Crf受体拮抗剂及其相关方法

专利名称：Crf受体拮抗剂及其相关方法
技术领域：
概括地说，本发明涉及CRF受体拮抗剂以及通过向有需要的哺乳动物给药这类拮抗剂来治疗疾病的方法。
背景技术：
第一种促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是由羊下丘脑分离的，并经鉴定为41-氨基酸肽(Vale等人，Science 2131394-1397，1981)。此后分离了人和大鼠的CRF序列，经测定它们是相同的，但是在其41个氨基酸残基中有7个不同于羊的CRF(Rivier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804851，1983；Shibahara等人，EMBO J.2775，1983)。
已发现CRF可引起内分泌、神经和免疫系统功能发生重要转变。据信CRF是由垂体前叶基础性(basal)和应激性释放促肾上腺皮质激素(“ACTH”)、β-内啡肽和其它阿片黑皮质素前体(″POMC″)衍生肽的主要生理调节剂(Vale等人，Science 2131394-1397，1981)。简而言之，据信CRF通过结合一种广泛分布于大脑(DeSouza等人，Science 2241449-1451，1984)、垂体(DeSouza等人，Methods Enzymol.124560，1986；Wynn等人，Biochem. Biophys. Res.Comm.110602-608，1983)、肾上腺(Udelsman等人，Nature 319147-150，1986)和脾(Webster，E.L.，和E.B. DeSouza，Endocrinology 122609-617，1988)中的质膜受体而启动其生物学效应。CRF受体与一种GTP-结合性蛋白质偶联(Perrin等，Endocrinology 1181171-1179，1986)，后者介导CRF-刺激的细胞内cAMP产生的增加(Bilezikjian，L.M.和W.W.Vale，Endocrinology 113657-662，1983)。现已从大鼠(Perrin等，Endol 33(6)3058-3061，1993)和人脑(Chen等，PNAS 90(19)8967-8971，1993；Vita等，FEBS 335(1)1-5，1993)克隆了CRF的受体。这种受体是一种具有415个氨基酸的蛋白质，其中包含七个跨膜结构域。大鼠与人序列之间的同一性比较表明它们在氨基酸水平上具有高度的同源性(97％)。
除了在刺激ACTH和POMC的生成中具有作用外，据信CRF还可以协调很多针对应激的内分泌、自主(autonomic)与行为反应(behavioralresponses)，因而可能涉及感情失常的病理生理学。此外，据信CRF在免疫、中枢神经、内分泌以及心血管系统之间的联系中是一种关键的媒介(Crofford等人，J.Clin.Invest.902555-2564，1992；Sapolsky等人，Science 238522-524，1987；Tilders等人，Regul.Peptides 577-84，1982)。总之，CRF似乎是关键性的中枢神经系统神经递质之一，在整合机体对应激的总体反应中具有决定性作用。
直接向大脑施用CRF所引起的行为、生理和内分泌反应与暴露在应激环境下的动物所观察到的反应相同。例如，向脑室内注射CRF导致行为活化(Sutton等人，Nature 297331，1982)、脑电图出现持续活化(Ehlers等人，Brain Res.278332，1983)、交感肾上腺髓质途径受到刺激(Brown等人，Endocrinology 110928，1982)、心率和血压升高(Fisher等人，Endocrinology1102222，1982)、氧消耗增加(Brown等人，Life Sciences 30207，1982)、胃肠活动改变(Williams等人，Am.J.Physiol.253G582，1987)、食物消耗受到抑制(Levine等人，Neuropharmacology 22337，1983)、性行为改变(Sirinathsinghji等人，Nature 305232，1983)、以及免疫功能受到损害(Irwin等人，Am.J.Physiol.255R744，1988)。此外临床数据表明，在抑郁症、焦虑相关疾病、和神经性厌食症中，大脑可能过度分泌CRF(DeSouza，Ann.Reports in Med.Chem.25215-223，1990)。因此，临床数据表明，CRF受体拮抗剂可能代表了一类新颖的抗抑郁症和/或抗焦虑药物，可用于治疗表现为CRF过度分泌的神经精神病样疾病(neuropsychiatric disorders)。
第一代CRF受体拮抗剂是肽类(参见例如Rivier等人，美国专利号4,605,642；Rivier等人，Science 224889，1984)。尽管这类肽证明CRF受体拮抗剂确实能够削弱对CRF的药理反应，但是肽类CRF受体拮抗剂仍然具有肽治疗剂的普遍缺点，即包括缺乏稳定性以及有限的口服活性。某些已公开的专利文献包括US6313124、WO 01/23388、和WO 97/29109均公开了作为CRF拮抗剂的吡唑并嘧啶化合物。已公开的申请WO 98/54093描述了某些作为酪氨酸激酶抑制剂的吡唑并嘧啶化合物。
由于CRF具有上述生理学意义，因此开发具有显著的CRF受体结合活性并且能够拮抗CRF受体的生物活性小分子仍然是期望的目标。这类CRF受体拮抗剂将可用于治疗内分泌、精神病样与神经病样病症或疾病，一般包括应激相关的病症。
尽管通过施用CRF受体拮抗剂已经在实现CRF调节方面取得了显著的进步，但是本领域仍然需要有效的小分子CRF受体拮抗剂。同样也需要含有这类CRF受体拮抗剂的药物组合物，以及涉及其使用方法，例如用于治疗应激相关的病症。本发明完成了这些需要，还提供了其它相关的优势。
发明概述简而言之，本发明一般性涉及CRF受体拮抗剂，更具体涉及具有下述通式结构(I)的CRF受体拮抗剂 及其可药用盐、酯、溶剂化物、立体异构体和前药，其中R1、R2、R3、Y、Ar和Het定义如下。
本发明的CRF受体拮抗剂具有广泛的治疗应用，可用于治疗各种病症或疾病，包括应激相关的病症。这类方法包括向有该需要的动物给药药学上有效量的本发明CRF受体拮抗剂，优选为药物组合物的形式。因此，在另一实施方案中公开了含有一种或多种本发明CRF受体拮抗剂和可药用载体和/或稀释剂的药物组合物。
参照下面的详细描述，本发明上述以及其它方面将是显而易见的。最后，本文列举了多份不同参考文献，它们更详细地描述了某些方法、化合物和/或组合物，在此将其全部内容引入作为参考。
发明详述本发明一般性地涉及促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)受体拮抗剂。在第一个实施方案中，本发明的CRF受体拮抗剂具有下述结构(I) 或者其可药用盐、酯、溶剂化物、立体异构体或前药，其中“---”表示任选的双键中的第二个键；R1是氢、烷基、被取代的烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、-NH2、或者卤素；R2是烷基、被取代的烷基、-C(O)NR7R8、芳基、被取代的芳基、芳氧基烷基、被取代的芳氧基烷基、杂芳基烷氧基烷基、被取代的杂芳基烷氧基烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基、芳烷基、被取代的芳烷基、杂芳基、或者被取代的杂芳基，其中所述杂芳基或者被取代的杂芳基通过碳-碳键与嘧啶环相连；R3不存在，或者是氢、或烷基；Y是＝(CR4)-或-(C＝O)-；R4是氢、烷基、被取代的烷基、烷硫基(thioalkyl)、烷基亚磺酰基、或烷基磺酰基；Ar是苯基、被1或2个R5取代的苯基、吡啶基或者被1或2个R5取代的吡啶基；R5在各种情况下(at each occurrence)是羟基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、氰基、卤素、烷基磺酰基、或者烷基亚磺酰基；Het是任选被1或2个R6取代的杂芳基；R6在各种情况下是羟基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、氰基、或者卤素；以及
