用来检测分析物的半透性传感器的制作方法

专利名称：：用来检测分析物的半透性传感器的制作方法背景本发明涉及制造用来检测葡萄糖之类分析物的传感器。有效治疗糖尿病需要监控糖尿病患者体内的葡萄糖水平的变化。目前是通过反复针刺糖尿病患者的手指获取评价所需血样来监控患者的状况。对葡萄糖的自监控是不连续的，无法提供个人体内葡萄糖水平的实时信息。已经提出了各种用来连续监控葡萄糖水平的具有可植入传感器的系统，这些传感器包含能够监测体内葡萄糖水平的试剂。然而，由于许多会影响传感器在宿主体内适当运作的因素，很难制得有用的可植入传感器。例如，宿主的免疫系统会对传感器进行攻击。这种攻击会在传感器周围形成纤维鞘，这种纤维鞘会妨碍，可能会阻止葡萄糖进入传感器，使传感器基本无效。如果宿主免疫系统的各种组分能够进入传感器，它们还会攻击传感器的试剂。如果传感器的渗透性过高，试剂会从传感器泄漏入宿主体内，对宿主造成伤害，而且会耗尽可用来检测葡萄糖的试剂的量。另外，如果传感器的渗透性过于有限，或传感器的试剂对宿主葡萄糖水平变化的应答过慢，则传感器所提供的信息无法准确反应宿主的生理状况。需要能够克服这些困难，并且能长期连续监控葡萄糖的传感器。概述在一个方面，本发明提供一种用来检测分析物的传感器，该传感器包括含有水凝胶的芯；位于该芯内的荧光试剂；包围着该芯的半透性涂层，该半透性涂层包含分子量约为4kDa至18kDa、多分散指数大于1的多分散聚合物；以及包围着所述半透性涂层的生物相容性涂层。在一些实施方式中，所述多分散聚合物的分子量约为8kDa至12kDa。在另外的实施方式中，所述多分散聚合物的分子量约为9kDa至10kDa。在一实施方式中，所述多分散聚合物的分子量约为9.4kDa。在一些实施方式中，所述多分散聚合物的多分散指数从大于1至约1.5。在另外的实施方式中，所述多分散聚合物包括聚赖氨酸。在一实施方式中，传感器的直径大于1毫米。在另外的实施方式中，传感器的直径至少为1.25毫米。在另一实施方式中，传感器的直径至少为1.5毫米。在一些实施方式中，传感器的直径不超过3毫米。在另外的实施方式中，传感器的直径不超过2.5毫米。在一些实施方式中，分析物包含葡萄糖。在一实施方式中，传感器能够根据非辐射荧光共振能量传输检测分析物。在一些实施方式中，所述荧光试剂包含能量受体(acceptor)和能量给体(donor)。在另外的实施方式中，荧光试剂选自羰花青染料、磺化氨基香豆素染料(sulfonatedaminocourmarindye)、磺化若丹明染料及其组合。在一实施方式中，所述荧光试剂包含葡萄糖结合蛋白和糖基化的底物。在一些实施方式中，所述葡萄糖结合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，糖基化的底物包括人血清白蛋白。在另一实施方式中，荧光试剂包含激发最大值约在581纳米、发射最大值约在596纳米的第一羰花青染料，伴刀豆球蛋白A，激发最大值约在675纳米、发射最大值约在694纳米的第二羰花青染料，和人血清白蛋白。在另外的实施方式中，所述第一羰花青与伴刀豆球蛋白A之比约为0.1-0.4。在一些实施方式中，所述第一羰花青与伴刀豆球蛋白A之比为0.2。在一实施方式中，第二羰花青与人血清白蛋白之比约为0.5-0.9。在一些实施方式中，所述人血清白蛋白是糖基化的，葡萄糖与人血清白蛋白的摩尔比约为7-12。在另一方面，本发明涉及制造传感器的方法，该方法包括使水性藻酸盐组合物的液滴与包含至少100mM第II族阳离子的离子溶液接触，形成包含交联凝胶的芯，所述水性藻酸盐组合物包含含有至少1％重量/体积的藻酸盐、在约25℃的粘度至少为1700厘泊的原液组合物的两倍稀释物。在一实施方式中，所述离子包括钡离子、钙离子或其组合。在一些实施方式中，所述藻酸盐组合物包含约1％重量/体积至约10％重量/体积的藻酸盐。在另外的实施方式中，所述藻酸盐包含约1％重量/体积至约3％重量/体积的藻酸盐。在一实施方式中，所述原液组合物在约25℃的粘度约为1700-2000厘泊。在另外的实施方式中，所述离子溶液包含约100mM至300mM的阳离子。在一些实施方式中，该方法还包括用包含多分散指数大于1的多分散聚合物的组合物涂布该芯。在另外的实施方式中，该方法还包括用包含多分散指数从大于1至约1.5的多分散聚合物的组合物涂布该芯。在另一实施方式中，该方法还包括用生物相容性组合物涂布多分散聚合物。在一实施方式中，该方法还包括使芯与包含荧光试剂的组合物接触。在一些实施方式中，所述水性藻酸盐组合物包含荧光试剂。在一实施方式中，所述荧光试剂包含能量给体和能量受体。在另外的实施方式中，所述荧光试剂包含葡萄糖结合蛋白和糖基化的底物。在一实施方式中，所述葡萄糖结合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，所述糖基化的底物包括人血清白蛋白。在一些实施方式中，所述荧光试剂选自羰花青染料、磺化氨基香豆素染料、磺化若丹明染料及其组合。在另外的实施方式中，所述荧光试剂包含羰花青染料、磺化氨基香豆素染料、磺化若丹明染料及其组合。在另一实施方式中，所述第一羰花青与伴刀豆球蛋白A之比约为0.1-0.4。在另外的实施方式中，所述第一羰花青与伴刀豆球蛋白A之比为0.2。在一些实施方式中，所述第二羰花青与人血清白蛋白之比约为0.5-0.9。在一实施方式中，葡萄糖结合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，糖基化的底物包括人血清白蛋白。在另一实施方式中，所述人血清白蛋白是糖基化的，葡萄糖与人血清白蛋白的摩尔比约为7-12。在另外的实施方式中，所述荧光试剂包含具有在约578纳米的激发最大值和在约603纳米的发射最大值的第一染料，伴刀豆球蛋白A，具有在约650纳米的激发最大值和在约665纳米的发射最大值的第二染料，和人血清白蛋白。