专利名称：用于癌症治疗的植物提取物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及利用植物提取物来改善疾病状态的领域。更特别地，本发明提供了用于预防和治疗疾病状态包括癌症的方法和植物提取物的组合物。
背景技术：
任一个体都处于患癌症的危险中。癌症的发生在生命中随衰老而增加(“终生危险”)。例如，在美国，男人具有二分之一的患癌症的终生危险，女人具有三分之一的危险。认为其它危险因素包括遗传、饮食和环境接触(例如，接触诱变性化学品、辐射、转化病毒等等)。世界卫生组织估计目前世界上每年大约有1000万新的癌症病例发生。到2015年该数字将预计达到1500万，这些新病例的三分之二发生于发展中国家(World Health4822，1995)。例如，据估计每年全世界有大约600000个新的肺癌病例；每年接近100万的乳腺癌新病例；对于头颈癌(全世界第六大最频繁发生的癌症)，每年有500,000个新病例发生。美国国立癌症研究所(the NationalInstitute of the United States)估计用于癌症的全部年度费用为1070亿美元。治疗费用占大约400亿美元。
在癌症的治疗中使用了几种化学治疗剂，包括烷化剂、抗代谢物拮抗剂、抗癌抗生素和植物来源的抗癌治疗剂。“烷化剂”的实例包括氮芥、盐酸氧氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、三胺硫磷、卡波醌、二丙胺磺酯、白消安、盐酸尼莫司丁、二溴甘露醇、美法仑、氮烯唑胺、雷诺氮芥、雌氮芥磷酸钠、三亚胺嗪、亚硝脲氮芥、洛莫司汀、链脲霉素、哌泊溴烷、依托格鲁、卡波铂、顺铂、米铂(miboplatin)、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、安巴司丁、dibrospidium盐酸盐、福替目丁、松龙苯芥、嘌米舌泊、ribomustin、替莫唑胺、treosulphan、氯乙环磷酰胺、净司他丁替马拉美、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)和比折来新(bizelesin)。“抗代谢物”的实例包括巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核糖苷、硫代肌苷、氨甲喋呤、依诺他宾、阿糖胞苷、阿糖胞苷酯、盐酸环胞苷、5-FU药物(例如，氟尿嘧啶、喃氟啶、UFT、脱氧氟尿苷、卡莫氟、gallocitabine、emmitefur)、氨基喋呤、甲酰四氢叶酸钙、硫鸟嘌呤、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟(emitefur)、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、丙米腙、thiazophrine和安巴司丁等等。“抗癌抗生素”的实例包括放线菌素-D、放线菌素-C、丝裂霉素-C、色霉素-A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培来霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿克拉霉素、盐酸吡喃阿霉素、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌霉素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、和盐酸去甲柔毛霉素等等。“植物来源的抗癌剂”的实例包括磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛和长春烯碱等等。
当开发了新的治疗剂并测试其针对肿瘤的功效时，许多目前可用的癌症治疗是相对无效的。据报道，化学疗法仅在4％所治疗的患者中产生持久反应，且基本上延长了仅仅3％晚期癌症患者的生命(Smith等人，1993，J.Natl.Cancer Inst.851460-1474)。许多目前的抗癌药物是费用高昂的，并且呈现出严重的毒性。关于后者并依赖于所用的药物或药物组合，全身化学疗法可导致一种或多种毒性，包括血液的、脉管的、神经的、胃肠的、肾脏的、肺的、耳的和致死的毒性。例如，已将三苯氧胺用于妇女以限制乳腺癌复发长达25年。1992年开始的试验显示，三苯氧胺不仅作为治疗剂是有效的，而且在癌症预防中具有非常重要的益处(乳腺癌预防剂)。然而，在该项研究中，三苯氧胺的使用在健康妇女中显示出不利作用，即患子宫癌或产生肺部血块的危险增加(Science News，1998，153228)。
植物是用于发现和开发用于治疗癌症的新的、自然来源的活性剂的宝贵资源。目前癌症治疗中所用的药物经设计用来干扰微管缩短(解聚)或延长(聚合)(Compton，D.A.等人，(1999)Science 286913-914)。中心体-细胞的主要微管组织中心(MOTC)由称为中心粒旁物质(PCM)包围的两个中心粒组成，所述中心粒旁物质由复杂的细丝网络和两套附器组成(Paintrand，M.(1992)J Struct Biol 108107-128)。中心体的主要功能是微管的成核现象和两极纺锤体的形成(Tanaka，T.等人，(1999)Cancer Res 58(17)3974-85)。中心体及其相关联的微管指导有丝分裂过程中的事件并控制动物细胞结构的组织和分裂间期的运动。恶性肿瘤通常显示出异常的中心体外形，特征为中心体大小和数量的增加、不规则的分配、异常的结构、异常的蛋白质磷酸化、以及与正常组织的中心体相比增强的微管成核能力(Lingle，W.L.等人，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(6)2950-5；Sato.N.，等人，(1999)Clin Cancer Res 5(5)963-70；Pihan，G.A.等人，(1998)Cancer Res 58(17)3974-85；Carroll，P.E.，等人，(1999)Oncogene 18(11)1935-44；Xu，X.，等人，(1999)Mol Cell 3(3)389-95；Brinkley，B.R.，等人，(1998)Cell Motil Cytoskeleton 41(4)281-8；Doxsey，S.(1998)Nat Genet20(2)104-6；Kuo，K.K.，等人，(2000)Hepatology 31(1)59-64)。在这些异常中，发现中心体超扩增在多种肿瘤类型中是更加频繁的(Carroll，P.E.等人，(1999)Oncogene 18；18(11)1935-44；Hinchcliffe，E.H.等人，(1999)Science 283(5403)851-4；Xu，X.等人，(1999)Mol Cell 3(3)389-95；Weber，R.G.等人，(1998)Cytogenet Cell Genet 83266-269)。
目前用于癌症治疗的多种药物，例如紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、长春烯碱，经设计用来干扰微管聚合(综述见JordanMA和Wilson L.，Microtubules as a target for anticancer drugs.NatureReviews Cancer 4253-265(2004))。它们共用结合到微管蛋白的作用机制，微管蛋白是组成微管的分子。(Compton，D.A.等人，(1999)Science 286913-914；Wilson，L.等人Cell Struct.&Function 24329-335(1999))。至少六种植物来源的抗癌剂已获得FDA批准(例如，紫杉醇、长春花碱、长春新碱、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷)。其它治疗剂正在进行临床试验评估(例如，喜树碱、9AC、和依立替康)。
紫杉醇，最初分离自太平洋紫杉短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮的二萜类化合物，是强有力的抗有丝分裂剂，其通过促进微管蛋白组装成稳定聚集的结构来起作用。(见综述Kingston，D.G.I.Trends Biotechnol.1994，12，222；Schiff，P.B.；Fant，J.；Horwitz，S.B.Nature，1979，277，665)。紫杉醇显示出作为抗癌化合物的巨大潜能。实际上，目前将其用于治疗顽固性卵巢癌，并且临床试验鼓励用于治疗乳腺、肺、头和颈癌。(Rowinsky，E.K.；Cazenave，L.A.；Donehower，R.C.J.Nat.Cancer Inst.1990，82，1247；McGuire，W.P.；Rowinsky，E.K.；Rosenshein，N.B.；Grumbine，F.C.；Ettinger，D.S.；Armstrong，D.K.；Donehower，R.C.Ann.Int.Med.1989，11，273；Forastiere，A.A.，Semin.Oncol.Suppl.3.1993，20，56)。
长春花生物碱，包括自然产物长春新碱和长春花碱以及半合成衍生物长春地辛和长春烯碱，是广泛用于癌症治疗的抗有丝分裂药物(DonehowerRC和Rowinsky EK，Anticancer drugs derived from plants，in CancerPrinciples and Practice of Oncology.De Vita VT，Hellman S和RosenbergSA eds.pp 409-417，JB Lippincott，Philadelphia.(1993))。第二代长春花生物碱，长春烯碱和长春氟宁(vinflunine)影响微管动力学，不同于第一代长春花生物碱长春花碱，其在体外强烈抑制微管缩短的速率和程度，而长春烯碱和长春氟宁抑制微管生长事件的速率和程度(Ngan V.K.等人，MolPharmacol.60(1)225-232(2001))。
研究了化学预防剂减少吸烟者和不吸烟者肺中癌前期细胞数量的能力，所述化学预防剂包括ACAPHA，其是在中国已经几个世纪以来用于疾病预防的六种植物性药材的组合(越南槐(Sophora tonkinensis)、圆穗蓼(Polygonum bistorta)、夏枯草(Prunella vulgaris)、Sonchus brachyotus、白鲜(Dictamnus dasycarpus)和黄独(Dioscorea bulbifera)。在US NationalCancer Institute许可下，British Columbia Cancer Agency(加拿大)正在领导国际联盟开展ACAPHA的二期临床试验。
