抗cd40抗体突变体的制作方法

专利名称：抗cd40抗体突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种识别与免疫相关的细胞膜分子CD40的抗CD40抗体。另外，本发明涉及一种在人抗体恒定区具有突变或亚单位部分被取代的抗体，从而可降低ADCC和/或CDC活性，但保持激动或拮抗活性。
背景技术：
1.CD40CD40是一种位于细胞膜表面，在B细胞、树突状细胞(DCs)、某些种类的癌细胞和胸腺上皮细胞中表达，分子量为50kDa的抗原。已知CD40在B细胞和DCs的增殖和分化中具有重要作用。CD40被鉴定为一种在人B细胞表面表达的抗原(E.A.Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986；及I.Stamenkovic等，EMBO J.81403，1989)，属于包括低亲和力NGF受体、TNF受体、CD27、OX40和CD30的TNF受体家族成员。最近已克隆出针对人和鼠CD40s的配体(CD40Ls)，并发现该配体是II型膜蛋白，在激活的CD4+T细胞中表达。而且发现CD40L可将强激活信号传递到人或鼠B细胞中。
已发现CD40在树突状细胞中的表达比在B细胞中更高，而且已表明CD40在树突状细胞中具有重要作用。CD40与CD40L结合可激活抗原呈递细胞(APCs)，即表达协同刺激因子例如CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，或增强IL-2的产生(Caux，C.，等Activation of humandendritic cells through CD40 cross-linking.J.Exp.Med.，1801263，1994；及Shu，U.，等Activated T cells induce interleukin-12 productionby monocyte via CD40-CD40 ligand interaction.Eur.J.Immunol.，251125，1995)。树突状细胞具有强的抗原呈递能力和强的刺激辅助T(Th)细胞的能力。而且也认为树突状细胞可调控天然Th细胞分化为Th1或Th2细胞。当作为骨髓树突状细胞的外周血单核细胞在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养，并通过CD40L使其成熟时，则得到的成熟树突状细胞(DC1)可在体外产生IL-12，并可刺激和激活异源天然Th细胞，以诱导产生IFNγ的T细胞(即促进其分化为Th1)。该作用可被抗IL-12抗体抑制，因此可通过IL-12起作用。另一方面，将存在于淋巴T区和外周血的胞浆T细胞，在存在IL-3和CD40配体的条件下培养时，得到的淋巴树突状细胞(DC2)不能产生IL-12，也不能刺激和激活异源天然Th细胞以诱导产生IL-4的T细胞，这表明促进其分化为Th2。Th1细胞被认为参与细胞免疫的激活，而Th2细胞与体液免疫的增强和细胞免疫的限制有关。当细胞毒素T细胞(CTL)在Th1细胞的辅助下被激活时，则它们可消除在细胞质和肿瘤细胞中生长的病原体(各种病毒、李斯特菌、结核菌、弓形体原生动物等)。
已表明可识别在膜表面表达的CD40的单克隆抗CD40抗体对B细胞具有不同的生物活性。通常根据在CD40和CD40L间的相互作用将单克隆抗CD40抗体划分为激动型或拮抗型抗体。
2.激动型抗体已知激动型抗体可激活B细胞。例如，已报道抗CD40抗体可诱导细胞黏附(Barrett等，J.Immunol.1461722，1991；及Gordon等，J.Immunol.1401425，1998)，增加细胞体积(Gordon等，J.Immunol.1401425，1998；及Valle等，Eur.J.Immunol.191463，1989)，诱导仅被抗IgM抗体、抗CD20抗体或佛波酯刺激的B细胞进行细胞分裂(Clark and Ledbetter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986；Gordon等，LEUCOCYTE TYPING III.A.J.McMicheal ed.OxfordUniversity Press.Oxford.p.426；及Paulie等，J.Immunol.142590，1989)，诱导B细胞在存在IL-4时进行细胞分裂(Valle等，Eur.J.Immunol.191463，1989；及Gordon等，Eur.J.Immunol.171535，1987)，诱导培养细胞在IL-4刺激和T细胞缺乏的条件下表达IgE(Jabara等，J.Exp.Med.1721861，1990；及Gascan等，J.Immunol.1478，1991)，诱导那些培养细胞表达IgG和IgM(Gascan等，J.Immunol.1478，1991)，通过IL-4从细胞中分泌可溶性CD23/FceRII(Gordon and Guy，Immunol.Today 839，1987；及Cairns等，Eur.J.Immunol.18349，1988)，通过IL-4在细胞上增强可溶性CD23/FceRII的表达(Challa，A.，Allergy，54576，1999)，及刺激IL-6的产生(Clarkand Shu，J.Immunol.1451400，1990)。另外，已报道在存在CDw32+黏附细胞时，向人原代培养B细胞中加入IL-4和抗CD40抗体可导致由其衍生的克隆B细胞的建立(Bancherauet等，Science 24170，1991)，而且不管抗原受体有活性或无活性，生发中心细胞的凋亡可通过CD40被抑制(Liu等，Nature 342929，1989)。如上所述，CD40已被鉴定为一种在人B细胞表面表达的抗原，因此，主要以诱导人B细胞增殖和/或分化的能力，或诱导癌细胞死亡的活性为指标对大多数已分离的抗体进行评估(Katira，A.等，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman，等人，547页，Oxford University Press.Oxford；W.C.Flansow等人，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman，等人，555页，Oxford University Press.Oxford；及J.D.Pound等人，International Immunology，1111，1999)。
已表明抗CD40抗体可使DC成熟(Z.H.Zhou等人，Hybridoma，18471，1999)。另外，已报道CD4T细胞在促进抗原特异的CD8 T细胞方面的作用是通过CD40-CD40L信号途径激活DC，而且已发现抗CD40的单克隆抗体(mAb)可代替CD40辅助T细胞激活树突状细胞(DC)(Shoenberger，S.P.，等人T-cell help for cytotoxic Tlymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions.Nature，480，1998)。而且已发现对鼠施用抗CD40抗体可保护动物体免受表达CD40的肿瘤细胞和不表达CD40的肿瘤细胞的侵袭(French，R.R.，等人CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicateslymphoma and bypasses T-cell help.Nature Medicine，5，1999)。
人们期望激动型抗CD40抗体基于上述作用可有效治疗由细菌、病毒等引起的传染性疾病、癌症和其它疾病。在WO 02/088186中描述了具有较好激动活性的抗CD40抗体。这些激动型抗体的代表性实例是KM341-1-19和2105抗体。产生KM341-1-19抗体的杂交瘤KM341-1-19和产2105抗体的杂交瘤2105分别在2001年9月27日和2002年4月17日根据布达佩斯条约在独立行政法人产业综合技术研究所进行国际保藏(地址日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6)。其保藏号分别是FERM BP-7759(KM341-1-19)和FERM BP-8024(2105)。
3.拮抗型抗体另一方面，如上所述，考虑到CD40在免疫应答中具有重要作用，因此期望抑制CD40与其配体的结合，将可在器官移植和自免疫疾病方面开发出用于免疫抑制的治疗性药物。Sawada、Hase等人已报道，患Crohn′s症的病人的外周血具有更高比例的高表达CD40的单核细胞。但并不十分清楚这种抗体是否可抑制CD40与其配体的结合。这些抑制性抗体可用于CD40的功能分析和治疗需激活CD40的疾病。而且也表明针对CD40配体的抑制性抗体对由CD40与CD40配体结合而导致的疾病是有效的。但据报道CD40L是在激活的血小板中表达的(V.Henn等，Nature 391591，1998)，因此，如果将抗CD40L抗体用作治疗性药物，可能导致血栓形成(T.Kawai等，Nat.Med.6114，2000)。从这点上来说，抗CD40抗体作为抑制CD40与其配体结合的治疗性抗体药物比抗CD40L的抗体更安全。抗CD40抗体可用于抑制CD40L与CD40的结合，但并不激活CD40本身。
根据如上所述的功能，这种拮抗型抗CD40抗体可用作治疗自免疫疾病和抑制器官、骨髓等移植中的免疫排斥。具有较好拮抗活性的抗CD40抗体在WO 02/088186中进行了描述。这些拮抗型抗体的代表性实例是4D11抗体。产4D11抗体的杂交瘤4D11在2001年9月27日根据布达佩斯条约在独立行政法人产业综合技术研究所进行国际保藏(地址日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6)。其保藏号是FERM BP-7758。
专利文献1 WO 02/088186发明内容本发明的目标是从WO 02/088186所描述的潜在治疗性抗CD40抗体中构建突变体，使该突变体适于设计为药物。
通过深入而细致的研究，本发明人成功地构建了比已知的抗CD40抗体对疾病具有更好治疗效果的激动型或拮抗型抗体的新型突变体，并在其基础上完成了本发明。本发明中修饰抗CD40抗体的基本思想将在下文中详细描述。
本说明书将包括作为本发明优先权基础的日本专利申请(特开)No.2003-431408的说明书中的描述和/或附图。


图1A-1所示的是根据CD40序列制备的结合位点的肽，抗CD40的激动型抗体可与之结合；图1A-2所示的是根据CD40序列制备的结合位点的肽，抗CD40的激动型抗体可与之结合(图1A-1的续)；图1B-1所示的是根据CD40序列制备的结合位点的肽，抗CD40的拮抗型抗体可与之结合；图1B-2所示的是根据CD40序列制备的结合位点的肽，抗CD40的拮抗型抗体可与之结合(图1B-1的续)；图2A所示的是抗CD40抗体与CD40突变体的结合；图2B所示的是抗CD40抗体与CD40突变体的结合；图2C所示的是抗CD40抗体与CD40突变体的结合；图3A所示的图表明具有P331S突变的KM341-1-19抗体在与Ramos细胞结合方面与原始的KM341-1-19抗体一样具有活性；图3B所示的图表明具有P331S突变的KM341-1-19抗体在增强Ramos细胞的CD95表达方面与原始的KM341-1-19抗体一样具有活性；图4A所示的图表明具有P331S突变的KM341-1-19抗体通过兔补体具有更低的CDC活性；图4B所示的图表明当用人的补体时，G2/4抗体具有更低的补体活性；图5A-1所示的图表明将2105抗体的亚类从IgG2转变为不同的亚类时对其与Ramos细胞的结合没有影响；图5A-2所示的图表明将KM341-1-19抗体的亚类从IgG2转变为不同的亚类时对其与Ramos细胞的结合没有影响；图5B-1所示的图表明将2105抗体的亚类从IgG2转变为不同的亚类时可降低增强Ramos细胞CD95表达的活性；图5B-2所示的图表明将KM341-1-19抗体的亚类从IgG2转变为不同的亚类时可降低增强Ramos细胞CD95表达的活性；图6A-1所示的图表明KM341-1-19抗体与Ramos细胞的结合能力不依赖于铰链区的可变结构；图6A-2所示的图表明2105抗体与Ramos细胞的结合能力不依赖于铰链区的可变结构；
图6B-1所示的图表明铰链区的上部和中部铰链对KM341-1-19抗体增强Ramos细胞CD95表达的活性非常重要；图6B-2所示的图表明上部和中部铰链区域对2105抗体增强Ramos细胞CD95表达的活性非常重要；图7A所示的图表明将F72抗体的亚类转变为IgG2对其与Ramos细胞的结合没有影响；图7B所示的图表明将F72抗体的亚类转变为IgG2可提高增强Ramos细胞CD95表达的活性；图8A所示的图表明将4D11抗体的亚类从IgG1转变为IgG4对其与Ramos细胞的结合没有影响；图8B所示的图表明将4D11抗体的亚类从IgG1转变为IgG4将以相同或不同程度抑制由CD40配体引起的Ramos细胞CD95表达的增强；图9所示的图表明将4D11抗体的亚类从IgG1转变为IgG4或IgG4PE可降低ADCC活性；图10所示的图表明将4D11抗体的亚类从IgG1转变为IgG4P可降低CDC活性；图11所示的是对人CD40转基因鼠施用4D11G1、4D11G4P或4D11G4PE后，血中的B细胞(外周血淋巴细胞中的B220-阳性细胞)的数目随时间的变化；图12A所示的是将抗CD40抗体施用于人CD40转基因鼠后，脾B细胞(脾B细胞中CD23-阳性细胞)CD23的表达更高；图12B所示的是将抗CD40抗体施用于人CD40转基因鼠后，脾B细胞(脾B细胞中CD86-阳性细胞)CD86的表达更高；图12C所示的是将抗CD40抗体施用于人CD40转基因鼠后，脾B细胞(脾B细胞中CD95-阳性细胞)CD95的表达更高；图13A所示的是4D11和281-1-10在人CD40转基因鼠中对抗原特异的抗体(IgG1)产生的抑制活性；图13B所示的是4D11和281-1-10在人CD40转基因鼠中对抗原特异的抗体(IgM)产生的抑制活性；图14A所示的是在抑制抗原特异的抗体产生活性的检测中B细胞(外周血淋巴细胞中的B220-阳性细胞)在血中的数目，
图14B所示的是在抑制抗原特异的抗体产生活性的检测中脾B细胞(脾淋巴细胞中的B220-阳性细胞)的数目，图15所示的是以30mg/kg的剂量对猕猴(cynomolgus)施用4D11G4P或4D11G4PE后，血中的B细胞(外周血淋巴细胞中的B220-阳性细胞)的数目随时间的变化；图16所示的是图15所示的检测中的血IL-12水平；图17所示的是4D11G4PE对猿的DTH(雄性猕猴中的延迟型超敏性)的抑制作用；图18所示的是图17的结果检测中抗破伤风毒素IgG的效价；图19所示的是图17的结果检测中抗破伤风毒素IgM的效价；图20A所示的是4D11G4PE和5C8(抗CD40配体的抗体)对血小板凝聚的影响；图20B所示的是4D11G4PE和5C8(抗CD40配体的抗体)对血小板凝聚的影响；图21所示的是4D11G4P、4D11G4PE、4D11G2Ser或4D11G4/2/4在pH2.7，37℃温育后，其寡聚体含量随时间的变化；图22所示的是抗CD40拮抗型抗体对皮肤移植排斥的抑制作用；图23所示的是将341G2Ser施用于具有Ramos细胞植入的荷瘤鼠，肿瘤体积在细胞植入后随时间的变化；图24所示的是将341G2Ser施用于具有T24细胞植入的荷瘤鼠，肿瘤体积在细胞植入后随时间的变化；图25所示的是将341G2Ser施用于具有Hs 766T细胞植入的荷瘤鼠，肿瘤体积在细胞植入后随时间的变化；及图26所示的是将341G2Ser施用于具有Capan-2细胞植入的荷瘤鼠，肿瘤体积在细胞植入后随时间的变化。
最佳实施方式1.激动型抗体的修饰抗体本质上是一类保护机体抵抗外来物，例如微生物、病毒及癌细胞的分子，因此抗体可杀死并清除掉那些可与其结合的细胞。致死活性包括两种不同的活性，所谓抗体依赖的细胞毒性(以下缩写为ADCC)和补体依赖的细胞毒性(以下缩写为CDC)的活性组成。
ADCC是指一类由在其表面表达的Fc受体与抗体的恒定区结合而识别靶细胞的巨噬细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞等激活而诱导的细胞毒性作用。相反，CDC是指一类由通过抗体抗原结合引发补体系统激活而诱导的细胞毒性作用。已知这些活性因抗体的不同亚类而改变，已发现这是由于抗体的恒定区的结构差异而造成的(Charles A.Janeway等，Immunology，1997，Current Biology Ltd./GarlandPublishing Inc.)。
如果抗CD40激动型抗体没有可诱导表达CD40的细胞死亡的ADCC和/或CDC活性，即免疫激活作用机制，则该抗体作为药物是更优选的。如果表达CD40的细胞被ADCC和/或CDC活性损伤，则可能发生免疫抑制而不是所需的免疫激活，从而导致疾病的恶化。另外，患有感染性疾病的病人可能具有更高的ADCC和/或CDC活性。因此，当将这种抗体应用于感染性疾病时，需要用比在这种情况下不能有效检测上述活性的健康人血清或外周血中的补体更具活性的，例如兔补体对其安全性进行更仔细地评估。由此，构建没有ADCC或CDC活性的突变体和重组体，并检测其活性。