R7和R8独立地是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂环、被取代的杂环、芳烷基、被取代的芳烷基、杂环烷基或者被取代的杂环烷基；或者R7和R8与它们相连的氮一起形成杂环或被取代的杂环。
本文中所用的上述术语具有下面的含义。
“烷基”(“alkyl”)表示含有1-10个碳原子的直链或支链、无环或环状、不饱和或饱和烃，而术语“低级烷基”具有与烷基相同的含义，但是含有1-6个碳原子。代表性的饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和的支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性的饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、-CH2-环丙基、-CH2-环丁基、-CH2-环戊基、-CH2-环己基等；而不饱和的环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。环状烷基也称作“碳环(homocyclic ring)”，包括二-与多-碳环，例如十氢化萘和金刚烷基。不饱和烷基在相邻碳原子之间含有至少一个双键或叁键(分别称作“链烯基”或“链炔基”)。代表性直链和支链链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性的直链和支链链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“亚烷基(Alkylidenyl)”表示其中从同一个碳原子上除去两个氢原子而得到的二价烷基，例如＝CH2、＝CHCH3、＝CHCH2CH3、＝C(CH3)CH2CH3等。
“芳基”表示芳香碳环基团，例如苯基或萘基。
“芳烷基”表示具有至少一个烷基氢原子被芳基取代的烷基，例如苄基(即-CH2-苯基)、-CH2-(1-或2-萘基)、-(CH2)2-苯基、-(CH2)3-苯基、-CH(苯基)2等。
“芳氧基烷基”表示通过氧桥与烷基相连的芳基(即芳基-O-烷基-)，例如-甲基-O-苯基等。
“杂芳基”表示具有至少一个选自氮、氧和硫中的杂原子、且含有至少1个碳原子的5-至10-元芳香杂环，包括单环和二环环系。代表性的杂芳基包括(但不限于)呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、吡咯基、吲哚基、异吲哚基、吖吲哚基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、_唑基、异_唑基、苯并_唑基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基和喹唑啉基。
“杂芳基烷基”表示具有至少一个烷基氢原子被杂芳基取代的烷基，例如-CH2-吡啶基、-CH2-嘧啶基等。
“杂环(heterocycle)”(在本文中也称作“杂环(heterocycle ring)”)表示饱和、不饱和或芳香性5-至7-元单环、或7-至14-元多环杂环，其中含有1-4个独立地选自氮、氧和硫中的杂原子，其中氮和硫杂原子可以任选被氧化，并且氮杂原子可以任选被季铵化，所述“杂环”也包括其中任意的上述杂环与苯环稠合的二环、以及三环(和更高级)杂环。杂环可以通过任意的杂原子或碳原子连接。杂环包括上述杂芳基。因此，除了前面列举的芳香杂芳基外，杂环还包括(但不限于)吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizinyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酰胺基(valerolactamyl)、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranyl)、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
“杂环烷基”表示具有至少一个烷基氢原子被杂环取代的烷基，例如-CH2-吗啉基等。
本文中使用的术语“被取代的”是指其中至少一个氢原子被取代基取代的任意基团(例如烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环或杂环烷基)。在酮取代基(“-C(＝O)-”)的情形中，两个氢原子被取代。本发明上下文中的“取代基”包括卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基、烷氧基、烷硫基、卤代烷基、羟基烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、被取代的芳烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂芳基烷基、被取代的杂芳基烷基、杂环、被取代的杂环、杂环烷基、被取代的杂环烷基、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaSO2Rb、-ORa、-C(＝O)Ra、-C(＝O)ORa、-C(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-SH、-SRa、-SORa、-S(＝O)2Ra、-OS(＝O)2Ra、-S(＝O)2ORa，其中Ra和Rb相同或不同，且独立地是氢、烷基、卤代烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、被取代的芳烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、杂芳基烷基、被取代的杂芳基烷基、杂环、被取代的杂环、杂环烷基或者被取代的杂环烷基。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
“卤代烷基”表示具有至少一个氢原子被卤素取代的烷基，例如三氟甲基等。卤代烷基是被取代的烷基的具体实施方案，其中烷基被一个或多个卤素原子取代。
“烷氧基”表示通过氧桥连接的烷基(即-O-烷基)，例如-O-甲基、-O-乙基等。
“烷硫基”表示通过硫桥连接的烷基(即-S-烷基)，例如-S-甲基、-S-乙基等。
“烷基氨基”和“二烷基氨基”表示通过氮桥连接的一个或两个烷基(即-NH烷基或-N(烷基)(烷基))，例如甲氨基、乙氨基、二甲基氨基、二乙基氨基等。
“羟基烷基”表示被至少一个羟基取代的烷基。
“单或二(环烷基)甲基”表示被一个或两个环烷基取代的甲基，例如环丙基甲基、二环丙基甲基等。
“烷基羰基烷基”表示被-C(＝O)烷基取代的烷基。
“烷基羰氧基烷基”表示被-C(＝O)O烷基或-OC(＝O)烷基取代的烷基。
“烷氧基烷基”表示被-O-烷基取代的烷基。
“烷基烷硫基”表示被-S-烷基取代的烷基。
“单或二(烷基)氨基”分别表示被一个烷基或两个烷基取代的氨基。
“单或二(烷基)氨基烷基”表示被单-或二(烷基)氨基取代的烷基。
“烷基磺酰基或烷基亚磺酰基”分别表示被(-S(＝O)2-)或(-S(＝O)-)官能团取代的烷基。
本文所列举的本发明实施方案是用于示例性目的而非限制性目的。在本发明第一实施方案的下述结构(II)中，R3不存在且Y是＝(CR4)-，在另一实施方案的下述结构(III)中，Y是-(C＝O)-。
当R2是苯基、R是所述苯基上的任选取代基、并且Y是＝(CR4)-时，本发明的其它实施方案具有结构(IV)。
在Y是＝(CR4)-的本发明其它实施方案中，在结构(V)中，Ar是被2个R5取代的苯基，在结构(IV)中，Het是被1个R6取代的吡啶基。