癌症涉及细胞中几个重要的信号通路例如生长控制通路(20％的已知类型的癌症，包括一些乳腺和脑癌)。相同的通路在自身免疫反应信号通路中也起关键作用，因此该通路的抑制剂具有作为免疫抑制和抗炎药物的潜在用途。将药物化合物与某些天然存在的蛋白质相组合已显示为产生改良的药物，特别是免疫抑制、抗炎和抗癌药物的备选方法。(Briesewitz R，RayGT，Wandless TJ，Crabtree GR.，Affinity modulation of small-moleculeligands by borrowing endogenous protein surfaces.Proc Natl Acad Sci USA.(1999)Mar 2；96(5)1953-1958)。
需要相对划算和有效的用于预防肿瘤和抑制肿瘤生长的方法，其另外减轻了通常与全身化学疗法相关的毒性。包含绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)提取物、大叶茶(Camellia sinensis)(绿茶)和山里红(Crataegus pinnatifida)(山楂浆果)的抗癌组合物及其制造方法是美国专利号5,910,308和6,168,795(DJang)的主题。
发明概述本发明提供了包含植物提取物的新型组合物、提取物和化合物及它们的生产和制备方法。还提供了此类化合物在预防和治疗疾病状态(包括癌症)中的用途，和制备和配制所述组合物的方法以及利用本发明的组合物进行治疗的方法。
所述组合物包含灵芝(Ganoderma lucidum)提取物、丹参(Salviamiltiorrhiza)提取物和半枝莲(Scutellaria barbata)提取物的两种或更多种的治疗有效量；和任选地沙棘(Hippophae rhamnoides)提取物的治疗有效量。尽管有关于这些单独的植物有益健康的效果的报道，但是在本发明中公开的它们在组合治疗中应用的协同效应是新颖的。一些实施方案还包含治疗有效量的至少一种化学治疗剂。
本发明涉及用于癌症治疗的组合物及其制备、配制和在疾病状态的预防和治疗中施用的方法。
本发明的组合物包含显示出抑制细胞效应的天然化合物，用于抑制原始癌细胞的进一步生长，所述化合物呈现出下列一种或多种特性(i)增强免疫系统，(ii)减小对细胞和组织的氧化性损伤，(iii)减轻炎症，(iv)阻止细胞周期特定阶段中细胞的增殖，(v)抗氧化剂活性，和(vi)针对进一步暴露至致癌剂和诱变剂的抗诱变效应。
本发明的组合物包含在与化学治疗剂、放射治疗和手术联合施用的细胞毒性组合物中有用的天然化合物。在一些实施方案中，在放射疗法、化学疗法或外科手术前，对受试者施用本发明的组合物。在其它实施方案中，将组合物与其它抗癌疗法同时施用。这些组合物除了呈现出前面所述的特性(i)增强免疫系统，(ii)降低对细胞和组织的氧化性损伤，(iii)减轻炎症，(iv)阻止细胞周期的特定阶段中细胞的增殖，(v)抗氧化剂活性，和(vi)针对进一步暴露至致癌剂和诱变剂的抗诱变效应之外还呈现出一种或多种特性(a)与化学疗法的协同作用(增强对化学治疗剂的敏感性)，(b)与放射疗法和外科手术的协同作用(通过抑制被放射或外科手术遗漏的先前存在的癌细胞的生长来增强有效性)。抗诱变特性(以及由协同引起的增强的敏感性)降低了治疗所必需的化学治疗剂的水平，从而导致对患者毒性的减轻。本发明的组合物可用于与化学治疗剂包括烷化剂、抗代谢物拮抗剂、抗癌抗生素和植物来源的抗癌剂联合。
“烷化剂”的实例包括氮芥、盐酸氧氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、三胺硫磷、卡波醌、二丙胺磺酯、白消安、盐酸尼莫司丁、二溴甘露醇、美法仑、氮烯唑胺、雷诺氮芥、雌氮芥磷酸钠、三亚胺嗪、亚硝脲氮芥、洛莫司汀、链脲霉素、哌泊溴烷、依托格鲁、卡波铂、顺铂、米铂(miboplatin)、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、安巴司丁、dibrospidium盐酸盐、福替目丁、松龙苯芥、嘌米舌泊、ribomustin、替莫唑胺、treosulphan、氯乙环磷酰胺、净司他丁替马拉美、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)和比折来新(bizelesin)。
“抗代谢物”的实例包括巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核糖苷、硫代肌苷、氨甲喋呤、依诺他宾、阿糖胞苷、阿糖胞苷酯、盐酸环胞苷、5-FU药物(例如，氟尿嘧啶、喃氟啶、UFT、脱氧氟尿苷、卡莫氟、gallocitabine、emmitefur)、氨基喋呤、甲酰四氢叶酸钙、硫鸟嘌呤、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟(emitefur)、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、丙米腙、thiazophrine和安巴司丁等等。
“抗癌抗生素”的实例包括放线菌素-D、放线菌素-C、丝裂霉素-C、色霉素-A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培来霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿克拉霉素、盐酸吡喃阿霉素、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌霉素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、和盐酸去甲柔毛霉素等等。
“植物来源的抗癌剂”的实例包括磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛和长春烯碱等等。
本发明的细胞毒性组合物也可与免疫治疗剂联合使用，所述免疫治疗剂包括溶血链球菌Su、云芝多糖K、西索菲兰、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴细胞毒素、卡介苗、短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、左旋咪唑、多糖K和苯咪唑丙酸。
虽然已知本发明的化合物在单独施用时显示出健康益处，但本发明涉及天然化合物的新组合，当作为特定组合施用时所述组合物显示出组合物的特性。通常，当以组合来施用时，本发明的特定组分显示出它们功效的协同增强。
本发明和本发明的其它目的、特征和优点将在下面的发明详述和附图及实施方案中变得更加显而易见。
附图简述
图1显示了植物提取物的提取平台。
图2显示了包含灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)及化学治疗药物的组合物(AneustatTM)抑制细胞增殖的组合指数(CI)值。
图3A-3C提供了对于不同植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)抑制细胞增殖的功效的概述。
图4显示了单独植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯(上图)和二氯甲烷(下图)提取物及其组合抑制COX-2酶活性的组合指数(CI)值。
图5显示单独植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯提取物及其组合抑制COX-1和COX-2酶活性的组合指数(CI)值。
图6显示了单独植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯提取物(#0401)及其组合对COX-2的抑制相对于对COX-1的抑制功效的比率。
图7显示了单独植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯提取物(#0401)及其组合抑制COX-2和COX-1的功效。
图8显示了以灵芝(#8)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的不同浓度的提取物处理的单核细胞(巨噬细胞前体)以及通过ELISA免疫测定测量的TNF-α的释放。
图9显示了由灵芝(#8)、半枝莲(#15)和丹参(#14)诱导的淋巴细胞增殖。
图10显示了以20μg每平板对灵芝(#8)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的提取物所进行的埃姆斯试验。
图11显示了Aneustat对SCID小鼠体重的影响。
图12显示了用Aneustat处理的A549细胞系的存活曲线。
图13显示了Aneustat处理对SCLC异种移植物生长的影响。
图14显示了Aneustat处理对SCLC异种移植物组织病理学的影响。
图15显示了Aneustat处理对SCLC细胞增殖的影响。
图16显示了Aneustat处理对体内DU145前列腺癌细胞系异种移植物的影响。
图17显示了Aneustat处理对NSCLC异种移植物生长的影响。
图18显示了Aneustat和顺铂+多西他赛处理对AB117 NSCLC异种移植物组织病理学的影响。
图19A和19B显示了柱状图，其说明了Aneustat和顺铂+多西他赛处理对NSCLC细胞在细胞周期中分布的影响。
发明详述本发明提供了用于预防和治疗个体中癌症的新方法和用作抗癌剂的新的组合物。本发明涉及新发现，即施用于个体时，基于植物提取物的组合物可有效地抑制肿瘤生长并且基本上是无毒的。组合物包含灵芝、半枝莲、丹参及任选地沙棘。
在一个实施方案中，此方法包含对患有肿瘤的个体(哺乳动物；在优选的实施方案中，人)施用治疗有效量的组合物。在另一实施方案中，该方法包含对个体施用预防有效量的组合物以防止肿瘤发展(例如，在处于患肿瘤的高危险中的个体中；或在缓解中但具有复发危险的个体中)。
因而，本发明的主要目的是提供通过施用治疗上有效并无毒性量的组合物来治疗具有肿瘤的个体的方法，当施用于具有肿瘤的个体时，所述组合物具有抑制肿瘤生长的特性。
本发明的另一目的是提供通过施用预防有效量的组合物来预防具有肿瘤发展危险的个体中的肿瘤发生，所述组合物当对该个体施用时具有预防或抑制肿瘤生长发生的特性。
本发明的另一目的是提供用治疗有效量的组合物治疗具有肿瘤的个体或具有发生肿瘤的危险的个体的方法，当施用于所述个体时所述组合物具有抑制肿瘤生长和基本无毒的两种特性。“基本无毒”意味着组合物没有通常与全身化学疗法相关的毒性；即，没有可检测的毒性，包括血液的、脉管的、神经的、胃肠的、肾脏的、肺的、耳的，和免疫抑制毒性(其可导致致命感染)。