由于已知ADCC和/或CDC活性随目标抗体的亚类而改变，因此改变亚类可能降低ADCC和/或CDC活性。例如，对人IgG亚类，通常IgG4是一个具有较低ADCC和CDC活性的亚类，而且已报道IgG2具有CDC活性，但ADCC活性较差，而IgG1的ADCC和CDC活性都较高(Charles A.Janeway等，Immunology，1997，Current BiologyLtd./Garland Publishing Inc.)。利用上述特征选择特定的亚类可以构建比原始抗体的细胞毒性作用更小的抗体。如下所述的抗体的特定亚类与点突变的关联性可用于构建具有所需活性的抗体。另外，已报道抗体ADCC和/或CDC活性的降低可通过在其恒定区引入突变而获得。例如，L235、D265、D270、K322、P331和P329(字母表示单字母注释的氨基酸，数字表示由Kabat等人提出的EU索引(Kabat等人，Sequences of proteins of Immunological Interest，1991 Fifthedition)，以下将使用这些符号)在人IgG的补体激活中起重要作用，用其它氨基酸取代这些位点的其中一个有可能降低CDC活性(Esohe E.Idusogie等人J.Immunol.2000，1644178-4184，Yuanyuan Xu等人J.Biol.Chem.1994，2693469-3474，Brekke，O.H.等人Eur.J.Immunol.1994，242542，Morgan，A.，等人，Immunology 1995，86319，Lund，J.等人，J.Immunol.，1996，1574963，Tao，M.H.，等人，J.Exp.Med.1993，178661)。具体地，用A取代D270、K322、P329或P331可降低CDC活性。用S或G取代P331也可得到同样的结果。
我们认为Glu233-Ser239、Gly316-Lys338、Lys274-Arg301、Tyr407-Arg416、Asn297、Glu318、Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299和Ala327-Ile332参与IgG与FcR的结合(Duncan，A.R.，Woof，J.M.，Partridge，L.J.，Burton，D.R.，and Winter，G.(1988)Nature 332，563-564，Gessner，J.E.，Heiken，H.，Tamm，A.，and Schmidt，R.E.(1998)Ann.Hematol.76，231-248，Gavin，A.，Hulett，M，andHogarth，P.M.(1998)in The Immunoglobulin Receptors and TheirPhysiological and Pathological Roles in Immunity(van de Winkel，J.G.J.，and Hogarth，P.M.，eds)，11-35页，Kluwer Academic PublishersGroup，Dordrecht，The Netherlands，Sautes，C.(1997)in Cell-mediatedEffects of Immunoglobulins(Fridman，W.H.，and Sautes，C.，eds)，29-66页，R.G.Landes Co.，Austin，TX，Da′ron，M.(1997)Annu.Rev.Immunol.15，203-234，Canfield，S.M.，and Morrison，S.L.(1991)J.Exp.Med.173，1483-1491，Chappel，M.S.，Isenman，D.E.，Everett，M.，Xu，Y.-Y.，Dorrington，K.J.，and Klein，M.H.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，9036-9040，Woof，J.M.，Partridge，L.J.，Jefferis，R.，andBurton，D.R.(1986)Mol.Immunol.23，319-330，Wines，B.D.，Powell，M.S.，Parren，P.W.H.I.，Barnes，N.，and Hogarth，P.M.(2000)J.Imunol.164，5313-5318)，因此在这些区域引入突变有可能降低ADCC活性。具体地，用E取代L235，或A取代G237可降低IgG与FcR的结合。
本发明的抗体至少具有一个氨基酸突变，以降低ADCC和/或CDC活性，优选地具有1-20、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2个突变。
本发明已发现在一些抗CD40抗体中，IgG2的铰链区在表达较强的激动活性时是非常重要的。用任何不同亚类取代除铰链区外的可变区或恒定区，或引入点突变不仅可调节ADCC和/或CDC活性，而且可增加抗体的产生，提高纯化和储存过程中的稳定性及其血液动力学。
为了生产抗体药物，抗体在纯化和储存过程中的稳定性是非常重要的。由于至今开发的抗体主要属于IgG1亚类，因此将除铰链区外的可变区或恒定区转化为来源于IgG1亚类的序列，可有效改善上述抗CD40激动型抗体的物理性质。
本发明提供如下激动型抗CD40抗体的突变体和其它突变体[1]具有激动活性、可与CD40结合的单克隆抗体的重链，其中所述重链包括来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链，及至少具有一个氨基酸缺失或取代，或至少添加一个氨基酸的恒定区，所述的缺失、取代或添加可增加或降低ADCC和/或CDC活性。
[1]中的重链，其中恒定区来源于人IgG。
[2]中的重链，其中人IgG是人IgG1。
[2]中的重链，其中人IgG是人IgG2。
[2]中的重链，其中人IgG是人IgG3。
[2]中的重链，其中人IgG是人IgG4。
[3]到[5]任何一项中的重链，其中所述的恒定区中氨基酸取代是用丝氨酸取代如Kabat等人的EU索引所示331位的脯氨酸。
包含[1]到[7]任何一项中的重链的单克隆抗体。
[1]到[7]任何一项中的重链，其中重链包括由杂交瘤KM341-1-19(保藏号FERM BP-7759)产生的单克隆抗体的重链的可变区。
包括来自由[9]中所述重链和来自由杂交瘤KM341-1-19(保藏号FERM BP-7759)产生的单克隆抗体的轻链的可变区的轻链组成的单克隆抗体。
[1]到[7]任何一项中的重链，其中重链包括由SEQ ID NO38所示的多肽的可变区。
由[11]中所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO40所示的多肽的可变区。
[1]中的重链，其中重链由从SEQ ID NO132所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
由[13]中的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中轻链由从SEQ ID NO134所示的多肽中除去信号肤序列后所余部分组成。
[1]中的重链，其中所述重链是由包含具有SEQ ID NO131所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生的。
[8]中的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是由包含具有SEQID NO131所示的多核苷酸和SEQ ID NO133所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生的。
[1]到[7]任何一项中的重链，其中重链包含来自由杂交瘤2105(保藏号FERM BP-8024)产生的单克隆抗体的重链的可变区。
由[17]中的重链和轻链构成的单克隆抗体，其中所述轻链包含来自杂交瘤2105(保藏号FERM BP-8024)产生的单克隆抗体的轻链的可变区。
[1]到[7]任何一项中的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO42所示的多肽的可变区。
由[19]中的重链和下述轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO44所示的多肽的可变区。
[1]中的重链，其中所述重链由从SEQ ID NO136所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
由[21]中的重链和下述的轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链由从SEQ ID NO44所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
[1]中的重链，其中所述重链是由包含具有SEQ ID NO135所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生的。
[8]中的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是由包含具有SEQID NO135所示的多核苷酸和SEQ ID NO137所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生的。
由SEQ ID NO131所示的多核苷酸。
由SEQ ID NO133所示的多核苷酸。
具有[25]中多核苷酸的表达载体。
具有[26]中多核苷酸的表达载体。
具有[25]和[26]中多核苷酸的表达载体。
包含[27]中表达载体的宿主。
包含[28]中表达载体的宿主。
包含[29]中表达载体的宿主。
生产单克隆抗体重链的方法，其包括以下步骤在培养基中培养[30]中所述的宿主；及从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体的重链。
生产单克隆抗体的方法，其包括以下步骤在培养基中培养[32]中所述的宿主；及从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体。
由SEQ ID NO135所示的多核苷酸。
由SEQ ID NO137所示的多核苷酸。
具有[35]中多核苷酸的表达载体。
具有[36]中多核苷酸的表达载体。
具有[35]和[36]中多核苷酸的表达载体。
包含[37]中表达载体的宿主。
包含[38]中表达载体的宿主。
包含[39]中表达载体的宿主。
生产单克隆抗体重链的方法，其包括以下步骤在培养基中培养[40]中的宿主；及从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体的重链。
生产单克隆抗体的方法，其包括以下步骤在培养基中培养[42]中的宿主；及从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体。
生产具有激动活性、能与CD40结合的单克隆抗体重链的方法，其包括用来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链分别取代不是来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链的抗体的上部铰链和中部铰链的步骤。
生产包含可变区和来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链的单克隆抗体重链的方法，其包括鉴定来源于可与CD40结合的单克隆抗体重链的形成可变区的多肽的步骤。
生产与CD40结合、具有激动活性的单克隆抗体的方法，其包括用来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链分别取代不是来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链的抗体的上部铰链和中部铰链的步骤。
生产包含可变区及来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链的单克隆抗体的方法，其包括鉴定来源于可与CD40结合的单克隆抗体重链的形成可变区的多肽的步骤。
包括[8]、[10]、[12]、[14]、[16]、[18]、[20]、[22]或[24]中的单克隆抗体为活性成分的药物组合物。
[49]中的药物组合物，其用于预防或治疗恶性肿瘤、病原体或自免疫疾病。
预防或治疗恶性肿瘤、病原体或自免疫疾病的方法，其包括对哺乳动物施用[49]中的药物组合物。
上述[8]、[10]、[12]、[14]、[16]、[18]、[20]、[22]或[24]中的单克隆抗体在生产用于预防或治疗恶性肿瘤、病原体或自免疫疾病的药物组合物中的用途。
从SEQ ID NO131所示的多核苷酸中除去编码信号序列的部分后的多核苷酸。
通过从SEQ ID NO133所示的多核苷酸中除去编码信号序列的部分后的多核苷酸。
通过从SEQ ID NO135所示的多核苷酸中除去编码信号序列的部分后的多核苷酸。
通过从SEQ ID NO137所示的多核苷酸中除去编码信号肽序列部分后的多核苷酸。
本发明提供一种通过修饰属于人IgG2的激动型抗CD40抗体而产生的抗体，其中修饰抗体是用来源于不同亚类的序列取代除上部和中部铰链外的恒定区而得到的突变体。优选IgG1亚类。本发明提供一种通过修饰属于人IgG2的激动型抗CD40抗体而产生的抗体，其中修饰抗体是用来源于不同亚类的序列取代除铰链区外的恒定区而得到的突变体。优选IgG1亚类。
此处ADCC和CDC活性的降低是指与相应的抗CD40单克隆抗体，而不是上述突变体的活性相比较，其活性降低，例如，与由杂交瘤KM341-1-19(保藏号FERM BP-7759)或2105(保藏号FERMBP-8024)产生的单克隆抗体的相应活性相比较。可通过任何已知方法，例如实施例中所述的方法测定ADCC和CDC活性。由杂交瘤KM341-1-19(保藏号FERM BP-7759)或2105(保藏号FERM BP-8024)产生的单克隆抗体的重链和轻链可变区的序列将在下面进行描述。
编码KM341-1-19抗体重链和轻链可变区的DNA及重链和轻链的氨基酸序列将在下面进行描述。
在KM341-1-19抗体的重链核苷酸序列(SEQ ID NO37)中，信号肽序列从50位的腺嘌呤(A)起始。信号肽序列和可变区的界线位于109位的″腺嘌呤″([A])和110位的胞嘧啶(C)之间，可变区和恒定区的界线位于493位的腺嘌呤(A)和494位的鸟嘌呤(G)之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在KM341-1-19抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO38)中，信号肽序列和可变区的界线位于20位的丝氨酸(S)和21位的谷氨酰胺(Q)之间，可变区和恒定区的界线位于148位的丝氨酸(S)和149位的丙氨酸(A)之间。
因此，KM341-1-19抗体的重链可变区的核苷酸序列从110位的胞嘧啶(C)到493位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO37。另外，KM341-1-19抗体的重链可变区的氨基酸序列从21位的谷氨酰胺(Q)到148位的丝氨酸(S)之间，参见SEQ ID NO38。
在KM341-1-19抗体的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO39)中，信号肽序列从29位的腺嘌呤(A)起始。信号肽序列与可变区的界线在88位的“腺嘌呤”([A])和89位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于400位的腺嘌呤(A)和401位的“胞嘧啶”([C])之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在KM341-1-19抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO40)中，信号肽序列和可变区的界线位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之间，可变区和恒定区的界线位于124位的赖氨酸(K)和125位的“精氨酸”([R])之间。
因此，KM341-1-19抗体的轻链可变区的核苷酸序列从89位的鸟嘌呤(G)到400位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO39。另外，KM341-1-19抗体的轻链可变区的氨基酸序列从21位的谷氨酸(E)到124位的赖氨酸(K)之间，参见SEQ ID NO40。
KM341-1-19抗体的重链核苷酸序列(SEQ ID NO37)
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCCKM341-1-19抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO38)MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