在一些实施方式中，当传感器在37℃、pH值＝7.4的条件下，在10mMHEPES/0.15M食盐水中贮存两周时，荧光试剂的泄漏小于1摩尔％。在另一方面，本发明涉及用来检测分析物的传感器，该传感器包括包含聚合物基质的芯；位于该芯内的荧光试剂；包围该芯的半透性涂层，该半透性涂层包含多分散聚合物；以及包围着所述半透性涂层的生物相容性涂层。当传感器在37℃、pH值＝7.4的条件下，在10mMHEPES/0.15M食盐水中贮存两周时，荧光试剂的泄漏小于1摩尔％。本发明涉及一种可用来检测葡萄糖之类的分析物的可植入、可移出(explantable)的传感器。该传感器的刚性足以进行植入和移出，可发生足够的形变以耐受身体的各种日常作用力而不发生破裂，尺寸大到足以触知(palpable)。所述传感器也足够大，足以使宿主在传感器周围形成鞘，所形成的鞘足够厚，足以使传感器维持在原处，并且足够薄，足以使相关分析物以生理学有用的速率扩散入传感器中和从传感器中扩散出来。传感器足够小，足以使分析物以生理学有用的速率扩散入传感器中和从传感器中扩散出来。所述传感器具有足够的机械强度，使其能够在宿主体内稳定存在至少6个月，甚至至少12个月，该传感器具有足够的生物相容性，使得在这至少6个月，甚至至少12个月内传感器不会引发对其适当工作有害的纤维化应答。该传感器的可渗透性足以使分析物以生理学适当的速率扩散入传感器中和从传感器中扩散出来，其不可渗透性足以将试剂保持在传感器内(即该传感器没有或基本没有试剂泄漏)，并且阻挡IgG，基本防止其进入传感器。由以下优选实施方式的描述和权利要求书可清楚地了解其它特征和优点。术语表根据本发明，这些术语含义如下在本文中，术语“荧光团”表示能够吸收能量，然后发光的分子。在本文中，术语“分析物类似物”表示一种材料，该材料至少有一些结合性质与分析物的结合性质相同，使得具有可同时结合二者的配体。然而，分析物类似物与分析物不能互相结合。所述分析物类似物可以是分析物的衍生物，例如通过在分析物上引入至少不会影响分析物的一些结合性质的官能团制得的化合物。另一种衍生物的例子是分析物的较低分子量的变体，该变体保持分析物的至少一些结合性质。另一衍生物的例子是分析物或分析物的多份拷贝与载体蛋白质的共价共轭物。在本文中，术语“可生物相容的”表示可被宿主的免疫系统接受，即诱发的免疫应答最小且对宿主无毒。在本文中，术语“荧光”表示受到特定波长辐射激发而发射的辐射。其包括短寿命(纳秒级)和长寿命激发态寿命；后者有时称为磷光。在本文中，术语“荧光试剂”表示在存在受测分析物的条件下，荧光性能(例如强度、发射激发态寿命、光谱或激发光谱)发生变化的组分。在本文中，发射最大值或激发最大值是相对于在水中获得的值而言。附1A是给体和受体分子吸收光谱和发射光谱的示意图。图1B是非辐射能量传输的示意图。图2是通过立体解剖显微镜20X的物镜得到的传感器彩色照片，该照片包括包围在锯齿状聚赖氨酸涂布的藻酸盐芯周围的藻酸盐涂层。图3是实施例1中测得的泄漏数据的图。图4是说明比较例1-3和实施例1的小球(bead)在第14天的Cy3.5泄漏的柱状图。详述所述传感器包括芯，该芯包含聚合物基质和位于聚合物基质中的试剂；包围在所述芯周围的包含多分散聚合物的半透性涂层；包围着所述半透性涂层的生物相容性涂层。传感器的构造能够保留住试剂，同时使分析物能够以可提供分析物相关生理状况的有用信息的速率扩散入传感器内和从传感器内扩散出来。传感器的结构可设计成适于以体内、体外或其组合形式使用，可用来检测包括体液在内的各种液体(例如血液、血浆、血清、皮下组织液和腹膜液)中的分析物。通过激发传感器的试剂，然后检测传感器发射的辐射来检测分析物(并任选地定量)。优选的传感器足够大，使得将其植入皮下时可被触知(即在进行以后的移出时便于定位)，而且足以诱发宿主在传感器周围形成鞘。鞘用来维持传感器在宿主体内的位置(例如固定)。优选的是鞘的厚度足够小，足以使分析物以生理学适当的速率扩散入传感器和从传感器中扩散出来。传感器也足够小，使得分析物能够以生理学适当的速率扩散入传感器和从传感器中扩散出来，传感器内的试剂以生理学适当的速率对生理状况的改变做出应答。对于任意形状的传感器，分析物扩散入传感器的特征时间可用传感器中心与表面上的点的平均距离表示。如果该距离称为x，D是分析物的扩散系数，则分析物扩散通过传感器的特征时间(t)可表示为t＝x2/6D。优选的传感器是球形的，直径大于1毫米，至少为1.25毫米，至少1.5毫米，不大于3毫米，甚至不大于2.5毫米。有用的传感器具有各种形状，包括例如球形、圆柱形、椭圆形、卵形和圆盘形。传感器可构造成包括被相同的聚合物基质包围的多个芯，即多个聚合物基质。优选的是传感器的折射率基本与水的折射率相同，使其不发生光散射，在水性环境下基本透明。优选的是，传感器具有足够的机械强度(例如刚性)，使其能够植入宿主和从宿主体内取出，具有足够的可变形性，以吸收在日常过程中所受的宿主的作用力。优选的是，传感器具有足够的机械强度，使传感器传感器能够保持长期植入宿主，例如至少6个月，甚至至少12个月而不发生破裂或丧失完整性。传感器的机械强度可源自聚合物基质、半透性涂层、生物相容性涂层及其组合。也可使用保护载体或外壳使传感器具有机械强度。所述外壳包括例如金属(例如钛、铂、金及其组合)制网格状封套。可通过改变用来形成聚合物基质的可交联组分的浓度以及聚合物基质的交联程度来改变聚合物基质的机械强度。聚合物基质优选由可交联组合物制得，使得最终的基质当完全水合时至少含50体积％，90体积％，92体积％，95体积％，98体积％，甚至99体积％的水。优选的是聚合物基质是水凝胶。水凝胶可由藻酸盐之类的可交联组分制成。