本发明进一步的目的是提供治疗肿瘤负担实质上减少但仍具有复发危险的个体的方法，其中该方法包括对所述个体施用预防有效量的组合物，其具有当施用于个体时抑制肿瘤生长和基本无毒的两种特性。
定义此处所用的“肿瘤”，对于说明书和权利要求书来说，是指导管上皮细胞来源的实体性非淋巴原发肿瘤，包括但不限于，起源于乳腺、前列腺、结肠、肺、胰、肝、胃、膀胱、生殖道(子宫颈、卵巢、子宫内膜等等)、脑以及骨髓；黑素瘤或淋巴瘤。
此处所用的“抑制肿瘤生长”，对于说明书和权利要求书来说，是指减慢肿瘤生长、停止肿瘤生长、引起肿瘤减小或退化、抑制肿瘤侵入、引起肿瘤细胞死亡、和引起转移瘤减少或退化中的一种或多种。
此处所用的“预防肿瘤发展”，对于说明书和权利要求书来说，是指抑制肿瘤的生长和更特定地，在预防肿瘤块形成中引起肿瘤细胞死亡。
此处所用的术语“植物”指的是对所述目的有用的种子、叶、茎、花、根、浆果、茎皮或任何其它的植物部分。对于某些用途，优选的是利用植物的地下部分，例如根和根状茎。叶、茎、种子、花、浆果、茎皮或其它植物部分也具有药用效果，并可用于制造茶叶和其它饮料、奶油及食品制备中。
通过组合指数(CI)可测定“协同性”。Chou和Talalay对组合指数方法进行了描述。(Chou，T.-C.The median-effect principle and the combinationindex for quantitation of synergism and antagonism，p.61-102.In T.-C.Chou和D.C.Rideout(ed.)，Synergism and antagonism in chemotherapy.Academic Press，San Diego，Calif.(1991)；Chou，T.-C.，和P.Talalay.Quantitative analysis of dose-effect relationshipsthe combined effects ofmultiple drugs on enzyme inhibitors.Adv.Enzyme Regul.2227-55(1984))。将0.90或更低的CI值认为是协同的，0.85的值是中等协同的，且低于0.70的值为显著协同的。将0.90至1.10的CI值视为几乎是累加的，而更高值则为拮抗的。
表1.协同作用/拮抗作用作为CI值的函数
值得注意的是协同的确定可受到生物变异性、剂量、实验条件(温度、pH、氧张力等等)、处理时间表和组合比率的影响。将协同作用测定为组合指数(CI)值，此处将0.7或更低的值认为是显著水平的协同。
植物(i)灵芝(Reishi)灵芝因其在老年人中增强记忆和预防健忘的效果而备受称赞，所述效果早在公元456-536年的神农本草经第一卷中就有所报道。利用口服或局部施用的灵芝对小鼠进行的研究表明灵芝具有抗炎活性。Stavinoha，W.，Satsangi，N.，&Weintraub，S.(1995).Study of theantiinflammatory efficacy of灵芝.In B.-K.Kim，&Y.S.Kim(Eds.)，Recent Advances in灵芝research(pp.3-7).Seoul KoreaThePharmaceutical Society of Korea。
已建议的灵芝的应用有(1)具有发展癌症的高危险性的个体中癌症的化学预防(2)在预防癌症的转移或复发中的辅助用途(3)减轻癌症相关的恶病质和痛苦，以及(4)对同时进行的化学疗法的附属使用，以减轻副作用、维持白细胞数量并允许更佳剂量的化学或放射疗法。Chang，R(1994)Effective Dose of Ganoderma in Humans；Proceedings of ContributedSymposium 59A，B 5th International Mycological Congress，Vancouverpp.117-121.由于人类剂量的研究是传统和经验性的，所以利用此数据和药物代谢动力学原理计算出了灵芝用于治疗的适当剂量范围。该计算提示(1)对于健康维持，每天0.5至1g的灵芝干燥子实体剂量(2)如果有慢性疲劳、紧张、自身免疫或其它慢性健康问题，每天2至5g，(3)对于严重疾病每天5至10g。Chang，R(1993)Limitations and Potential applications ofGanoderma and related fungal polyglycans in clinical ontology；FirstInternational Conference on Mushroom Biology and Mushroom products96。
(ii)半枝莲(黄芩属)半枝莲是用于肝、肺和肾脏肿瘤的中药，已显示出抑制诱变、黄曲霉毒素B1(AFB1)和细胞色素P450连接的氨基比林N-脱甲基酶的DNA结合和代谢。(Wong B.Y.，等人Eur J Cancer Prey 1993Jul；2(4)351-6；Wong B.Y.，等人，Mutat Res.1992Jun 1；279(3)209-16).半枝莲还能够在体外增强巨噬细胞功能以及在体内抑制肿瘤生长。(Wong B.Y.等人，Cancer Biother Radiopharm 1996Feb；11(1)51-6)。
此种植物含有维生素C和E以及钙、钾、镁、铁、锌黄芩素、挥发油、丹宁和苦味素。黄芩素作用于中枢神经系统。来自半枝莲的活性成分黄芩素已经通过液相层析而得以纯化。(Wenzhu Zhang；Duolong Di；Bo Wen；Xia Liu；Shengxiang Jiang，Determination of Scutellarin in Scutellariabarbata Extract by Liquid Chromatography-Electrochemical Detection，Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies 26(13)2133-2140(2003)。
(iii)丹参有超过900种的鼠尾草并且它们中的许多具有药用的历史。中医中使用丹参来促进血液循环和消除瘀血。Bensky D，Gamble A Chinesebotanical Medicine Materia Medica 1987 Eastland PressSeattle.384。它增加血小板中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，因而提供针对肺栓塞的保护和对血小板聚集的抑制。Wang X，等人″Effect of danshen injection onpulmonary thromboembolism and platelet free radical levels in mice″.中国中医药杂志1996；21558-60。已有显示丹参在高胆固醇血动物中降低胆固醇、减少内皮破坏并抑制脂类过氧化反应。LDL氧化的抑制可减轻动脉粥样硬化。Wu YJ，等人″Increase of vitamin E content in LDL andreduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits by a water-solubleantioxidant-rich fraction of Salvia miltiorrhiza.″Arterioscler ThrombVasc Biol 1998；18481-6。已发现一种丹参成分通过减少Ca2+动员而抑制去甲肾上腺素诱导的主动脉带的收缩。此种血管舒张活性可以解释丹参在高血压中的传统应用。Nagai M，等人″Vasodilator effects of des(alpha-carboxy-3，4-dihydroxyphenethyl)lithospermic acid(8-epiblechnicacid)，a derivative of lithospermic acids in salviae miltiorrhizae radix″BiolPharm Bull 1996；19228-32。已有显示丹参具有明显优于硝化甘油的效果，对心脏功能具有更持久的作用和更好的改善。Bai YR，.Wang SZ.″Hemodynamic study on nitroglycerin compared with Salvia miltiorrhiza″中国中西医结合杂志1994；1424-5，4。
丹参也是丹参化合物中的首要成分。丹参化合物包含四种重要的植物用于促进外周循环和一般健康。中国植物丹参、印度植物Coleus forskohlii和缬草(Valeriana officinalis)增强了Crataegus laevigata的作用。中国植物医学将丹参用于妇女的紊乱、腹部疼痛、失眠、荨麻疹、肝炎和乳腺炎。
(iv)沙棘沙棘种子油含有高含量的两种必需脂肪酸——亚油酸和α-亚麻酸，其为其它多不饱和脂肪酸例如花生四烯酸和二十碳五烯酸的前体。来自沙棘浆果的果肉/果皮的油富含棕榈油酸和油酸(Chen等人″Chemical composition and characteristics of seabuckthorn fruit and itsoil.″Chem.Ind.Forest Prod.(中国)10(3)，163-175)。在血浆脂类中α-亚麻酸水平的升高表明对AD症状的明显改善的效果(Yang等人J NutrBiochem.2000 Jun 1；11(6)338-340)。已将α-亚麻酸的这些效果归因于类花生酸组成的变化和独立于类花生酸合成的其它机制(Kelley 1992，α-linolenic acid and immune response.Nutrition，8(3)，215-2)。
利用淋巴细胞作为模型系统已证实沙棘(Hippophae rhamnoides)的抗氧化剂和免疫调节性质(Geetha等人，J Ethnopharmacol 2002Mar；79(3)373-8)。还阐明了沙棘的己烷提取物的抗溃疡效果(Suleyman H等人，Phytother Res 2001Nov；15(7)625-7)。沙棘的植物制剂在小鼠中对全身致命辐射的辐射保护提示了自由基清除，干细胞增殖加速和免疫刺激剂特性。(Goel HC等人，Phytomedicine 2002Jan；9(1)15-25)。
(v)大叶荼(绿荼)将来自大叶荼植物的干叶子加工成三种类型的茶乌龙茶、红茶和绿茶。绿茶提取物是主要用于对抗自由基的富含生物类黄酮的有效提取物。它具有高含量的多酚——一种类型的生物类黄酮。在绿茶的制作中，通过湿热或干热来稳定茶叶，该过程破坏多酚氧化酶从而防止了多酚的氧化。这些多酚是绿茶中主要的生物活性成分。在优选的实施方案中，绿茶是龙井茶。