KM341-1-19抗体的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO39)ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGKM341-1-19抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO40)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT编码2105抗体重链和轻链可变区的DNA及重链和轻链的氨基酸序列将在下面进行描述。
在2105抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO41)中，信号肽序列从70位的腺嘌呤(A)起始。信号肽序列与可变区的界线位于126位的“胸腺嘧啶”([T])和127位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于495位的腺嘌呤(A)和496位的鸟嘌呤(G)之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在2105抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO42)中，信号肽序列和可变区的界线位于19位的半胱氨酸(C)和20位的谷氨酸(E)之间，可变区和恒定区的界线位于142位的丝氨酸(S)和143位的丙氨酸(A)之间。
因此，2105抗体的重链可变区的核苷酸序列从127位的鸟嘌呤(G)到495位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO41。另外，2105抗体重链可变区的氨基酸序列从20位的谷氨酸(E)到142位的丝氨酸(S)之间，参见SEQ ID NO42。
在2105抗体的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO43)中，信号肽序列从28位的腺嘌呤(A)起始。信号肽序列与可变区的界线位于87位的“腺嘌呤”([A])和88位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于405位的腺嘌呤(A)和406位的“胞嘧啶”([C])之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在2105抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO44)中，信号肽序列和可变区的界线位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之间，可变区和恒定区的界线位于126位的赖氨酸(K)和127位的“精氨酸”([R])之间。
因此，2105抗体的轻链可变区的核苷酸序列从88位的鸟嘌呤(G)到405位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO43。另外，2105抗体的轻链可变区的氨基酸序列从21位的谷氨酸(E)到位126的赖氨酸(K)之间，参见SEQ ID NO44。
2105抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO41)CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG2105抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO42)MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK2105抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO43)
CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTG2105抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO44)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV在341G2Ser的重链核苷酸序列(SEQ ID NO131)中，信号肽序列与可变区的界线位于60位的“腺嘌呤”([A])和61位的胞嘧啶(C)之间，可变区和恒定区的界线位于444位的腺嘌呤(A)和445位的鸟嘌呤(G)之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在341G2Ser的重链氨基酸序列(SEQ ID NO132)中，信号肽序列和可变区的界线位于20位的丝氨酸(S)和21位的谷氨酰胺(Q)之间，可变区和恒定区的界线位于148位的丝氨酸(S)和149位的丙氨酸(A)之间。
因此，341G2Ser的重链可变区的核苷酸序列从61位的胞嘧啶(C)到444位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO131。另外，341G2Ser重链可变区的氨基酸序列从21位的谷氨酰胺(Q)到148位的丝氨酸(S)之间，参见SEQ ID NO132。
341G2Ser完整重链的核苷酸序列(SEQ ID NO131)
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA341G2Ser完整重链的氨基酸序列(SEQ ID NO132)MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在341G2Ser的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO133)中，信号肽序列与可变区的界线位于60位的“腺嘌呤”([A])和61位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于372位的腺嘌呤(A)和373位的“胞嘧啶”([C])之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在341G2Ser的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO134)中，信号肽序列和可变区的界线位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之间，可变区和恒定区的界线位于124位的赖氨酸(K)和125位的“精氨酸”([R])之间。因此，341G2Ser的轻链可变区的核苷酸序列从61位的鸟嘌呤(G)到372位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO133。另外，341G2Ser轻链可变区的氨基酸序列从21位的谷氨酸(E)到124位的赖氨酸(K)之间，参见SEQ ID NO134。
341G2Ser完整轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO133)ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA341G2Ser完整轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO134)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在2105G2Ser的重链核苷酸序列(SEQ ID NO135)中，信号肽序列与可变区的界线位于57位的“胸腺嘧啶”([T])和58位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于426位的腺嘌呤(A)和427位的鸟嘌呤(G)之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在2105G2Ser的重链氨基酸序列(SEQ ID NO136)中，信号肽序列和可变区的界线位于19位的半胱氨酸(C)和20位的谷氨酸(E)之间，可变区和恒定区的界线位于142位的丝氨酸(S)和143位的丙氨酸(A)之间。
因此，2105G2Ser的重链可变区的核苷酸序列从58位的鸟嘌呤(G)到426位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO135。另外，2105G2Ser重链可变区的氨基酸序列从20位的谷氨酸(E)到142位的丝氨酸(S)之间，参见SEQ ID NO136。
2105G2Ser完整重链的核苷酸序列(SEQ ID NO135)ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAGGAGTAGAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA2105G2Ser完整重链的氨基酸序列(SEQ ID NO136)MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK在2105G2Ser的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO137)中，信号肽序列与可变区的界线位于60位的“腺嘌呤”([A])和61位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于378位的腺嘌呤(A)和379位的“胞嘧啶”([C])之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在2105G2Ser的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO138)中，信号肽序列和可变区的界线位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之间，可变区和恒定区的界线位于126位的赖氨酸(K)和127位的“精氨酸”([R])之间。因此，2105G2Ser轻链可变区的核苷酸序列从61位的鸟嘌呤(G)到378位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO137。另外，2105G2Ser轻链可变区的氨基酸序列从21位的谷氨酸(E)到126位的赖氨酸(K)之间，参见SEQ ID NO138。
2105G2Ser完整轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO137)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA2105G2Ser完整轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO138)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC2.拮抗型抗体的修饰和激动型抗体一样，如果抗CD40拮抗型抗体在作用机制方面没有ADCC和/或CDC活性，则其作为治疗性药物是更优选的。另外，即使检测不到ADCC活性，但抗CD40拮抗型抗体的没有通过其体内经Fc受体交联而诱导信号的活性也是非常重要的。换句话说，必须确保它们不激活免疫，这样的活性抗体可作为药物。抗CD40拮抗型抗体作为治疗自免疫疾病或抑制器官移植中排斥反应的药物是非常有潜力的。但如果由于给患者施用后的某些作用而诱导即使可能很弱的拮抗活性，那么症状可能会恶化，与所需的治疗效果相背离。因此，没有任何拮抗活性的抗体是更优选的药物。在本发明中，用猴子的动物实验已表明，在IgG4中引入一个点突变L235E(表示在235位用E取代L；下文使用相同的符号)可在体内有效降低拮抗活性。虽然IgG4是一个具有较低ADCC和CDC活性的亚类，但已报道当在细胞例如CHO中表达作为重组蛋白的IgG4时，其半个分子由于重链间的弱S-S键而分泌出来(Rob C.Aalberse等，Immunology，105，9-19，2002)。为了克服这个问题，已报道在抗体恒定区引入一个突变可成功地促进S-S键的形成。因此，也对这种突变的有用性进行了评估。具体地，在228位引入P取代S(S.Angal等，Molecular Immunology，vol.30，no.1，105-108，1993)。
对拮抗型抗体和激动型抗体而言，抗体在纯化和储存过程的稳定性是非常重要的。有一些方法可构建这种既具有较好的物理性质又保持拮抗活性的抗体。迄今为止商品化的抗体药物主要属于IgG1亚类，而且也没有报道它们在药物配方方面存在问题。根据这些事实，从物理性质的角度考虑，由IgG1衍生抗体的恒定区是非常有利的。但对抗CD40抗体而言，需要降低其ADCC和CDC活性。因此，可能需要用某些点突变修饰具有IgG1型恒定区的抗体。上述突变可用于构建这种抗体。通过在其中引入点突变P331G，则IgG1型恒定区的ADCC和CDC活性会降低。而且也发现在IgG4中引入点突变L235E可除去其体内微弱的拮抗活性，使其在治疗上更有效，但使其在低pH下稳定性降低。因此，用E以外的其它氨基酸取代L235可能使其物理上更具有功能。对于4D11抗体，它的可变区结构与2B11抗体非常相似。与4D11抗体相比较，2B11抗体具有较低的拮抗活性，但在低pH下具有更高的稳定性。基于以上特性，如果将来源于2B11恒定区的某些氨基酸引入到4D11抗体中，那么4D11可能会变得更稳定。具体地，重链中的点突变L38V、P58R、G62W、I79M、K81Y、H87Y、S98A、K109R、V120M或T124A，或轻链中的N75S，或二者联合可达到这个目的。具体地，通过用V取代4D11抗体重链可变区38位的L的突变体(缩写为L38V；以下使用同样的符号)、P58R突变体、G62W突变体、I79M突变体、K81Y突变体、H87Y突变体、S98A突变体、K109R突变体、V120M突变体或T124A突变体，或轻链中的N75S突变体，或二者联合可达到这个目的。
根据本发明的抗体至少有一个氨基酸突变以降低ADCC和/或CDC活性，优选地具有1-15、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、或1或2个突变。
本发明提供如下拮抗型抗CD40抗体的突变体和其它突变体 一种具有拮抗活性、能与CD40结合的单克隆抗体的重链，其中所述重链包括至少具有一个氨基酸缺失或取代，或至少添加一个氨基酸的恒定区，所述缺失、取代或添加可增加或降低ADCC和/CDC。
[53]中的重链，其中恒定区来源于人IgG。
[54]中的重链，其中人IgG是IgG1。
[54]中的重链，其中人IgG是IgG2。
[54]中的重链，其中人IgG是IgG3。
[54]中的重链，其中人IgG是IgG4。
[55]、[57]或[58]任何一项中的重链，其中所述的恒定区中的氨基酸取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
[53]到[58]任何一项中的重链，其中所述重链包括至少具有一个氨基酸缺失或取代，或至少添加一个氨基酸的恒定区，所述缺失、取代或添加可促进重链间S-S键的形成。
[60]中的抗体重链，其中所述的恒定区中的氨基酸取代是用脯氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的228位的丝氨酸。
一种包含[53]到[61]任何一项中的重链的单克隆抗体。
[53]到[61]任何一项中的重链，其中重链包含由杂交瘤4D11(保藏号FERM BP-7758)产生的单克隆抗体的重链的可变区。
一种包含[63]中的重链和下述轻链的单克隆抗体，所述轻链包含由杂交瘤4D11(保藏号FERM BP-7758)产生的单克隆抗体轻链可变区。
[53]到[61]任何一项中的重链，其中所述重链包含SEQ ID NO46所示的多肽的可变区。
一种由[65]中的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO48所示的多肽的可变区组成。
[53]中的重链，其中重链由从SEQ ID NO140所示的多肽中除去信号肽序列的所余部分组成。
一种由[67]中的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链由从SEQ ID NO142所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
[53]中的重链，其中重链是由包含具有SEQ ID NO139所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生的。
[62]中的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是由包含具有SEQ ID NO139所示的多核苷酸和SEQ ID NO141所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生的。