一种可用的可交联藻酸盐组合物是由在室温下(即约20-25℃)粘度至少为1700厘泊，甚至1700厘泊至约2000厘泊的藻酸盐储存液制成，该溶液在使用前1∶1地稀释，形成包含至少1％重量/体积(w/v)，约1％w/v至约10％w/v，甚至约1％w/v至约3％w/v的藻酸盐水溶液的可交联组合物。优选通过将藻酸盐组合物滴入包含至少100mM(毫摩尔)，约100-300mM，甚至约100-150mM离子的浓离子溶液中，使藻酸盐交联。有用的离子包括第II族阳离子，包括例如钙离子、钡离子、镁离子及其组合。优选的藻酸盐凝胶源自包含连接在一起的1，4-连接的(D-甘露糖醛酸)(M)和(-1-葡糖醛酸(glocoronicacid))(G)区段(例如MG区段交替连结)的藻酸盐。优选的藻酸盐具有高G区段含量，例如至少含有约60％的G区段。随着藻酸盐组合物中G区段百分含量的增加，所得凝胶基质的孔径和强度会增大。具有高M区段含量的藻酸盐凝胶比具有高G区段含量的凝胶更容易导致免疫。其它合适的凝胶包括能够形成具有足够强度的芯，使其能够保持所需传感器形状的任何凝胶。可用的水凝胶的例子包括例如角叉藻聚糖、树胶(例如黄原胶)、琼脂糖、琼脂、骨胶原、明胶、壳聚糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷及其组合。其它有用的聚合物基质包括例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及其组合。合适的形成聚合物基质的方法包括例如向能够形成凝胶的组合物(gelformingcomposition)中加入水，向可交联组合物施加交联剂，改变能够形成凝胶的组合物的温度(例如加热)，使能够形成凝胶的组合物暴露于辐射，以及它们的组合。对形成聚合物基质的条件进行选择，以保持传感器组分的整体性。可通过改变该组合物中可交联组分的浓度、交联剂的浓度、交联过程的环境条件(例如温度、pH值、盐度和辐照)、加入链转移剂、加入引发剂及其组合来改变聚合物基质的交联度。或者所述芯还可包括一种水溶液，在此情况下对半透膜进行选择，使传感器具有足够的刚性，使其适于植入和移出。芯可已有各种形状，包括例如球形、扁圆球形、长球形、圆柱形和圆盘状。优选的是芯为球形小珠。可使用任何适合用来制造微球状小珠的方法来制造芯，这些方法包括例如乳化、电喷镀、滴下、Raleigh喷射(例如空气喷射)，和浇注。可用来制造圆柱形和圆片形芯的方法包括例如先挤出然后切割，以及浇住。所述聚合物基质的孔隙率影响组分通过聚合物基质的迁移，可通过几种方法改变孔隙率，这些方法包括例如改变用来形成聚合物基质的组合物中可交联组分的浓度，改变可交联材料的平均分子量，改变可交联组分的分子量分散度，改变可交联组分的组成，在可交联组分中掺杂其他可交联组分，使用不同的交联剂，改变可交联组分的羟基化程度，及其组合。可加入藻酸盐中以改变由此形成的凝胶的组分包括例如明胶和骨胶原。其他合适的交联剂包括例如钡离子、钙离子之类的其它具有相同价态的离子，蛋白质交联剂(例如伴刀豆球蛋白A(concavalinA)之类的外源凝聚素)，光致交联剂，化学交联剂(例如戊二醛(gluteraldehyde))以及它们的组合。可添加或减少加入凝胶基质的物料以改变其孔隙率。例如在Thu，B.J.的名为″AlginatepolycationmicrocapsulesAstudyofsomemolecularandfunctionalpropertiesrelevanttotheiruseasabioartificialpancreas，″NorwegianUniversityofScienceandTechnology，pages35-46(August1996)的论文中描述了各种可用来改变藻酸盐孔隙率的机理，其中包括改变藻酸盐中M区段与G区段之比。用来形成水凝胶的可交联组合物的温度能够影响所制得的凝胶基质的孔径。例如，可交联组合物温度的升高会导致水凝胶收缩，这会减小水凝胶的孔隙率。优选的是芯的聚合物基质的折射率与水的折射率基本相同，不会在用来激发传感器的试剂的波常范围内发射荧光，而且不具有光散射性。优选传感器的外表面足够光滑，使光散射最少，优选消除光散射。通过立体解剖显微镜在透射光环照射下观察传感器来测定传感器的平滑度，所述显微镜的物镜为0.8X至5X，目镜为10倍，总共放大倍数为8X至50X。一种有用的形成平滑传感器的方法包括，通过将可交联组合物的液滴分散在高浓度交联剂中，使可交联组合物快速交联形成水凝胶芯，从而形成平滑的芯，该过程优选在使振动最小(例如隔振)的条件下进行。适用于交联藻酸盐的浓交联剂组合物包括上述的可交联组合物和离子交联溶液，这些描述结合入本文中。传感器的芯还包括能够检测是否存在分析物的试剂。该试剂优选可在聚合物基质中移动。传感器的试剂可包含一种以上的组分。该试剂适合用来检测体液(例如血液和间质液)之类液体中的分析物。有用的试剂包括例如吸能试剂(例如吸光试剂和吸声试剂)，x-射线试剂，自旋共振试剂，核磁共振试剂及其组合。在一些实施方式中，所述试剂的价态足以使试剂聚集，以增强在发生结合时，或不发生结合时试剂所发射的信号。试剂的聚集也有助于将试剂保持在传感器中，即试剂不会通过半透性涂层到传感器的外面。优选试剂是多价的，例如包括至少两个能够与分析物结合的结合位点。在基于非辐照荧光能量传输的情况下，如下面将更详细讨论的，该试剂可包含分析物类似物和能够与该分析物类似物结合的配体。优选的是所述分析物类似物具有至少两个能够与配体结合的位点。优选该试剂至少为2价，2-15价，甚至3-10价。对试剂进行选择，使得位于检测器和传感器之间的皮肤和其他人体组织不会影响试剂发射的信号。优选的试剂所发射的光信号的波长能够透过皮肤，优选的是试剂发光为600nm至1100nm。一种有用的试剂包括荧光试剂，即包含荧光团的试剂或用荧光团标记的化合物。