEI(位点)，可获得PRG4-Lub2 cDNA构建体(SEQ ID NO10)。该PRG4-Lub1 cDNA构建体具有一个Bsu36I限制位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO6中的碱基1225-1231)。当把合成cDNA盒-2加入PRG4-Lub1 cDNA构建体中时，该Bsu36I位点被破坏了，但合成盒-2含有另一个内部Bsu36I限制位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO3中的碱基92-98)。因此，可通过将合成cDNA盒-2 Bsu36I/BspEI加至上述PRG4-LubN构建体中由合成cDNA盒-2提供的内部Bsu36I限制位点，以制备PRG4-LubN+1构建体。所述cDNA盒被合成为单链寡核苷酸形式，并可杂交在一起，生成具有粘性末端的双链DNA片段。这是末端BssHII、Bsu36I和BspEI位点不完整的原因。在合成cDNA盒-1(SEQ ID NO1)中，与位于BssHII(G^CGCGC)和BspEI(T^CCGGA)限制位点两侧的残留部分结合的序列包括内部Bsu36I限制位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG)；该限制位点如下划线部分所示CGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCTACTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCACGCCTAAGGAGCCAGCTCCTACTACAACGAAACCGGCACCAACCACTCCGG
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1的翻译序列，包括4个完全匹配的KEPAPTT序列(如突出部分所示)
合成cDNA盒-2(SEQ ID NO3)同样具有残留的5′-末端Bsu36I限制位点(即CC^TNAGG，仅由TAA序列证实)、3′-末端残留BspEI限制位点(T^CCGGA)和内部Bsu36I限制位点(CC^TNAGG)；这些限制位点如下划线部分所示TAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAACCACTCCGG
SEQ ID NO4是SEQ ID NO3的翻译序列，包括3个完全匹配的KEPAPTT序列(如突出部分所示) 在pTmed2载体(构建体外加载体等同于SEQ ID NO5)中，重组PRG4-Lub1 cDNA构建体(SEQ ID NO6)的侧翼为SalI(G^TCGAC；SEQ ID NO5中的碱基1027-1032)和NotI(GC^GGCCGC；SEQ ID NO5中的碱基3984-3991)限制位点。SalI位点将修饰的Kozak翻译起始序列(CCCACC；SEQ ID NO5中的碱基1032-1037)整合在翻译起始密码子ATG(SEQ ID NO5中的碱基1038-1040)之前。BssHII(G^CGCGC；SEQ ID NO5中的碱基2155-2160)和BspEI(T^CCGGA；SEQ ID NO5中的碱基2306-2311)限制位点之间具有上述内部Bsu36I克隆位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO5中的碱基2262-2268)。PRG4-Lub1 cDNA构建体(SEQ ID NO6)被翻译进PRG4-LUB1蛋白(SEQ ID NO7)中。介于完整PRG4-LUB1蛋白(SEQ ID NO7)中S373-E425(即天然PRG4的E848)之间的插入片段是如SEQ ID NO9所示的51个氨基酸。这些氨基酸从Lub1 DNA插入片段(SEQ ID NO8)翻译，包括4个完全的KEPAPTT序列。BssHII限制位点(G^CGCGC；SEQ ID NO6中的碱基1118-1123)和BspEI限制位点(T^CCGGA；SEQ ID NO6的碱基1269-1274)之间具有内部Bsu36I克隆位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO6中的碱基1225-1231)。与重组PRG4-Lub1构建体被包含在pTmed2载体中的情况一样，在pTmed2载体中，重组PRG4-Lub2 cDNA构建体(SEQ ID NO10)的侧翼为SalI(G^TCGAC)和NotI(GC^GGCCGC)限制位点；SalI位点将修饰的Kozak翻译起始序列(CCCACC)整合在翻译起始密码子ATG(SEQ ID NO10中的碱基1-3)之前。同样，在pTmed2载体中，重组PRG4-Lub3 cDNA构建体(SEQ ID NO14)、重组PRG4-Lub4 cDNA构建体(SEQ ID NO18)和重组PRG4-Lub5 cDNA构建体(SEQ ID NO22)的侧翼均为SalI(G^TCGAC)和NotI(GC^GGCCGC)限制位点；SalI位点将修饰的Kozak翻译起始序列(CCCACC)整合在翻译起始密码子ATG(分别为SEQ ID NO14、18和22中的碱基1-3)之前。PRG4-Lub2 cDNA构建体中的内部Bsu36I克隆位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO10中的碱基1318-1324)位于BssHlI(G^CGCGC；碱基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；碱基1347-1352)限制位点之间。PRG4-Lub2构建体(SEQ ID NO10)被翻译进PRG4-LUB2蛋白(SEQ ID NO11)中。介于完整PRG4-LUB2蛋白(SEQ ID NO11)中S373-E451(即天然PRG4的E848)之间的插入片段是如SEQ ID NO13所示的77个氨基酸。这些氨基酸从Lub2 DNA插入片段(SEQ ID NO12)翻译。重组润滑素PRG4-LUB2中取代了天然PRG4内A374-P847(474个氨基酸)的77个氨基酸形成了6个完全的KEPAPTT序列和大约4个不完全的KEPAPTT序列。PRG4-Lub3 cDNA构建体中的内部Bsu36I克隆位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO14中的碱基1411-1417)位于BssHII(G^CGCGC；碱基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；碱基1440-1445)限制位点之间。PRG4-Lub3构建体(SEQ ID NO14)被翻译进PRG4-LUB3蛋白(SEQ ID NO15)中。介于完整PRG4-LUB3蛋白(SEQ ID NO15)中S373-E482(即天然PRG4的E848)之间的插入片段是如SEQ ID NO17所示的108个氨基酸。这些氨基酸从Lub3 DNA插入片段(SEQ ID NO16)翻译。重组润滑素PRG4-LUB3中取代了天然PRG4内A374-P847(474个氨基酸)的108个氨基酸形成了9个完全KEPAPTT序列和大约5个不完全的KEPAPTT序列。PRG4-Lub4 cDNA构建体中的内部Bs36I克隆位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO18中的碱基1504-1510)位于BssHII(G^CGCGC；碱基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；碱基1533-1538)限制位点之间。PRG4-Lub4构建体(SEQ ID NO18)被翻译进PRG4-LUB4蛋白(SEQ ID NO19)中。完整PRG4-LUB4蛋白(SEQ ID NO19)中介于S373-E513(即天然PRG4的E848)之间的插入片段是如SEQ ID NO21所示的139个氨基酸。这些氨基酸从Lub4 DNA插入片段(SEQ ID NO20)翻译。重组润滑素PRG4-LUB4中取代了天然PRG4内A374-P847(474个氨基酸)的139个氨基酸形成了12个完全KEPAPTT序列和大约6个不完全KEPAPTT序列。PRG4-Lub5 cDNA构建体中的内部Bsu36I克隆位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO22中的碱基1597-1603)位于BssHII(G^CGCGC；碱基1118-1123)和BspEI(T^CCGGA；碱基1626-1631)限制位点之间。PRG4-Lub5构建体(SEQ ID NO22)被翻译进PRG4-LUB5蛋白(SEQ ID NO23)中。介于完整PRG4-LUB5蛋白(SEQ ID NO23)中S373-E544(即天然PRG4的E848)之间的插入片段是如SEQ ID NO25所示的170个氨基酸。这些氨基酸从Lub5 DNA插入片段(SEQ ID NO24)翻译。重组润滑素PRG4-LUB5中取代了天然PRG4内A374-P847(474个氨基酸)的170个氨基酸形成了15个完全KEPAPTT序列和大约6个不完全KEPAPTT序列。重要的是，插入合成cDNA盒-2的过程可以无限重复。每次重复可加入3个完全KEPAPTT序列。与通过该方式利用插入序列而得以构建的重组润滑素PRG4-LUB2到PRG4-LUB5一样，也可构建重组润滑素PRG4-LUB6-PRG4-LUBN。表2为BssHII/BspEl插入序列的概括。本发明提供的优选实施方案是编码重组润滑素并被克隆进真核表达载体pTmed2的SalI(G^TCGAC；SEQ ID NO5中的碱基1027-1032)和NotI(GC^GGCCGC；SEQ ID NO5中的碱基3984-3991)限制位点中的cDNA构建体(例如，pTmed2表达载体中的重组PRG4-Lub1 cDNA构建体位于SEQ ID NO5中的碱基1038-3983之间)。SalI位点将修饰的Kozak翻译起始序列的第一个碱基(CCCACC；SEQ ID NO5的碱基1032)整合在蛋氨酸起始密码子(ATG；SEQ ID NO5中的碱基1038-1040)之前。本发明的另一些实施方案包括其它限制位点组合和其它表达载体。在一种优选实施方案中，所述重复方法利用了位于表达载体pTmed2中，且侧翼为用于BssHII(G^CGCGC)和BspEI(T^CCGGA)的限制位点的合成cDNA盒-1(SEQ ID NO1)，以及包括内部Bsu36I限制位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO1中的碱基107-113)的合成cDNA盒-1。对在该优选实施方案中重复生成的含有KEPAPTT样序列的重组润滑素构建体而言，合成cDNA盒-2(SEQ IDNO3)被插入在该重组构建体的Bsu36I和BspEI位点之间。合成cDNA盒-2(SEQ ID NO3)的侧翼为经过修饰的残留Bsu36I位点(TAAAG)和残留BspEI(ACTCCGG)位点。还包括内部Bsu36I位点(CC^TNAGG，即CC^TAAGG；SEQ ID NO3中的碱基92-98)。在将合成cDNA盒-2克隆进重组润滑素构建体的Bsu36I和BspEI位点中的基础上，原始构建体的Bsu36I克隆位点被破坏了，在新构建体中仅残留了一个Bsu36I克隆位点。在该优选实施方案中，氨基酸序列“APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK”(SEQ ID NO26；45个氨基酸)保留了各PRG4-LUBN蛋白(其中N＝1或更大的整数)中的一个部分。此外，氨基酸序列“KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO27；31个氨基酸)由特定DNA插入片段编码，该插入片段通过将合成cDNA盒-2Bsu36I/BsuEI加入PRG4-LubN cDNA构建体而得以成为各PRG4-LubN+1 cDNA构建体的一部分。在优选实施方案中，对N为大于或等于3的整数的PRG4-LUBN蛋白而言，氨基酸序列“EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP”(SEQ ID NO28；22个氨基酸)将SEQ ID NO26与SEQ ID NO27的(N-2)个重复连接起来。此外，在N为大于或等于2的整数的PRG4-LUBN蛋白优选实施方案中，氨基酸序列“KEPKPAPTTP”(SEQ ID NO29；10个氨基酸)直接位于最后一个SEQ ID NO27的插入重复之后。由于SEQ ID NO26、SEQ ID NO27和SEQ ID NO28形成了至少2个KEPAPTT序列，本文将它们均称为“重复的KEPAPTT样序列”(SEQ ID 28的N-末端与K残基相连，因此SEQ ID NO28在PRG4-LUBN蛋白中形成了2个KEPAPTT序列)。因此，对重组润滑素蛋白PRG4-LUBN(其中N为等于1或大于1的整数)而言，优选实施方案中的PRG4-LUBN蛋白包括SEQID NO26。此外，对重组润滑素蛋白PRG4-LUBN(其中N为等于2或大于2的整数)而言，优选实施方案中的PRG4-LUBN蛋白还包括SEQ ID NO27。SEQ ID NO27在这些优选实施方案的各PRG4-LUBN蛋白内重复了(N-1)次。在PRG4-LUB2中，SEQ ID NO26和SEQ IDNO27重叠(即它们共有一个KEPAPTT序列)
在N为大于或等于3的整数的另一些优选实施方案(例如，N等于3-200的整数，或更优选的实施方案中，即在N等于5-50的整数，或在还要更优选的实施方案中，即N等于10-30的整数)中，重组润滑素蛋白包括SEQ ID NO28所示的22个氨基酸，这些氨基酸将SEQ ID NO26的N-末端方向的45个氨基酸与SEQ ID NO27所示31个氨基酸的(N-2)个重复连接在一起，其中SEQ ID NO29所示10个氨基酸位于SEQ ID NO27的最后一个31个氨基酸的重复的C-末端。表3.优选PRG4-LUB蛋白中的序列频率 在N等于重复KEPAPTT样序列数目的优选实施方案中，PRG4-LUBN蛋白通常具有(3×N)个重复的KEPAPTT序列。重组润滑素PRG4-LUB5(在优选实施方案中具有3×N＝3×5＝15个拷贝的KEPAPTT序列)是最大的重组润滑素PRG4-LUBN，其序列由本文具体公开。不过，对本发明的重组润滑素而言，N值可能大于5，诸如7、10、12、15、20、25、30、40、50、100、150、200或更大值。具体而言，本文具体描述的蛋白质PRG4-LUB1、PRG4-LUB2、PRG4-LUB3、PRG4-LUB4和PRG4-LUB5分别具有4、6、9、12和15个完全的KEPAPTT序列。但通过连续进行本文所述的重复LubN插入方法使添加的KEPAPTT序列数不断增加是可能的。我们具体描述了与天然PRG4/润滑素蛋白相比，所具有的KEPAPTT或KEPAPTT样序列数相对较少的PRG4-LUBN重组润滑素，因为较小的蛋白质易于合成和操纵。使KEPAPTT样序列的数目超过天然PRG4蛋白所含该序列数也可能是理想的。这可通过下述两种方法实现，即连续进行本文所述的重复LubN插入方法，使重组润滑素PRG4-LUBN蛋白中含有78个以上的KEPAPTT样序列，或者首先利用完整PRG4 cDNA，而不是外显子6-缺失或外显子6-不完整形式的PRG4 cDNA。因此，加入的任意KEPAPTT样序列的数目均应超过其存在于天然PRG4蛋白中的数目。本发明包括了从完整PRG4 cDNA生成较大重组润滑素蛋白的插入方法，以及利用外显子6-缺失或外显子6-不完整形式的PRG4cDNA的插入方法。
实施例2′LUB′蛋白的表达和纯化
如下所述，在经过稳定转染和预适应的CHO DUKX细胞系内表达PRG4-Lub1 cDNA构建体(SEQ ID NO6；含有合成cDNA盒-1序列)，并从条件培养基中将其纯化后，溶解在含有500mM L-精氨酸盐酸盐的PBS中。在经过稳定转染的CHO DUKX细胞系内表达PRG4-Lub1cDNA构建体，并收集条件培养基。利用安装了10kDa标称分子量截留极限(NMWL)、30kDa NMWL或100kDa NMWL PALLFILTRONOMEGATM圆盘膜的AMICONM2000TM过滤设备在压缩氮气(40psi)条件下过滤浓缩2升体积的该条件培养基。从圆盘膜上抽吸获得浓缩体积约为100ml的培养基。接着将该圆盘膜从AMICONM2000TM过滤设备上移除。利用细胞刮棒收集圆盘膜表面积聚的“粘液”存留物，转移进微量离心管中。以12,000xg离心微量离心管中的样品10分钟，除去水性上清液。将存留的“润滑素-富集的”沉淀溶解在含有500mM L-精氨酸盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。L-精氨酸盐酸盐的浓度范围可以是100mM-2.0M。利用上述方法，直接从圆盘膜上获得了从PRG4-LUB2到PRG4-LUB5糖蛋白(和PRG4-LUBN蛋白，其中N＝6或大于6的非负整数，以及含有KEPAPTT样序列的其它糖蛋白)，即未纯化圆盘膜上截留的浓缩液。也就是说，直接从10kDa NMWL、30kDa NMWL或100kDa NMWL PALL FILTRONOMEGATM过滤设备的圆盘膜上分离出了这些重组润滑素糖蛋白。在某些情况中，也可通过层析技术或电泳技术或二者的组合从圆盘膜上截留的浓缩液中纯化出这些糖蛋白。也可利用层析法和本领域已知的其它技术纯化重组润滑素蛋白和糖蛋白(正如例如，US6433142有关MSF蛋白的描述；也可参考Deutscher，1990和Scopes，1994)。