一种由SEQ ID NO139所示的多核苷酸。
一种由SEQ ID NO141所示的多核苷酸。
一种具有[71]中多核苷酸的表达载体。
一种具有[72]中多核苷酸的表达载体。
一种具有[71]和[72]中多核苷酸的表达载体。
一种包含[73]中表达载体的宿主。
一种包含[74]中表达载体的宿主。
一种包含[75]申表达载体的宿主。
一种产生单克隆抗体重链的方法，其包括以下步骤在培养基中培养[76]中的宿主；及从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体的重链。
一种产生单克隆抗体的方法，其包括以下步骤在培养基中培养[78]中的宿主；及从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体。
一种包含[62]、[64]、[66]、[68]或[70]中的单克隆抗体为活性成分的药物组合物。
[81]中的药物组合物用于预防或治疗移植排斥、自免疫疾病、变态反应或凝血因子VIII抑制。
一种预防或治疗移植排斥、自免疫疾病、变态反应或凝血因子VIII抑制的方法，其包括对哺乳动物施用[81]中的药物组合物。
[62]、[64]、[66]、[68]或[70]中的单克隆抗体在制备用于预防或治疗移植排斥、自免疫疾病、变态反应或凝血因子VIII抑制的药物组合物中的应用。
一种产生与CD40结合、具有拮抗活性且激动活性降低的单克隆抗体的重链的方法，其包括在人抗体的重链恒定区缺失或取代至少一个氨基酸，或添加至少一个氨基酸的步骤。
[85]中的方法，其中恒定区来源于人IgG。
[86]中的方法，其中人IgG是人IgG4。
[85]到[87]任何一项中的方法，其中所述恒定区氨基酸的取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
一种由从SEQ ID NO139所示的多核苷酸中除去编码信号肽序列的其余部分所得的多核苷酸。
一种由从SEQ ID NO141所示的多核苷酸中除去编码信号肽序列的其余部分所得的多核苷酸。
另外，本发明提供以下材料。
一种拮抗型抗CD40抗体的突变体，包括至少一个在由杂交瘤4D11(保藏号FERM BP-7758)产生的单克隆抗体重链可变区进行的取代，以及包含用S取代4D11抗体轻链可变区75位的N的拮抗型抗CD40抗体的突变体，所述取代选自用V取代38位的L、用R取代58位的P、用W取代62位的G、用M取代79位的I、用Y取代81位的K、用Y取代87位的H、用A取代98位的S、用R取代109位的K、用M取代120位的V、和用A取代124位的T的组。
此处，ADCC和CDC活性的降低是指这些活性与相应的抗CD40单克隆抗体的活性相比而不是上述突变体的活性相比较是降低的，例如，与由杂交瘤4D11(保藏号FERM BP-7758)产生的单克隆抗体的相应活性相比较。可通过任何已知方法，例如实施例中所述的方法测定ADCC和CDC的活性。由杂交瘤4D11(保藏号FERM BP-7758)产生的单克隆抗体的重链和轻链可变区的序列将在下面进行描述。
编码4D11抗体重链和轻链可变区的DNA及重链和轻链的氨基酸序列将在下面分别进行描述。
在4D11抗体的重链核苷酸序列(SEQ ID NO45)中，信号肽序列和可变区的界线位于93位的″胞嘧啶″([C])和94位的胞嘧啶(C)之间，可变区和恒定区的界线位于456位的腺嘌呤(A)和457位的鸟嘌呤(G)之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在4D11抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO46)中，信号肽序列和可变区的界线位于26位的丝氨酸(S)和27位的谷氨酰胺(Q)之间，可变区和恒定区的界线位于147位的丝氨酸(S)和148位的丙氨酸(A)之间。
因此，4D11抗体的重链可变区的核苷酸序列从94位的胞嘧啶(C)到456位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO45。另外，4D11抗体的重链可变区的氨基酸序列从27位的谷氨酰胺(Q)到147位的丝氨酸(S)之间，参见SEQ ID NO46。
在4D11抗体的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO47)中，信号肽序列和可变区的界线位于124位的″胸腺嘧啶″([T])和125位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于442位的腺嘌呤(A)和443位的“胞嘧啶”([C])之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在4D11抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO48)中，信号肽序列和可变区的界线位于22位的半胱氨酸(C)和23位的丙氨酸(A)之间，可变区和恒定区的界线位于128位的赖氨酸(K)和129位的“精氨酸”([R])之间。
因此，4D11抗体的轻链可变区的核苷酸序列从125位的鸟嘌呤(G)到442位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO47。另外，4D11抗体的轻链可变区的氨基酸序列从23位的丙氨酸(A)到128位的赖氨酸(K)之间，参见SEQ ID NO48。
4D11抗体的重链核苷酸序列(SEQ ID NO45)ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC4D11抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO46)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS4D11抗体的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO47)
AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG4D11抗体的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO48)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT在4D11抗体G4PE的重链核苷酸序列(SEQ ID NO139)中，信号肽序列和可变区的界线位于78位的″胞嘧啶″([C])和79位的胞嘧啶(C)之间，可变区和恒定区的界线位于441位的腺嘌呤(A)和442位的鸟嘌呤(G)之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在4D11抗体的重链氨基酸序列(SEQ ID NO140)中，信号肽序列和可变区的界线位于26位的丝氨酸(S)和27位的谷氨酰胺(Q)之间，可变区和恒定区的界线位于147位的丝氨酸(S)和148位的丙氨酸(A)之间。
因此，4D11抗体的重链可变区的核苷酸序列从79位的胞嘧啶(C)到441位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO139。另外，4D11抗体的重链可变区的氨基酸序列从27位的谷氨酰胺(Q)到147位的丝氨酸(S)之间，参见SEQ ID NO140。
4D11G4PE完整重链的核苷酸序列(SEQ ID NO139)
ATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA4D11G4PE完整重链的氨基酸序列(SEQ ID NO140)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
在4D11G4PE的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO141)中，信号肽序列和可变区的界线位于66位的″胸腺嘧啶″([T])和67位的鸟嘌呤(G)之间，可变区和恒定区的界线位于384位的腺嘌呤(A)和385位的“胞嘧啶”([C])之间(使用了基因预测软件(Signal P ver.2))。
在4D11G4PE的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO142)中，信号肽序列和可变区的界线位于22位的半胱氨酸(C)和23位的丙氨酸(A)之间，可变区和恒定区的界线位于128位的赖氨酸(K)和129位的“精氨酸”([R])之间。
因此，4D11G4PE的轻链可变区的核苷酸序列从67位的鸟嘌呤(G)到384位的腺嘌呤(A)之间，参见SEQ ID NO141。另外，4D11抗体的轻链可变区的氨基酸序列从23位的丙氨酸(A)到128位的赖氨酸(K)之间，参见SEQ ID NO142。
4D11G4PE完整轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO141)ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA4D11G4PE完整轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO142)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3.定义此处所用术语定义如下。
本发明中所述的“CD40”是指具有E.A.Clark等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986，或I.Stamenkovic等人在EMBO J.81403，1989中所述的氨基酸序列的多肽，具体来说，是指在B细胞、DC、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞或来源于这些细胞的肿瘤细胞表面表达的抗原多肽。
“抗CD40抗体”是指任何针对细胞表达的CD40、全长CD40或部分长度的CD40的单克隆抗体。
另外，本发明中的“抗体”是来源于编码构成免疫球蛋白的重链可变区和重链恒定区，及轻链可变区和轻链恒定区的基因(统称为抗体基因)。人免疫球蛋白分为5个不同的类别，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。另外，IgG由4个不同的亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成，而IgA由2个不同的亚类IgA1和IgA2组成。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4位于人染色体14q32，33上。免疫球蛋白的基本结构是由两个同源的L链(轻链)和两个同源的H链(重链)组成。免疫球蛋白的类别和亚类由其H链决定。本发明中的抗体可包括免疫球蛋白的任何类别，任何亚类或任何同种型。发明抗体的“功能片段”是指上述定义的抗体中单独或多个对相应于所述抗体的抗原有活性的部分(部分片段)，例如包括F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、二硫键稳定的FV、单链FV(scFV)及其多聚体(D.J.King，Applications and Engineering ofMonoclonal Antibodies，1998，T.J.International Ltd.)。
迄今为止，已知IgG1包括J00228、Z17370和Y14737，IgG2包括J00230、AJ250170、AF449616、AF449617、AF449618、Z49802和Z49801，IgG3包括M12958、K01313、X16110、X99549、AJ390236、AJ390237、AJ390238、AJ390241、AJ390242、AJ390246、AJ390247、AJ390252、AJ390244、AJ390254、AJ390260、AJ390262、AJ390272、AJ390276和AJ390279，IgG4包括K01316、AJ001563和AJ001564(以上列出的符号表示基因的登录号)。
在本发明中，CH1、铰链、CH2和CH3表示的是基于Kabat等人的EU索引(Kabat等，Sequences of proteins of immunological interest，1991 Fifth edition)中的任何抗体重链恒定区的一部分。通过定义，CH1是EU索引中从118到215之间，铰链是EU索引中从216到230之间，CH2是EU索引中从231到340之间，CH3是EU索引中从341到446之间。
本发明中的“人抗体”是指抗体是来源于人的抗体基因的表达产物。
“激动性”是指增强配体与细胞例如B细胞、肿瘤细胞或树突状细胞表面表达的CD40结合的作用，或赋予表达CD40的细胞至少一种CD40配体对表达CD40的细胞的作用。“激动型抗体”是指具有激动作用的抗体。赋予表达CD40的细胞作用的一个例子是促进CD95的表达。
“拮抗性”是指抑制配体与细胞例如B细胞、肿瘤细胞或树突状细胞表面表达的CD40结合的作用，或中和至少一种CD40配体对表达CD40的细胞的作用。“拮抗型抗体”是指具有拮抗作用的抗体。赋予表达CD40的细胞作用的一个例子是抑制B细胞增殖或抗体的产生。
本申请通过氨基酸序列清楚地阐述了抗体、重链或轻链可变区。本发明也包括具有至少一个氨基酸，优选地是1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2个氨基酸缺失或取代、或添加的氨基酸序列。
本申请通过核苷酸序列清楚地阐述了编码抗体、重链或轻链可变区的基因。本发明也包括具有至少一个核苷酸，优选地是1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2个核苷酸缺失或取代、或添加的核苷酸序列。
本发明中的抗CD40抗体可通过将抗体基因插入到表达载体，将载体转染到合适的宿主细胞，从培养细胞或上清收获抗体及纯化抗体而提供。
载体可以是能在宿主细胞中自我复制，并能整合到宿主染色体上的噬菌体或质粒。质粒DNA可来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母，而噬菌体DNA可以来自λ噬菌体。
用于转化的宿主细胞并无特别限定，只要其可以表达靶基因即可。宿主细胞的例子包括细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)、酵母、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)和昆虫细胞。
已知有各种方法将基因转移到宿主细胞中，包括各种方式，例如有钙离子介导，电穿孔、原生质体融合、醋酸锂介导、磷酸钙转染或脂质体转染。为了将基因转入动物中的方法包括微注射、对ES细胞使用的电穿孔或脂质体转染；及核移植，如下所述。
在本发明中，“培养”是指(a)培养液上清，(b)培养的细胞、培养的生物量或其分解物质，或(c)转化子的分泌物。为了培养转化子，要使用适于宿主的培养基及静态培养，有时可能使用转瓶培养或其它培养方式。
培养后，如果所需抗体蛋白在菌体内或细胞内产生，则通过破碎菌体或细胞来收获抗体。如果所需抗体在菌体或细胞外产生，则通过离心或其它方式从菌体或细胞中分离培养液。然后，单独或联合使用任何适于分离/纯化蛋白的层析方法将所需抗体从培养液中分离出来。
另外，可使用构建转基因动物的技术产生将基因整合为内源基因的转基因动物，例如转基因牛、转基因山羊、转基因绵羊或转基因猪(Wright，G.，等，(1991)Bio/Technology 9，830-834)，从而从这些转基因动物的乳汁中获得大量来源于抗体基因的单克隆抗体。根据待培养杂交瘤的性质、研究目的和培养方法，可用已知的营养培养基或任何从已知基本培养基制备的营养培养基对杂交瘤进行体外培养，使杂交瘤生长、维持、储存并在其上清中产生单克隆抗体。
4.抗体特性(1)激动型抗体由于如本发明所述的激动型抗体突变体的ADCC和/或CDC活性等于或低于原始抗体，但保持激动活性，因此它可激活免疫系统，但不损伤免疫活性细胞。因此期望该突变体具有等于或高于原始抗体的免疫激活作用，而对表达CD40的细胞的细胞毒性作用等于或低于原始抗体。
(2)拮抗型抗体如本发明所述的拮抗型抗CD40抗体突变体与未修饰的抗体相比较，其ADCC和/或CDC活性降低，但保持对CD40L诱导的免疫激活信号有抑制活性。而且也期望它可以降低通过Fc受体引发的体内信号诱导活性。
5.药物组合物一种包含如本发明的纯化抗体制剂的药物组合物也在本发明的范围内。除抗体外，药物组合物优选地可包含生理上可接受的稀释液或载体，而且可以是与不同抗体或不同药物例如抗生素混合的混合物。合适的载体包括但不限定于，生理盐水、磷酸缓冲盐、磷酸缓冲盐葡萄糖溶液和缓冲生理盐水。选择性地，抗体可进行冷冻干燥以进行储存，在使用时，重新将其溶解在上述水溶性缓冲液中。药物组合物可通过口服途径、肠胃外注射途径例如静脉内、肌肉、皮下或腹膜内注射或定量施用。