绿茶中的多酚是儿荼素，其具有多个连接的环状结构。多酚是具有几个酚基团的生物类黄酮的形式。它们控制着味道和生物学作用。儿茶素是具有抗氧化特性(保护细胞免受自由基破坏)的一组多酚化学物质，包括酸表儿茶素-3酯(EGCG)、表儿茶素和酸表儿茶素-3-酯。最近，已显示EGCG为尿激酶(Jankun等人，1997，Nature 387561)和醌醇氧化酶(可能是肿瘤细胞生长关键性的酶)的抑制剂。酸表儿茶素-3酯(EGCG)还保护其免受消化和呼吸感染。
灵芝、半枝莲、丹参和沙棘以及大叶茶(绿茶)已经单独用于健康促进和治疗目的。对于包含灵芝、半枝莲和丹参以及任选地沙棘和大叶茶(绿茶)的提取物的组合物所观察到的新的肿瘤抑制、免疫加强、炎症减轻和抗氧化的特性，以及通过在根据本发明的方法中所用的两种或更多这些提取物的新组合所阐明的协同效应可能是提取物中存在的一种或多种皂苷、类黄酮和多酚组合的结果。
组合物以限定性质的比活性为基础对组合物进行标准化，其允许基于标准化的基于IC50的组合进行非常有效的质量控制。如此申请中别处所述，特定提取步骤进一步促进了组合物的标准化。
组合物包含利用热水和有机溶剂提取的植物制剂，其允许方便的(例如口服)药物递送。
本发明的组合物可以为任意有效的形式，包括，但不限于干粉、研磨物物(grounds)、乳剂、提取物和其它常规的组合物。为提取或浓缩组合物的有效成分，通常用适当的溶剂例如水、乙醇、甲醇或其它溶剂或混合溶剂接触植物部分。溶剂的选择可常规地完成，例如，基于将通过溶剂提取或浓缩的活性成分的特性。组合物crenulata优选的活性成分包括，但不限于毛柳苷、对羟苯基乙醇、β-谷甾醇、没食子酸、连苯三酚、大花红天素(crenulatin)、rhodionin和/或rhodiosin。这些成分可以同样的步骤来提取，例如，利用醇溶剂、或者单独提取它们，每次利用对从植物中提取特定目的成分特别有效的溶剂。在特定的实施方案中，可通过下列方法来进行提取将所选的部分，优选根研磨成粉末。可将粉末在目的溶剂中浸泡一段时间以从该组合物中有效提取活性剂。可将溶液过滤并浓缩以产生含有高浓度的溶剂提取成分的糊剂。在一些情况下，可将糊剂干燥来产生组合物crenulata的粉末提取物。提取物中活性成分的含量可利用HPLC、UV和其它光谱测定方法来测定。
本发明的组合物可以任意形式通过任何有效的途径施用，施用途径包括例如，经口、肠道外的、肠的、腹膜内的、局部的、经皮的(例如利用任何标准贴剂)、眼的、鼻的、局部的、非口服的、例如气溶胶的、吸入、皮下的、肌内的、口腔的、含服、直肠的、阴道的、动脉内的、和鞘内途径等等。它可单独或与任意活性或非活性成分包括在药用形式中或者作为食物或饮料添加剂施用。
在本发明优选的实施方案中，将组合物以任意适当的形式经口施用，所述形式包括，例如，整个植物、粉末化或研磨的植物材料、提取物、丸剂、胶囊剂、粒剂、片剂或混悬剂。
可将组合物与任何药物学上可接受的载体组合。短语“药物学上可接受的载体”表示任何药物载体，例如Remington′s Pharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing company，1990中所描述的标准载体。合适载体的实例在本领域是众所周知的，可包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液，含有Polysorb 80的磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂和多种类型的润湿剂。其它载体还可包括无菌溶液、片剂、包衣片剂药物和胶囊剂。通常此类载体含有赋形剂，例如淀粉、奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、二元醇。此类载体还可包括风味或颜色添加剂或其它成分。通过众所周知的常规方法配制包含此类载体的组合物。通常与组合物一起配制的赋形剂适合于经口施用并且不与其或其它活性成分有害地反应。
合适的药物学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、明胶、糖，例如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟基甲基纤维素等等。其它添加剂包括，例如，抗氧化剂和防腐剂，着色剂、调味剂和稀释剂，乳化剂和悬浮剂，例如，阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、藻酸钠、皂土、卡波姆、角叉藻聚糖、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛苯昔醇-9(octoxynol 9)、油醇、聚维酮、一硬脂酸丙二醇酯、十二烷基硫酸钠、山梨聚糖酯、硬脂醇、黄蓍胶、黄原胶，及其衍生物，溶剂和混杂成分，例如微晶纤维素、柠檬酸、糊精、葡萄糖、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等等。
组合物可与其它活性成分配制，所述活性成分为例如抗氧化剂、维生素(A、C、抗坏血酸、B族、例如B1、硫胺素、B6、吡哆醇、B复合物、生物素、胆碱、烟酸、泛酸、B12、维生素B12、和/或B2、D、D2、D3、麦角钙化醇、E、例如生育酚、核黄素、K、K1、K2)。优选的化合物，包括，例如一水合肌酸、丙酮酸盐、L-肉碱、α-硫辛酸、植酸钙镁或植酸、辅酶Q10、NADH、NAD、D-核糖、氨基酸例如L-谷氨酰胺、赖氨酸、白杨素、前激素，例如4-雄烯二酮、5-雄烯二酮、4(或5-)雄烯二醇、19-去甲-4(或5-)-雄烯二酮、19-去甲-4(或5-)-雄烯二醇、β-蜕皮甾酮、5-甲基-7-甲氧基异黄酮。优选的活性成分包括，例如，松花粉、枸杞子(Fructus Lycii)、沙棘、当归(ligusticum)、刺五加(Acanthopanax)、距骨(astragalus)、麻黄(ephedra)、党参(Codonopsis)、远志(polygola tenuifolia Willd)、百合(Lilium)黑三棱(Sparganium)、人参、panax notogiseng、藤黄(Garcinia)、Guggle、葡萄种子提取物或粉末、和/或无心银杏(Ginkgo Biloba)。
可与本发明的组合物配制的其它植物和植物药材包括多种教科书和出版物，例如ES Ayensu，Medicinal Plants of West Africa，ReferencePublications，Algonac，Mich.(1978)；L.Boulos，Medicinal Plants of NorthAfrica，Reference Publications Inc.，Algonac，Mich.(1983)；和N.C.Shah，Botanical Folk Medicines in Northern India，J.Ethnopharm，6294-295(1982)中所提及的那些。
其它活性成分包括，例如，抗氧化剂、抗癌剂、抗炎剂、激素、和激素拮抗剂、抗生素(例如，羟氨苄青霉素)和其它细菌制剂，以及其它医药上有用的药物，例如那些在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，1990中所鉴定的药物。本发明优选的组合物包含大约1％-100％，优选地大约20-70％的植物提取物；以及，任选地，药物学上可接受的赋形剂。
本发明涉及施用组合物的方法，例如，用以提供抗氧化剂效果、保护免受氧化、提供抗癌效果、促进DNA修复、提供抗辐射效果、保护免受辐射、减轻炎症、及如此处所述的其它病症和疾病。
术语“施用”意指以这样的方式将组合物递送给宿主，所述方式可以实现预期的目的。如所提到的，可通过有效的途径例如经口、局部地、直肠地等等途径来施用组合物。组合物可施用给需要治疗的任意宿主，例如脊椎动物，例如哺乳动物，包括人、男人、女人、灵长类、宠物，例如猫和狗、家畜，例如牛、马、鸟、鸡等等。
将有效量的组合物施用于此类宿主。有效量是这样的量，其可用于实现预期效果，优选地如上所述的有益或治疗性效果。所述量可常规地来确定，例如，通过进行剂量反应实验，其中对细胞、组织、动物模型(例如处于按标准心理测试所做的迷津测试、游泳测试、毒性测试、记忆测试中的大鼠或小鼠，等等)施用不同剂量以确定获得效果的有效量。量的选择基于多种因素，包括病毒所施用的环境(例如，癌症患者、动物模型、组织培养细胞，等等)、所要处理的细胞的位置、所要治疗的患者或动物的年龄、健康、性别和重量，等等。有用量包括每剂量不同形式的组合物10毫克-100克，优选地，100毫克-10克、250毫克-2.5克、1克、2克、3克、500毫克-1.25克，等等，所述组合物为例如植物粉剂、植物提取物糊剂或粉剂、制备成含有组合物有效成分的茶和饮料，以及注射剂，这取决于受者的需要和制备方法。
抑制细胞的组合物本发明抑制细胞的组合物也称为AneustatTM。
本发明的组合物包含有效量的灵芝、半枝莲、丹参和任选地沙棘的提取物，其显示出抑制细胞的效果，所述组合物通过显示下述一种或多种特性用于抑制原始癌细胞的进一步生长(i)增强免疫系统，(ii)减轻对细胞和组织的氧化性损伤，(iii)减轻炎症，(iv)抑制细胞周期特定阶段中细胞的增殖，(v)抗氧化剂活性，和(vi)针对进一步暴露至致癌剂和诱变剂的抗诱变效应。
在本发明的一方面中，所述组合物包含等量的灵芝、半枝莲和丹参提取物。以显示出展示本申请中所述的多种特性的组合物有效浓度为基础，本领域的技术人员可容易地确定组合物的剂量。包含不同比率的各种提取物的组合物可以类似地确定。
细胞毒性组合物本发明的细胞毒性组合物也称为AneutoxTM。
本发明的组合物包含灵芝、半枝莲、丹参和任选地，沙棘的提取物，其在与化学治疗剂、放射治疗和外科手术联合施用的细胞毒性组合物中是有用的。除了前面所述的特性(i)增强免疫系统，(ii)减轻对细胞和组织的氧化性损伤，(iii)减轻炎症，(iv)抑制细胞周期特定阶段中细胞的增殖，(v)抗氧化剂活性，和(vi)针对进一步暴露至致癌剂和诱变剂的抗诱变效应之外，这些组合物还显示出下述一种或多种特性(a)与化学疗法的协同作用(增强对化学治疗剂的敏感性)，(b)与放射疗法和外科手术的协同作用(通过抑制被放射或外科手术错过的原始癌细胞的生长来增强有效性)。抗诱变特性(连同协同作用引起的增强的敏感性)降低了治疗所必需的化学治疗剂的水平，从而导致对患者的毒性减轻。
本发明的细胞毒性组合物可与化学治疗剂联合使用，所述化学治疗剂包括烷化剂、抗代谢物拮抗剂、抗癌抗生素和植物来源的抗癌剂。