实施例3免疫组织化学
进一步利用免疫组织化学技术研究正常和骨关节炎关节中润滑素的细胞来源。此外，根据下述方法还检查了包括胸膜、心包、腹膜和脑膜在内的其它组织表面是否存在润滑素。在接受膝关节更换手术的患者同意的情况下获得了骨关节炎软骨和滑膜。接受检查的其它组织为正常人滑膜和正常非人灵长类动物(NHP)滑膜、软骨、胸膜、心包、腹膜、脑膜、脑、腱和韧带，以及犬科动物的正常和骨关节炎半月板、软骨、滑膜、韧带和腱。在采集后或在不含和含有补充莫能菌素(5μM)的培养基中温育24小时后，立即将这些组织固定在4％多聚甲醛中。为进行免疫组织化学研究，将这些组织固定在4％多聚甲醛中24小时后制备6-8微米厚的石蜡切片。将少部分组织冷冻在光学相干性X射线断层术(OCT)冷冻化合物中，并以5-10微米的间距切片后进行丙酮固定。免疫组织化学和免疫荧光分析利用的是通过用截短形式的重组润滑素免疫生成并利用蛋白A柱纯化后获得的纯化多克隆兔抗人润滑素抗体(Ab 06A10)。CD16抗体(NEOMARKERS，Fremont CA)被用于鉴定巨噬细胞(Fcy受体III)。CD106/VCAM-1抗体(NEOMARKERS)被用于标记恒冷箱切片内的成纤维细胞。对照切片则连续利用了等浓度的RIgG(VECTOR LABSTM，CA)、MIgG1(DAKO)和MIgG2a(DAKO)。采用Dextran Technology System(ENVISION+TM；DAKO)使抗体结合显影，并用Mayer的明矾苏木精对切片进行复染。利用上述初级抗体进行免疫荧光检验，并用第二抗体(Alexa Dyes-MOLECULAR PROBESTM，Oregon)山羊抗兔Alexa染料于546nm和山羊抗小鼠Alexa染料于488nm波长处探测。抗体的荧光结合用NIKON荧光显微镜检测。沿人正常和骨关节炎关节软骨和滑膜的表面检测润滑素。原纤维化的骨关节炎表面被厚润滑素层完全包被。CD106免疫荧光检验结果显示滑膜的内膜成纤维细胞的细胞膜染色深；滑膜细胞内染色也显示存在润滑素蛋白。对CD106+润滑素双重免疫染色的结果清晰显示二者共同定位于滑膜的内膜成纤维细胞内。对滑膜巨噬细胞的CD16染色结果证实这些细胞存在于整个滑膜层中，但未与润滑素共同定位。用润滑素抗体对NHP和犬科动物关节组织(正常和OA)的染色结果显示润滑素包被了滑膜、软骨、半月板和腱的表面。在未加入莫能菌素以提高所述糖蛋白的细胞内含量的情况下，NHP软骨的浅区细胞和移行区细胞中都显示具有强免疫反应性。沿腹膜、心包和胸膜分布的细胞也显示存在润滑素表达，但在脑膜或脑内未观测到免疫反应性。概括而言，正常和骨关节炎滑膜、腱、半月板和软骨均包被了充实的润滑素层。该糖蛋白明显地存在于OA关节内的组织上。对人OA滑膜双重免疫荧光染色的结果证实内膜成纤维细胞滑膜细胞负责了润滑素的合成。尚无与润滑素蛋白在关节组织外部的定位有关的报道。在肺胸膜、心包和腹膜上明确证实存在润滑素表层。一般认为润滑素在滑膜关节内具有润滑功能，但在其它组织内还可能具有多重作用，包括但不限于润滑和抗粘连功能。用润滑素补充这些其它组织是本发明包括的生物疗法。
实施例4作为机械润滑剂的重组润滑素
重组润滑素可作为润滑剂，通常与例如密封垫或轴承等一起应用。例如，标题为“Self-lubricating seal”的US3973781、标题为“Grooved mechanical face seal”的US4491331、标题为“Multi lip seal”的US4560174，以及标题为“Differential surface roughness dynamic sealsand bearings”的US4973068均描述了不同设计形式的密封垫。重组润滑素可作为润滑剂与这些密封垫一起应用。具体而言，重组润滑素可被用作医疗设备、假体和植入物的润滑剂尤其是在必需生物相容性润滑剂的情况下。此外，其应用不仅限于医疗，还包括在对环境要求敏感的情况中的应用，即应用生物相容性润滑剂可能是理想的情况。
实施例5重组润滑素组合物
本发明所述重组润滑素可与药学可接受载体组合应用在药物组合物中。这种组合物(除含有上述蛋白质和载体外)还可含有稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及本领域熟知的其它物质。术语“药学可接受的”指不干扰有效成分的生物学活性作用效果的无毒物质。所述载体的特征取决于给药途径。本发明所述药物组合物还可含有细胞因子、淋巴因子或其它造血因子，诸如M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、血小板生成素、干细胞生长因子和促红细胞生成素。该药物组合物可进一步含有可增强所述蛋白活性或对其在治疗中的活性或用途起补充作用的其它物质。这些其它的因子和/或物质可被包括在该药物组合物中，从而与本发明所述蛋白产生协同作用，或将副作用减至最少。反过来，本发明所述蛋白也可被包括在上述特定细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝因子，或抗炎症剂的制剂中，从而将副作用减至最少。将重组润滑素蛋白与上述聚合乙酰透明质酸(HA)和较高分子量的hylans组合应用于关节内补充是尤其优选的。可应用于关节内补充的另一些优选组合包括重组润滑素蛋白与麻醉剂(例如利多卡因)、类固醇(例如丙酮缩去炎松己酸酯)或放射性同位素(例如钇)的组合应用。可应用于关节内补充的另一些优选组合可包括自体或异源细胞制剂(例如培养的软骨细胞、滑膜细胞或干细胞的细胞制剂，而无论其来源为自身或异源)。本发明所述重组润滑素可以多聚体(例如异二聚体或同二聚体)或与其本身或其它蛋白复合的形式发挥作用。因此，本发明所述药物组合物可能包括这种多聚或复合形式的本发明蛋白。本发明所述药物组合物可能为复合形式，即由本发明所述重组润滑素蛋白和蛋白或肽抗原复合而成。该蛋白和/或肽抗原可将刺激信号送递至B和T淋巴细胞。B淋巴细胞通过其表面免疫球蛋白受体应答抗原。T淋巴细胞则在MHC蛋白呈递抗原后通过其T细胞受体(TCR)应答该抗原。包括那些由宿主细胞上的I和II类MHC基因编码的MHC和结构相关蛋白在内的MHC和结构相关蛋白可将所述肽抗原呈递给T淋巴细胞。抗原组分也可被作为纯化MHC-肽复合物单独提供，或与可直接向T细胞传递信号的共同刺激分子一起被组合提供。能够结合B细胞上的表面免疫球蛋白和其它分子的可选抗体和能够结合T细胞上的TCR和其它分子的抗体均可与本发明所述药物组合物组合。本发明所述药物组合物可为脂质体形式，其中除其它药学可接受载体外，还组合含有本发明所述蛋白和两亲剂，诸如可以胶束、不溶性单层、液晶或薄层的聚集形式存在于水性溶液的脂质。适用于脂质体制剂的合适脂质包括，但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆酸等。这种脂质体制剂的制备方法是本领域熟知的，被公开在例如US4235871、US4501728、US4837028和US4737323中。在实施本发明所述治疗或应用方法的过程中，是将治疗有效量的本发明蛋白施用于存在待治疗状况的被试者(例如哺乳动物)。根据本发明方法，可单独施用本发明所述蛋白，或与其它疗法组合施用，诸如应用细胞因子、淋巴因子、其它造血因子或以细胞为基础的补充物所进行的治疗。当与一种或多种细胞因子、淋巴因子、其它造血因子或以细胞为基础的补充物共同施用时，施用本发明蛋白和这些细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝因子，或以细胞为基础的补充物的顺序可为同时或序贯。如为序贯施用，则由主治医师决定组合施用本发明蛋白和细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓剂或抗凝因子，或以细胞为基础的补充物的顺序。被应用在本发明所述药物组合物中或被用于实施本发明所述方法的本发明蛋白的施用可通过多种常规方法实现，诸如皮肤、皮下、腹膜内、肠胃外或静脉注射，或在某些情况中采用口服、吸入、体表应用的施用方法。通常优选通过注射进入关节组织内而实现对患者给药的方法(Schumacher，2003)。当通过口服方式施用治疗有效量的本发明蛋白时，其形式可为片剂、胶囊、粉剂、溶液或酏剂。当以片剂形式被施用时，本发明药物组合物可另外含有诸如明胶的固体载体或佐剂。该片剂、胶囊和粉剂含有大约5-95％的本发明蛋白，优选地含有大约25-90％的本发明蛋白。当以液体形式被施用时，可加入液体载体，诸如水、石油、动物或植物来源的油，诸如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油，或合成的油。液体形式的药物组合物可进一步含有生理盐水、葡萄糖或其它糖溶液，或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二元醇。当以液体形式被施用时，按重量计算，该药物组合物含有大约0.5-90％的本发明蛋白，优选含有大约1-50％的本发明蛋白。当通过静脉内、皮肤或皮下注射施用治疗有效量的本发明蛋白时，本发明蛋白应为无致热原、肠胃外可接受的水性溶液形式。这种肠胃外可接受蛋白溶液的制备方法在本领域技术范围内，应考虑pH、等渗性、稳定性等因素。适用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选药物组合物除含有本发明蛋白外，还应含有等渗载体，诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸化林格氏注射液或本领域已知的其它载体。本发明药物组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。例如，与利多卡因或其它局部麻醉剂、类固醇或肾上腺类固醇、HA和/或hylans，或放射性同位素联合或组合在一起的注射方法均被包括在本发明中。本发明蛋白在本发明药物组合物中的量取决于待治疗状况的性质和严重程度，以及患者之前已接受的治疗的性质。最终由主治医师决定治疗个体患者所需本发明蛋白的量。最初，主治医师应施用低剂量的本发明蛋白，并观察患者的反应。直到对该患者在不进一步提高剂量的情况下已获得理想治疗效果时才可施用较大剂量的本发明蛋白。根据施用方法和实施的准确疗程，预期被用于实施本发明方法的多种药物组合物的施用剂量应为每公斤体重施用大约0.01μg-大约100mg(优选大约0.1μg-大约10mg，更优选大约0.1μg-大约1mg)的本发明蛋白。如果通过静脉内途径施用，利用含有本发明重组润滑素的药物组合物进行静脉内治疗的持续时间应根据待治疗疾病的严重程度和个体患者的状况和潜在特异体质反应的不同进行调整。预期每次连续静脉内施用本发明蛋白的持续时间应为12-24个小时。最终由主治医师决定利用本发明药物组合物进行静脉内治疗的合适持续时间。对有助于治疗骨、软骨、腱或韧带的本发明组合物而言，治疗方法包括将该组合物局部、系统地施用或作为植入物或装置局部施用。应用于本发明的治疗组合物被施用时应为生理学可接受形式，且必须不含致热原。此外，该组合物可能需要被胶囊化或以粘质形式注射，以送递至骨、软骨或组织损伤部位。体表施用可能适用于某些伤口愈合和组织修复状况。在本发明方法中，可选或另外地，可将还可任选地被包括在上述组合物中并有助于治疗的物质与含本发明重组润滑素蛋白的组合物同时或序贯施用。该组合物优选地应包括能够将含有所述蛋白的组合物送递至骨和/或软骨损伤部位、可能能够使发育中的骨和软骨具有结构，以及任选地能够被吸收进体内的基质。这种基质可由目前应用于其它移植医学应用的材料制成。如应用上述基质，应基于生物相容性、生物降解力、机械特性、外观和界面特性选择基质材料。本发明所述组合物的这一特殊应用相应限定了合适的制剂。可能适用于该组合物的基质可能是生物可降解和已被化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸、聚乙醇酸和聚酐。另一些可能适用的材料是生物可降解和已被生物学具体定义的材料，诸如骨或皮肤胶原。所述基质进一步包括纯蛋白或胞外基质组分。另一些可能适用的基质是非生物可降解和已被化学定义的基质，诸如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。所述基质可包括上述任意类型材料的组合，诸如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷的组分可以变化，诸如钙-铝酸盐-磷酸盐的各组分比例可以变化，并可经过加工，从而改变孔的大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解力。在进一步的组合物中，本发明蛋白可与有助于治疗骨和/或软骨缺陷、伤口或存在问题的组织的其它物质组合在一起。这些物质包括多种生长因子，诸如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)，以及胰岛素样生长因子(IGF)。目前，该治疗组合物也具有兽医应用价值。除人以外，尤其是诸如猫和狗的家畜、诸如小鼠和大鼠的实验室动物，以及马均是尤其适合接受利用本发明重组润滑素蛋白进行的这种治疗的被试者或患者。含有所述蛋白的药物组合物被应用于组织再生方面时的给药方案应由主治医师根据下述多种可改变所述蛋白作用效果的要素确定，例如希望形成的组织的重量、受损部位、受损组织的状况、伤口大小、受损组织类型(例如软骨或腱)、患者的年龄、性别、饮食、所有感染的严重程度、给药时间及其它临床要素。剂量可随着重构所应用基质的类型和所述药物组合物中包含的其它蛋白的改变而调整。例如，在最终组合物中加入其它已知的生长因子，诸如IGF I(胰岛素样生长因子I)也可能影响该剂量。通过例如，X-射线、组织形态测定和四环素标记法定期评估组织/骨生长和/或修复状况，以监测再生过程。本发明多核苷酸还可被用于基因治疗。该多核苷酸可通过体内或离体方法被导入被试者(例如哺乳动物)的细胞内，并在其中表达。本发明多核苷酸还可通过其它已知适用于将核酸导入细胞或生物内的方法被施用(包括但不限于，以病毒载体或裸DNA的形式)。也可在存在本发明核酸或蛋白的条件下体外培养细胞，使该细胞增殖或对其产生预期作用或使其具有预期活性。接着可将经过处理的细胞导入体内用于治疗。
实施例6抗-润滑素抗体
本发明所述重组润滑素蛋白还可被用于免疫动物，以获得可与其或在某些实施方案中与其天然对应物特异性反应的多克隆和单克隆抗体。以完整重组润滑素蛋白或其片段作为免疫原便可获得这种抗体。所述肽免疫原的羧基末端还可含有半胱氨酸残基，并可与诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)的半抗原结合。本领域已知这种肽的合成方法(例如Merrifield，1963和Krstenansky et al.，1987所述方法)。可与本发明重组润滑素蛋白结合的单克隆抗体可能是有助于免疫检测相关蛋白的诊断剂。中和可与这些相关蛋白结合的单克隆抗体也可能是有助于治疗与润滑素相关病症或在某些情况中是有助于治疗可能涉及润滑素异常表达的某些癌症形式(例如滑膜瘤)的疗法。除了可导向重组润滑素蛋白多肽核心的抗体外，可导向重组润滑素蛋白的糖部分或糖蛋白复合体的抗体也是理想的抗体。为生成可与糖基化重组润滑素结合(而不结合其去糖基化形式)的抗体，免疫原优选氨基酸序列跨重组润滑素的高度糖基化部分，例如重复KEPAPTT样序列的糖肽。也可以将在该高度糖基化区域范围内的较短糖肽，例如8-15个氨基酸长度的糖肽作为免疫原。生成高度糖基化生物分子的抗体的方法是本领域已知的(例如Schneerson et al.，1980所述方法)。
实施例7重组润滑素送递