包括如本发明所述的抗体和合适的稀释液及生理上可接受的载体的组合物的单次有效剂量是每千克体重0.0001毫克到100毫克，施用的时间间隔可以是2天到8周。
当药物组合物中的抗体是激动型抗体时，可用作免疫刺激剂(抗病毒或抗感染药物)用于病原体包括例如甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、HIV、流感病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、乳头瘤病毒、衣原体、支原体、弓形体、疟疾、锥体虫和结核杆菌；抗肿瘤药物用于具有CD40表达的癌细胞的恶性肿瘤，包括例如胰腺癌、膀胱癌，淋巴瘤(例如Hodgkin′s淋巴瘤)、白血病、恶性黑素瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和头颈癌；及自免疫疾病例如风湿病的治疗药物。药物组合物可用于上述疾病的联合治疗。也可以作为癌症特异的多肽的佐剂联合使用。另一方面，当药物组合物是拮抗型抗体时，则可用作器官移植中的免疫抑制剂(用于胰岛、肾或其它，或GVHD移植中排斥反应的预防或治疗性药物)，自免疫疾病(例如，风湿病、牛皮癣、慢性溃疡性结肠炎、Crohn′s病、全身性红斑狼疮、多发性硬化、肌无力症、硬皮病、抗磷脂抗体综合症、自身免疫性肝炎、原发性血小板减少性紫癜、Behcet′s综合症、动脉硬化、肾炎及呼吸窘迫综合症)的治疗药物，变态反应(例如哮喘)的治疗药物，及凝血因子VIII抑制的治疗药物。药物组合物可用于以上疾病的联合治疗。
6.表位分别确定了具有超级激动活性的KM341-1-19和2105抗体和具有超级拮抗活性的4D11抗体对CD40的结合表位(实施例2)。本发明提供具有激动或拮抗活性的抗体，这些抗体具有不同于上述抗体的可变区序列，但与上述抗体识别相同的表位。这些抗体可通过如下所述的步骤获得。
例如，当要获得与KM341-1-19抗体识别相同表位的激动型抗CD40抗体时，用CD40免疫鼠及类似动物，得到单克隆抗体，然后根据标准方法从中筛选和KM341-1-19抗体竞争结合CD40的单克隆抗体。根据实施例2中所述方法从筛选到的抗体中选择与KM341-1-19抗体具有相同的结合肽的模式的抗体。
参照以下实施例对本发明进行详细描述。但本发明并不局限于实施例所述的具体实施方式
。
实施例1抗体和抗原蛋白的表达和纯化将含抗体可变区的载体质粒转染到CHO细胞(ATCC)中，用G418筛选表达抗体的细胞，以制备稳定表达细胞系。
通过将载体瞬时引入HEK细胞(ATCC)来表达突变抗原。
通过以下方法将抗CD40抗体从上述培养液上清中纯化。含抗CD40抗体的培养液上清用Hyper D蛋白质A柱(由NGK Insulators，Ltd.生产)，对鼠IgG1纯化时用蛋白质G柱(Amersham PharmaciaBiotech)，根据所附说明，以PBS(-)为吸附缓冲液，0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)为洗脱缓冲液进行亲和纯化。通过加入1M Tris-HCl(pH 8.0)或Na2HPO4溶液将洗脱组分调整到pH约7.2。制备的抗体溶液用PBS(-)通过渗透膜(10,000分子截留，由Spectrum Laboratories，Inc.生产)或SP柱(Amersham Pharmacia Biotech)进行透析，并用孔径为0.22μm的滤膜MiuEX-GV(由Millipore Corp.生产)进行过滤和除菌。通过测定280nm吸收值计算纯化抗体的浓度，以1.450D为1mg/ml。
实施例2表位的测定将CD40胞外区含氨基酸175的13-mer肽段(SEQ ID NO1)每两个氨基酸“步移”(shift)，共合成82种肽段(SEQ ID NOS49到130)，从C末端在纤维素膜上形成点，并对其N末端进行乙酰化(JeriniAG，Germany)。然后进行常规的Western分析(参见Reineke，U.等，(2001)，″Epitope mapping with synthetic peptides prepared by SPOTsynthesis.″Antibody Engineering(Springer Lab Manual)Eds.Kontermann/Dubel，433-459)。在分析中，点的色彩密度用LumiImagerTM(Boehringer-Mannheim Corp.)进行定量(图1A-1、A-2、B-1和B-2)。
结果表明4D11抗体强烈地识别第20个到第24个和第41个肽段，2105抗体强烈地识别第12个到第23个和第64个肽段，KM341-1-19抗体强烈地识别第41个和第42个肽段，KM643-4-11强烈地识别第43个肽段，F72强烈地识别第75个肽段，110强烈地识别第64个肽段，F4-465强烈地识别第34、35、54、55、65、66和75个肽段，KM281-1-10强烈地识别第21、24、64和75个肽段，2B11(新型抗体)强烈地识别第21、24和64个肽段，F76(新型抗体)强烈地识别第21、35、51和52个肽段。
为了确定抗CD40抗体的结合位点，制备了含引入突变的CD40-FC融合蛋白，并通过ELISA检测其结合能力。由于抗CD40抗体并不与鼠B细胞发生交叉反应，因此通过将部分氨基酸序列转变为鼠CD40的氨基酸序列而制备了5个融合蛋白。对抗体与抗原的结合性进行了检测。制备突变CD40-FC融合蛋白的方法如下所述。通过将鼠CD40序列引入到可与抗体强烈结合的肽序列部分而制备突变位点。CD40mut1将第15个肽段的EFTE转变为ALEK，CD40mut2将第21个肽段的LDT转变为SAQ，CD40mut3将第24个肽段的TH转变为IR，CD40mut4将第42个肽段的EEGW转变为KEGQ，CD40mut5将的64个肽段的VSSA转变为QSSL。通过基因工程技术制备这些抗体(图2A、B和C)。分析结果表明，2105抗体极大地降低了与CD40mut1的结合能力。结果也表明，4D11抗体和2B11降低了与CD40mut2的结合能力。
实施例3抗CD40激动型抗体与Ramos细胞的结合活性将Ramos细胞系以浓度2×106/ml悬浮在含0.1％NaN3和2％FCS的PBS染色缓冲液(SB)中。将细胞悬浮液(100μl/孔)分配到96孔圆底平板(Becton，Dickinson and Company生产)中。加入杂交瘤培养上清(50μl)，并在冰上温孵30分钟。以针对人血清白蛋白的人IgG1抗体为阴性对照，将其在杂交瘤培养基中调整到浓度为2μg/ml，加样量为50μl，然后在冰上温孵15分钟。平板用SB洗涤后，加入50μl 250倍稀释的R-PE荧光标记抗人抗体(由SouthernBiotechnology Associates，Inc.生产)，然后在冰上温孵15分钟。平板用SB洗涤两次后，将其悬浮到300到500μl FACS缓冲液中，通过FACS(FACSort，FACScan，由Becton，Dickinson and Company生产)测定每种细胞的荧光强度。
实施例4抗CD40激动型抗体对Ramos细胞激动活性的评估将5.0×105cells/ml Ramos细胞悬浮液以100μl/孔接种到96孔板中。将杂交瘤培养上清或纯化的抗体在培养基中稀释到20μg/ml，然后将稀释液以100μl/孔的浓度加到96孔板中。过夜培养后，收获细胞，然后对细胞使用R-PE标记的抗CD95抗体(Pharmingen NJ)。通过FACScan或FACSsort(Becton，Dickinson and Company)进行分析。
实施例5抗CD40拮抗型抗体在Ramos细胞中对CD95表达的抑制将1.0×106cells/ml Ramos细胞悬浮液以50μl/孔接种到96孔板中。将杂交瘤培养上清或纯化的抗体在培养基中调整到2μg/ml，然后将培养基以100μl/孔加到96孔板中。向培养基中加入4μg/ml溶解性CD40配体(Alexis Corporation)及4μg/ml抗FLAG抗体(M2，Sigma)，然后将培养基以50μl/孔加到96孔板中。过夜培养后，收获细胞，然后对细胞使用R-PE标记的抗CD95抗体(Pharmingen NJ)。通过FACS进行分析。
实施例6抗CD40抗体CDC活性的测定在CDC检测中，相对于2,000个Cr51标记的靶细胞用总体积200μl终浓度为5％的来源于人血清的补体(由Sigma Co.生产)或来源于兔血清的补体(Cedarlane Laboratories Limited，Ontario，Canada)及各种浓度的抗体，于37℃，5％CO2下在圆底96孔板中培养2小时。
培养后，离心平板，使细胞沉淀，然后将50μL上清转移到含闪烁粉(LumaplateTM-96由Packard Instrument Co.，Inc.生产)的96孔板中，并在55℃干燥1.5小时。确定平板干燥后，在平板上覆盖一个特定的盖子(TopSealTM-A96孔板，由Packard Instrument Co.，Inc.生产)，用闪烁计数器(TopCount由Packard Instrument Co.，Inc.生产)测定γ-射线的剂量。
实施例7抗CD40抗体ADCC活性的测定对于抗体介导的细胞毒性作用，测定了存在具有杀伤活性的细胞，例如NK细胞或嗜中性粒细胞和抗体(抗体依赖的细胞毒性作用，以下为ADCC)时针对靶细胞的细胞毒性作用，及存在补体和抗体(补体依赖的细胞毒性作用，以下为CDC)时针对靶细胞的细胞毒性作用。以hIgG为对照。
测定方法简单描述如下。将放射性铬(Cr51)掺入到靶细胞的细胞质中，然后测定细胞死亡后释放到培养液中的Cr51的量作为γ-射线的剂量。
具体地，将105个Burkitt′s淋巴瘤细胞系的靶细胞Raji(ATCCCCL-86)悬浮到15μL胎牛血清(FCS)中。向悬浮液中加入50μL(37MBq/mL)Cr51标记的铬酸钠(由PerkinElmer，Inc.生产以下以Cr51表示)，将细胞在37℃培养1小时。然后加入10mL培养基，通过离心除去培养基。该操作步骤重复3次以除去未整合到细胞中的Cr51。
在ADCC检测中，将2,000个Cr51标记的靶细胞和由实施例6中所述方法获得的200,000个健康人外周血单核白细胞与各种浓度的抗体一起在圆底96孔板(由Falcon生产)中培养，总体积200μL，37℃，5％CO2培养4小时。
培养后，离心平板使细胞沉淀，然后将50μL上清转移到含闪烁粉(LumaplateTM-96由Packard Instrument Co.，Inc.生产)的96孔板中，并在55℃干燥1.5小时。确定平板干燥后，在平板上覆盖一个特定的盖子(TopSealTM-A96孔板，由Packard Instrument Co.，Inc.生产)，用闪烁计数器(TopCount由Packard Instrument Co.，Inc.生产)测定γ-射线的剂量。
实施例8抗CD40激动型抗体P331S突变体的制备和活性评估抗CD40激动型抗体KM341-1-19和2105的基因克隆如WO02/099186所述。已报道将IgG2恒定区331位的脯氨酸转变为丝氨酸可降低CDC活性。为了降低KM341-1-19抗体和2105抗体的CDC活性，在IgG2恒定区引入了P331S突变。
将抗体表达载体N5KG1-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals以下缩写为N5KG1)的人IgG1恒定区用人IgG2取代，制备N5KG2，然后将IgG2331位的Pro转变为Ser以制备突变体。根据说明书通过离心收获KM341-1-19杂交瘤，加入TRIZOL(Gibco BRL)提取总RNA，进行IgG2恒定区的cDNA克隆。用Clontech公司的SMART RACEcDNA扩增试剂盒根据说明书克隆抗体cDNA可变区。cDNA的第一条链用5μg总RNA为模板进行制备。以tnIgG3NheatatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC(SEQ ID NO2)G和tnIgG2BamatatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC(SEQ ID3)为引物序列，用ZtaqPCR试剂盒(Takara)进行PCR，进行30个循环，每个循环包括98℃1秒，55℃30秒，72℃1分钟以扩增基因。反应后，用QIAGEN PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化，然后用NheI和BamHI消化，并整合到N5KG1中以确定其序列。该载体命名为N5KG2。
如下制备N5KG2Ser(331位Pro转变为Ser)。以N5KG2为模板，IgG3NheatatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG(SEQ ID NO4)和G2Ser2GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC(SEQ ID NO5)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG2为模板，IgG2BamatatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC(SEQ ID NO6)和G2Ser1GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC(SEQ ID NO7)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物IgG3Nhe和IgG2Bam，并进行15次同样的反应。然后将扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体(N5KG2Ser)中的IgG1恒定区进行取代。将含用Bg1II和NheI消化的抗体可变区序列的片段整合到N5KG2Ser中。
评估通过上述方法表达和纯化的抗体对Ramos细胞的结合能力(图3A)和激动活性(图3B)。未观察到由于引入P331S突变而产生的活性变化。
实施例9抗CD40激动型抗体331ser突变体的CDC活性测定根据以上方法测定CDC活性。使用来源于兔血清的补体，以Ramos细胞为靶细胞。结果表明，在抗体浓度为1μg/ml的KM341-1-19抗体中，与IgG2相比较，IgG2ser的CDC活性极大降低(图4A)。另外，当使用人补体时，没有观察到变化(图4B)。
实施例10恒定区改变的激动型抗CD40抗体的制备和活性测定在WO 02/088186所述的抗CD40抗体中，有两个属于IgG2亚类的抗体具有很强的激动活性(KM341-1-19抗体和2105抗体)。为了检测IgG2亚类是否对激活CD40是重要的，分别制备了抗体恒定区改变为IgG1、IgG3和IgG4的重组蛋白，并根据实施例4和6测定了对抗原的结合能力及在Ramos细胞中增强CD95表达的活性。用N5KG1表达IgG1，用通过以IgG2和IgG3取代N5KG1恒定区而获得的表达载体N5KG2和N5KG3表达IgG2和IgG3。用IgG3特异的引物根据部分修改的IgG2克隆方法进行IgG3恒定区的cDNA克隆。用N5KG4PE(IDEC Pharmaceuticals)表达IgG4。
根据实施例1表达抗体蛋白。将IgG2转变为IgG1、IgG3或IgG4并不影响KM341-1-19抗体和2105抗体对表达人CD40的Ramos细胞的结合活性(图5A-1和5A-2)。但这些抗体在Ramos细胞中对促进CD 95表达增强的活性降低了10％或更多(图5B-1和5B-2)。这表明，不仅可变区的结构可确定抗体的结合区，抗体恒定区的结构在2105抗体和KM341-1-19抗体的强激动活性中也是重要的。因此，为了检测IgG2恒定区的哪个区对激动活性是重要的，制备了将IgG2结构与IgG4结构混合的结构域交换突变体，并测定其活性。如下所述，通过取代铰链区而制备结构域交换的突变体。在这种情况下，“铰链区”包括上部铰链(从Kabat EU编码216)、中部铰链(从Kabat EU编码226)和下部铰链(Kabat EU编码231)，如Ole H Brekke等人在ImmunologyToday 1995，16，85-90中所描述。分别制备了KM341-1-19抗体和2105抗体的4个结构域交换突变体IgG2/4(CH1和铰链区IgG2，其它区IgG4)，IgG4/2/4(铰链区IgG2，其它区IgG4)，IgG2/4/4(CH1IgG2，其它区IgG4)和IgG4/2/2(CH1IgG4，其它区IgG2)。
用Ztaq PCR试剂盒(Takara)制备表达IgG2/4抗体的载体N5KG2/4。以N5KG2为模板，IgG3BamatatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC(SEQ ID NO8)和24Chi4AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT(SEQ ID NO9)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG4(IDECPharmaceuticals)为模板，24Chi3AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT(SEQID NO10)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO11)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物IgG3Bam和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO12)，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