本发明化合物一般可以其游离碱形式使用。或者，本发明化合物也可以酸加成盐的形式使用。本发明游离碱氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域熟知的方法制备，可以由有机酸和无机酸生成。适宜的有机酸包括马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。适宜的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。因而，术语结构(I)的“可药用盐”是指包括任何和所有的可药用盐形式。
一般而言，结构(I)化合物可以按照本领域技术人员已知的有机合成方法以及实施例所述代表性方法加以制备。可用于制备本发明化合物的合成步骤的实例如反应流程

图1-3所示。
反应流程图1
可以将4-氨基苯甲酸酯a的氨基官能团与任选被取代的丙二醛缩合得到相应的4-吡唑-1-基苯甲酸酯b。与LAH、SOCl2、和NaCN反应后转化为吡唑并苯基乙腈化合物c，将其与Na/羧酸乙酯和肼反应得到二吡唑d。与被适当取代的β-酮酸酯反应得到吡唑并嘧啶e，后者与POCl3反应得到氯化物f。该氯化物f与适宜的有机金属试剂R2M在适宜的催化剂或引发剂存在下反应，得到化合物g。适宜的有机金属试剂和适宜的催化剂/引发剂实例包括1.(被取代的)烷基格氏试剂R2MgX(Fe(acac)3引发剂)；2.芳基、杂芳基或链烯基硼酸或酯(Pd(PhP)4催化剂)；和3.芳基或杂芳基锌试剂(Pd(PhP)4催化剂)。
为了得到本发明的其它实施例，可以将上述R2基团采用本领域技术人员已知的常规方法进一步处理或反应(例如氧化/还原、水解等)。
反应流程图2
可以使用多种合成途径获得本发明的吡唑并嘧啶核。在反应流程图2中，将任选被取代的卤代苯甲醛h与甲苯磺酰基甲基异氰化物(tosylmethylisocyanide)(TosMIC)反应，形成苯基乙腈i。i与NaH和EtOAc反应得到3-羟基丁-2-烯腈j，后者与肼HBr反应发生闭环后得到3-氨基2-苯基吡唑k。加入β-酮酯得到吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-醇l。按照反应流程图1进行氧取代以及将末端溴用Het取代后，得到本发明的化合物。
反应流程图3 将被取代的乙腈m与酮n反应，其中R′是良好的离去基团例如烷氧基、氰基、或卤素，并且其中R″是例如羟基或烷氧基的基团，得到氰基酮o，后者与肼反应得到被取代的吡唑p。p与β-酮酯q反应得到吡唑并嘧啶r。与POCl3反应得到氯化物s，该氯化物用R2取代后得到化合物t。
化合物作为CRF受体拮抗剂的效力可以通过各种测定方法加以测定。适宜的本发明CRF拮抗剂能够抑制CRF与其受体的特异性结合，拮抗与CRF有关的活性。通过一种或多种公认用于上述目的的测定法，可以评价结构(I)化合物作为CRF拮抗剂的活性，包括(但不限于)由DeSouza等人(J.Neuroscience 788，1987)和Battaglia等人(Synapse 1572，1987)公开的测定法。如上所述，适宜的CRF拮抗剂包括证实具有CRF受体亲合力的化合物。CRF受体亲合力可以通过结合性研究测定，测量化合物抑制放射性标记的CRF(例如[125I]酪氨酸-CRF)与其受体(例如从大鼠脑皮质膜制备的受体)结合的能力。DeSouza等人(出处同上，1987)所述放射性配体结合测定法提供了用于测定化合物对CRF受体的亲合力的测定法。这种活性通常是以IC50计算的，IC50是化合物代替受体中50％的放射性标记配体所需的浓度，以“Ki”值表示，利用下列方程计算Ki=IC501+L/KD]]>其中L＝放射性配体，KD＝放射性配体对受体的亲合力(Cheng和Prusoff，Biochem.Pharmacol.223099，1973)。
除了抑制CRF受体结合以外，化合物的CRF受体拮抗剂活性还可以通过化合物拮抗与CRF有关的活性的能力来加以确定。例如，已知CRF可以刺激各种生物化学过程，包括腺苷酸环化酶活化。因此，化合物可以因它们拮抗CRF-刺激的腺苷酸环化酶活性的能力(例如通过测量cAMP水平)而被评价为CRF拮抗剂。Battaglia等人(出处同上，1987)所述的CRF-刺激的腺苷酸环化酶活性测定法提供了用于测定化合物拮抗CRF活性的能力的测定法。因此，CRF受体拮抗剂活性可以通过这样的测定方法加以测定，其中一般包括最初的结合测定(例如由DeSouza(出处同上，1987)公开的结合测定)，接着进行cAMP筛选方案(例如由Battaglia(出处同上，1987)公开的方案)。
关于CRF受体结合亲合力，本发明的CRF受体拮抗剂的Ki小于10μM。在本发明的优选实施方案中，CRF受体拮抗剂的Ki小于1μM，更优选小于0.25μM(即250nM)。正如在下文中详细描述的那样，Ki值可以通过实施例27所述的方法测定。
本发明的CRF受体拮抗剂证实具有对CRF受体部位的活性，因而可用作治疗多种病症或疾病的治疗剂，所述病症或疾病包括内分泌、精神病样和神经病样病症或疾病。更具体地说，本发明的CRF受体拮抗剂可用于治疗由CRF过度分泌引起的生理学疾病或病症。据信CRF是一种关键性的神经递质，其激活和协调针对应激的内分泌、行为与自主反应(automaticresponse)，因此本发明的CRF受体拮抗剂可用于治疗神经精神病样病症。可通过本发明的CRF受体拮抗剂治疗的神经精神病样病症包括情感性精神病症，例如抑郁症；焦虑相关性精神病症，例如泛化性焦虑症、惊恐性障碍(panicdisorder)、强迫观念与行为的障碍(obsessive-compulsive disorder)、异常攻击(abnormal aggression)、心血管异常(例如不稳定的心绞痛和反应性高血压(reactive hypertension))；和进食障碍，例如神经性厌食症、食欲过盛和过敏性肠综合征(IBS)。CRF拮抗剂也可以用于治疗应激-诱发的与各种疾病状态有关的免疫抑制、以及中风。本发明CRF拮抗剂的其它用途包括治疗炎症(例如类风湿性关节炎、眼色素层炎、哮喘、炎性肠病和G.I.蠕动(G.I.motility))、疼痛、库兴氏病(Cushing′s disease)、婴儿痉挛、癫痫与其它见于婴儿和成人的癫痫发作、以及各种物质滥用与脱瘾(包括酗酒)。
在本发明的另一个实施方案中，公开了含有一种或多种CRF受体拮抗剂的药物组合物。为了进行给药，可以将本发明的化合物配制成药物组合物。本发明的药物组合物含有本发明的CRF受体拮抗剂(即结构(I)的化合物)和可药用载体和/或稀释剂。CRF受体拮抗剂按照足以有效治疗特定病症-也就是足以实现CRF受体拮抗剂活性的量存在于组合物中，并且优选对患者的毒性反应是可接受的。优选地，本发明的药物组合物可以包括每剂量0.1mg至250mg CRF受体拮抗剂，这取决于给药的途径，更优选为1mg至60mg。本领域技术人员可以方便地确定适宜的浓度和剂量。
可药用载体和/或稀释剂是本领域技术人员所熟悉的。就配制成液体溶液剂形式的组合物而言，可药用载体和/或稀释剂包括盐水和无菌水，并且可以任选地含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂(bacteriostats)和其它常用添加剂。也可以将组合物配制成丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂形式，其中除了含有CRF受体拮抗剂以外，还含有稀释剂、分散剂与表面活性剂、粘合剂和润滑剂。本领域技术人员可以按照公认的惯例，进一步以适当的方式配制CRF受体拮抗剂，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro著，MackPublishing Co.，Easton，PA 1990中公开的方法。
另外，前药也被包括在本发明范围内。前药是指任何共价键合的载体，在将这类前药向患者施用时，它们在体内释出结构(I)化合物。前药一般通过以这样一种方式修饰官能团而加以制备，即通过常规处理或在体内可以裂解除去这种修饰而得到母体化合物。