荧光试剂能够可逆地与分析物结合，当发生与分析物结合时，试剂的荧光性能会发生变化。可通过几种方法测量与分析物的存在相关的荧光变化。这些变化包括荧光团(或用荧光团标记的组分)激发态寿命的变化，或所发射荧光强度的变化。这些变化还包括荧光团(或用荧光团标记的组分)的激发光谱或发射光谱的变化。激发光谱或发射光谱的变化也可通过测量以下现象来测量(a)发射峰的出现或消失，(b)在两个或更多发射波长观察到的信号之比，(c)激发峰的出现或消失，(d)在两个或更多激发波长观察到的信号的比例或(e)荧光偏振的变化。可对试剂进行选择，使其具有非辐射荧光共振能量传输(FRET)，该能量传输可用来测量特定结合对之间是否发生了结合或结合的程度。FRET的基本原理FRET通常包括两个荧光团之间的非辐射能量传输，一个是能量给体(D)，另一个是能量受体(A)。可使用任何适当选择的给体-受体对，只要给体的发射光谱与受体的激发光谱相重叠，而且两者均能够在一定波长吸收光能，并在不同的波长发射光能。或者给体和受体均能吸收光能，但是仅有其中之一能够发射光能。例如一种分子(给体)可以是荧光性的，另一种分子(受体)可以是非荧光性的。还可使用一种给体-受体对，其中受体在用来激发(荧光)给体的波长下通常不会被激发；然而，非辐射FRET会造成受体激发。可对激发波长进行选择，使其主要仅激发给体分子。使用术语″主要″说明由于渗过现象(bleedthroughphenomena)，也可能有一些受体被激发。因此，在本文中，术语给体或受体的″激发″表示主要激发给体或受体的激发波长。激发之后，通过测量两个发射波长的荧光信号的比例测定非辐射荧光共振能量传输，其中一个波长的荧光是给体发射的，另一个是受体发射的。正如在激发的情况那样，荧光信号可能有一些″渗出″，使得受体的发射对给体发射信号的贡献较小，反之亦然。因此，当称一种信号是“由于”给体发射或受体发射时，表示这种信号主要是由于给体发射或受体发射造成的。或者可对激发进行选择，使其在第一波长激发给体，在第二波长激发受体。换句话说，采用两种独立的激发，每种激发采用不同的波长。在此情况下，通过测定由于给体激发之后受体发射的荧光信号与以及受体激发后受体产生的荧光信号之比来测定非辐射荧光能量传输。也可通过评估是否会有给体寿命会缩短、给体荧光强度猝灭或受体荧光强度增大来测量FRET；后面两者在相应于在不同波长激发的波长测量(与上述的比例测量相反，其包括测量两个不同波长的发射比或测量在由于两个单独的波长的激发的波长的发射比)。尽管在本文中将给体和受体称为″对″，但是这“对”中的两个″成分″可以是相同的物质。通常这两种成分是不同的(例如Cy3.5和Cy5.5)。一种分子(例如Cy3.5或Cy5.5)可既作为给体又作为受体；在此情况下，通过测量荧光去偏振来测定能量传输。特别有效的用于能够检测葡萄糖的FRET基传感器的试剂包括一种受体和一种给体，所述受体包含与伴刀豆球蛋白A(例如重组伴刀豆球蛋白A)结合的Cy5.5，其中染料与蛋白质之比约为0.1-0.4，甚至约为0.2，所述给体包括与人血清白蛋白结合的Cy3.5，其中染料与蛋白质之比约为0.5-0.9，葡萄糖与蛋白质之比约为7-12。根具生产商AmershamBioSciences(CardiffWales)的报道，Cy3.5是激发最大值在581纳米、发射最大值在596纳米的羰花青染料。根据生产商AmershamBioSciences报道，Cy5.5是激发最大值在675纳米，发射最大值在694纳米的羰花青染料。另一种有用的试剂包含一种给体和一种受体，所述给体包含与伴刀豆球蛋白A(例如重组伴刀豆球蛋白A)结合的ALEXA568，所述受体包含与人血清白蛋白结合的ALEXA647。根据生产商MolecularProbes，(Eugene，Oregon)所述，ALEXA568的激发最大值约为578纳米，发射最大值约为603纳米。根据生产商MolecularProbes所述，ALEXA647的激发最大值约为650nm，发射最大值约为665纳米。给体/受体对的其他例子是NBDN-(7-硝基苯并-2-，1，3-二唑-4-基)与若丹明，NBD或荧光素与曙红或赤藓红，丹酰与若丹明，以及吖啶橙与若丹明。在本文中，术语荧光素表示包括各种相关化合物及其衍生物的化合物。类似的，在本文中，术语若丹明表示一类包括各种相官化合物及其衍生物的化合物。较佳的是，所述传感器包括能够在400-800纳米，532纳米，635纳米，645纳米，655纳米，660纳米，或甚至670纳米波长激发，能够发射600-1100纳米，或甚至600-700纳米辐射的试剂。可用的含荧光团染料的种类包括例如羰花青染料，磺化的aminocourmarin和若丹明，以及它们的组合。在例如Panchuk-Voloshina，Nataliya等的″AlexaDyes，aSeriesofNewFluorescentDyesthatYieldExceptionallyBright，PhotostableConjugates，″TheJounialofHistocheniistryandCytochemistry，vol.47(9)1179-1188(1999)中进一步描述一些这种化合物的化学性质。有用的可在市场上购得的含荧光团染料，它们的生产商以及它们相应的近似发射最大值列于下表1。表11MolecularProbes，Eugene，Oregon.2AmershamBioSciences，CardiffWales.3DeNovoBiolabelsGmbH，Munster，Germany.有用的能量给体和能量受体对列于下表2。表2FRET的概念见图1。图1A显示了分别表示为A(D)和E(D)的给体的吸收和发射，分别表示为A(A)和E(A)的受体的吸收和发射。