表达IgG4/2/4的载体N5KG4/2/4如下进行制备。以N5KG4为模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO13)、G2Hin3TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG(SEQ ID NO14)、linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO15)和G2Hin4ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG(SEQ ID NO16)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后以混合物为模板，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
表达IgG2/4/4的载体N5KG2/4/4如下进行制备。以N5KG2为模板，IinkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO17)和G4CH1-2GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG(SEQ ID NO18)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG4模板，G4CH1-1CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC(SEQ ID NO19)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO20)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
表达IgG4/2/2的载体N5KG4/2/2如下制备。以N5KG4为模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO21)和G4CH1-2GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG(SEQ ID NO22)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG2为模板，G4CH1-1CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC(SEQ ID NO23)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO24)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
测定KM341-1-19抗体和2105抗体4种结构域交换突变体的结合活性。结果表明，它们与原始的IgG2之间的结合活性没有差异(图6A-1和6A-2)。但只有KM341-1-19抗体和2105抗体的IgG2/4/4的激动活性极大降低(图6B-1和6B-2)。结果表明IgG2的铰链区对激动活性是非常重要的。
进一步检测了铰链区的哪段序列是重要的。将铰链区分为3个部位，具体地为上部铰链、中部铰链和下部铰链(Ole H Brekke等，Immunology Today 1995，16，85-90)。将这些区中IgG2特异的序列用IgG4特异的序列取代。通过在上部铰链(从Kabat EU code 216)、中部铰链(从Kabat EU code 226)和下部铰链(从Kabat EU code 231)引入突变而得到的抗体分别命名为IgG2UH4、IgG2MH4和IgG2LH4。它们各自的表达载体命名为N5KG2UH4、N5KG2MH4和N5KG2LH4。“铰链”根据Kabat等人在Sequences of proteins ofimmunological interest，1991 Fifth edition中所述定义为EU索引216到230。
N5KG2UH4制备如下。以N5KG2为模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO25)和UH4-2CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC(SEQ ID NO26)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG2为模板，UH4-1GGTGGACAAGAgAGTTGAGtccAAATGTTGTG(SEQ ID NO27)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO28)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
N5KG2MH4制备如下。以N5KG2为模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO29)和UM4-2GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC(SEQ ID NO30)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG2为模板，UM4-1GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC(SEQ ID NO31)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO32)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
N5KG2LH4制备如下。以N5KG2为模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO33)和UL4-2GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA(SEQ ID NO34)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。同时，以N5KG2为模板，UL4-1TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC(SEQ ID NO35)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO36)为引物进行反应，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反应进行15次。扩增的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化，并将两种纯化DNA片段进行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，进行5次反应。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并进行15次同样的反应。扩增的DNA片段用NheI和BamHI进行酶切，并用N5KG1载体中的IgG1恒定区进行取代。
其中检测到有3个KM341-1-19抗体和2105抗体的结构域交换突变体对抗原具有相同的结合活性(图6A-1和6A-2)。但IgG2UH4和IgG2MH4对Ramos细胞的激动活性极大降低(图6B-1和6B-2)。从上述结果发现，铰链区上部和中部铰链的结构对抗CD40抗体KM341-1-19和2105的IgG2亚类依赖性激动活性是非常重要的。
由于IgG2对激动活性是非常重要的，因此对将除IgG2外的其它亚类的抗体转变为IgG2亚类抗体后是否可以增强其激动活性进行了检测。检测几个克隆发现，F76的激动活性可通过将IgG1亚类转变为IgG2亚类而增强(图7A和B)。
实施例11抗CD40的拮抗型抗体突变体的制备将含如WO 02/088186所述的，来源于IgG1的4D11抗体重链和轻链的DNA片段用Bg1II和NheI消化、纯化并整合到N5KG4PE、N5KG4P和N5KG4载体(IDEC Pharmaceuticals)中。N5KG4PE在IgG4恒定区包含点突变S228P和L235E，而N5KG4P在IgG4恒定区包含点突变S228P。根据上述方法对抗体蛋白进行表达和纯化。根据上述方法以对Ramos细胞的结合为指标对抗体进行纯化。未观察到IgG1、IgG4、IgG4P和IgG4PE对Ramos细胞结合活性的变化(图8A)。根据上述方法比较IgG1与各种IgG4突变体的拮抗活性，结果发现，IgG1的拮抗活性与IgG4突变体的拮抗活性没有差异(图8B)。
实施例12抗CD40拮抗型抗体突变体ADCC活性和CDC活性的评估根据上述方法评估抗CD40突变抗体的ADCC活性和CDC活性。
当以人MNC细胞为效应细胞，表达CD40的Daudi细胞为靶细胞时，与作为4D11抗体原始亚类的IgG1相比较，有两个突变体IgG4和IgG4PE的ADCC活性极大降低(图9)。
以Daudi细胞为靶细胞，比较IgG1与IgG4P的CDC活性。结果发现，与IgG1相比，IgG4P的CDC活性极大降低(图10)。
实施例13抗CD40拮抗型抗体对B细胞的作用将100μg4D11抗体的IgG1、IgG4P和IgG4PE尾静脉施用于其遗传背景是鼠内源CD40破坏但具有人CD40基因的纯合子转基因鼠(Yasui.等，Int.Immunol.2002 Vol 14319)。施用24小时后，从眼窝静脉血管丛收集血液。用0.16mol/L氯化铵溶血后，向溶血裂解物中加入FITC-标记的抗B220抗体，并用FACS进行分析。结果如图11所示。在图中，纵轴表示B细胞在总淋巴细胞中的比例。IgG1可最大程度降低B细胞的比例，IgG4P降低的比例较小，而IgG4PE降低的比例更小。施用24小时后，切除脾，用载玻片压碎，制备细胞悬浮液。对细胞悬浮液溶血后，对溶血裂解物使用PE-标记的抗B220抗体和FITC-标记的抗CD23、CD86或CD95抗体，并用FACS进行分析。结果如图12A、B和C所示。在图中，纵坐标表示表达表面标志物的B细胞在总淋巴细胞中的比例。结果表明，4D11G1可达到与商品化的鼠抗人CD40激动型抗体5C3(Pharmingen)相同水平的增加每种标志物表达的能力。与IgG1和IgG4P相比较，IgG4PE对激活表面标志物表达的增加较小。
实施例14抗CD40拮抗型抗体对抑制抗原特异的抗体产生和B细胞数目改变方面的作用将100μg(基于NP-CGG)4-羟基-3-硝基苯乙酰基-鸡γ-球蛋白结合物(NP-CGG由Hitoshi KIKUTANI教授提供，Research Institute forMicrobial Diseases，Osaka University)和明矾的复合体通过腹膜内施用于其遗传背景是鼠内源CD40破坏但具有人CD40基因的纯合子转基因鼠(Yasui.等，Int.Immunol.2002 Vol 14319)，使鼠致敏。在用抗原致敏前，通过尾静脉施用50或100μg抗体。施用100μg抗人白蛋白的人IgG4PE抗体作为对照。致敏7和14天后，从眼窝静脉血管丛收集血液。通过ELISA方法测定血清中NP特异的IgG1和IgM抗体的量。ELISA方法如下进行。将50μl/孔结合NP的牛血清白蛋白(NP-BSA2.5μg/ml)加到用于ELISA测定的96微孔板(Maxisorp，由Nunc A/S生产)的孔中，并在4℃温育，以使NP-BSA吸附在其上。然后除去上清，向每个孔中加入封闭试剂(SuperBlock，由PierceBiotechnology，Inc.生产)，在室温下温育，进行封闭。然后用含0.1％Tween 20的磷酸缓冲液(PBS-T)洗涤孔3次。然后向孔中加入用含10％Block Ace(50μl/孔)的PBS-T稀释的血清，在37℃温育反应2小时。将微孔板用PBS-T洗涤3次。然后向孔中加入碱性磷酸酶(CosmoBio，1070-04 or 1020-04)标记的1,000倍稀释的羊抗鼠IgG1抗体或IgM抗体及含10％Block Ace的PBS-T(50μg/孔)，37℃温育2小时。然后用PBS-T洗涤微孔板，然后向孔中加入显色底物溶液(50μl/孔，Sigma 104，磷酸酶底物)。用微孔板读数仪测定波长405nm处的吸收值。结果如图13A和B所示。在图中，纵坐标表示将从C57BL/6鼠收集的10,000倍稀释(对IgG1而言)或100倍稀释(对IgM抗体而言)的血清转换为注射2次1个单位NP-CGG的血清而得到的值。4D11抗体和281的IgG4P或IgG4PE抗体可同等程度抑制NP特异的IgG1和IgM抗体的产生。
根据与实施例1中相同的方法测定鼠外周血和脾中B细胞数目的变化，检测对产生抗体的抑制作用。结果如图14A和B所示。与IgG4PE抗体相比较，4D11抗体和281的IgG4P抗体可显著降低外周血中B细胞的比例。在抗原致敏14天后，施用100μg IgG4PE抗体并不改变脾中B细胞的数目。但施用IgG4P可改变或倾向于改变该比例。
实施例15抗CD40拮抗型抗体对猕猴的作用对猕猴前臂-头静脉施用30mg/kg 4D11抗体的IgG4P或IgG4PE，一定时间后从股静脉收集血液。在外周血淋巴细胞的亚类分析中，对细胞悬浮液使用了FITC-标记的抗CD3抗体、PE-标记的抗CD20抗体和APC-标记的抗CD45抗体，用FACS测定阳性细胞的比例，从而计算CD45阳性细胞的比例。结果如图15所示。在图中，纵坐标表示每个时间点CD20阳性细胞与抗体施用前CD20阳性细胞的比例。在单独施用IgG4P抗体1到7天后，CD20阳性细胞在个体中降低约40％。但单独施用IgG4PE抗体4天后，CD20阳性细胞仅降低20％。
通过ELISA方法测定血清中IL12的浓度。从股动脉收集血液，在室温下放置20到60分钟，然后3,000rpm，室温下离心15分钟。通过猴IL12 ELISA试剂盒(BioSource International Inc.)测定所得血清中的IL12浓度。结果如图16所示。在任何采血时间点都没有观察到由IgG4PE抗体引起的IL-12产生的增加。但由IgG4P抗体引起的IL12在第四天产生最大值。
实施例16抗CD40拮抗型抗体对猕猴迟发型超敏反应模型的作用用破伤风类毒素(TTx)(10Lf/ml；Denka Seiken Co.，Ltd.)对9只雄性猕猴进行皮内或肌肉内刺激，以诱导对TTx的迟发型超敏反应。同时，在致敏开始前10分钟，对每3只动物静脉内施用0.1和10mg/kg 4D11G4PE抗体3次(每周一次)，以检测4D11G4PE对迟发型超敏反应的作用。在肌肉内施用氯胺酮进行麻醉后，通过皮内对背部施用TTx(50μL/位点×12位点)，并对股骨肌肉内施用TTx(0.6mL/身体)进行致敏反应，在致敏21天后，通过对胸腔皮内施用TTx(10μL/位点，对每3个位点施用0到10Lf/ml)进行激发。在激发24和48小时后，观察施用部位的皮肤反应，并根据Draize皮肤过敏评分标准进行评估。每3个位点测定的TTx浓度结果为一个平均值。结果如图17所示。施用4D11G4PE抗体24和48小时后，可显著抑制迟发型超敏反应。
检测了TTx对TTx特异的IgG和IgM抗体的作用。在不同时间从股骨静脉采血，并在室温放置20到60分钟，然后在室温下3,000rpm离心15分钟。通过ELISA方法测定所得血清的抗体效价。ELISA方法如下进行。将100μl/孔的TTx(0.5Lf/ml)加到用于ELISA测定的96微孔板(Maxisorp，由Nunc A/S生产)的孔中，并在4℃温育，以使TTx吸附于其上。然后除去上清，向孔中加入封闭试剂(含0.5％BSA的磷酸缓冲液)，在室温下温育进行封闭。然后用含0.05％Tween 20的磷酸缓冲液(PBS-T)洗涤孔3次。然后向孔中加入用含0.5％BSA的PBS-T稀释的血清(100到819，200倍稀释，稀释放大率2；100μl/孔)，在室温下反应2小时。微孔板用PBS-T洗涤3次。然后向孔中加入过氧化物酶标记的3,000倍稀释的羊抗猴IgG抗体或IgM抗体(Nordic Immunology)和含0.5％BSA(100μg/孔)的PBS-T，室温下温育1小时。然后用PBS-T洗涤微孔板，然后向孔中加入显色底物溶液(100μl/孔，o-盐酸苯二胺+过氧化氢水溶液)。用微孔板读数仪测定492nm波长处的吸收值。抗TTx抗体效价定义为使吸收值为0.1或更高时的最大稀释倍数。当吸收值甚至在100倍稀释仍不能达到0.1时，则抗体的效价为0。结果如图18和19所示。施用1mg/kg 4D11G4PE可抑制TTx特异的IgG和IgM抗体效价约为1/10。当施用10mg/kg4D11G4PE时，抗体效价在任何采血点都在检测灵敏度之下。