送递重组润滑素采用了标准方法。对关节内施用而言，是将浓度范围为20-500μg/ml的重组润滑素送递进滑膜腔，且单次注射体积为大约0.1-2ml。例如，利用细(例如14-30号，优选18-26号)针将浓度为200-300μg/ml的1ml重组润滑素注射进膝关节。本发明组合物还适用于肠胃外施用，诸如静脉内、皮下、肌内或腹膜内施用，在优选实施方案中则是被施用于腹膜、心包或胸膜的表面。正确的施针位置对关节治疗中通过注射送递重组润滑素蛋白的效能而言具有关键作用(Schumacher，2003)。可通过利用超声技术帮助正确施针定位。在成功抽吸液体后，更易实现成功的注射。业已提出一种进入髌上囊的外上侧方法，可提供进入膝关节关节间隙的最可靠通路。关节内注射除了可以施用重组润滑素外，还可将编码重组润滑素的核酸(例如在基因治疗应用中)送递至滑膜腔。为避免手术粘连，本文所述重组润滑素被施用时的形式为凝胶、泡沫、纤维或织物。以该方式配制的重组润滑素被置于受损或暴露的组织界面上方和之间，以避免相对表面之间的粘连形成。为了能够生效，所述凝胶或薄膜必须持续足够长的时间保持固定并阻止组织接触，从而在其最终消散时使所述组织得以接触并不再有粘连倾向。在大鼠盲肠磨损模型(Goldberg et al.，1993)中评估了被配制用于抑制或预防粘连形成的重组润滑素(例如，以膜、织物、泡沫或凝胶的形式)在预防手术后粘连方面的效果。所述组合物被置于通过外科方法磨损的大鼠盲肠周围，并与未经治疗的对照动物进行对比(其盲肠已磨损但未接受任何治疗的动物)。与缺乏重组润滑素制剂条件下大鼠模型内的粘连形成量相比，该制剂存在条件下粘连形成量的减少表明该制剂在临床上可有效减少组织粘连的形成。但在需要组织粘连的状况中(例如需使软骨裂缝愈合的状况)则最好避免采用重组润滑素。使软骨表面润滑将有损于软骨间的整合(Schaefer et al.，2004)。重组润滑素也可被用于包被将被移植进哺乳动物体内的假肢和人工关节。例如，可将这种装置浸入或浸没在重组润滑素溶液中，例如，遵照US5709020或US5702456所述方法。但在体内应用重组润滑素以在假体周围提供润滑效果时应多加注意。据报道，PRG4基因表达(即MSF基因表达)出现的显著上调与假体松动有关；润滑素可破坏骨与假体之间紧密的相互作用，从而使假体松动(Morawietz etal.，2003)。
实施例8OA模型
为评估关节内施用润滑素制剂的效能，制备了骨关节炎/软骨侵蚀的小鼠模型。为外科诱发骨关节炎，通过腹膜内施用250mg/kg三溴乙醇(SIGMAChemical)麻醉小鼠，并对其膝关节进行无菌外科手术。从髌骨韧带的中间将其纵向切开，打开关节囊，并确定半月板胫骨韧带(将内侧半月板固定在胫骨坪上)的位置。对一部分动物不进行其它操作，并认为该组接受了假手术。对试验组动物则横切其内侧半月板胫骨韧带，使其内侧半月板失去稳定状态(DMM)。分别将接受假手术和DMM的动物的关节囊和皮下层缝合紧密，并通过应用NEXABANDS/C组织粘合剂(Abbott，North Chicago，IL)将该部分的皮肤关闭。在手术前和手术后施用Buprenorphine(BUPRENEX；Reckitt & Coleman，Kingston-upon-Hull，UK)。通过利用30号针关节内注射施用重组润滑素制剂。手术后一周对每个膝关节关节注射施用5-10毫升。以每周一次为基础任选地进行其它注射。在手术后第4周和第8周用二氧化碳处死动物。为评估骨关节炎的进展和严重程度，将完整膝关节置入4％的多聚甲醛中24小时后，在EDTA/聚乙烯吡咯烷酮中脱钙5天。石蜡包埋关节并从完整关节中获得6-μm额向切片。用Safranin O-fastgreen染色载玻片，并利用修饰的的半定量评分系统(Chambers et al.，2001)以70-μm间距对整个关节评级，其中“0”＝正常软骨；“0.5”＝丧失Safranin O且无结构变化；“1”＝关节表面粗糙并有小的原纤维形成；“2”＝原纤维形成下至表层下的紧邻层中，并丧失部分表层；“3”＝轻度(＜20％)；“5”＝中度(20-80％)；和“6”＝重度(＞80％)丧失未钙化软骨。评分“4”(侵蚀至骨)不是该模型的特征。分别对关节的所有四分体(内侧胫骨坪、内侧股骨髁、外侧胫骨坪和外侧股骨髁)进行评分。由不知道该试验内容的观测者对各膝关节关节进行评分，最少分为12个级别。评分以在各关节内观测到的最大组织评分或总组织评分表示。总评分表示对整个关节各组织切片上的各关节四分体的累计评分。该分析方法可对损伤的严重程度以及被OA样病变所影响的软骨表面积进行评估(Glasson et al.，2004)。参考文献(1)Chambers et al.，2001，Arthritis Rheum.441455-65；(2)Deutscher，1990，Methods in Enzymology，Vol.182Guide to Protein Purification，AcademicPress；(3)Espallargues and Pons，2003，Iht′l J.Tech.Assess.Health Care 1941-56；(4)Flannery et al.，1999，Biochem.Biophys.Res.Comm.254535-41；(5)Glasson et al.，2004，Arthritis Rheum.502547-58；(6)Goldberg et al.，1993，InGynecologic Surgery andAdhesion Prevention，Willey-Liss，pp.191-204；(7)Hills，2002，J.Rheumatology 29200-01；(8)Ikegawa et al.，2000，Cytogenet.Cell Genet.90291-297；(9)Jay et al.，2001，J.Orthopaedic Research 19677-87；(10)Jay et al.，2002，Glycoconjugate Journal 18807-15；(11)Krstenansky et al.，1987，FEBS Lett.21110-16；(12)Marcelino et al.，1999，Nature Genetics 23319-322；(13)Merberg et al.，1993，Biology of Vitronectins and theirReceptors，Pressner et al.(编辑)Elsevier Science Publishers，pp.45-53；(14)Merrifield，1963，J.Amer.Chem.Soc.852149-54；(15)Morawietz et al.，2003，Virchows Arch.44357-66；(16)Rees et al.，2002，Matrix Biology 21593-602；(17)Schneerson et al.，1980，J.Exp.Med 152361-76；(18)Scopes，1994，Protein PurificationPrinciples and Practice(第3版)，Springer Verlag；(19)Schaefer et al.，2004，Biorheology 41503-508；(20)Schumacher，2003，Arthritis & Rheumatism 49413-20；(21)Tatusova and Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174247-50；(22)Wobig et al.，1998，Clin.Ther.20410-23；和(23)Wobig et al.，1999，Clin.Ther.211549-62.
序列表<110>WyethFlannery，Carl RCorcoran，Christopher JFreeman，Bethany ARacie，Lisa A<120>重组润滑素分子及其用途<130>50657-01404WOPT<160>29<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>155<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成cDNA盒-1的核苷酸序列。
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<223>合成cDNA盒-2的核苷酸序列。
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<223>SEQ ID NO3的翻译序列。
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<220>
<223>含有重组PRG4-Lub1 cDNA构建体的pTmed2载体。
<400>5catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgtact 60gagtcattag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc120aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat agggactttc cattgggttt180tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt ttttcccatt attggcacgt240acataaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc caatttaatt aaaacgccat300gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta atgcaacgtg acctttaaac360ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct cgagccaata cacgtcaatg420ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt ttcccctgga aattccatat480tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt ataagaggcg cgaccagcgt540cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc agagctcctc gctgcagccc600aagctctgtt gggctcgcgg ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga660tcggaaaccc gtcggcctcc gaacggtact ccgccaccga gggacctgag cgagtccgca720tcgaccggat cggaaaacct ctcgactgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca780tgacttctgc gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc840ccgcggtgat gcctttgagg gtggccgcgt ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt900tgtcaagctt gaggtgtggc aggcttgaga tctggccata cacttgagtg acaatgacat960ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcaga cttcgaattc 1020tactgagtcg acccaccatg gcatggaaaa cacttcccat ttacctgttg ttgctgctgt 1080ctgttttcgt gattcagcaa gtttcatctc aagatttatc aagctgtgca gggagatgtg 1140gggaagggta ttctagagat gccacctgca actgtgatta taactgtcaa cactacatgg 1200agtgctgccc tgatttcaag agagtctgca ctgcggagct ttcctgtaaa ggccgctgct 1260ttgagtcctt cgagagaggg agggagtgtg actgcgacgc ccaatgtaag aagtatgaca 1320
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tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc4260cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg4320cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct4380cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat4440ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct4500aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgattgc tcgagccatc4560atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac4620ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca4680acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc4740attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc4800aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt4860attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct4920gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg4980caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc5040ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt5100gaagtctacg agaagaaaga ctaacaggaa gatgctttca agttctctgc tcccctccta5160aagctatgca ttttttataa gaccatggga cttttgctgg ctttagatca taatcagcca5220taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct5280gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta5340caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag5400ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatccccg gccaacggtc5460tggtgacccg gctgcgagag ctcggtgtac ctgagacgcg agtaagccct tgagtcaaag5520acgtagtcgt tgcaagtccg caccaggtac tgatcatcga tgctagaccg tgcaaaagga5580gagcctgtaa gcgggcactc ttccgtggtc tggtggataa attcgcaagg gtatcatggc5640