“烷化剂”的实例包括氮芥、盐酸氧氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、三胺硫磷、卡波醌、二丙胺磺酯、白消安、盐酸尼莫司丁、二溴甘露醇、美法仑、氮烯唑胺、雷诺氮芥、雌氮芥磷酸钠、三亚胺嗪、亚硝脲氮芥、洛莫司汀、链脲霉素、哌泊溴烷、依托格鲁、卡波铂、顺铂、米铂(miboplatin)、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、安巴司丁、dibrospidium盐酸盐、福替目丁、松龙苯芥、嘌米舌泊、ribomustin、替莫唑胺、treosulphan、氯乙环磷酰胺、净司他丁替马拉美、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)和比折来新(bizelesin)。“抗代谢物”的实例包括巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核糖苷、硫代肌苷、氨甲喋呤、依诺他宾、阿糖胞苷、阿糖胞苷酯、盐酸环胞苷、5-FU药物(例如，氟尿嘧啶、喃氟啶、UFT、脱氧氟尿苷、卡莫氟、gallocitabine、emmitefur)、氨基喋呤、甲酰四氢叶酸钙、硫鸟嘌呤、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟(emitefur)、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、丙米腙、thiazophrine和安巴司丁等等。“抗癌抗生素”的实例包括放线菌素-D、放线菌素-C、丝裂霉素-C、色霉素-A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培来霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿克拉霉素、盐酸吡喃阿霉素、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌霉素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、和盐酸去甲柔毛霉素等等。“植物来源的抗癌剂”的实例包括磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛和长春烯碱等等。
“烷化剂”的实例包括氮芥、盐酸氧氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、三胺硫磷、卡波醌、二丙胺磺酯、白消安、盐酸尼莫司丁、二溴甘露醇、美法仑、氮烯唑胺、雷诺氮芥、雌氮芥磷酸钠、三亚胺嗪、亚硝脲氮芥、洛莫司汀、链脲霉素、哌泊溴烷、依托格鲁、卡波铂、顺铂、米铂(miboplatin)、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、安巴司丁、dibrospidium盐酸盐、福替目丁、松龙苯芥、嘌米舌泊、ribomustin、替莫唑胺、treosulphan、氯乙环磷酰胺、净司他丁替马拉美、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)和比折来新(bizelesin)。
“抗代谢物”的实例包括巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核糖苷、硫代肌苷、氨甲喋呤、依诺他宾、阿糖胞苷、阿糖胞苷酯、盐酸环胞苷、5-FU药物(例如，氟尿嘧啶、喃氟啶、UFT、脱氧氟尿苷、卡莫氟、gallocitabine、emmitefur)、氨基喋呤、甲酰四氢叶酸钙、硫鸟嘌呤、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟(emitefur)、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、丙米腙、thiazophrine和安巴司丁等等。
“抗癌抗生素”的实例包括放线菌素-D、放线菌素-C、丝裂霉素-C、色霉素-A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培来霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿克拉霉素、盐酸吡喃阿霉素、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌霉素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、和盐酸去甲柔毛霉素等等。
“植物来源的抗癌剂”的实例包括磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛和长春烯碱等等。
本发明的细胞毒性组合物也可与免疫治疗剂联合使用，所述免疫治疗剂包括溶血链球菌Su、云芝多糖K、西索菲兰、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴细胞毒素、卡介苗、短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、左旋咪唑、多糖K和苯咪唑丙酸。
组合物选自包含两种或更多种灵芝、半枝莲、丹参的提取物的组合。这些化合物的组合显示出协同抑制癌细胞(包括子宫颈癌和肺癌细胞)的增殖。发现各自植物的提取物也降低氧化、减轻炎症和增强免疫系统。
在本发明的一方面中，组合物包含等量的灵芝、半枝莲和丹参提取物。以显示出展示本申请中所述的多种特性的组合物有效浓度为基础，本领域的技术人员可容易地确定组合物的剂量。包含不同比率的各种提取物的组合物可以类似地确定。例如，组合物在一种浓度或比率的提取物组合下可以显示出抑制细胞效应，而在其它浓度或比率的提取物组合下可以显示出不同程度的细胞毒性效应。
在一个实施方案中，抗癌治疗包含对处于发展癌症风险的个体施用预防有效量的本发明组合物。预防有效量是指当对处于发展癌症(新癌症或复发)风险的个体施用时，可实现癌症抑制。如本领域技术人员所知的，剂量可随个体的年龄、大小、健康和个体代谢及相关因素而改变。施用的途径可通过任何常规途径，通过该途径可将组合物安全并有效地递送。优选的施用途径是经口途径。组合物可以片剂/小胶囊/胶囊剂的形式或以在药学上可接受的载体(例如，液体、水、盐或其它生理溶液或凝胶)的形式施用。
包含灵芝、半枝莲、丹参提取物的两种或更多种的组合是针对抑制癌细胞(包括子宫颈和肺癌细胞)增殖、降低氧化、减轻炎症和增强免疫系统的能力来选择的。另外，将其它抗癌化合物(化学治疗剂)包括于典型的组合物中。
适合用于本发明的组合物和方法中的化学治疗剂可为任意已知的药学上上可接受的治疗剂，这至少部分取决于因其抗癌活性而干扰细胞结构和/或代谢。常规的化学治疗剂的实例包括但不限于，铂化合物，例如顺铂、卡波铂和它们的类似物及衍生物；烷化剂例如苯丁酸氮芥、氮芥、氧氮芥、环磷酰胺、4-过氧羟基环磷酰胺、醛磷酰胺(aldophosphamide)的2-己烯基吡喃糖苷(2-hexenopyranoside)、苯丙氨酸氮芥、BCNU、CCNU、甲基-CCNU、尿嘧啶芥、甘露氮芥、三亚胺嗪(triethylenemelamine)、氯脲霉素、ACNU、GANU、MCNU、TA-77、六甲密胺、二溴甘露醇、哌泊溴烷、双环氧哌啶、环氧哌嗪、ethoglucide、pippsulfan、dimethylmilelane、bubulfan、inprocuon、threnimone、噻替哌和氮替哌；抗代谢物例如5-氟尿嘧啶、叶酸、氨甲喋呤(MTX)、6-巯基嘌呤、氨基蝶呤、8-氮鸟嘌呤、咪唑硫嘌呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、重氮丝氨酸、喃氟啶、BHAC、SALVIAMILTIORRHIZA108、阿糖胞苷、cispuracham、diazamycine、HCFU、5′DFUR、TK-177和cyclotidine；抗生素，例如博来霉素、柔红霉素、四环素、放线菌素D、丝裂霉素C、carzinophylin、macrocinomycin、neothramycin、大分子霉素、nogaromycin、cromomycin、7-o-methylnogallol-4′-表柔比星、4-去甲氧基柔红霉素、链脲佐菌素DON和米托蒽醌；二-氯乙基化治疗剂，例如麦磺磷芥、氮芥、nornitrogenmustard、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥；激素类例如雌激素类；生物还原剂，例如丝裂霉素C、和其它的治疗剂，例如米托蒽醌、甲基苄肼、多柔比星、表柔比星、松龙苯芥、异环磷酰胺、P-糖蛋白抑制剂，例如thaliblastine，以及蛋白激酶抑制剂，例如蛋白激酶C抑制剂(依莫佛新)。化学治疗剂特别指抗微管剂或微管蛋白靶定剂，包括长春花生物碱；长春花生物碱例如依托泊苷、鬼臼毒素、长春新碱和长春花碱；紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛)和前体紫杉烷(10-脱乙酰基浆果赤霉素III)、砷盐、秋水仙素、硫代秋水仙素、秋水仙酰胺、秋水仙碱水杨酸盐和其它colchium盐；表鬼臼毒素(依托泊苷)、细胞松弛素(例如A-E，H，J)、冈田酸(okadaic acid)、胺甲萘及其代谢物，例如萘酚或萘基化合物，包括1-萘酚、2-萘酚、磷酸1-萘基酯、丙二酸、洛可达唑(甲基-(5-[2-噻吩基-羰基]-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸酯)、cryptophycin(CP)及其类似物例如CP-52、渥曼青霉素、12-0-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)、14-3-3sigma及其同系物(例如rad24和rad25)、Ustiloxin F、野百合碱，例如野百合碱吡咯(MCTP)、雌氮芥、以及腺苷的抑制剂。这些化学治疗剂既可单独使用也可组合使用。优选地，将一种抗代谢物和一种抗微管剂相组合，且更优选地将具有不同肿瘤杀伤机制的紫杉醇、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、博来霉素或5-氟尿嘧啶相组合。干扰细胞骨架的含有砷化合物、秋水仙素、秋水仙碱、秋水仙酰胺、秋水仙碱水杨酸盐、colchium salts、长春花碱、紫杉醇及相关化合物的组合是最优选的。由于新的化学治疗剂和药物得以鉴定并且可被本领域利用，所以可将它们直接应用于本发明的实践中。