给体发射光谱和受体吸收光谱的重叠面积(即重叠积分)是很重要的。如果在波长I发生激发，给体会在波长II发射光线，但是受体不会在波长III发光，这是由于受体不会吸收波长I的光。图1B显示发生的非辐射传输过程。D分子吸收电场矢量表示为E的光子。D的激发态显示为一偶极子，其一侧具有正电荷，另一侧具有负电荷。如果受体分子(A)与D足够接近(例如通常小于100埃)，会在其上诱导出相反的偶极子(被激发到激发态)。这种偶极子诱导的偶极子相互作用以给体-受体分子间距离的六次幂衰减。典型地说，可发生部分的能量传输。然而在FRET中不会如此，FRET是一种要么完全发生，要么完全不发生的量子力学情况。也即是说，给题无法将其部分的能量传输给受体。必须传输所有的能量，只有在能级(即光谱)发生重叠的情况下才会发生能量传输。当A离开其激发态时，所发射的光相对于入射光来说是旋转的(rotated)或去偏振的。结果，FRET自身表示为在II的荧光强度降低(即给体发射减少)，在III出现荧光强度(即敏化的发射的增加)以及荧光相对于入射光的去偏振。FRET的最后一种表现是激发态的寿命。荧光可看作是一个平衡过程，在此过程中分子停留在其激发态的时间长度是被入射光将其激发入激发态的速率与使其离开激发态的速率的总和(荧光和非辐射过程)之间竞争的结果。如果添加其他的非辐射过程FRET(其他条件不变)，则衰减占优势，这意味着在II的给体寿命缩短。当激发光谱和发射光谱重叠的两个荧光团近似足够接近时，给体分子的激发态能量通过共振偶极子诱导偶极子相互作用传输到相邻的受体荧光团上。在FRET中，在一定波长辐照一样品或混合物，该辐射能够激发给体，但是不会直接激发受体分子。然后在给体发射波长和受体发射波长这两种波长下检测该样品。如果给体和受体不够接近，不会发生FRET，仅会在给体波长有发射。如果给体和受体足够接近，会发生FRET。这种互相作用的结果是给体寿命缩短，给体荧光猝灭，受体荧光强度增大，荧光强度消偏振。随着给体分子和受体分子之间的距离R的增加，能量传输效率Et迅速降低。对于孤立的给体受体对，能量传输效率表示为Et＝1/[1+(R/Ro)6](1)式中R是给体与受体之间的间距，Ro是半传输的距离。Ro是取决于给体发射光谱与受体激发光谱之间的重叠积分、折射率、给体的量子产率、给体发射和受体吸收时刻的取向的数值。Forster，T.，ZNaturforsch.4A，321-327(1949)；Forster，T.，Disc.FaradaySoc.27，7-17(1959)。由于FRET与1/R的相关性，FRET与分子距离有很大的关系，被称为″光谱规则″。(Stryer，L.和Haugland，R.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98719(1967)。例如，该技术已被用来有效地测定包括蛋白质和核酸之类的各种聚合物中本征和非本征荧光团的给体和受体之间的距离。Cardullo等证明可采用FRET检测两种低聚脱氧核苷酸的杂化(Cardullo，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，858790-8794(1988))。使用FRET检测分析物的原理通常采用两种方法的其中之一使用FRET来检测分析物。第一种方法是竞争分析法，在此方法中对待测分析物的类似物和能够与类似物和分析物结合的配体进行标记，其中一种用给体荧光团标记，另一种用受体荧光团标记。因此，类似物可用给体标记，配体可用受体标记，或者类似物可被受体标记，配体被给体标记。当标记的试剂接触分析物时，分析物替换了与配体相连的类似物。由于配体和类似物互相不够接近，无法发生FRET，由FRET产生的荧光信号减少；这种减少与分析物的浓度相关(可在此前的标定步骤中建立这种关联)。为了能重新利用该荧光试剂，分析物与配体之间的结合在生理条件下应当是可逆的。类似地，分析物-配体结合的平衡结合常数与类似物-配体结合的平衡结合常数应使得分析物能够取代类似物。换句话说，类似物-配体的结合不应过强，使得分析物无法取代类似物。优选的是，传感器不含由传感器的试剂引起的内部过滤作用(innerfiltereffect)。根据传感器的化学性质，对最小过滤作用的需要具有不同的后果。当试剂包含荧光团时，当荧光试剂的浓度高到足以对发射的光造成显著的再吸收时，会产生内部过滤作用。如果试剂通过直接改变分析物结合时的荧光起作用，如果分析物的结合常数处于测量所需范围内，此时可通过降低传感器内荧光试剂的浓度，同时保持足够的荧光信号，可以使内部过滤作用最小化。当试剂通过荧光分析物类似物和荧光分析物结合剂之间的FRET起作用时，可通过选择相互的亲和力远高于分析物和分析物结合剂之间亲合力，但是与分析物的亲和力在所需浓度范围之内的试剂使内部过滤作用最小化。也可将类似的方法用于任何竞争荧光检测。例如在美国专利第5,342,789号中所述的传感器化学在试剂间具有微摩尔的亲和力，但是能够检测具有毫摩尔范围的亲和性的葡萄糖。试剂可通过许多方法结合在芯内。根据一种方法，在形成芯之前将试剂加入可交联组合物中。根据另一种方法，将芯置于包含该试剂的组合物中，使试剂渗透入芯内。传感器的半透性涂层是由各种聚合物制备的多孔聚合物涂层，所述各种聚合物是例如杂聚物、均聚物及其混合物。该涂层的渗透性使得相关分析物能够流入传感器和从其中流出，从而可以测量分析物的生理相关变化，传感器内的试剂保持在传感器内(即宿主未暴露于试剂)，使相关分析物与试剂接触，同时抑制、优选防止预定分子量的组分进入传感器内。对用来制备半透性涂层的聚合物种类和分子量和涂层的厚度进行选择，使其具有所需的渗透性。优选的是在37℃2周后，从传感器泄漏的荧光试剂少于5摩尔％，少于1摩尔％，少于0.5摩尔％，甚至少于0.2摩尔％。