实施例17抗CD40拮抗型抗体对血小板血栓形成的影响将从健康人体收集的血液分为4份(每份6ml)。向每份分别加入对照人IgG4PE、对照鼠IgG2a、人抗人CD40IgG4PE(4D11)和鼠抗人CD154 IgG2a(5C8)，使每份的血液浓度为100μg/ml。根据说明书组装扁平灌注室(GlycoTech Corp.)和包被胶原的Petri培养皿。将用各种抗体处理的血液以对血液的剪切力为1,500/s的速度经过7分钟流到灌注室中。然后，将4％多聚甲醛磷酸缓冲液以对缓冲液的剪切力为1,500/s的速度经过10分钟流到灌注室中。将在Petri培养皿上形成的血小板凝集固定、用血小板特异的PE-标记的CD41a抗体染色，并用荧光显微镜进行观察。结果如图20A和B所示。用人抗人CD40IgG4PE(4D11)处理的血液和用对照抗体处理的血液一样可在包被胶原的Petri培养皿上形成血小板凝集。但用鼠抗人CD154 IgG2a处理的血液不形成血小板凝集。
实施例18抗CD40拮抗型抗体稳定性的评估对4D11抗体恒定区修饰抗体的稳定性进行了比较和检测。在评估方法中，将瞬时表达G4P、G4PE、G2Ser和G4/2/4的HEK293细胞培养液上清通过蛋白质A柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并用0.1M柠檬酸缓冲液(pH 2.7)进行洗脱，然后在37℃温育1分钟和10分钟。然后用50nM磷酸缓冲液(pH 7.0)进行中和。通过凝胶过滤柱(Tosoh Corp.)测定所得抗体溶液中寡聚体的含量。结果表明，寡聚体含量随着温育时间的增加而增加，G4/2/4最容易产生寡聚体，G4PE次之，G2Ser第三，而G4P第四(图21)。
实施例19抗CD40拮抗型抗体对抑制皮肤移植排斥的作用将DBA/2鼠尾部的皮肤移植到其遗传背景是鼠内源CD40破坏但具有人CD40基因的纯合子转基因鼠C57BL/6的胸腔侧背面，并用石膏对移植的皮肤固定7天。在皮肤移植0、2、4、7、9、11和14天后，将100μg待测底物4D11G4PE或载体进行尾静脉给药。为了抑制NK细胞的移植排斥作用，在操作前3天和操作后第1、4和9天对所有鼠腹膜内施用100μg抗asialo GML抗体。结果如图22所示。与施用载体的组相比较，施用4D11G4PE组的移植排斥有明显的延迟。
实施例20CD40在人肿瘤细胞系中表达的分析用341G2Ser通过FACS分析来验证CD40在Burkitt′s淋巴瘤细胞系Ramos、膀胱癌细胞系T24(ATCC，HTB-4)、胰腺癌细胞系Hs 766T(ATCC，HTB-134)和Capan-2(ATCC，HTB-80)中的表达。
用胰蛋白酶消化T24、Hs 766T和Capan-2并收获细胞，Ramos同样进行收获。用PBS洗涤细胞系，然后重悬到含1μg/ml 341G2Se的染色缓冲液中。染色缓冲液是通过向PBS中加入0.05mM EDTA、0.05％叠氮化钠和5％固定化的牛血清而得到的。在4℃温育15分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞2次，然后重悬到用染色缓冲液进行1∶250稀释的PE-结合的羊抗人IgG(γ)(Southern Biotechnology Associates，Inc)稀释液中。在4℃温育15分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞2次，然后用FACSCalibur(由BD Biosciences生产)进行分析。以相同量的人抗-2，4-二硝基苯酚(DNP)抗体为阴性对照。用Cellquest(由BDBiosciences生产)数据分析软件计算平均荧光强度进行分析。
结果表明，当用341G2Ser染色时，Ramos、T24、Hs766T和Capan-2的平均荧光强度明显高于阴性对照，从而验证了CD40的表达。
实施例21抗CD40激动型抗体对人肿瘤细胞系的作用分别将2.5×103个Ramos细胞，2.5×102个T24细胞，5×103个Hs766T细胞和5×103个Capan-2细胞悬浮在培养基中，使其在圆底96孔板(由Falcon生产)中总体积为100μL。将Ramos和Hs766T、Capan-2和T24与浓度为1ng/ml到1,000ng/ml的341G2Ser一起在37℃，5％CO2下培养66小时、90小时和114小时。加入10μL(3.7MBq/mL)3H-标记的胸腺嘧啶(由Amersham Biosciences生产)，并在37℃，5％CO2下培养6小时。在Printed Filtermat A(由PerkinElmer，Inc.生产)上用96微孔板收获器(由Skatron Instruments，Inc.生产)收获Ramos细胞，并用样品袋(由PerkinElmer，Inc.生产)覆盖。加入12mL Betaplate Scint(由PerkinElmer，Inc.生产)，然后用液体闪烁计数器(Pharmacia 1205 Betaplate由Pharmacia Corp.生产)测定β-射线的剂量。用收获器(由PerkinElmer，Inc.生产)在过滤型微孔板(由PerkinElmer，Inc.生产)上分别收获Hs 766T细胞、T24细胞和Capan-2细胞。将特定的封条贴在过滤器背面，然后向其中加入20μL/孔MicroScint 20(由PerkinElmer，Inc.生产)。用闪烁计数器(TopCount由Packard Instrument Co.，Inc.生产)测定β-射线的剂量。数据以三次独立实验中获得的三次测量的平均值除以非处理对照的值而获得的细胞存活率(％)来表示。
结果表明，在所有细胞系中，细胞存活率都随341G2Ser的浓度而降低(表1)。当加入100ng/ml 341G2Ser时，Ramos细胞的存活率为58％，T24细胞的存活率为22％，Hs 766T细胞的存活率为15％，Capan-2细胞的存活率为77％。结果表明341G2Ser具有抑制Ramos细胞、T24细胞、Hs 766T细胞和Capan-2细胞生长的活性。
表1细胞存活率

实施例22抗CD40激动型抗体对患癌鼠模型的作用(1)Ramos细胞用3Gy射线照射6周龄雌Balb/c裸鼠(购自CLEA Japan，Inc.)，并将2×107cells/鼠的Ramos细胞皮下移植到其背部。移植16天后，测定该处的肿瘤体积。将肿瘤大小为50到170mm3的患癌鼠划为一组，每组包括5只鼠。在第16天用100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)对患癌鼠静脉内施用1次，并在第47天测定肿瘤大小。以人抗人血清白蛋白(HAS)抗体为阴性对照。
(2)T24细胞除去3次皮下植入裸鼠背部的T24细胞块，并将其皮下移植到6周龄雌Balb/c裸鼠(购自CLEA Japan，Inc。)背部。移植的肿瘤块约为3平方毫米。移植10天后，测定移植的肿瘤的体积。将肿瘤大小为80到200mm3的患癌鼠划分为一组，每组包括5只鼠。在第10天用100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)对患癌鼠静脉内施用1次，并在第29天测定肿瘤大小。以人抗DNP抗体为阴性对照。
(3)Hs 766T细胞将7×105cells/鼠的Hs 766T细胞皮下移植到6周龄雌Balb/c裸鼠(购自CLEA Japan，Inc.)背部。移植16天后，测定移植肿瘤的大小。将肿瘤大小为50到140mm3的患癌鼠划分为一组，每组包括5只鼠。在第16天用100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)对患癌鼠静脉内施用1次，并在第32天测定肿瘤大小。以人抗DNP抗体为阴性对照。
(4)Capan-2细胞将2×106cells/鼠的Capan-2细胞皮下移植到6周龄雌Balb/c裸鼠(购自CLEA Japan，Inc.)背部。移植13天后，测定移植肿瘤的大小。将肿瘤大小为30到130mm3的患癌鼠划分为一组，每组包括5只鼠。从第13天用10或100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)对患癌鼠进行静脉内施用，每周两次，并在第34天测定肿瘤大小。以人多克隆抗体(hIgG)(由Sigma Co.生产)为阴性对照。
通过以下公式计算肿瘤生长抑制率(TGIR)。
100-[{(施用341G2Ser组在最后测量日的平均肿瘤体积-施用341G2Ser组在开始施用抗体时的平均肿瘤体积)/(施用阴性对照组在最后测量日的平均肿瘤体积-施用阴性对照组在开始施用抗体时的平均肿瘤体积)}×100]结果表明，T24、Hs766T和Capan-2患癌鼠中的TGIR超过100％，并在鼠中观察到肿瘤体积的减小。另一方面，Ramos患癌鼠中的TGIR为73.4％，肿瘤体积在鼠中的增加受到相当抑制(表2)。图23到26分别表示的是在移植了Ramos细胞、T24细胞、Hs 766T细胞和Capan-2细胞的患癌鼠中肿瘤体积的变化。
表2肿瘤生长抑制率

细胞系的抑制率是最后测量日的值。
工业应用如实施例所述，本发明的抗CD40抗体在恒定区引入突变，使抗CD40抗体亚类的部分结构被另一亚类取代，从而降低了ADCC活性和CDC活性，但保持其活性。因此，本发明的抗体在作为治疗性抗体向患者施用时可降低对表达CD40的细胞的细胞毒性作用，从而具有安全性。
本申请所引用的所有出版物，专利和专利申请均全部并入本申请作为参考。
序列表说明SEQ ID NOS2到36合成的DNASEQ ID NOS49到130合成的肽序列表<110>KIRIN BEER KABUSIKI KAISHA<120>抗CD40抗体突变体<130>PH-2356-PCT<140>
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<150>JP 2003-431408<151>2003-12-25<160>142<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>175<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln1 5 10 15Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr20 25 30Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu35 40 45Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp50 55 60Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp65 70 75 80Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys85 90 95Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys100 105 110Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val115 120 125Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp130 135 140Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn145 150 155 160Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg Ala Leu165 170 175<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser1 5 10<210>51<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成肽<400>96Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro1 5 10<210>97<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr210 215 220Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val225 230 235 240Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val245 250 255Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser275 280 285His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr305 310 315 320Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro405 410 415Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu450 455 460Ser Pro Gly Lys465<210>137<211>702<212>DNA<213>人<400>137atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240
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50 55 60Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr65 70 75 80Lys Ser Gly Ser Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr85 90 95Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser100 105 110Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Val Val115 120 125Arg Tyr Phe Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr130 135 140Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro145 150 155 160Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val165 170 175Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala180 185 190Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly195 200 205Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly210 215 220Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys225 230 235 240Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys245 250 255Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro260 265 270Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys275 280 285Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp290 295 300Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu325 330 335His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn340 345 350Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly355 360 365Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu370 375 380Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr385 390 395 400Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe420 425 430Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys465 470<210>141<211>708<212>DNA<213>人<400>141atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggcttctgc tgctctggct cccaggtgcc 60agatgtgcca tccagttgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagcagtg ctttagcctg gtatcagcag 180aaaccaggga aagctcctaa gctcctgatc tatgatgcct ccaatttgga aagtggggtc 240ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300cagcctgaag attttgcaac ttattactgt caacagttta atagttaccc gacgttcggc 360caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttga 708<210>142<211>235<212>PRT<213>人<400>142Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val65 70 75 80Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110Phe Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu130 135 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 23权利要求