在优选的实施方案中，除了灵芝、半枝莲、丹参任意两种或更多种外，全天然细胞毒性组合物还包含植物成分，例如环磷酰胺、4-过氧羟基环磷酰胺、噻替哌、紫杉醇和相关化合物，阿霉素、柔红霉素和新制癌菌素。
目前用于癌症治疗及设计用于干扰微管缩短(解聚)或延长(聚合)的药物例如紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春新碱、长春花碱和长春烯碱是细胞毒性组合物的优选成分。这些药物结合到微管蛋白——组成微管的分子上，并通过抑制纺锤体组装来抑制有丝分裂中的细胞(Compton，D.A.等人，(1999)Science 286313-314)。
除施用治疗有效量的组合物外，根据本发明利用细胞毒性组合物进行抗癌治疗的方法还包含施用治疗有效量的一种或多种标准抗癌治疗(例如，一种或多种放射疗法、化学疗法、外科手术、免疫疗法和光动力疗法)。在此备选的优选实施方案中，除施用治疗有效量的组合物外，所述方法还包含施用治疗有效量的一种或多种标准化学治疗药物。治疗有效量的一种或多种标准化学治疗药物和治疗有效量的细胞毒性组合物的组合可导致肿瘤抑制(包括现有肿瘤的退化)中的协同效应。
性质本发明组合物的几个明显性质使它们独特地适合于癌症治疗。
提取物的植物来源是天然的，在个体化合物/提取物的长期使用中，化合物是基本无毒的。如埃姆斯试验结果所证实的抗诱变性质(与由协同引起的增强的敏感性一起)降低了治疗所需的化学治疗剂的水平，导致了对患者降低的细胞毒性。
组合物还表现出增强细胞周期的能力，这可使Aneustat组合物通过增强有效性和降低化学治疗剂的剂量而成为化学疗法(在Aneutox制剂中)或放射疗法的有力佐剂。
质量控制。以确定性质的比活性为基础，可对基于IC50的组合物进行标准化。
组合物也可适于方便的(经口)药物递送。用热水和有机溶剂(乙酸乙酯、乙醇)提取组合物。
总的来说，在Aneustat组合物中，组分主要显示抑制细胞效应，具有非常弱的细胞毒性效应。细胞毒性组合物(Aneutox)任选地包括已知的化学治疗剂。
组合物证实了抗氧化活性，其防止对染色体/基因的损伤，降低诱变剂的效应，减轻化学治疗剂的副作用，并增强细胞修复机制。
组合物还表现出免疫系统增强活性，其促进了(i)受损伤的细胞或(ii)具有受损伤基因细胞的清除。另外，组合物提供了改善免疫条件(被动免疫治疗)的一般益处。
Aneustat处理的细胞的组织病理学显示了死亡癌细胞的最低保留，其增强了癌症治疗后的恢复。
组合物显示出显著的抗炎活性。Aneustat显示Cox-2抑制(优于COX-14.5倍以上)。该活性延迟了肿瘤发展，已建议将COX-2抑制剂作为治疗癌症的方法。
Aneustat还诱导淋巴细胞释放肿瘤坏死因子α——已知其在促进编程性细胞死亡中发挥重要作用，促进编程性细胞死亡在癌症治疗中是关键的。
因此Aneustat组合物在预防癌症以及抑制现有癌细胞生长方面是有用的。Aneutox组合物可与化学治疗剂联合使用。它降低了药物抗性，也作为化学疗法、放射疗法和外科手术的佐剂。另外，所述组合物与癌症治疗化学疗法、放射疗法和外科手术协同作用，因而增强了有效性并降低了所需的剂量水平。最后，组合物是独特且有效的，因为该组合物的各种成分的效果协同作用。
实施例相信本领域的技术人员不用进一步的详细阐明就可以利用前面的描述在最大程度上利用本发明。下面的实例仅仅是例证性的，并且无论如何不限制该公开的剩余内容。
整个实施例中使用了提取物的下列组合灵芝、半枝莲和丹参是Aneustat的成分。Aneutox包含相同或不同浓度的相同成分并另外包含，任选地，化学治疗剂。
另外，本发明的组合物可包括，任选地，西洋参(Panax Quinquefolium)、大叶茶(绿茶)、和沙棘。常常将利用这些组合或单独提取物所获得的结果与ACAPHA——六种植物的组合(越南槐(Sophora tonkinensis)、圆穗蓼(Polygonum bistorta)、夏枯草(Prunella vulgaris)、Sonchus brachyotus、白鲜(Dictamnus dasycarpus)和黄独(Dioscorea bulbifera)相比较。
实施例1植物提取物的制备方法本发明的组合物可以作为干燥植物施用。植物制剂含有植物化学物质，它们中的一些在水性介质中是可溶的，而其它的在有机(醇、脂类)介质中是相对更可溶的。使用了不同的提取方法并测试了从植物中提取有效成分的能力。提取方法包括热水提取、有机(脂类级分)提取、有机(水性级分)提取、和乙醇提取。
通过图1A中所示的一般提取平台利用不同的溶剂从植物中制备产物。通常，通过视觉和其它检查方法将植物按一致的大小和质量进行预先筛选。将粗品植物材料用所希望的溶剂进行提取。优选地，对于每一批进行两次提取过程。将液体提取物蒸发至干。如果需要，除去溶剂并将干燥提取物混合作为最后的产物。任选地，可将混合物封装用于保存和递送。
在图1B-1G中描述的提取方案中，用溶剂(热水，80％乙醇，或乙酸乙酯)在回流下提取植物或植物混合物30-60分钟，通过过滤分离以获得滤液，并风干用于进一步分析。在确定活性之前将滤液合并、稀释或浓缩。利用热水、80％乙醇和氯仿/甲醇的提取步骤分别图解于图1B、1C和1D中。利用热水、80％乙醇以及热水然后是80％乙醇的植物混合物的提取步骤分别图解于图1E、1F和1G中。利用乙酸乙酯的植物混合物的提取步骤图解于图1H中。
实施例2提取物对肺癌细胞的抗增殖效应对抑制组织培养中A549人肺癌细胞中癌细胞增殖所需的宽范围浓度(mg/ml)的灵芝、半枝莲、Pq和丹参的单个植物提取物进行了持续72小时的测试。通过硫代罗丹明B试验测定存在和不存在提取物时细胞数目的增加。通过利用如Skehan等人，″New Colorimetric Cytotoxicity Assay forAnticancer-drug Screening，″J.Natl.Cancer Inst.，821107-1112(1990)所述的硫代罗丹明B试验测定总的细胞蛋白质的量，获得细胞生长抑制的IC50值。将MCF-7细胞在37℃下5％CO2中培养于含有17％胎牛血清、12μg/ml硫酸庆大霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。将汇合的细胞用胰蛋白酶消化，稀释40倍，并接种进96孔微量滴定板中。在无药物下生长24小时后，将含有不同浓度药物的培养基加入不同孔中(二甲基亚砜的终浓度，0.1％)。另外48小时后，测定IC50值。
图2显示了组合物(AneustatTM)抑制细胞增殖的组合指数(CI)值，所述组合物包含灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)及化学治疗药物。将每种成分添加至它们各自IC50值的浓度。AneustatTM显示出与吉西他滨(GemzarTM)非常显著和强烈的协同作用，以及与氨甲喋呤的显著协同作用。注意到与卡波铂、埃坡霉素B和多西他赛(Taxotere)的一定拮抗作用。
对有机和含水提取物的功效进行了对比。图3A-3C提供了当多次提取和通过不同方法提取时，由不同植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)分别抑制细胞增殖的潜能的概述。测试了通过水、乙酸乙酯(酯)和甲醇的提取。
实施例3提取物对Cox-2的抑制环加氧酶(Cox)是我们体内天然存在的酶。Cox-2是引起疼痛所必需的酶。非类固醇抗炎药物(NSAIDs)由于它们的镇痛和抗炎活性而广泛应用于治疗疼痛及关节炎的病征和症状。公认常见的NSAIDs通过阻断环加氧酶(COX)的活性而起作用，环加氧酶也称为前列腺素G/H合酶(PGHS)，该酶将花生四烯酸转变成前列腺素类。最近，鉴定了两种形式的COX组成型同工型(COX-1)和诱导型同工型(COX-2)，其在炎症位置的表达受到上调(Vane，J.R.；Mitchell，J.A.；Appleton，I.；Tomlinson，A.；Bishop-Bailey，D.；Croxtoll，J.；Willoughby，D.A.Proc.Natnl.Acad.Sci.USA，1994，91，2046)。认为COX-1发挥生理学作用并负责胃肠和肾脏保护。另一方面，COX-2似乎发挥病理学作用并且是存在于炎症状态下的主要同工型。Cox2酶是炎症特异性的，Cox2抑制剂(例如Celebrex、Vioxx)最近通过了FDA批准。
大量的证据表明环加氧酶-2(COX-2)在胃肠癌中是重要的。与邻近的非肿瘤组织相比胰腺癌中COX-2mRNA的水平增加大于60倍。(Tucker等人，Cancer Res.1999Mar 1；59(5)987-990.)环加氧酶-2(COX-2)在头和颈的鳞状细胞癌(HNSCC)中过表达，但在来自健康受试者的正常口腔粘膜中未检测到表达。(Chan等人，Cancer Res.1999Mar 1；59(5)991-994)。
目前有越来越多的证据表明COX-2的组成型表达在恶性上皮肿瘤的发生和发展中发挥作用。(Denkert等人，Cancer Res.2001Jan 1；61(1)303-308.)。这些结果一起提示COX-2可成为癌症预防或治疗的靶标。
利用前列腺素内过氧化物H合酶-1和-2同工酶(PGHS-1和-2)，基于它们将花生四烯酸转变为前列腺素(PGs)的能力，进行了COX-2抑制活性的抗炎试验。本实验中使用的阳性对照是阿司匹林、萘普生和异丁苯丙酸。
测定了单个植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的二氯甲烷提取物及其组合对于抑制COX-2酶活性的组合指数(CI)值。以最大抑制的50％(如通过热失活所测定的)抑制酶活性的提取物浓度的倒数显示于图4中。如同所有三种植物的Aneustat组合，灵芝(#9)和丹参(#14)的组合显示出最大协同作用。
测定了单独的植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯提取物及其组合抑制COX-2酶活性的组合指数(CI)值。以最大抑制(如通过热失活所测定的)的50％抑制酶活性的提取物浓度的倒数显示于图5中。灵芝(#9)和半枝莲(#15)的组合显示出显著的协同性(CI～0.6)。
优选的COX-2抑制剂将显示出对COX-2比对COX-1更强的抑制，COX-1负责胃肠和肾脏的保护。测定了单独植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯提取物及其组合对COX-2的抑制与对COX-1的抑制潜能的比率，并显示于图6中。通过按其抑制COX-1或COX-2活性的IC50比率混合两种或更多种提取物来制备所显示的组合。因而不同的组合混合物用于COX-1和COX-2抑制。丹参(#14)提取物是最有选择性的一种试剂并显示出对COX-2比对COX-1的15倍的优先。如图6显示，灵芝(#9)和丹参(#14)的提取物组合抑制COX-2比抑制COX-1强19倍。