优选的是用来制备半透性涂层的多分散聚合物的重均分子量约为4千道尔顿(kDa)至18kDa，约8kDa至12kDa，或者甚至约9kDa至10kDa。优选的多分散聚合物的多分散指数Mn/Mw(dI)大于1，从约大于1.0至约1.5，甚至约1.1至1.4。有用的聚合物的例子包括聚氨基酸(例如聚赖氨酸和聚鸟氨酸)，聚核苷酸及其组合。优选的聚合物包括例如长度为19-60个氨基酸，约38-60个氨基酸，或约43-48个氨基酸的聚氨基酸。合适的多分散聚氨基酸可购自SigmaChemical公司(St.Louis，Missouri)。所述半透性涂层可包含不同分子量的单分散聚合物的混合物。不希望受限于理论，本发明人预期用低分子量聚合物填充芯表面上较小的区域，以及较高分子量聚合物之间的间隔。所述半透性涂层可包括多个层，其中每个层由相同的聚合物组合物或不同的聚合物组合物制成。例如，半透性涂层可包括一层或多层多分散聚合物，单分散聚合物及其组合。有用的单分散聚合物包括单分散聚氨基酸，其包括例如具有33，47和60个残基的聚-L-赖氨酸单分散均聚物。在一些情况下，尽管在传感器上施加多个层，但是单独的层是无法单独辨别的。优选的是半透性涂层不含IgG和补体(例如补体Clq)。优选半透性涂层不会使分子量大于100kDa，大于60kDa，或大于30kDa的分子进入传感器。可对半透性涂层的组成进行选择以减小芯的体积。包含较低分子量的多分散聚氨基酸(例如聚赖氨酸或聚鸟氨酸(polyornithine))的涂层组合物可显著减小其将要施用的凝胶芯的体积。在许多情况下体积的减小至少约为50％，至少60％，甚至至少70％。优选聚氨基酸的分子量不大于约30,000Da，不大于约15kDa，不大于约10kDa，不大于约8kDa，不大于约7kDa，不大于约5kDa，不大于约4kDa，不大于约3kDa，甚至不大于约1.5kDa。分子量为3kDa，7kDa，9.6kDa甚至12kDa的多分散聚赖氨酸能够导致将要在其上施用涂层的芯的直径显著减小(在一些情况下约30％)。低分子量聚氨基酸还可形成具有良好渗透选择性的涂层，可形成“修剪过的”即锯齿状的(即比较卷曲的或粗糙的)表面。这种修剪的表面可能造成纤维化的应答。对此修剪的表面施用藻酸盐可在传感器的外部提供较平滑的表面，这会抑制纤维化和减少光散射效应。图2显示在20X的透射光环的照射下通过立体解剖显微镜(CarlZiessInc.，Thornwood，NewYork)观察的传感器10，在该传感器10锯齿状聚赖氨酸涂布的14藻酸盐芯12外包围有藻酸盐涂层16。传感器的外表面具有足够的生物相容性，以免引起宿主免疫系统的纤维化应答，所述纤维化应答将减少或阻止相关分析物以生理相关的速率分散入传感器内或从传感器中分散出来，同时传感器的外表面具有足够的非生物相容性，使宿主在传感器周围形成鞘，使传感器在宿主体内固定起来。合适的生物相容性涂层组合物包含上述芯的聚合物基质的可交联组合物(结合在其中)，包括例如水凝胶(例如藻酸盐和琼脂糖)。在美国专利第6,126,936号中描述有用的提供生物相容性涂层的方法。优选在传感器上涂敷一层足够厚的生物相容性涂层，以完全包封传感器。外部生物相容性涂层的厚度优选至少为1微米，约1-25微米，甚至约5-20微米。所述外部涂层优选足够光滑，以免宿主引发纤维化应答，这种应答会减少或阻止分析物分散入传感器内和从传感器内分散出来。在2002年3月11日提交的名为″MICROREACTORANDMETHODOFDETERMININGAMICROREACTORSUITABLEFORAPREDETERMINEDMAMMAL.″的美国专利申请第10/095,503号中有关于纤维化应答的讨论。传感器可具有合适的结构，用来检测各种分析物，所述分析物包括例如碳水化合物(例如葡萄糖，果糖及其衍生物)。在本文中，″碳水化合物″表示由碳、氢和氧组成的任何种类的有机化合物，包括糖、淀粉和纤维素。其他合适的分析物包括糖蛋白(例如血红蛋白，甲状腺球蛋白，糖基化的白蛋白，糖基化的白蛋白和糖基化的载脂蛋白)，糖肽和糖脂(例如鞘磷脂和神经节苷脂GM2)。其他合适的分析物包括离子。这些离子可以是无机的或有机的。例子包括钙、钠、氯、镁、钾、碳酸氢根、磷酸根、碳酸根、柠檬酸根、乙酸根、胆碱及其组合。所述传感器也可用来检测蛋白质和肽(后者是前者较低分子量的形式)；已知有许多生理状态能改变血液和其他体液中蛋白质的含量。还包括酶(例如与细胞死亡相关的酶，例如LDH，SGOT，SGTT，以及酸性和碱性磷酸酶)，与妊娠相关的激素，例如人绒膜促性腺激素)，脂蛋白(例如高密度、低密度和极低密度的脂蛋白)和抗体(例如自身免疫病(例如AIDS，重症肌无力和狼疮)的抗体)。抗原和半抗原也是合适的分析物。另外，传感器可检测类固醇(例如胆固醇、雌激素及其衍生物)之类的分析物。传感器可用来检测和监控茶碱和肌酸酐之类的物质。所述传感器也可用来检测和监控农药和药物。在本文中，″药物″表示一种当通过摄食、吸气、吸收或其他方法被人体吸收时能够引发生理应答的材料。其包括醇、治疗药物(例如环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、足叶乙苷、顺氯氨铂和卡波铂之类的化疗剂)，麻醉剂(例如可卡因和海洛因)以及精神药物(例如LSD)。传感器也可用来检测和监控多核苷酸(例如DNA和RNA)。传感器可用来例如测定总DNA水平，作为细胞溶解作用的测量。或者可用传感器测量特定序列(例如HIVRNA)的表达。传感器可在体内或原位使用。对于体内应用，传感器可置入皮肤内、皮肤上或皮下，或置于器官或血管(例如静脉或动脉)内。可通过激发传感器(例如直接或透皮激发植入的传感器)，然后检测传感器发射的荧光信号(例如直接或透皮检测植入的传感器发出的荧光)来检测分析物。下面将通过以下实施例描述本发明。