关于立体异构体，结构(I)化合物可以具有手性中心，因此可以外消旋物、外消旋混合物和个别的对映异构体或非对映异构体存在。所有这类异构形式、包括其混合物都被包括在本发明范围内。此外，部分结晶形式的结构(I)化合物可以另外的结晶、非结晶或多晶型如多晶型物的形式存在，它们全部被包括在本发明范围内。此外，一些结构(I)化合物还可以与水或其它有机溶剂形成溶剂化物。这类溶剂化物同样被包括在本发明范围内。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗多种病症或疾病的方法，包括内分泌、精神病样和神经病样病症或疾病。这类方法包括向温血动物按照足以治疗该病症或疾病的用量施用本发明的化合物。该方法包括将本发明的化合物以足以治疗所述病症或疾病的量给药于温血动物。这类方法包括将本发明的CRF受体拮抗剂优选以药物组合物的形式进行全身给药。本文所用的全身给药包括口服和肠胃外给药方法。就口服给药而言，适宜的CRF受体拮抗剂的药物组合物包括粉剂、颗粒剂、丸剂、片剂和胶囊剂，以及液体、糖浆剂、混悬剂和乳剂。这些组合物还可以包括调味剂、防腐剂、助悬剂、增稠剂和乳化剂、以及其它可药用添加剂。就肠胃外给药而言，可以将本发明的化合物制备成含水注射溶液剂，其中除了含有CRF受体拮抗剂以外，还可以含有缓冲剂、抗氧化剂、抑菌剂(bacteriostats)和其它常用于这类溶液剂中的添加剂。
在另一个实施方案中，通过使用放射性或非放射性药剂，本发明可以实现体内特定位点的诊断可视化(diagnostic visualization)。使用本发明的化合物可以为患者提供生理性、功能性、或生物性评价或者提供疾病或病理检测和评价方法。放射性药物制剂被用于闪烁照相术(scintigraphy)、正电子发射断层扫描术(positron emission tomography)(PET)、计算机断层扫描(CT)、和单光子发射计算机控制断层摄影术(SPECT.)。为了实现这类应用，掺入诸如碘(I)元素的放射性同位素包括123I(PET)、125I(SPECT)和131I，锝(Tc)元素的放射性同位素包括99Tc(PET)，磷(P)元素的放射性同位素包括31P和32P，铬(Cr)元素的放射性同位素包括51Cr，碳(C)元素的放射性同位素包括11C，氟(F)元素的放射性同位素包括18F，铊(Tl)元素的放射性同位素包括201Tl等正电子和电离辐射的发射子。非放射性药物被用于磁共振成像(MRI)、荧光透视法和超声中。为了实现这类应用，掺入诸如钆(Gd)元素的同位素包括153Gd、铁(Fe)、钡(Ba)、锰(Mn)和铊(Tl)。这类实体还可用于确定混合物中是否存在特定的靶位和标记混合物中的分子。
如上所述，施用本发明的化合物可用于治疗各种病症或疾病。特别地，向温血动物施用本发明的化合物，可用于治疗抑郁症、焦虑症、惊恐性障碍、强迫观念与行为的障碍、异常攻击、不稳定的心绞痛、反应性高血压、神经性厌食症、食欲过盛、过敏性肠综合征、应激-诱发的免疫抑制、中风、炎症、疼痛、库兴氏病、婴儿痉挛、癫痫、以及物质滥用或脱瘾。
出于示例性说明而非限制性目的，提供下列实施例。
实施例本发明的CRF受体拮抗剂可以通过实施例1-26所公开的方法制备。实施例27代表用于测定受体结合亲和力的方法，实施例28公开了用于筛选本发明化合物对CRF-刺激的腺苷酸环化酶的活性的测定。
分析HPLC-MS方法1平台Agilent 1100系列配备有自动采样器、UV检测器(220nM和254nM)、MS检测器(APCI)；HPLC柱YMC ODS AQ，S-5，5μ，2.0×50mm筒(cartridge)；HPLC梯度1.0mL/分钟，在2.5分钟内由10％乙腈的水溶液至90％乙腈的水溶液，保持90％持续1分钟。乙腈和水均含有0.025％TFA。
分析HPLC-MS方法2平台Agilent 1100系列配备有自动采样器、UV检测器(220nM和254nM)、MS检测器(APCI)；HPLC柱Phenomenex Synergi-Max RP，2.0×50mm柱；HPLC梯度1.0mL/分钟，在13.5分钟内由5％乙腈的水溶液至95％乙腈的水溶液，保持95％持续2分钟。乙腈和水中均含有0.025％TFA。
分析HPLC-MS方法3平台Agilent 1100系列配备有自动采样器、UV检测器(220nM和254nM)、MS检测器(电喷射)；
HPLC柱XTerra MS，C18，5μ，3.0×250mm柱；HPLC梯度1.0mL/分钟，在46分钟内由10％乙腈的水溶液至90％乙腈的水溶液，跳跃至99％乙腈，然后保持99％乙腈持续8.04分钟。乙腈和水均含有0.025％TFA。
分析HPLC-MS方法4平台Agilent 1100系列配备有自动采样器、UV检测器(220nM和254nM)、MS检测器(APCI)和Berger FCM 1200 CO2泵组件(module)；HPLC柱Berger吡啶(Pyridine)，PYR 60A，6μ，4.6×150mm柱；HPLC梯度4.0mL/分钟，120巴；在1.67分钟内由10％甲醇的超临界CO2溶液至60％甲醇的超临界CO2溶液，保持60％持续1分钟。甲醇含有1.5％水。在140巴下调节反压力(backpressure)。
制备型HPLC-MS平台Shimadzu HPLC，配备有Gilson 215自动采样器/流分收集器、UV检测器和PE Sciez API150EX质量检测器；HPLC柱BHK ODS-O/B，5μ，30×75mmHPLC梯度35mL/分钟，在7分钟内10％乙腈的水溶液至100％乙腈，保持100％乙腈持续3分钟，含有0.025％TFA。
缩写AA乙酸乙酯LAH氢化铝锂DCM二氯甲烷DMSO二甲亚砜EAA乙酰乙酸乙酯LC-MS液相色谱-质谱NaBH(OAc)3三乙酰氧基氢化钠Pd-C钯(10％)-碳TFA三氟乙酸Tosmic甲苯磺酰基甲基异氰化物(tosylmethyl isocyanide)
acac乙酰丙酮EDCIN-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐THF四氢呋喃TEA三乙胺tR保留时间实施例17-(2-甲氧基-苯基)-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶 步骤1A向冷却后的4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(6.82g，37.7mmol)的6N HCl(含水)悬浮液中逐滴加入亚硝酸钠溶液(2.60g，37.7mmol)。在0℃下搅拌20分钟后，分批加入二氯化锡二水合物(24.7g，109.3mmol)。所得到的混悬液在0℃下搅拌1.5小时，然后过滤。将收集得到的固体悬浮于EtOH中，向其中加入丙二醛双(二甲基乙缩醛)(7.5mL，45.7mmol)，将上述反应混合物回流过夜。蒸发除去EtOH后，将残余物在EtOAc和水之间萃取，将有机相干燥后蒸发至干。残余物通过硅胶塞(plug)(25％EtOAc/己烷)得到为含苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯混合物的化合物1b(7.43g)。
步骤1B
在0℃下，向1b(10.6g)的无水二乙醚(200mL)溶液中缓慢加入LAH粉末(1.74g)。在0℃下搅拌45分钟后，将反应混合物倾泻到冰水上，水相酸化至pH为4.0。分离后，该醇(8.8g)用亚硫酰氯(10mL)的DCM溶液回流2.5小时，然后倾泻到冰水上，用DCM萃取。粗产物苄基氯(8.26g)与NaCN(3.65g，74.4mmol)的DMSO(100mL)溶液在80℃下加热45分钟。除去DMSO后，通过使用30％EtOAc/己烷的柱色谱处理后，得到化合物1c(5.98g)。
步骤1C向1c(5.98g，28.1mmol)的EtOAc(150mL)溶液中分批加入金属钠(1.0g，43.5mmol)，混合物回流过夜。将所得到的悬浮液倾泻到冰水上，酸化至pH为4.0。将有机相干燥后蒸发至干。将所得到的化合物(9.5g)与肼单氢溴化物(15.3g，135.4mmol)混和，在EtOH/H2O(6∶1)中回流5小时。蒸发除去EtOH后，用EtOAc萃取，将有机相干燥并蒸发至干得到化合物1d(7.5g)。
步骤1D将1d(7.5g，27.9mmol)混合物与乙酰乙酸乙酯(5.0mL)在AcOH(100mL)中回流3小时。蒸发除去AcOH后从二乙醚中沉淀出来，过滤后得到化合物1e(10.4g)。