图7显示了单独植物灵芝(#9)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的乙酸乙酯提取物(#0401)及其组合抑制COX-2和COX-1的效能。以所测试的每种组合物的IC50的倒数来表示效能。通过COX-1和COX-2ELISA测定试剂盒(Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI)测定抑制。丹参(#14)单独或与灵芝(#9)，或者灵芝(#9)和半枝莲(#15)组合显示出最大的效能。实施例4提取物的抗氧化活性测试了包含两种或更多种半枝莲浆果、半枝莲叶子、Pq、灵芝、丹参和半枝莲提取物的混合物的抗氧化特性。混合物A包含所有6种成分，混合物B-G每次特别排除一种成分。发现半枝莲叶子负责整个混合物的几乎50％的抗氧化活性。
测试了包含两种或更多种灵芝、丹参和半枝莲的热水提取物的混合物的抗氧化特性。比较标准是Trolox(维生素E的水溶性类似物)，并将相对抗氧化活性定义为Trolox当量(TE)。内部比较(comparison in)的标准是槲皮素(一种类黄酮)，并将相对抗氧化活性定义为槲皮素当量。发现在两种测量系统下沙棘叶子负责整个混合物的几乎50％的抗氧化活性。实施例5提取物的TNF-α试验肿瘤负担导致了循环的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的显著增加，TNF-α是可诱导骨骼肌中蛋白质分解的细胞因子。(Llover等人，Mol CellEndocrinol.1998Jul 25；142(1-2)183-189)。TNF-α是从受刺激的淋巴细胞释放的细胞毒性细胞因子。TNF-α靶向那些正经历异常有丝分裂的肿瘤细胞。当到达靶细胞时，TNF-α结合到受体上并引起细胞经历编程性细胞死亡。TNF-α释放自许多淋巴细胞，包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、活化的T和B淋巴细胞、自然杀伤细胞等等。TNF-α也是免疫反应的主要调节剂。
测试了提取物刺激巨噬细胞释放TNF-α的能力。用灵芝(#8)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的一种或多种的不同浓度提取物处理单核细胞(巨噬细胞前体)4小时并通过ELISA免疫测定来测量TNF-α的释放。结果显示于图8中。灵芝显示出诱导TNF-α释放的最大能力。
实施例6提取物增强免疫系统活性的能力淋巴细胞的增殖与免疫系统的增强相关，因为这代表着免疫系统的更多数目细胞的可用于打击病原体。测试了灵芝(#8)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的不同浓度的提取物增强免疫系统细胞增殖的能力。以掺入到淋巴细胞DNA中的氚标记的胸苷的量来测定淋巴细胞的增殖，并显示于图9中。
实施例7用于测定提取物的诱变性的埃姆斯试验埃姆斯试验的使用是基于这样的假设大多数致癌剂除在动物细胞中引起肿瘤之外，还是诱变剂。本试验中所用的细菌是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的菌株，其在his操纵子中带有突变，使其不能够从其培养基中的成分合成氨基酸组氨酸(His)。his操纵子中的突变是组氨酸营养缺陷体——它们不能在不添加组氨酸时生长。恢复了His+表型的回复突变株将在无组氨酸的基本培养基平板上生长。这提供了将his突变体的回复突变株简单灵敏的筛选为经诱变剂处理(Ames，B.，F.Lee，和W.Durston.1973.An improved bacterial test system for the detection andclassification of mutagens and carcinogens.Proc.Natl.Acad.Sci.USA70782-786)。
埃姆斯试验显示了所测验的组合物是否是自身诱变的并且从而是潜在危险的。该测验还可显示提取物是否通过防止突变而有益。许多化合物在肝脏中受到改变而成为诱变剂。因而在存在和缺失肝脏酶(用NADPH和葡萄糖-6-磷酸激活的肝脏提取物)的情况下进行测验。将2-aminoantracene用作阳性对照。对灵芝(#8)、半枝莲(#15)和丹参(#14)的提取物以20μg每板进行埃姆斯试验，并显示于图10中。提取物中没有一种显示出任何显著的诱变性。
实施例8AneustatTM的最大耐受剂量将代表10×IC50的Aneustat溶液(灵芝、丹参、半枝莲)经口施用于SCID/nod小鼠。将提取物质的溶液(43.65mg/ml)经口施用(1ml/天/动物)于SCID/nod小鼠(25gm；n＝5)，每天一次，长达14天。在药物施用后，对小鼠的应激征候进行28天的监测，包括体重的实质减轻、腹泻、严重喘气、毛的褶皱、等等。在第2至14天，观察到小于13％的体重减轻(图11)，且认为动物是健康的。在这段时期的末尾，通过CO2吸入将小鼠处死。用盐水以1ml/天处理年龄匹配的对照小鼠(n＝4)共14天。数据显示提取物的日剂量43.65mg/ml/25gm小鼠是无毒的。将此剂量用与初步研究中以研究提取物对异种移植物模型系统中肿瘤生长的效果。
实施例9人肺癌组织异种移植物/小鼠模型的建立利用异种移植物模型对肺癌治疗剂的临床前测试已经大量开展，所述异种移植物模型中已将人肺癌细胞系皮下注射进免疫缺陷的小鼠中。然而，癌细胞异种移植物不能够准确地模拟体内肺肿瘤的行为。事实上，癌细胞系异种移植物模型很少有准确预测抗癌剂的临床效能的记录。建立了多种癌前期和癌性人组织，包括肺癌组织的新的异种移植物模型。最重要的是，模型中的异种移植物保持着亲本组织的组织学特征。对于所选择的癌症类型，异种移植物以类似于患者中所观察到的方式应答治疗。例如，生长于SCID小鼠中的前列腺癌组织显示出如在临床种观察到的对雄激素消除治疗的剧烈反应。
AB79肺癌异种移植物在体内生长两个半月以后，两个组织异种移植物中的一个已长成胡桃大小。移植至肾脏位置的肿瘤存活下来并保持了它们最初的组织病理和分化标记图，甚至在连续传代后也是如此。肺癌组织在SCID小鼠中具有非常快的生长速度，具有大约5天的倍增时间。细胞发生分析确实显示了一些异常染色体。不仅有易位，还有缺失和染色体片段的重复。(注意因为每个染色体具有其自身的显示颜色，沿染色体长度上有多于一种颜色表明易位)。光谱核型(SKY)分析显示AB79肺癌异种移植物组织仅含有少量的核型改变，尽管癌症已是高度发展的。
实施例10Aneustat对携带人肺癌细胞系A549异种移植物的小鼠的存活影响将人A549细胞与胶原蛋白凝胶(106细胞/凝胶)混合并移植在3SCID/nod小鼠的肾囊下。在体内2月后，A549细胞已经形成了实体瘤，然后收获实体瘤并将之切成多个同样的小块。在第0天将肿瘤的4块(每块大约2.5mm3)移植入一只小鼠。总共将60块移植进15只小鼠。移植后的25天平均肿瘤体积是20.8mm3。将Aneustat经口施用(14.4mg/动物/天)于6只小鼠，为期21天。用盐水处理年龄匹配的对照小鼠相同的时间。对小鼠的存活结果监测12周的时间并显示于图12中。用Aneustat处理3周在3个月的时间内显著增加了带有A549肿瘤的小鼠的存活。
实施例11Aneustat对人抗药性小细胞肺癌(AB79)异种移植物生长的影响利用来自患有抗药性SCLC的68岁患者的异种移植物测试了Aneustat对抗药性小细胞肺癌(SCLC)的效能。在第0天将80个肿瘤组织块(2mm3)随机移植进24只小鼠的肾囊下。在治疗开始时(第6天)，对照组中的平均肿瘤体积大约是5mm3，在第21天增加至600mm3。
在第7天，当平均移植物体积为大约5mm3时，开始Aneustat治疗。对每组6只小鼠的3个组每组分别用43.65、14.4和4.3mg/动物/天处理16天，其后收获移植物以确定对肿瘤体积、组织学、编程性细胞死亡指数(Tunel试验)和增殖指数(增殖标记Ki67染色)的影响。TUNEL试验通过定量荧光试验检测编程性细胞死亡诱导的DNA断裂。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化通过缺刻末端标记将溴脱氧尿苷(BrdU)残基掺入断裂的核DNA的3’-羟基末端。然后TRITC缀合的抗BrdU抗体可以标记3’-羟基末端用于检测。
Aneustat治疗基本在所有三种剂量都以统计学上显著的方式(p＜0.01)抑制SCLC异种移植物的生长(在14.4mg/动物/天的剂量下抑制＞50％)。混合的植物提取物基本在所有3种剂量都抑制肺癌组织的生长约50％。对照和处理的动物中肿瘤生长的区别是统计学上显著的(p＜0.01)。将抑制效果与CDDP+VP16的标准化学治疗方案相比较，并显示于图13中。
组织病理学显示了坏死模式的不同。在未处理的异种移植物中，坏死主要是病灶性的和中心的，如所有小细胞未分化癌中常见的，并反映出由快速增殖引起的血管远端坏死(图14a)。坏死的细胞主要位于肿瘤的中心部分(图14b)。Ki67免疫染色显示出与无修复迹象的坏死区域邻近的增殖的通常增加(图14c)。
在Aneustat处理的异种移植物中，坏死增加了且主要是汇合的而不是病灶性的。坏死是血管中心的(vasocentric)(图14d)且与发展的肿瘤边界并列存在，而不是中心的(图14e)。Ki67免疫染料显示了“S”期中细胞数目的总体增加，且这在发展的边缘尤其显著(图14f)。从这些观察中可推断出活性生长区域中增加的血液供应和血液递送的细胞毒性。S期细胞的增加和增殖活性的增加可表明Aneustat组合物的“保护”效果。Aneustat处理的异种移植物的健康外观(与CDDP+VP16处理的异种移植物相比)可反映出组合物的细胞抑制效应或减轻的毒性。
利用ApopTag荧光素原位编程性细胞死亡检测试剂盒(Chemicon)测定了编程性细胞死亡。在Aneustat处理的异种移植物中显著更多的细胞处于编程性细胞死亡。由Aneustat处理诱导的编程性细胞死亡是重要的性质，因为癌常常通过中和细胞编程性细胞死亡的能力来增殖。
用抗Ki67抗体染色的移植物显示出Aneustat处理后癌细胞Ki67染色的边际的、但统计学上显著的增加。S期中所发现的Ki67标记细胞表明S期中的抑制(图15)。
实施例12对前列腺癌细胞系(DU145)的异种移植物效能研究。
为确定Aneustat对其它癌症类型的效能并将其性能与标准化学治疗方案相比较，将来自前列腺细胞系DU145的肿瘤异种移植物切成2mm3的小块并移植进SCID/nod小鼠。在第13天开始处理(平均体积＝15.6mm3)。将小鼠分为3个相等的组用于用盐水、3.3IC50的Aneustat和雌氮芥磷酸钠(EMCYT)及多西他赛(E+D)处理。如图16所示的，与E+D方案相比，Aneustat显示出显著的抑制效果。