ggacgaccgg ggttcgaacc ccggatccgg ccgtccgccg tgatccatcc ggttaccgcc5700cgcgtgtcga acccaggtgt gcgacgtcag acaacggggg agcgctcctt ttggcttcct5760tccaggcgcg gcggctgctg cgctagcttt tttggcgagc tcgaattaat tctgcattaa5820tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg5880ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag5940gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa6000ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc6060cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca6120ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg6180accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct6240caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt6300gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag6360tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc6420agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac6480actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga6540gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc6600aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg6660gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca6720aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt6780atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca6840gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg6900atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca6960ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt7020cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt7080
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca7140cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca7200tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga7260agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact7320gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga7380gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg7440ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc7500tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga7560tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat7620gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt7680caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt7740atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac7800gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc7860tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag7920acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca7980gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg8040agagtgcac8049<210>6<211>2946<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组PRG4-Lub1 cDNA构建体。
<400>6atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120
gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaag gagccagctc ctactacaac gaaaccggca 1260ccaaccactc cggaaacacc tcctccaacc acttcagagg tctctactcc aactaccacc 1320aaggagccta ccactatcca caaaagccct gatgaatcaa ctcctgagct ttctgcagaa 1380cccacaccaa aagctcttga aaacagtccc aaggaacctg gtgtacctac aactaagacg 1440ccggcggcga ctaaacctga aatgactaca acagctaaag acaagacaac agaaagagac 1500ttacgtacta cacctgaaac tacaactgct gcacctaaga tgacaaaaga gacagcaact 1560
acaacagaaa aaactaccga atccaaaata acagctacaa ccacacaagt aacatctacc1620acaactcaag ataccacacc attcaaaatt actactctta aaacaactac tcttgcaccc1680aaagtaacta caacaaaaaa gacaattact accactgaga ttatgaacaa acctgaagaa1740acagctaaac caaaagacag agctactaat tctaaagcga caactcctaa acctcaaaag1800ccaaccaaag cacccaaaaa acccacttct accaaaaagc caaaaacaat gcctagagtg1860agaaaaccaa agacgacacc aactccccgc aagatgacat caacaatgcc agaattgaac1920cctacctcaa gaatagcaga agccatgctc caaaccacca ccagacctaa ccaaactcca1980aactccaaac tagttgaagt aaatccaaag agtgaagatg caggtggtgc tgaaggagaa2040acacctcata tgcttctcag gccccatgtg ttcatgcctg aagttactcc cgacatggat2100tacttaccga gagtacccaa tcaaggcatt atcatcaatc ccatgctttc cgatgagacc2160aatatatgca atggtaagcc agtagatgga ctgactactt tgcgcaatgg gacattagtt2220gcattccgag gtcattattt ctggatgcta agtccattca gtccaccatc tccagctcgc2280agaattactg aagtttgggg tattccttcc cccattgata ctgtttttac taggtgcaac2340tgtgaaggaa aaactttctt ctttaaggat tctcagtact ggcgttttac caatgatata2400aaagatgcag ggtaccccaa accaattttc aaaggatttg gaggactaac tggacaaata2460gtggcagcgc tttcaacagc taaatataag aactggcctg aatctgtgta ttttttcaag2520agaggtggca gcattcagca gtatatttat aaacaggaac ctgtacagaa gtgccctgga2580agaaggcctg ctctaaatta tccagtgtat ggagaaatga cacaggttag gagacgtcgc2640tttgaacgtg ctataggacc ttctcaaaca cacaccatca gaattcaata ttcacctgcc2700agactggctt atcaagacaa aggtgtcctt cataatgaag ttaaagtgag tatactgtgg2760agaggacttc caaatgtggt tacctcagct atatcactgc ccaacatcag aaaacctgac2820ggctatgatt actatgcctt ttctaaagat caatactata acattgatgt gcctagtaga2880acagcaagag caattactac tcgttctggg cagaccttat ccaaagtctg gtacaactgt2940ccttaa 2946
<210>7<211>981<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB1蛋白的氨基酸序列。
<400>7Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Set Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Set Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Set Ser Ser Ser Set Ser Ser Set Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Set Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr
195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser420 425 430Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys435 440 445Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys
450 455 460Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr465 470 475 480Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr485 490 495Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro500 505 510Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser515 520 525Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp530 535 540Thr Thr Pro Phc Lys Ile Thr Thr Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro545 550 555 560Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn565 570 575Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys580 585 590Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro595 600 605Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys610 615 620Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn625 630 635 640Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro645 650 655Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu660 665 670Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro675 680 685His Val Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg690 695 700Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
705 710 715 720Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn725 730 735Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro740 745 750Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile755 760 765Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys770 775 780Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile785 790 795 800Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu805 810 815Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp820 825 830Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr835 840 845Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala850 855 860Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg865 870 875 880Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln885 890 895Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn900 905 910Glu Val Lys Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr915 920 925Ser Ala Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr930 935 940Tyr Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg945 950 955 960Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val
965 970 975Trp Tyr Asn Cys Pro980<210>8<211>157<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来源于合成cDNA盒-1的Lub1 DNA插入片段。
<400>8gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaggagccag120ctcctactac aacgaaaccg gcaccaacca ctccgga 157<210>9<211>51<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub1 DNA插入片段编码的51个氨基酸(在SEQ ID NO7中位于S373-E425之间有4个KEPAPTT序列)。
<400>9Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Pro Ala Pro35 40 45Thr Thr Pro50<210>10<211>3024