步骤1E向1e(2.1g，6.3mmol)的乙腈悬浮液中加入POCl3(2.2mL，24.1mmol)，混合物回流5小时后倾入冰水中，用EtOAc萃取并经柱色谱纯化后，得到化合物1f(1.88g)。
步骤1F在110℃下，将含有化合物1f(1.0mmol)、2-甲氧基苯基硼酸(1.2mmol)、K2CO3(2.0mmol)和Pd(PPh3)4(0.05mmol)的混合物在1，4-二_烷/H2O(2∶1)中加热过夜。蒸发除去溶剂后，将混合物在CHCl3/H2O之间萃取，将有机相干燥后蒸发至干。经柱色谱法处理后得到化合物1-1(402mg)。根据芳基硼酸试剂中的芳基官能团，合成并通过制备型(preparative)LC-MS纯化得到下表中列举的化合物
实施例1A中间体1f的替代合成方法 步骤1A-A向配备有机械搅拌器的三颈烧瓶中加料250g(1.12mol)2-甲氧基-4-乙酰氨基苯甲酸甲酯，再加入1L甲醇。开始搅拌后缓慢加入94mL(3.36mmol，3当量)浓硫酸，使得轻微回流。将混合物搅拌24小时。将混合物真空浓缩得到稠浆状物。该浆状物用布氏漏斗过滤，用300mL冷甲醇洗涤。滤饼收集后在45℃下真空干燥24小时，得到302g为半硫酸盐的1a，收率96％。
步骤1A-B在配备有机械搅拌器和热电偶的2L三颈Morton烧瓶中加料200g(716mmol)4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯1a。固体用700mL 6N盐酸浆化，然后冷冻在冰浴中。向混合物中逐滴加料54.3g(788mmol，1.1当量)亚硝酸钠的100mL水溶液，在加料过程中保持温度＜15℃。将混合物继续搅拌1.5小时，得到浅黄色均匀溶液。向混合物中小心加入272g(1432mmol，2当量)无水二氯化锡。加料过程中保持温度＜10℃。混合物在0℃下搅拌1小时，然后在5℃下保持16小时。通过布氏漏斗过滤收集沉淀，滤饼风干2小时。将滤饼转移至配备有磁搅拌棒的2L圆底烧瓶中，用600mL乙醇稀释。向浆状物中进料入142mL(859mmol，1.2当量)丙二醛双(二甲基乙缩醛)，将混合物回流6小时。蒸发除去乙醇后，残余物用乙酸乙酯稀释，用氢氧化钠中和。分离有机相，干燥并真空浓缩。该粗产物通过硅胶塞，用25％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到96g为含甲酯和乙酯混合物的化合物1b，收率为58％。
步骤1A-C向含有500mL无水THF的1L圆底烧瓶中加入LAH(14.5g，380mmol，0.95当量)，将混合物冷却至0℃。向上述混合物中逐滴加入1b(96g，400mmol，1.0当量)在300mL THF中的溶液。在加料过程中保持温度低于15℃。加料完毕后，将混合物搅拌1小时，然后将反应混合物小心用水(14.5mL)、10％氢氧化钠水溶液(14.5mL)和水(43.5mL)猝灭。将所得到的混合物通过Celite_垫过滤，浓缩得到为浅黄色油状物的1b.1(63.9g，75.7％)，其直接使用不再纯化。
步骤1A-D将亚硫酰氯(95mL，1.30mol，3.1当量)在1小时内逐滴加入至1b.1(85.0g，0.42mol)在400mL DCM中的溶液中，控制加料速度使得保持温和回流。形成沉淀，在加入完成后其再次溶解。将所得到的暗色溶液回流4小时。将冷却后的反应混合物倾泻到500g冰上，将所得到的混合物用2×700mLDCM萃取。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到为褐色固体的1b.2(76.5g)，其直接使用不再纯化。
步骤1A-E将1b.2(76g，340mmol，1.0当量)的DMF(100mL)溶液在20分钟内逐滴加入至加热至100℃的含有氰化钠(24.5g，500mmol，1.5当量)和DMF(300mL)的混合物中。将混合物在100℃下加热4小时，然后将冷却后的混合物通过Celite_过滤。滤液浓缩后，将残余物溶于300mL DCM中，用饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到暗褐色固体残余物。该残余物在乙醇(100mL)中浆化，然后将固体通过过滤收集，用冷的乙醇和乙醚洗涤，得到为灰白色固体的1c(48.0g)。将母液浓缩后通过硅胶色谱法纯化，用1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，再次得到15.4g为白色固体的1c。合并的收率为63.4g。
步骤1A-F向1c(63.4g，0.30mol，1当量)的乙酸乙酯(800mL)溶液中分批加入金属钠(10.3g，0.45mmol，1.5当量)，将混合物回流16小时。将冷却后的悬浮液倾泻到500g冰上，酸化至pH为5，然后用2×300mL乙酸乙酯萃取。将有机相用硫酸钠干燥，过滤并浓缩至粗品黄色油状物(86.5g)。
将该粗品黄色油状物(86.5g)溶解于乙醇(480mL)和水(80mL)中，然后加入肼单氢溴化物(100g，0.88mol，3当量)，将混合物在85℃下加热16小时。蒸发除去溶剂后，加入盐水(200mL)，将混合物用2×300mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到为粗品褐色泡沫的1d(68g)，其直接使用不再纯化。
步骤1A-G将含有1d(68g，250mmol，1.0当量)、乙酰乙酸乙酯(100mL)、乙酸(150mL)、和乙醇(150mL)的混合物回流24小时。将冷却后的混合物浓缩得到固体残余物，然后将其沉积到烧结玻璃过滤器中，用乙醚洗涤，得到为灰白色固体的1e(52.0g，51.2％)。母液浓缩后在硅胶上进行色谱处理，用10％甲醇的DCM溶液作为洗脱液。将所得到的固体产物用乙醚洗涤，得到另外17.0g为灰白色固体的1e(合并收率69g)。
步骤1A-H向1e(41.2g，123mmol)的乙腈(200mL)悬浮液中加入POCl3(45.0mL，493mmol)，将该混合物回流16小时。将冷却后的反应混合物倾泻到冰水上，并将所得到的混合物用氯仿萃取。将合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，用3∶1己烷/乙酸乙酯洗脱得到为棕褐色固体的1f(29.0g)。
实施例27-异丙基-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶 步骤2A在室温下，向化合物1f(1.41g，4.0mmol)和Fe(acac)3(424mg，1.2mmol)在THF/NMP(v/v＝8∶1)中的溶液中缓慢加入iPrMgCl(2.0M的THF溶液，4.0mL)。将反应混合物搅拌1.5小时后，用1N HCl(水溶液)猝灭。用EtOAc萃取后，将粗产物通过柱色谱法纯化(25％EtOAc/己烷)，得到化合物2-1(628mg)。
根据烷基卤化镁中的烷基官能团，合成得到下表中列举的化合物
实施例33-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶-7-羧酸乙酯
步骤3A向20mL EtOH中加入化合物1d(1.0g，实施例1，步骤1C)和2，4-二氧代戊酸乙酯(0.82g)，随后加入0.5mL乙酸。将反应混合物在80℃下加热12小时。浓缩并经硅胶柱色谱法纯化后，得到化合物3-1(0.66g，46.1％收率)和反向(inverted)加合产物化合物3-2(0.47g，32.2％收率)。
步骤3B向溶解于THF(1.5mL)中的化合物3-1(30mg)中加入DIBAL(150uL的2MDIBAL的己烷溶液)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并用水(0.4mL)猝灭。通过LC-MS纯化后，得到化合物3-3(3.3mg)。按照相同步骤，将化合物3-2还原并纯化后得到化合物3-4(2.6mg)。