实施例测试步骤以下是用于所述实施例地测试步骤。荧光渗漏测量法制造传感器，计算各传感器中荧光试剂的含量。将传感器置于pH值超过7.4的10mMHEPES/0.15M的盐水中，在37℃保温(incubate)过夜以除去传感器表面的残余物。从传感器移出上清液，使用QM-1PTI型QuantumMaster荧光分光计(PTIQuantumMaster，SouthBrunswick，NewJersey)测量上清液的荧光发射光谱。通过在试剂荧光团的激发最大值附近激发上清液，然后测量包括荧光团发射最大值的波长范围的发射以测量发射光谱。当荧光试剂包含多个不同的荧光团时，对各个不同的荧光团重复上述步骤。然后将传感器置入另外的过量体积的新鲜HEPES/盐水中，该传感器在37℃保温过夜，然后移去HEPES/食盐水。将足够数量的(N)传感器与足够体积的HEPES/盐水一起置于试管内，使得如果荧光染料发生100％的渗漏，所得上清液的浓度将为10-10摩尔荧光团/毫升上清液。准备大量相同的试管，为该研究提供足够数量的样品。每个时间点在来自三个不同的试管的一式三份的样品，即等分样品中进行测量。从三个试管中取出100微升HEPES/食盐水的样品等分试样，对这三个样品分别进行荧光测量。这些样品定义为0时间。余下的样品在37℃保温所需的时间。在每个时间点从三个试管中取出等分样品，如上所述对各等分试样进行荧光测量。如果检测到荧光，则使用能够滤出游离荧光染料的过滤器过滤样品，保留荧光试剂(10kDaMWcutoffCentricon过滤器(Amicon，WRGrace的分公司))，测量洗提液的荧光，以测定游离染料的含量。标记的蛋白质的渗漏百分数通过计算(上清液的荧光强度-洗提剂的荧光强度)/(与每单位体积HEPES/盐水毫升的传感器数量(N)等当量的染料混合物溶液的荧光强度)来测定。包括荧光试剂的微球小珠的制备一定体积的Cy3.5HSA(人血清白蛋白，分子量66,430克/摩尔)和Cy5.5-ConA(伴刀豆球蛋白A，分子量104,000克/摩尔)在pH＝7.4的10mMHEPES/0.15M盐水的溶液加入等体积的3％的无菌藻酸盐的HEPES/食盐水溶液。该溶液在振荡器上混合5分钟。然后对该混合物进行离心，用14号(gauge)的导管将其抽入注射器。从样品中除去空气气泡。移去该14号的导管，代之以24号的导管。然后缓慢地推压注射器的柱塞，使藻酸盐滴落入含有25毫升HEPES/食盐水和1.5％(重量/体积)的无水氯化钙的试管内。所述小珠浸没20分钟。然后用HEPES/食盐水和2mM氯化钙淋洗小珠四次，然后将小珠贮存在HEPES/食盐水中。比较例1由1％的具有33肽残基的单分散聚赖氨酸溶于HEPES/盐水缓冲储液制备0.2％的单分散聚赖氨酸(BoehringerMannheim)涂料溶液(溶于HEPES/食盐水)，然后加热至37℃。所述第一涂料溶液的体积是涂敷的微球小珠体积的15倍。第二涂料溶液的体积是涂敷的微球小珠体积的10倍。两种溶液均无菌过滤并保持在37℃。微球传感器小珠包括第一荧光试剂组分，Cy3.5HSA(人血清白蛋白，分子量66,430克/摩尔)和第二荧光组分Cy5.5-ConA(伴刀豆球蛋白A，分子量104,000克/摩尔)，在振荡器上用一定体积的聚赖氨酸涂料溶液涂敷该小珠5分钟，所述涂料溶液的体积是所述微球小珠体积的15倍。移出小珠，用HEPES/食盐水淋洗三次。然后该小珠在室温下的HEPES/食盐水中蔽光保温60分钟。60分钟后从小珠移去HEPES/食盐水。向所述微球小珠加入第二体积的聚赖氨酸涂料溶液。该第二体积的聚赖氨酸涂料溶液是所述微球小珠体积的10倍，小珠在振荡器上在聚赖氨酸涂料溶液中37℃保温5分钟。然后取出小珠，用HEPES/食盐水淋洗三次。比较例2依照比较例1所述制备用聚赖氨酸涂敷的微球小珠，其不同之处在于比较例2的聚赖氨酸具有47肽残基。比较例3依照比较例1所述制备用聚赖氨酸涂敷的微球小珠，其不同之处在于比较例2的聚赖氨酸具有60肽残基。实施例1用pH值为7.4，而且包含2mM氯化钙的1％的多分散聚赖氨酸HEPES/食盐水储液制备0.2％的多分散聚赖氨酸(SigmaChemical公司)涂料溶液。将此0.2％的多分散聚赖氨酸组合物加热至37℃。所述多分散聚赖氨酸的重均分子量为11,200Da，数均分子量为9800Da，多分散指数为1.14。将包括Cy3.5HSA(人血清白蛋白，分子量66,430克/摩尔)和Cy5.5ConA(伴刀豆球蛋白A，分子量104,000克/摩尔)的藻酸盐微球小珠置于一定体积的聚赖氨酸涂料溶液中，所述涂料溶液的体积比小珠的体积大15倍，该小珠在振荡器上，在聚赖氨酸涂料溶液中37℃保温15分钟。然后将小珠从聚赖氨酸溶液移出，用HEPES/食盐水和2mM的氯化钙淋洗三次。该小珠在室温下在HEPES/食盐水中蔽光保温60分钟。60分钟后从小珠移去HEPES/食盐水，向该小珠加入第二体积的聚赖氨酸涂料溶液，该溶液的体积是小珠体积的10倍，该小珠在振荡器上在聚赖氨酸溶液中在37℃保温15分钟。然后移出涂敷过的小珠，用HEPES/食盐水淋洗三次。然后涂敷的小珠在无菌试管内在4℃的HEPES/食盐水中贮存过夜。然后用1.5％的UP藻酸盐溶液进一步涂敷该涂敷过的小珠，然后置于pH＝7.2、包含1.5％氯化钙的HEPES溶液中10分钟。对实施例1和比较例的各组聚赖氨酸涂敷的小珠进行渗漏百分数测试。这些小珠在37所述的贮存3天，每天用HEPES/食盐水淋洗。在3天的淋洗期后，在50天内根据上述荧光渗漏测量法周期性地测量小珠的荧光组分Cy5.5和Cy3.5的渗漏。具体来说，计算实施例1和比较例的小珠中荧光试剂的含量。将一定量(180)的小珠置于30毫升HEPES/食盐水中，在37℃保温过夜以除去小珠表面上的残余物。