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组PRG4-Lub2 cDNA构建体。
<400>10atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct 1260
gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaggaaccca aaccggcacc aaccactccg gaaacacctc ctccaaccac ttcagaggtc1380tctactccaa ctaccaccaa ggagcctacc actatccaca aaagccctga tgaatcaact1440cctgagcttt ctgcagaacc cacaccaaaa gctcttgaaa acagtcccaa ggaacctggt1500gtacctacaa ctaagacgcc ggcggcgact aaacctgaaa tgactacaac agctaaagac1560aagacaacag aaagagactt acgtactaca cctgaaacta caactgctgc acctaagatg1620acaaaagaga cagcaactac aacagaaaaa actaccgaat ccaaaataac agctacaacc1680acacaagtaa catctaccac aactcaagat accacaccat tcaaaattac tactcttaaa1740acaactactc ttgcacccaa agtaactaca acaaaaaaga caattactac cactgagatt1800atgaacaaac ctgaagaaac agctaaacca aaagacagag ctactaattc taaagcgaca1860actcctaaac ctcaaaagcc aaccaaagca cccaaaaaac ccacttctac caaaaagcca1920aaaacaatgc ctagagtgag aaaaccaaag acgacaccaa ctccccgcaa gatgacatca1980acaatgccag aattgaaccc tacctcaaga atagcagaag ccatgctcca aaccaccacc2040agacctaacc aaactccaaa ctccaaacta gttgaagtaa atccaaagag tgaagatgca2100ggtggtgctg aaggagaaac acctcatatg cttctcaggc cccatgtgtt catgcctgaa2160gttactcccg acatggatta cttaccgaga gtacccaatc aaggcattat catcaatccc2220atgctttccg atgagaccaa tatatgcaat ggtaagccag tagatggact gactactttg2280cgcaatggga cattagttgc attccgaggt cattatttct ggatgctaag tccattcagt2340ccaccatctc cagctcgcag aattactgaa gtttggggta ttccttcccc cattgatact2400gtttttacta ggtgcaactg tgaaggaaaa actttcttct ttaaggattc tcagtactgg2460cgttttacca atgatataaa agatgcaggg taccccaaac caattttcaa aggatttgga2520ggactaactg gacaaatagt ggcagcgctt tcaacagcta aatataagaa ctggcctgaa2580tctgtgtatt ttttcaagag aggtggcagc attcagcagt atatttataa acaggaacct2640gtacagaagt gccctggaag aaggcctgct ctaaattatc cagtgtatgg agaaatgaca2700
caggttagga gacgtcgctt tgaacgtgct ataggacctt ctcaaacaca caccatcaga 2760attcaatatt cacctgccag actggcttat caagacaaag gtgtccttca taatgaagtt 2820aaagtgagta tactgtggag aggacttcca aatgtggtta cctcagctat atcactgccc 2880aacatcagaa aacctgacgg ctatgattac tatgcctttt ctaaagatca atactataac 2940attgatgtgc ctagtagaac agcaagagca attactactc gttctgggca gaccttatcc 3000aaagtctggt acaactgtcc ttaa 3024<210>11<211>1007<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB2蛋白的氨基酸序列。
<400>11Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125
Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380
Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr435 440 445Thr Pro Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr450 455 460Thr Thr Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr465 470 475 480Pro Glu Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro485 490 495Lys Glu Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro500 505 510Glu Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg515 520 525Thr Thr Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr530 535 540Ala Thr Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr545 550 555 560Thr Gln Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile565 570 575Thr Thr Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys580 585 590Lys Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala595 600 605Lys Pro Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro610 615 620Gln Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro625 630 635 640
Lys Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg645 650 655Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala660 665 670Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser675 680 685Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu690 695 700Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu705 710 715 720Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile725 730 735Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys740 745 750Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe755 760 765Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro770 775 780Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr785 790 795 800Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp805 810 815Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro820 825 830Lys Pro Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala835 840 845Ala Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe850 855 860Phe Lys Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro865 870 875 880Val Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr885 890 895
Gly Glu Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly900 905 910Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu915 920 925Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile930 935 940Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro945 950 955 960Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys Asp965 970 975Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala Ile Thr980 985 990Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn Cys Pro995 1000 1005<210>12<211>235<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来源于合成cDNA盒-1的Lub2 DNA插入片段和一个合成cDNA盒-2序列。
<400>12gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaggaac ccaaaccggc accaaccact ccgga 235<210>13<211>77<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub2 DNA插入片段编码的77个氨基酸(在SEQ ID NO11中位于S373-E451之间有6个KEPAPTT序列)。
<400>13Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro65 70 75<210>14<211>3117<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组PRG4-Lub3 cDNA构建体。
<400>14atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600
aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct1260gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc1380acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaggaac ccaaaccggc accaaccact1440ccggaaacac ctcctccaac cacttcagag gtctctactc caactaccac caaggagcct1500accactatcc acaaaagccc tgatgaatca actcctgagc tttctgcaga acccacacca1560aaagctcttg aaaacagtcc caaggaacct ggtgtaccta caactaagac gccggcggcg1620actaaacctg aaatgactac aacagctaaa gacaagacaa cagaaagaga cttacgtact1680acacctgaaa ctacaactgc tgcacctaag atgacaaaag agacagcaac tacaacagaa1740aaaactaccg aatccaaaat aacagctaca accacacaag taacatctac cacaactcaa1800gataccacac cattcaaaat tactactctt aaaacaacta ctcttgcacc caaagtaact1860acaacaaaaa agacaattac taccactgag attatgaaca aacctgaaga aacagctaaa1920ccaaaagaca gagctactaa ttctaaagcg acaactccta aacctcaaaa gccaaccaaa1980gcacccaaaa aacccacttc taccaaaaag ccaaaaacaa tgcctagagt gagaaaacca2040
aagacgacac caactccccg caagatgaca tcaacaatgc cagaattgaa ccctacctca2100agaatagcag aagccatgct ccaaaccacc accagaccta accaaactcc aaactccaaa2160ctagttgaag taaatccaaa gagtgaagat gcaggtggtg ctgaaggaga aacacctcat2220atgcttctca ggccccatgt gttcatgcct gaagttactc ccgacatgga ttacttaccg2280agagtaccca atcaaggcat tatcatcaat cccatgcttt ccgatgagac caatatatgc2340aatggtaagc cagtagatgg actgactact ttgcgcaatg ggacattagt tgcattccga2400ggtcattatt tctggatgct aagtccattc agtccaccat ctccagctcg cagaattact2460gaagtttggg gtattccttc ccccattgat actgttttta ctaggtgcaa ctgtgaagga2520aaaactttct tctttaagga ttctcagtac tggcgtttta ccaatgatat aaaagatgca2580gggtacccca aaccaatttt caaaggattt ggaggactaa ctggacaaat agtggcagcg2640ctttcaacag ctaaatataa gaactggcct gaatctgtgt attttttcaa gagaggtggc2700agcattcagc agtatattta taaacaggaa cctgtacaga agtgccctgg aagaaggcct2760gctctaaatt atccagtgta tggagaaatg acacaggtta ggagacgtcg ctttgaacgt2820gctataggac cttctcaaac acacaccatc agaattcaat attcacctgc cagactggct2880tatcaagaca aaggtgtcct tcataatgaa gttaaagtga gtatactgtg gagaggactt2940ccaaatgtgg ttacctcagc tatatcactg cccaacatca gaaaacctga cggctatgat3000tactatgcct tttctaaaga tcaatactat aacattgatg tgcctagtag aacagcaaga3060gcaattacta ctcgttctgg gcagacctta tccaaagtct ggtacaactg tccttaa 3117<210>15<211>1038<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB3蛋白的氨基酸序列。