步骤3C向1.5mL THF中加入化合物3-1(30mg)，再加入CH3MgBr(150uL的2MCH3MgBr的THF溶液)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后用水猝灭。将所得到的物质通过LC-MS纯化，得到化合物3-5(3.8mg)。接着使用化合物3-1和CH3CH2MgBr进行上述步骤并纯化后，得到化合物3-6(4.1mg)。使用化合物3-2作为起始试剂和CH3MgBr作为亲核试剂完成相同反应步骤并纯化后，得到化合物3-7(4.0mg)。
步骤3D在室温下，在搅拌下，用30分钟的时间向THF(1.5mL)中加入乙酰氨肟(acetamidoxime)(20mg)和NaH(10mg)。加入化合物3-2(40mg)，并将混合物在密闭试管中于90℃加热2小时。通过LC-MS纯化后，得到化合物3-8(5.5mg)。
步骤3E向化合物3-1(200mg)的二_烷∶水(9∶1)溶液中加入LiOH(30mg)。将反应在室温下进行搅拌6小时，然后猝灭至pH为4(HCl，4N)，在H2O(20mL)和EtOAc(20mL)之间萃取。将有机相用Na2SO4干燥并浓缩。将所得到的浓缩物通过硅胶柱色谱法纯化(50∶50 EtOAc/己烷)，得到化合物3-9(180mg)。下表列出了实施例3所代表的化合物
实施例43-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-7-三氟甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤4A在150℃下，将化合物1d(40mg，实施例1，步骤1C)和1，1，1-三氟戊烷-2，4-二酮(过量)的混合物在AcOH中微波加热15分钟，通过LC-MS纯化后得到化合物4-1(29mg)。根据所使用的三氟二酮，合成得到下表中的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例53-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶-7-羧酸二甲基酰胺
步骤5A向化合物3-9(50mg，0.14mmol，1当量)的DCM(1mL)溶液中加入HOBT(57mg，0.42mmol，3当量)、TEA(0.12mL，0.84mmol，6当量)、二甲胺盐酸盐(34mg，0.42mmol，3当量)和EDCI(79mg，0.42mmol，3当量)。将混合物在室温下搅拌16小时，然后蒸发除去溶剂，该粗品反应混合物通过制备型HPLC/MS纯化，得到为TFA盐的化合物5-1(10mg)。根据上述酰胺化步骤中使用的胺，合成得到下表中的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例6环戊基-{2-[3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶-7-基]-苄基}-胺
步骤6A向1f(500mg，1.4mmol，1当量)的1∶1二_烷/水(6mL)溶液中加入2-甲酰基苯基硼酸(255mg，1.7mmol，1.2当量)，随后加入碳酸钾(390mg，2.8mmol，2.0当量)和四(三苯基膦)钯(O)(82mg，0.07mmol，0.05当量)。将混合物在密闭试管中于100℃加热3小时，然后真空除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用1∶1己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的6a(500mg，85％)。
步骤6B在室温下将三乙酰氧基硼氢化钠(80mg，0.38mmol，2当量)加入至6a(80mg，0.19mmol，1当量)和乙酸(0.011mL，0.19mmol，1当量)在二氯乙烷(1mL)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌16小时，然后将混合物浓缩后溶于甲醇中，并通过制备型HPLC/MS纯化，得到为TFA盐的6-1(36mg，38％收率)。
根据上述还原胺化步骤中使用的胺，合成得到下表中的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例73-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-7-[2-(2-吗啉-4-基-乙基)-苯基]-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤7A
在室温下，向6a(345mg，0.82mmol)的1∶1 THF/甲醇(4mL)悬浮液中小心地加入硼氢化钠(62mg，1.6mmol，2当量)。将混合物搅拌30分钟，然后加入水，将混合物用DCM萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为固体的7-1(450mg，90％)，其直接使用不再纯化。
步骤7B在室温下，将亚硫酰氯(0.17mL，2.3mmol，2.2当量)加入至7-1(450mg，1.05mmol，1当量)的DCM(5mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入水，将混合物用DCM萃取。将合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为黄色固体的7-2(420mg，90％)。
步骤7-C在室温下，将氢化钠(11mg的60％的矿物油分散体，0.28mmol，4当量)加入至2-甲基咪唑(17mg，0.21mmol，3当量)在2ml DMF中的溶液中。将混合物搅拌10分钟，然后加入7-2(30mg，0.07mmol，1当量)在0.2ml DMF中的溶液，将混合物在室温下搅拌17小时。将混合物用甲醇稀释，然后通过制备型HPLC/MS纯化，得到为TFA盐的7-X(6mg)。
步骤7D在室温下，将氰化钠(3.3mg，0.067mmol，3当量)加入至7-2(10mg，0.023mmol，1当量)的DMSO(3mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时，然后加入水，将混合物用DCM萃取。将合并的有机层用水和盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为固体的粗产物7-3(8mg，80％收率)。
步骤7E在-78℃下，将DIBAL-H(0.23mL的1.5M的甲苯溶液，0.35mmol，3当量)加入至7-3(50mg，0.11mmol)的DCM(1mL)溶液中。将混合物在-78℃下搅拌20分钟，然后温热至室温。加入水，并将混合物搅拌10分钟，然后将水层再用两份DCM萃取。将合并的有机萃取液用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，通过Celite_过滤并浓缩。将残余物通过制备型HPLC/MS纯化，得到为TFA盐的7a(15mg)。
步骤7F将三乙酰氧基硼氢化钠(15mg，0.069mmol，2当量)加入至7a(15mg，0.034mmol，1当量)和乙酸(0.002mL，0.034mmol，1当量)在DCM(1mL)中的室温溶液中。将混合物在室温下搅拌16小时，然后将混合物浓缩，溶于甲醇中，直接通过制备型HPLC/MS纯化，得到为TFA盐的7-4(11mg，50％收率)。
下表概述了实施例7的化合物。通过改变上述还原胺化步骤中使用的胺，按照步骤7E的方法合成得到包括在下表中的化合物7-5和7-6