从小珠移出上清液，测量上清液的荧光发射。然后将小珠置于20毫升新鲜HEPES/食盐水中，在37℃保温过夜，然后移去HEPES/食盐水。通过在570纳米激发上清液，测量575-625纳米的发射，从而得到发射光谱。通过在660纳米激发上清液，然后在670-725纳米测量发射，获得第二光谱。将10种小珠各自置于18个装有2毫升HEPES/食盐水的试管中。从三个试管中取出100微升的HEPES/食盐水溶液等分样品，对各三个样品进行荧光测量。这些样品定义为0时间。余下的样品继续保温在37上述的。在所需的时间点从三个试管取出等分样品，进行荧光测量。入过检测到荧光，使用10kDaMWcutoffCentricon过滤器(Amicon，adivisionofW.R.Grace)过滤样品，改样品能够滤去游离的荧光染料，留下荧光试剂。测量洗提剂的荧光以测定游离染料的量。结果在图3中作图，图中的方块表示Cy3.5的渗漏百分数，圆点表示Cy5.5渗漏百分数。图4是根据比较例1-3和实施例1制备的小珠在第14天的Cy3.5渗漏的柱状图。权利要求1.一种用来检测分析物的传感器，所述传感器包括含有水凝胶的芯；位于该芯内的荧光试剂；包围着该芯的半透性涂层，该半透性涂层包含重均分子量约为4kDa至18kDa、多分散指数大于1的多分散聚合物；包围着所述半透性涂层的生物相容性涂层。2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述生物相容性涂层的厚度约为1-25微米。3.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述荧光试剂可在芯内移动。4.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述多分散聚合物包含聚赖氨酸。5.如权利要求1所述的传感器，该传感器的直径大于1毫米。6.如权利要求1所述的传感器，该传感器的直径至少为1.25毫米。7.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述分析物包含葡萄糖。8.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述传感器能够基于非辐射荧光共振能量传输检测分析物。9.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述荧光试剂选自羰花青染料，磺化氨基香豆素染料，磺化若丹明染料及其组合。10.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述荧光试剂包含葡萄糖结合蛋白和糖基化的底物。11.如权利要求10所述的传感器，其特征在于，所述葡萄糖结合蛋白包括伴刀豆球蛋白A，所述底物包括人血清白蛋白。12.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述荧光试剂包含具有在约581纳米的激发最大值和在约596纳米的发射最大值的第一羰花青染料、伴刀豆球蛋白A、具有在约675纳米的激发最大值和在约694纳米的发射最大值的第二羰花青染料、和人血清白蛋白。13.如权利要求11所述的传感器，其特征在于，所述葡萄糖结合蛋白包括重组伴刀豆球蛋白A。14.如权利要求12所述的传感器，其特征在于，所述第一羰花青染料与伴刀豆球蛋白A的摩尔比约为0.1-0.4。15.如权利要求12所述的传感器，其特征在于，所述第二羰花青染料与人血清白蛋白的摩尔比约为0.5-0.9。16.如权利要求12所述的传感器，其特征在于，所述人血清白蛋白是糖基化的。17.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述荧光试剂包含具有在约578纳米的激发最大值和在约603纳米的发射最大值的第一染料、伴刀豆球蛋白A、具有在约650纳米的激发最大值和在约665纳米的发射最大值的第二染料、和人血清白蛋白。18.一种制造传感器的方法，该传感器包括包含荧光试剂的芯，所述方法包括使第一水性藻酸盐组合物的液滴与包含第II族阳离子的离子溶液接触，形成交联凝胶芯，所述第一水性藻酸盐组合物包含水、藻酸盐和任选的荧光试剂，所述方法还包括以下步骤中的至少一个使所述的芯与荧光试剂接触，使所述芯与一种组合物接触，该组合物包含多分散指数大于1的多分散聚合物。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多分散聚合物在所述芯上形成涂层，所述方法还包括在所述多分散聚合物涂层上涂敷生物相容性组合物。20.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，当所述传感器在37℃下在pH＝7.4的10mMHEPES/0.15M食盐水中贮存两周后，其荧光试剂的渗漏小于1摩尔％。21.一种用来检测分析物的传感器，所述传感器包括包含聚合物基质的芯；位于该芯内的荧光试剂；包围着该芯的半透性涂层，该半透性涂层包含多分散聚合物；包围着所述半透性涂层的生物相容性涂层，当所述传感器在37℃下在pH＝7.4的10mMHEPES/0.15M食盐水中贮存两周后，其荧光试剂的渗漏小于1摩尔％。全文摘要揭示了一种用来检测分析物的传感器，该传感器包括含有水凝胶的芯，位于该芯内的荧光试剂，包围着芯的半透性涂层，以及包围着半透性涂层的生物相容性涂层，所述半透性涂层包含分子量约为4kDa－18kDa，多分散指数大于1的多分散聚合物。文档编号A61K49/00GK1874719SQ200480031828公开日2006年12月6日申请日期2004年10月28日优先权日2003年10月31日发明者D·E·沃尔夫申请人:传感技术有限公司