实施例13Aneustat对非小细胞肺癌(NSCLC)系(AB117)异种移植物生长的影响从患有晚期疾病的53岁男性获得显示肺鳞状细胞癌特征的AB117肿瘤。用盐水(对照)、Aneustat、顺铂+多西他赛和顺铂+长春烯碱处理异种移植物。只有Aneustat是经口施用，其它药物腹膜内施用。
如图17所示，Aneustat在体内对NSCLC组织的生长具有显著的抑制效果。
如图18所示，Aneustat处理的肿瘤显示出增加的多态性(18c)和多核化细胞(18d)。相比，对照肿瘤显示出较少的坏死和多态性(18a)。顺铂+多西他赛处理的肿瘤(18b)只显示出很少的活肿瘤细胞。
图19A和19B中荧光激活细胞分选仪(FACS)所产生的柱状图中，顺铂+多西他赛处理的肿瘤显示出循环细胞的几乎全部损失。在G2/M期中有一些抑制，但在S+G2+M中的细胞总共仅有6％。相比，Aneustat处理的肿瘤显示出S、G2和M细胞的百分数大约30-50％的增加。此证据表明Aneustat处理的细胞既具有更短的G1期，或者从G0到G1增强的转换反映出细胞的增强的循环。增强的循环可使Aneustat组合物成为化学疗法(在Aneutox制剂中)或放射疗法的强有力的佐剂。
实施例14提取物对子宫颈癌细胞的抗增殖效应测试了对于抑制组织培养中子宫颈癌细胞生长所需的单个植物提取物的浓度并与ACAPHA的浓度做了比较。对比了有机(脂类)和水性(热水)提取物的效能。灵芝、半枝莲、Pq和丹参在比ACAPHA更低的浓度下是有效的。有机提取物的脂类级分比热水提取物的效能强约10倍。
测试了子宫颈癌细胞生长的50％抑制所需的单个草药提取物的脂类级分的浓度并与ACAPHA和中药的浓度进行了比较。将丹参鉴定为最有效提取物的来源。
测定了子宫颈癌细胞生长的50％抑制所需的草药提取物组合的脂类级分的浓度(mg/ml)。植物提取物的组合比最有效的单个植物——丹参更有效2至4倍。还发现植物提取物的组合比ACAPHA的最有效提取物更有效。
实施例15人癌细胞生长的协同抑制虽然丹参(#14)、灵芝(#9)和半枝莲(#15)的提取物对抑制人癌症细胞系的生长是有效的(表2A和2B)，但如表3A和3B中所示的，丹参(#14)、灵芝(#9)和半枝莲(#15)单种植物提取物的组合在抑制来自肺癌(A549)、乳腺癌(MCF7)、前列腺癌(DU145)和结肠癌(DLD-1)的人癌症细胞系中显示出协同效应。
表2A.植物提取物对不同细胞系的细胞增殖抑制的IC50(以mg/ml表示，带有标准差)
表2B.植物提取物对不同细胞系的细胞增殖抑制的IC50与平均值的标准差
表3A.肺、前列腺和结肠癌细胞增殖的协同抑制
表3B.乳腺和前列腺癌细胞增殖的协同抑制
如表4中所概括的，丹参(#14)、灵芝(#9)和半枝莲(#15)三种植物提取物的所有组合协同抑制人肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和结肠癌细胞的增殖。
表4.植物提取物组合对肺、乳腺、前列腺和结肠癌细胞增殖的协同抑制的概括
此说明书中所引用的所有出版物和专利申请在此处引用作为参考，如同将每个单独的出版物或专利申请特别地并单独地指出引用作为参考一样。
尽管为了清楚理解已通过举例说明和实施例的方式详细地描述了前面的发明，但是本领域技术人员依据本发明的教导显而易见的是，可以对本发明进行一定修改和修饰而不背离所附权利要求的精神或范围。
权利要求
1.抗癌治疗的方法，其包括对处于发展癌症危险的个体施用预防、治疗有效量的组合物，其包含灵芝提取物、丹参提取物和半枝莲提取物的两种或多种，其中每种提取物按重量计占约10％至约50％。
2.根据权利要求1的方法，其中所述提取物是热水提取物。
3.根据权利要求1的方法，其中所述提取物是有机提取物。
4.根据权利要求1的方法，其中所述提取物是乙酸乙酯提取物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述提取物显示出至少一种特性，其选自抗炎、免疫增强、诱导淋巴细胞释放TNF-α和加速细胞增殖。
6.根据权利要求5的方法，其中所述抗炎活性相对于COX-1选择性抑制COX-2。
7.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是肺癌。
8.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是子宫颈癌。
9.根据权利要求1的方法，其还包含大叶茶(绿茶)的提取物。
10.抗癌治疗的方法，其包括对处于癌症早期的个体施用(a)治疗有效量的组合物，其包含灵芝提取物、丹参提取物和半枝莲提取物的两种或多种，其中每种提取物按重量计占约10％至约50％；和(b)治疗有效量的至少一种化学治疗剂。
11.根据权利要求10的方法，其中所述提取物是热水提取物。
12.根据权利要求10的方法，其中所述提取物是有机提取物。
13.根据权利要求10的方法，其中所述提取物是乙酸乙酯提取物。
14.根据权利要求10的方法，其中所述提取物显示出至少一种特性，其选自抗炎、免疫增强、诱导淋巴细胞释放TNF-α和加速细胞增殖。
15.根据权利要求14的方法，其中所述抗炎活性相对于COX-1选择性抑制COX-2。
16.根据权利要求10的方法，其还包括对所述个体施用治疗有效量的一种或多种抗癌治疗，所述抗癌治疗选自放射疗法、化学疗法、外科手术、免疫疗法、光动力疗法和它们的组合。
17.根据权利要求10的方法，其中所述癌症选自肺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
18.根据权利要求10的方法，其中所述癌症是子宫颈癌。
19.根据权利要求10的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
20.根据权利要求10的方法，其中所述化学治疗剂选自吉西他滨和氨甲喋呤。
21.根据权利要求10的方法，其中所述化学治疗剂干扰微管聚合。
22.根据权利要求21的方法，其中所述化学治疗剂选自紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春新碱、长春花碱和长春烯碱。
23.根据权利要求10的方法，其中所述化学治疗剂选自环磷酰胺、4-过氧羟基环磷酰胺、噻替哌、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素和新制癌菌素。
24.根据权利要求10的方法，其还包含大叶茶(绿茶)提取物。
25.抗癌治疗的方法，其包括对处于癌症早期的个体施用(a)治疗有效量的组合物，其包含灵芝提取物、丹参提取物和半枝莲提取物的两种或多种，其中每种提取物按重量计占组合物的约10％至约50％；(b)治疗有效量的至少一种化学治疗剂；和(c)治疗有效量的沙棘提取物。
26.根据权利要求25的方法，其中所述提取物是热水提取物。
27.根据权利要求25的方法，其中所述提取物是乙酸乙酯提取物。
28.根据权利要求25的方法，其中所述提取物是有机提取物。
29.根据权利要求25的方法，其中所述提取物显示出至少一种特性，其选自抗炎、免疫增强、诱导淋巴细胞释放TNF-α和加速细胞增殖。
30.根据权利要求29的方法，其中所述抗炎活性相对于COX-1选择性抑制COX-2。
31.根据权利要求25的方法，其中沙棘提取物是热水提取物。
32.根据权利要求25的方法，其还包括对所述个体施用治疗有效量的一种或多种抗癌治疗，所述抗癌治疗选自放射疗法、化学疗法、外科手术、免疫疗法、光动力疗法和它们的组合。
33.根据权利要求25的方法，其中所述癌症是肺癌。
34.根据权利要求25的方法，其中所述癌症是子宫颈癌。
35.根据权利要求25的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
36.根据权利要求25的方法，其中所述化学治疗剂选自吉西他滨和氨甲喋呤。
37.根据权利要求25的方法，其中所述化学治疗剂干扰微管聚合。
38.根据权利要求37的方法，其中所述化学治疗剂选自紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春新碱、长春花碱和长春烯碱。
39.根据权利要求25的方法，其中所述化学治疗剂选自环磷酰胺、4-过氧羟基环磷酰胺、噻替哌、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素和新制癌菌素。
40.根据权利要求25的方法，其还包含大叶茶(绿茶)提取物。
41.抗癌组合物，其包含灵芝提取物、丹参提取物和半枝莲提取物的两种或多种，其中每种提取物包含治疗有效量。
42.根据权利要求41的方法，其中所述提取物显示出至少一种特性，其选自抗炎、免疫增强、诱导淋巴细胞释放TNF-α和加速细胞增殖。
43.根据权利要求42的方法，其中所述抗炎活性相对于COX-1选择性抑制COX-2。
44.根据权利要求41的组合物，其还包含治疗有效量的至少一种化学治疗剂。
45.根据权利要求41的组合物，其还包含治疗有效量的至少一种化学治疗剂和治疗有效量的沙棘提取物。
46.根据权利要求41的组合物，其中所述化学治疗剂干扰微管聚合。
47.根据权利要求41的组合物，其中所述化学治疗剂选自紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春新碱、长春花碱和长春烯碱。
48.根据权利要求41的组合物，其中所述化学治疗剂选自吉西他滨和氨甲喋呤。
49.根据权利要求41的组合物，其中所述化学治疗剂选自环磷酰胺、4-过氧羟基环磷酰胺、噻替哌、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素和新制癌菌素。
50.根据权利要求41的组合物，其中每种提取物以大约相等的量使用。
51.根据权利要求50的组合物，其中每种提取物是热水提取物。
52.根据权利要求50的组合物，其中每种提取物是有机提取物。
53.根据权利要求52的组合物，其中每种提取物是乙酸乙酯提取物。
全文摘要
提供了预防和治疗癌症的方法和组合物。提供了包含灵芝提取物、丹参提取物和半枝莲提取物的两种或更多种的治疗有效量及任选地的沙棘提取物的治疗有效量的组合物。公开了组合治疗中使用这些化合物的新的协同作用。还提供了还包含治疗有效量的至少一种化学治疗剂的实施方案。
文档编号A61K41/00GK1874781SQ200480031791
公开日2006年12月6日 申请日期2004年9月8日 优先权日2003年9月8日
发明者J·道, T·C·S·道, D·D·佟, L·威尔森, M·A·乔丹, W·格尔维克 申请人:盖尼奥斯生物医学国际公司