<400>15Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val
1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys
260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr435 440 445Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys450 455 460Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr465 470 475 480Pro Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr485 490 495Thr Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro500 505 510Glu Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys
515 520 525Glu Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu530 535 540Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr545 550 555 560Thr Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala565 570 575Thr Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr580 585 590Gln Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr595 600 605Thr Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys610 615 620Thr Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys625 630 635 640Pro Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln645 650 655Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys660 665 670Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys675 680 685Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu690 695 700Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys705 710 715 720Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly725 730 735Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val740 745 750Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile755 760 765Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro
770 775 780Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg785 790 795 800Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala805 810 815Arg Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val820 825 830Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser835 840 845Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys850 855 860Pro Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala865 870 875 880Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe885 890 895Lys Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val900 905 910Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly915 920 925Glu Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro930 935 940Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala945 950 955 960Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu965 970 975Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro Asn980 985 990Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys Asp Gln995 1000 1005Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala Ile Thr1010 1015 1020Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn Cys Pro
1025 1030 1035<210>16<211>328<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来源于合成cDNA盒-1的Lub3 DNA插入片段和2个合成cDNA盒-2序列。
<400>16gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac240ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaagg300aacccaaacc ggcaccaacc actccgga 328<210>17<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub3 DNA插入片段编码的108个氨基酸(在SEQ ID NO15中位于S373-E482之间有9个KEPAPTT序列)。
<400>17Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60
Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro65 70 75 80Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr85 90 95Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro100 105<210>18<211>3210<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组PRG4-Lub4 cDNA构建体。
<400>18atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga900
aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct1260gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc1380acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag1440gagcctgcac ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg1500actcctaagg aacccaaacc ggcaccaacc actccggaaa cacctcctcc aaccacttca1560gaggtctcta ctccaactac caccaaggag cctaccacta tccacaaaag ccctgatgaa1620tcaactcctg agctttctgc agaacccaca ccaaaagctc ttgaaaacag tcccaaggaa1680cctggtgtac ctacaactaa gacgccggcg gcgactaaac ctgaaatgac tacaacagct1740aaagacaaga caacagaaag agacttacgt actacacctg aaactacaac tgctgcacct1800aagatgacaa aagagacagc aactacaaca gaaaaaacta ccgaatccaa aataacagct1860acaaccacac aagtaacatc taccacaact caagatacca caccattcaa aattactact1920cttaaaacaa ctactcttgc acccaaagta actacaacaa aaaagacaat tactaccact1980gagattatga acaaacctga agaaacagct aaaccaaaag acagagctac taattctaaa2040gcgacaactc ctaaacctca aaagccaacc aaagcaccca aaaaacccac ttctaccaaa2100aagccaaaaa caatgcctag agtgagaaaa ccaaagacga caccaactcc ccgcaagatg2160acatcaacaa tgccagaatt gaaccctacc tcaagaatag cagaagccat gctccaaacc2220accaccagac ctaaccaaac tccaaactcc aaactagttg aagtaaatcc aaagagtgaa2280gatgcaggtg gtgctgaagg agaaacacct catatgcttc tcaggcccca tgtgttcatg2340
cctgaagtta ctcccgacat ggattactta ccgagagtac ccaatcaagg cattatcatc2400aatcccatgc tttccgatga gaccaatata tgcaatggta agccagtaga tggactgact2460actttgcgca atgggacatt agttgcattc cgaggtcatt atttctggat gctaagtcca2520ttcagtccac catctccagc tcgcagaatt actgaagttt ggggtattcc ttcccccatt2580gatactgttt ttactaggtg caactgtgaa ggaaaaactt tcttctttaa ggattctcag2640tactggcgtt ttaccaatga tataaaagat gcagggtacc ccaaaccaat tttcaaagga2700tttggaggac taactggaca aatagtggca gcgctttcaa cagctaaata taagaactgg2760cctgaatctg tgtatttttt caagagaggt ggcagcattc agcagtatat ttataaacag2820gaacctgtac agaagtgccc tggaagaagg cctgctctaa attatccagt gtatggagaa2880atgacacagg ttaggagacg tcgctttgaa cgtgctatag gaccttctca aacacacacc2940atcagaattc aatattcacc tgccagactg gcttatcaag acaaaggtgt ccttcataat3000gaagttaaag tgagtatact gtggagagga cttccaaatg tggttacctc agctatatca3060ctgcccaaca tcagaaaacc tgacggctat gattactatg ccttttctaa agatcaatac3120tataacattg atgtgcctag tagaacagca agagcaatta ctactcgttc tgggcagacc3180ttatccaaag tctggtacaa ctgtccttaa 3210<210>19<211>1069<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB4蛋白的氨基酸序列。
<400>19Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30
Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285
Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr435 440 445Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys450 455 460Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys465 470 475 480Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu485 490 495Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro500 505 510Glu Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr515 520 525Lys Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu530 535 540
Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu545 550 555 560Pro Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met565 570 575Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr580 585 590Pro Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr595 600 605Thr Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln610 615 620Val Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr625 630 635 640Leu Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr645 650 655Ile Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro660 665 670Lys Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys675 680 685Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr690 695 700Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met705 710 715 720Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala725 730 735Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu740 745 750Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu755 760 765Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val Thr770 775 780Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile785 790 795 800
Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val805 810 815Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly820 825 830His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg835 840 845Arg Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe850 855 860Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln865 870 875 880Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro885 890 895Ile Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu900 905 910Ser Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys9l5 920 925Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln930 935 940Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu945 950 955 960Met Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser965 970 975Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr980 985 990Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu Trp995 1000 1005Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro Asn1010 1015 1020Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys Asp1025 1030 1035Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala Ile1040 1045 1050
Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn Cys1055 1060 1065Pro<210>20<211>421<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来源于cDNA盒-1的Lub4 DNA插入片段和3个合成cDNA盒-2序列。
<400>20gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac240ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaaag300aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc gcacccacaa360caccaaagga gccggcccct acgactccta aggaacccaa accggcacca accactccgg420a421<210>21<211>139<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub4 DNA插入片段编码的139个氨基酸(在SEQ ID NO19中位于S373-E513之间有12个KEPAPTT序列)。
<400>21Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala
20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro65 70 75 80Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr85 90 95Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr100 105 110Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr115 120 125Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro130 135<210>22<211>3303<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组PRG4-Lub5 cDNA构建体。
<400>22atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga120gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc180aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga240gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat300gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct360ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca420aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt480
tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg 540aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta 600aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa1020ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct1080accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag1140cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact1200actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct1260gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct1320aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc1380acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag1440gagcctgcac ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg1500actcctaaag aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc1560gcacccacaa caccaaagga gccggcccct acgactccta aggaacccaa accggcacca1620accactccgg aaacacctcc tccaaccact tcagaggtct ctactccaac taccaccaag1680gagcctacca ctatccacaa aagccctgat gaatcaactc ctgagctttc tgcagaaccc1740acaccaaaag ctcttgaaaa cagtcccaag gaacctggtg tacctacaac taagacgccg1800gcggcgacta aacctgaaat gactacaaca gctaaagaca agacaacaga aagagactta1860cgtactacac ctgaaactac aactgctgca cctaagatga caaaagagac agcaactaca1920
acagaaaaaa ctaccgaatc caaaataaca gctacaacca cacaagtaac atctaccaca1980actcaagata ccacaccatt caaaattact actcttaaaa caactactct tgcacccaaa2040gtaactacaa caaaaaagac aattactacc actgagatta tgaacaaacc tgaagaaaca2100gctaaaccaa aagacagagc tactaattct aaagcgacaa ctcctaaacc tcaaaagcca2160accaaagcac ccaaaaaacc cacttctacc aaaaagccaa aaacaatgcc tagagtgaga2220aaaccaaaga cgacaccaac tccccgcaag atgacatcaa caatgccaga attgaaccct2280acctcaagaa tagcagaagc catgctccaa accaccacca gacctaacca aactccaaac2340tccaaactag ttgaagtaaa tccaaagagt gaagatgcag gtggtgctga aggagaaaca2400cctcatatgc ttctcaggcc ccatgtgttc atgcctgaag ttactcccga catggattac2460ttaccgagag tacccaatca aggcattatc atcaatccca tgctttccga tgagaccaat2520atatgcaatg gtaagccagt agatggactg actactttgc gcaatgggac attagttgca2580ttccgaggtc attatttctg gatgctaagt ccattcagtc caccatctcc agctcgcaga2640attactgaag tttggggtat tccttccccc attgatactg tttttactag gtgcaactgt2700gaaggaaaaa ctttcttctt taaggattct cagtactggc gttttaccaa tgatataaaa2760gatgcagggt accccaaacc aattttcaaa ggatttggag gactaactgg acaaatagtg2820gcagcgcttt caacagctaa atataagaac tggcctgaat ctgtgtattt tttcaagaga2880ggtggcagca ttcagcagta tatttataaa caggaacctg tacagaagtg ccctggaaga2940aggcctgctc taaattatcc agtgtatgga gaaatgacac aggttaggag acgtcgcttt3000gaacgtgcta taggaccttc tcaaacacac accatcagaa ttcaatattc acctgccaga3060ctggcttatc aagacaaagg tgtccttcat aatgaagtta aagtgagtat actgtggaga3120ggacttccaa atgtggttac ctcagctata tcactgccca acatcagaaa acctgacggc3180tatgattact atgccttttc taaagatcaa tactataaca ttgatgtgcc tagtagaaca3240gcaagagcaa ttactactcg ttctgggcag accttatcca aagtctggta caactgtcct3300taa 3303
<210>23<211>1100<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完整PRG4-LUB5蛋白的氨基酸序列。
<400>23Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val1 5 10 15Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly20 25 30Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr35 40 45Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys50 55 60Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg65 70 75 80Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys85 90 95Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser100 105 110Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr115 120 125Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys130 135 140Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val145 150 155 160Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser165 170 175Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg180 185 190
Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr195 200 205Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser210 215 220Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr225 230 235 240Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys245 250 255Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys260 265 270Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu275 280 285Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr290 295 300Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp305 310 315 320Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu325 330 335Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro340 345 350Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro355 360 365Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr370 375 380Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr385 390 395 400Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr405 410 415Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro420 425 430Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr435 440 445