实施例83-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-7-(3-甲基-吡啶-2-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤8A向冷却至-70℃的2-溴-3-甲基吡啶(4.85g，28.2mmol)的无水THF(8.0mL)溶液中逐滴加入n-BuLi(1.6M的己烷溶液，17.6mL，28.2mmol)。将反应混合物在-70℃下搅拌30分钟，然后在5分钟内加入ZnCl2(0.5M的THF溶液，66.0mL，34mmol)。将混合物在1小时内温热至0℃，然后加入化合物1f(1.66g，4.70mmol)和四(三苯基膦)钯(O)(326mg，0.28mmol)。然后将混合物加热回流4小时。将冷却后的反应混合物用水猝灭，蒸发除去THF，将得到的含水混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，将残余物进行硅胶色谱法处理，用1∶3的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到为黄色固体的8-1游离碱(1.6g，83％)。在0℃下，向8-1(1.6g，3.9mmol)在7∶1乙酸乙酯/氯仿(100mL)中的溶液中加入氯化氢(4.0mL的2.0M的乙醚溶液，8.0mmol)。将悬浮液用乙醚稀释，然后将固体在烧结玻璃过滤器上收集，用乙醚冲洗并高真空干燥后得到8-1HCl盐(1.7g，98％)。
根据上述步骤8A中使用的卤化物，合成得到下表中的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例9试剂2-甲基-4-(吡唑-1-基)苯基硼酸频哪醇酯的合成
步骤9A
将4-溴-3-甲基苯胺(10.2g)悬浮于6N HCl(85mL)中，然后冷却至0℃。在10分钟内加入亚硝酸钠溶液(4g，在40mL H2O中)。将反应在0℃下搅拌15分钟，然后加入二氯化锡二水合物(36g，在25mL的12N HCl中)。将反应在0℃下搅拌2小时。将反应过滤后，将滤饼用冷H2O洗涤，得到为黄褐色固体的4-溴-3-甲基苯基肼盐酸盐(化合物9a，20g)。
步骤9B将由步骤9A得到的化合物(20g)悬浮于50mL乙醇中。加入丙二醛双-二甲基乙缩醛(malondialdehyde bis-dimethylacetal)(11.0mL，67mmol)，将反应在2小时内加热至85℃。将反应混合物用碳酸氢钠中和，通过用DCM洗涤萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，将混合物通过Celite_垫过滤。滤液蒸发后，将油状残余物通过柱色谱法纯化(1∶1的乙酸乙酯∶己烷)，得到为琥珀色油状物的1-(4-溴-3-甲基苯基)吡唑(化合物9b，9.6g，73％)。
步骤9C向化合物9b的溶液(2.0g，在15mL二_烷中)中加入双联频哪醇二硼酸酯(bis(pinacolate)diboron)(2.4g)、醋酸钾(2.4g)和1，1’-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯(II)(500mg)。将反应在12小时内加热至85℃。将反应混合物通过Celite_垫过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。滤液浓缩成棕色液体，将其通过柱色谱法纯化(20％的乙酸乙酯∶己烷)，得到为黄色油状物的2-甲基-4-(吡唑-1-基)苯基硼酸频哪醇酯(pinacol ester)(化合物9c，1.8g，75％)；LC/MS[M+H]＝285.0。
通过上述方法还制备得到2-氯-4-(吡唑-1-基)苯基硼酸频哪醇酯(9d)和2-甲基-3-(吡唑-1-基)苯基硼酸频哪醇酯(9e)。
实施例107-(2-氟-3-甲氧基-苯基)-2，5-二甲基-3-(4-甲基-6-吡唑-1-基-吡啶-3-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤10A将3-氨基-5-甲基吡唑(20.0g，206mmol)、乙酰乙酸乙酯(32.0g，247mmol)、乙酸(6mL)、和二_烷(150mL)的溶液回流16小时。白色固体沉淀析出后，通过过滤收集。滤饼用乙醚洗涤，得到为白色固体的10a(29.0g，86％)。
步骤10B向化合物10a(5.0g，31mmol)在1，4-二_烷(30mL)中的悬浮液中加入三乙胺(8.50mL，62mmol)和三氯氧化磷(7.4mL，77mmol)。将反应在氮气氛下于100℃加热2小时。将反应混合物在冰浴中冷却，然后依次用水和碳酸氢钠水溶液(最终pH为8)处理。加入二氯甲烷，将混合物用水洗涤3x。将合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩成暗褐色油状物。将粗产物通过硅胶色谱法纯化，用30％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱液，得到为白色固体的10b(3.8g，70％)。
步骤10C向含有80mL二_烷和8mL水的混合物中加入化合物10b(3.3g，18mmol，1当量)、2-氟-3-甲氧基苯基硼酸(4.3g，26mmol，1.4当量)、碳酸钾(5.0g，36mmol，2当量)和四(三苯基膦)钯(O)(1.5g，1.3mmol，0.07当量)。将混合物在100℃搅拌加热16小时，冷却后加入水(75mL)。将混合物用乙酸乙酯萃取，然后将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，用4∶1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到为白色固体的化合物10c(3.78g，76％)。
步骤10D在-10℃下，将溴(1.77g，11mmol)加入至10c(3.0g，11mmol)的甲醇(30mL)溶液中。10分钟后，过滤混合物，收集已经形成的沉淀物。将滤饼用冷的甲醇洗涤，然后真空干燥得到为黄色固体的10d(3.15g，83％)。
步骤10E使用化合物12-1替代2-氟-3-甲氧基苯基硼酸，化合物10d(460mg，1.3mmol)按照上述步骤10C的方法进行Suzuki反应，得到化合物10-1(15mg，固体)，然后通过制备型HPLC/MS和硅胶色谱法纯化(使用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱液)。
根据最后Suzuki反应中使用的硼酸酯或酸，合成并通过制备型LC-MS纯化得到下表中列举的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例117-(2-氟-3-甲氧基-苯基)-2，5-二甲基-3-(3-甲基-5-吡唑-1-基-吡啶-2-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤11A在室温下，将氢化钠(1.54g的60％的油分散体，38.5mmol，2当量)加入至氰基丙酮钠盐(cyanoacetone sodium salt)(2.5g，23mmol，1.2当量)的DMF(40mL)溶液中。将混合物搅拌15分钟，然后逐滴加入2-氟-3-甲基-5-硝基吡啶(3.0g，19.2mmol，1.0当量)在10mL DMF中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌6小时。反应用5g冰猝灭，接着加入150mL水和10mL乙酸猝灭。混合物用乙酸乙酯萃取，然后将合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，使用30％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱液，得到为橙色油状物的11a(1.85g，44％收率)。
步骤11B将含有11a(1.8g，8.2mmol，1.0当量)、肼单氢溴化物(1.0g，8.8mmol，1.1当量)、乙醇(30mL)和水(3mL)的混合物加热回流17小时。蒸发除去溶剂，将残余物通过硅胶色谱法直接纯化，使用1∶1己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色泡沫的11b(1.8g，94％收率)。
步骤11C在105℃下，将含有11b(1.8g，7.7mmol，1.0当量)、乙醇(15mL)、乙酸(15mL)、和乙酰乙酸乙酯(1.6g，12.4mmol，1.6当量)的混合物在密闭试管中加热19小时。蒸发除去溶剂，将残余物在烧结玻璃过滤器上沉积，用乙醚冲洗，得到为黄色固体的11c(1.0g，43％收率)。