1.具有激动活性、与CD40结合的单克隆抗体的重链，其中所述重链包括来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链，及具有至少一个氨基酸缺失或取代，或至少添加一个氨基酸的恒定区，所述的缺失、取代或添加可提高或降低ADCC和/或CDC。
2.如权利要求1所述的重链，其中，所述的恒定区来源于人IgG。
3.如权利要求2所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG1。
4.如权利要求2所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG2。
5.如权利要求2所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG3。
6.如权利要求2所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG4。
7.如权利要求3到5任何一项中所述的重链，其中，所述的恒定区中的氨基酸取代是用丝氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的331位的脯氨酸。
8.包括权利要求1到7任何一项中所述的重链的单克隆抗体。
9.如权利要求1到7任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括来自由保藏号为FERM BP-7759的杂交瘤KM341-1-19产生的单克隆抗体的重链可变区。
10.由如权利要求9所述的重链和下述轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链包含来自由保藏号为FERM BP-7759的杂交瘤KM341-1-19产生的单克隆抗体的轻链可变区。
11.如权利要求1到7任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括SEQ ID NO38所示的多肽的可变区。
12.由如权利要求11所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中，所述的轻链包括SEQ ID NO40所示的多肽的可变区。
13.如权利要求1所述的重链，其中，所述的重链由从SEQ ID NO132所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
14.由如权利要求13所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中，所述的轻链由从SEQ ID NO134所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
15.如权利要求1所述的重链，其中，所述的重链由包含具有SEQID NO131所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生。
16.如权利要求8所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体由包含具有SEQ ID NO131所示的多核苷酸和SEQ ID NO133所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生。
17.如权利要求1到7任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括来自由保藏号为FERM BP-8024的杂交瘤2105产生的单克隆抗体的重链的可变区。
18.由如权利要求17所述的重链和轻链组成的单克隆抗体，其中所述轻链包含来自由保藏号为FERM BP-8024的杂交瘤2105产生的单克隆抗体的轻链的可变区。
19.如权利要求1到7任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括SEQ ID NO42所示的多肽的可变区。
20.由如权利要求19所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中，所述的轻链包括SEQ ID NO44所示的多肽的可变区。
21.如权利要求1所述的重链，其中，所述的重链由从SEQ ID NO136所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
22.由如权利要求21所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中，所述的轻链由从SEQ ID NO138所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
23.如权利要求1所述的重链，其中，所述的重链由包含具有SEQID NO135所示多核苷酸的表达载体的宿主产生。
24.如权利要求8所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体由包含具有SEQ ID NO135所示的多核苷酸和SEQ ID NO137所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生。
25.由SEQ ID NO131所示的多核苷酸。
26.由SEQ ID NO133所示的多核苷酸。
27.具有如权利要求25所述的多核苷酸的表达载体。
28.具有如权利要求26所述的多核苷酸的表达载体。
29.具有如权利要求25和26所述的多核苷酸的表达载体。
30.包含如权利要求27所述的表达载体的宿主。
31.包含如权利要求28所述的表达载体的宿主。
32.包含如权利要求29所述的表达载体的宿主。
33.产生单克隆抗体重链的方法，其包括以下步骤在培养基中培养如权利要求30所述的宿主；从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体的重链。
34.产生单克隆抗体的方法，其包括以下步骤在培养基中培养如权利要求32所述的宿主；从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体。
35.由SEQ ID NO135所示的多核苷酸。
36.由SEQ ID NO137所示的多核苷酸。
37.具有如权利要求35所述的多核苷酸的表达载体。
38.具有如权利要求36所述的多核苷酸的表达载体。
39.具有如权利要求35和36所述的多核苷酸的表达载体。
40.包含如权利要求37所述的表达载体的宿主。
41.包含如权利要求38所述的表达载体的宿主。
42.包含如权利要求39所述的表达载体的宿主。
43.产生单克隆抗体重链的方法，其包括以下步骤在培养基中培养如权利要求40所述的宿主；从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体的重链。
44.产生单克隆抗体的方法，其包括以下步骤在培养基中培养如权利要求42所述的宿主；从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体。
45.产生具有激动活性、能与CD40结合的单克隆抗体重链的方法，其包括用来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链分别取代上部铰链和中部铰链不是来源于人IgG2的抗体的上部铰链和中部铰链的步骤。
46.产生包含可变区和来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链的单克隆抗体重链的方法，其包括鉴定来源于能与CD40结合的单克隆抗体重链，并能形成可变区的多肽的步骤。
47.产生具有激动活性、能与CD40结合的单克隆抗体的方法，其包括用来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链分别取代上部铰链和中部铰链不是来源于人IgG2的抗体的上部铰链和中部铰链的步骤。
48.产生包含可变区及来源于人IgG2的上部铰链和中部铰链的单克隆抗体的方法，其包括鉴定来源于能与CD40结合的单克隆抗体重链，并能形成可变区的多肽的步骤。
49.包括如权利要求8、10、12、14、16、18、20、22和24任何一项中所述的单克隆抗体为活性成分的药物组合物。
50.如权利要求49所述的药物组合物，其用于治疗或预防恶性肿瘤、病原体或自免疫疾病。
51.治疗或预防恶性肿瘤、病原体或自免疫疾病的方法，其包括对哺乳动物施用如权利要求49所述的药物组合物。
52.如权利要求8、10、12、14、16、18、20、22和24任何一项中所述的单克隆抗体在生产用于治疗或预防恶性肿瘤、病原体或自免疫疾病的药物组合物中的用途。
53.具有拮抗活性、与CD40结合的单克隆抗体的重链，其中，所述的重链包括至少具有一个氨基酸缺失或取代，或至少添加一个氨基酸的恒定区，所述的缺失、取代或添加可提高或降低ADCC和/或CDC。
54.如权利要求53所述的重链，其中，所述的恒定区来源于人IgG。
55.如权利要求54所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG1。
56.如权利要求54所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG2。
57.如权利要求54所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG3。
58.如权利要求54所述的重链，其中，所述的人IgG是人IgG4。
59.如权利要求55、57和58任何一项中所述的重链，其中，所述的恒定区中的氨基酸取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
60.如权利要求53到59任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括至少具有一个氨基酸缺失或取代，或至少添加一个氨基酸的恒定区，所述的缺失、取代或添加可促进重链间S-S键的形成。
61.如权利要求60所述的抗体重链，其中，所述的恒定区中的氨基酸取代是用脯氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的228位的丝氨酸。
62.包括权利要求53到61任何一项中所述的重链的单克隆抗体。
63.如权利要求53到61任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括由保藏号为FERM BP-7758的杂交瘤4D11产生的单克隆抗体的重链的可变区。
64.包含如权利要求63所述的重链和下述轻链的单克隆抗体，所述轻链包含由保藏号为FERM BP-7758的杂交瘤4D11产生的单克隆抗体轻链可变区。
65.如权利要求53到61任何一项中所述的重链，其中，所述的重链包括SEQ ID NO46所示的多肽的可变区。
66.由如权利要求65所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中，所述的轻链包含SEQ ID NO48所示的多肽的可变区。
67.如权利要求53所述的重链，其中，所述的重链由从SEQ ID NO140所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
68.由如权利要求67所述的重链和单克隆抗体轻链组成的单克隆抗体，其中，所述的轻链由从SEQ ID NO142所示的多肽中除去信号肽序列后所余部分组成。
69.如权利要求53所述的重链，其中，所述的重链由包含具有SEQID NO139所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生。
70.如权利要求62所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体由包含具有SEQ ID NO139所示的多核苷酸和SEQ ID NO141所示的多核苷酸的表达载体的宿主产生。
71.由SEQ ID NO139所示的多核苷酸。
72.由SEQ ID NO141所示的多核苷酸。
73.具有如权利要求71所述的多核苷酸的表达载体。
74.具有如权利要求72所述的多核苷酸的表达载体。
75.具有如权利要求71和72所述的多核苷酸的表达载体。
76.包含如权利要求73所述的表达载体的宿主。
77.包含如权利要求74所述的表达载体的宿主。
78.包含如权利要求75所述的表达载体的宿主。
79.产生单克隆抗体重链的方法，其包括以下步骤在培养基中培养如权利要求76所述的宿主；从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体的重链。
80.产生单克隆抗体的方法，其包括以下步骤在培养基中培养如权利要求78所述的宿主；从培养物和/或宿主中获得单克隆抗体。
81.包括如权利要求62、64、66、68、和70任何一项中所述的单克隆抗体为活性成分的药物组合物。
82.如权利要求81所述的药物组合物，用于治疗或预防移植排斥、自免疫疾病、变态反应或凝血因子VIII抑制。
83.治疗或预防移植排斥、自免疫疾病、变态反应或凝血因子VIII抑制的方法，其包括对哺乳动物施用如权利要求81所述的药物组合物。
84.如权利要求62、64、66、68、和70任何一项中所述的单克隆抗体在生产用于治疗或预防移植排斥、自免疫疾病、变态反应或凝血因子VIII抑制的药物组合物中的用途。
85.产生与CD40结合、具有拮抗活性但激动活性降低的单克隆抗体重链的方法，其包括在人抗体重链恒定区进行至少一个氨基酸的缺失或取代、或至少添加一个氨基酸的方法。
86.如权利要求85所述的方法，其中恒定区来源于人IgG。
87.如权利要求86所述的方法，其中人IgG是人IgG4。
88.如权利要求85到87任何一项中所述的方法，其中，所述的恒定区中的氨基酸取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
89.从SEQ ID NO131所示的多核苷酸中除去编码信号序列部分后的多核苷酸。
90.由从SEQ ID NO133所示的多核苷酸中除去编码信号序列部分后的多核苷酸。
91.由从SEQ ID NO135所示的多核苷酸中除去编码信号序列部分后的多核苷酸。
92.由从SEQ ID NO137所示的多核苷酸中除去编码信号序列部分后的多核苷酸。
93.由从SEQ ID NO139所示的多核苷酸中除去编码信号序列部分后的多核苷酸。
94.由从SEQ ID NO141所示的多核苷酸中除去编码信号序列部分后的多核苷酸。
全文摘要
提供了一种具有治疗前景的抗CD40抗体突变体，该突变体具有设计为适于作为药物制剂的降低的ADCC和CDC活性。一种激动型抗CD40抗体突变体，包括在恒定区至少含有一个氨基酸突变和/或取代，以降低其ADCC和/CDC活性，及一种拮抗型抗CD40抗体突变体，包括在恒定区至少含有一个突变和/或取代，以降低其ADCC和/CDC活性，这两种抗体均具有至少一个来源于人IgG2的铰链区。
文档编号A61K39/395GK1922316SQ20048004210
公开日2007年2月28日 申请日期2004年12月24日 优先权日2003年12月25日
发明者高桥信明, 三浦彻, 北川义康, 平野亚树 申请人:麒麟麦酒株式会社