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys450 455 460Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys465 470 475 480Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu485 490 495Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu500 505 510Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro515 520 525Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu530 535 540Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys545 550 555 560Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu565 570 575Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro580 585 590Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr595 600 605Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro610 615 620Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr625 630 635 640Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val645 650 655Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu660 665 670Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile675 680 685Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys690 695 700
Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys Pro705 710 715 720Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr Met725 730 735Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met Thr740 745 750Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala Met755 760 765Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu Val770 775 780Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu Thr785 790 795 800Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val Thr Pro805 810 815Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn820 825 830Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp835 840 845Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His850 855 860Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg865 870 875 880Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr885 890 895Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr900 905 910Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile915 920 925Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser930 935 940Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg945 950 955 960
Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln Lys965 970 975Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Met980 985 990Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln995 1000 1005Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr1010 1015 1020Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu1025 1030 1035Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro1040 1045 1050Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys1055 1060 1065Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala1070 1075 1080Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn1085 1090 1095Cys Pro1100<210>24<211>514<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来源于cDNA盒-1的Lub5 DNA插入片段和4个合成cDNA盒-2序列。
<400>24gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag120cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa180aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac240
ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaaag300aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc gcacccacaa360caccaaagga gccggcccct acgactccta aagaaccagc ccctactacg acaaaggagc420ctgcacccac aaccacgaag agcgcaccca caacaccaaa ggagccggcc cctacgactc480ctaaggaacc caaaccggca ccaaccactc cgga514<210>25<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由Lub5 DNA插入片段编码的170个氨基酸(在SEQ ID NO23中位于S373-E544之间有15个KEPAPTT序列)。
<400>25Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala35 40 45Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro50 55 60Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro65 70 75 80Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr85 90 95Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr100 105 110Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr115 120 125Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr130 135 140
Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro145 150 155 160Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro165 170<210>26<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>优选PRG4-LUBN蛋白中的氨基酸序列″APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK″(45个氨基酸)<400>26Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala1 5 10 15Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala20 25 30Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys35 40 45<210>27<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在优选PRG4-LUBN蛋白中重复N-1次的氨基酸序列″KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP″(31个氨基酸)<400>27Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr1 5 10 15Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro20 25 30<210>28
<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在优选PRG4-LUBN蛋白中使SEQ ID NO26与SEQ ID NO27的(N-2)个重复连接的氨基酸序列″EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP″(22个氨基酸)，其中N＝3或更高数值。
<400>28Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu1 5 10 15Pro Ala Pro Thr Thr Pro20<210>29<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>优选PRG4-LUBN蛋白中的氨基酸序列″KEPKPAPTTP″(10个氨基酸)，其中N＝2或更高数值。
<400>29Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro1 5 10
权利要求
1.分离的蛋白，包括SEQ ID NOS9、13、17、21或25。
2.分离的蛋白，包括与SEQ ID NO27的N-2个重复连接的SEQID NO26，其中N为3-200的整数。
3.权利要求2所述的蛋白，其中N为5-50的整数。
4.权利要求2所述的蛋白，其中N为10-30的整数。
5.分离的蛋白，包括SEQ ID NO26加SEQ ID NO28加[SEQ IDNO27的N-2个重复]加SEQ ID NO29，其中N为10-30的整数。
6.分离的多核苷酸，含有编码权利要求1所述蛋白的核酸序列。
7.分离的多核苷酸，含有编码权利要求2所述蛋白的核酸序列。
8.分离的多核苷酸，含有编码权利要求3所述蛋白的核酸序列。
9.分离的多核苷酸，含有编码权利要求4所述蛋白的核酸序列。
10.分离的多核苷酸，含有编码权利要求5所述蛋白的核酸序列。
11.分离的蛋白，包括SEQ ID NOS7、11、15、19或23。
12.分离的多核苷酸，含有编码权利要求11所述蛋白的核酸序列。
13.权利要求6所述的多核苷酸，其中该多核苷酸包括SEQ IDNOS8、12、16、20或24。
14.权利要求12所述的多核苷酸，其中该多核苷酸包括SEQ IDNOS6、10、14、18或22。
15.分离的多核苷酸，包括与SEQ ID NOS6、10、14、18或22在序列的全长上具有至少80％同一性的多核苷酸。
16.权利要求15所述的多核苷酸，包括具有至少90％同一性的多核苷酸。
17.权利要求15所述的多核苷酸，包括具有至少95％同一性的多核苷酸。
18.权利要求15所述的多核苷酸，包括具有至少99％同一性的多核苷酸。
19.权利要求1或2所述的蛋白，其中该蛋白与β-(1-3)-Gal-GalNac为O连接。
20.组合物，含有药学可接受载体中的治疗有效量的权利要求19所述的蛋白。
21.权利要求20所述的组合物，还包括乙酰透明质酸或hylan。
22.治疗被试者的方法，包括获得权利要求20所述的组合物；和对被试者的组织施用该组合物。
23.权利要求22所述的方法，其中所述组织选自软骨、滑膜、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜。
24.权利要求23所述的方法，其中所述组织为软骨。
25.权利要求22所述的方法，还包括选自下列的步骤向被试者提供麻醉剂；向被试者提供抗炎症药物；向被试者提供抗生素；从被试者抽吸液体；清洗被试者的组织；并对被试者的组织成像。
26.权利要求22所述的方法，其中被试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、马和人。
27.权利要求26所述的方法，其中被试者为人。
28.表达载体，含有与表达控制序列可操作连接的权利要求6或7所述的多核苷酸。
29.制备重组蛋白的方法，包括在液体培养基内培养由权利要求28所述的表达载体转化的细胞；并从该培养基中收集重组蛋白。
30.权利要求29所述的方法，其中蛋白收集步骤还包括通过膜过滤培养基使所述蛋白浓缩；从膜上收集被截留的蛋白；并将收集到的蛋白溶解在含有浓度范围为0.1-2.0M的L-精氨酸盐酸盐的缓冲盐溶液中。
31.权利要求30所述的方法，其中L-精氨酸盐酸盐的浓度为0.5M。
32.对权利要求1或2所述的蛋白具有特异性的分离抗体。
全文摘要
重组润滑素分子及其用途。本发明提供了新的重组润滑素分子及其作为润滑剂、抗粘连剂和/或关节内补充物应用于例如滑膜关节、半月板、腱、腹膜、心包和胸膜的用途。
文档编号A61K31/728GK1867350SQ200480029904
公开日2006年11月22日 申请日期2004年8月13日 优先权日2003年8月14日
发明者C·R·弗里纳里, C·J·科尔科兰, B·A·弗里曼, L·A·拉西 申请人:惠氏公司