步骤11D将含有11c(800mg，2.7mmol，1.0当量)、三氯氧化磷(900mg，5.9mmol，2.2当量)、和乙腈(15mL)的混合物回流3小时。将反应倾泻到冰上，然后将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯萃取液用碳酸氢钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到为黄色固体的11d(640mg，76％)。
步骤11E将11d(640mg，2.0mmol，1当量)、2-氟-3-甲氧基苯基硼酸(480mg，3.8mmol，1.4当量)、碳酸钾(555mg，4.0mmol，2.0当量)、四(三苯基膦)钯(O)(230mg，0.2mmol，0.1当量)在20mL二_烷和2mL水中的悬浮液在100℃下搅拌加热16小时。加入水(50mL)，将混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物用甲醇研磨，得到为黄色固体的11e(300mg，37％)。
步骤11F将10％Pd/C(100mg)加入至11e(300mg，0.74mmol，1.0当量)在20mL乙醇和10mL THF中的用氮气鼓泡的溶液中。将混合物在室温下、在40psi氢气的帕尔振摇器中振摇6小时。将混合物用氮气净化(purge)并过滤。将滤液浓缩得到为黄色油状物的11f(260mg，94％收率)。
步骤11G将亚硝酸钠(60mg，0.87mmol，1.3当量)的水溶液(10mL)逐滴加到冰冷的11f(260mg，0.69mmol，1.0当量)在4N盐酸(5mL)中的溶液中。将混合物在0℃下搅拌1小时，然后加入10mL半饱和的碘化钾水溶液。将混合物在室温下搅拌16小时，然后加入50mL饱和碳酸氢钠水溶液，将混合物用2×50mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，并将残余物通过硅胶色谱法纯化，用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的11g(170mg，51％收率)。
步骤11H向11g(170mg，0.35mmol，1.0当量)的二_烷(6mL)溶液中加入碳酸钾(200mg，1.45mmol，4.1当量)、吡唑(60mg，0.89mmol，2.5当量)、碘化亚铜(I)(60mg，0.32mmol，0.9当量)、反式-1，2-二氨基环己烷(36mg，0.32mmol，0.9当量)和N，N’-二甲基乙二胺(28mg，0.32mmol，0.9当量)。将混合物搅拌后，在100℃的密闭试管中加热19小时。将反应混合物通过Celite_垫过滤，浓缩并通过制备型HPLC/MS纯化，得到为TFA盐的化合物11-1(70mg，37％收率)；MW428.47；LC/MS429[MH]+；tR5.390，分析方法2。
实施例124-甲基-2-吡唑-1-基-5-吡啶基硼酸
步骤12A将2-氯-4-甲基-5-硝基吡啶(5.0g，29mmol，1.0当量)溶解于50mL肼溶液(1M的THF溶液)中，在密闭试管中在80℃下，将混合物搅拌并加热22小时。将冷却的反应混合物过滤，将得到的固体用乙醚洗涤，得到5.7g茶绿色固体。
在密闭试管中在80℃下，将含有上述固体(5.7g，24mmol，1.0当量)、丙二醛双(二甲基乙缩醛)(5.9g，31mmol，1.3当量)和乙酸(50mL)的混合物搅拌并加热5小时。蒸发除去溶剂后，加入碳酸氢钠水溶液(200mL)，混合物用2×200mL乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物由乙醇重结晶，得到为黄色固体的12a(2.6g，53％收率)。
步骤12B将12a(2.6g，13mmol)和10％Pd/C(200mg)在30mL 1∶1 THF/甲醇中的混合物在室温下、40psi氢气的Parr装置中振摇2小时。反应混合物通过Celite_垫过滤，滤液浓缩成亮绿色油状物。将油状物再次悬浮于10mL的3N氢溴酸中，冷却至0℃，然后逐滴用亚硝酸钠(835mg，12mmol，1.1当量)在2mL水中的溶液处理。混合物在0℃下搅拌1小时，然后加入2mL半饱和的碘化钾，并将混合物在室温下搅拌22小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液，然后将混合物用2×100mL乙酸乙酯萃取，并将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化，用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的12b(1.23g，33％)。
步骤12C在-78℃下，将正丁基锂(1.8mL的2.0M的戊烷溶液，3.6mmol)逐滴加入至化合物12b(600mg，2.1mmol)和三异丙基硼酸酯(900mg，4.8mmol)在5mL THF中的溶液中。混合物在1小时内温热至室温，然后冷却至-78℃，用另外的三异丙基硼酸酯(400mg，2.1mmol)处理，然后用另外的正丁基锂(0.5mL的2.0M的戊烷溶液，1.0mmol)处理。混合物再次在1小时内温热至室温，然后加入0.8mL的1N盐酸，混合物搅拌1小时。将混合物过滤，固体用甲醇和乙酸乙酯冲洗，然后将滤液浓缩。将残余物经硅胶色谱法，用1∶1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到为红色固体的化合物12-1(220mg，52％收率)。
实施例137-(4-氯-苯氧基甲基)-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶 步骤13A向化合物3-3(25mg，0.072mmol，1当量)的THF(1.5mL)溶液中加入二叔丁基偶氮二羧酸酯(30mg，0.11mmol，1.5当量)、三苯基膦(30mg，0.11mmol，1.5当量)和4-氯苯酚(30mg，0.023mmol，3.3当量)。混合物在室温下搅拌17小时，然后蒸发除去溶剂，将残余物通过硅胶色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯洗脱，得到为固体的化合物13-1(8mg)。
根据所使用的苯酚，合成并通过制备型LC-MS纯化得到下表中列举的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例146-{3-[3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶-7-基]-丙氧基}-烟腈(nicotinonitrile) 步骤14A向化合物1f(1.06g，3.0mmol)和乙酰基丙酮化铁(III)(iron(III)acetylacetonate)(353mg，1.0mmol)在10mL无水THF/NMP(7∶1)中的溶液中缓慢加入3-丁烯基氯化镁(9.0mL 0.5M的THF溶液，4.5mmol)。反应混合物在室温下搅拌1小时，然后加入更多的乙酰基丙酮化铁(III)(1.0g，2.8mmol)和格氏试剂(6.0mL，3.0mmol)。反应混合物搅拌2小时后，加入水。混合物用乙酸乙酯萃取，然后将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物经硅胶色谱法处理，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到14a(538mg，48％收率)。
步骤14B
在室温下，向14a(380mg，1.02mmol)在10mL THF/水(4∶1)中的溶液中加入四氧化锇(26mg，0.10mmol)，随后加入高碘酸钠(642mg，3.0mmol)。混合物在室温下搅拌1小时，然后加入乙酸乙酯和水。有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到粗产物醛，将其溶解于甲醇(20mL)中。逐滴加入硼氢化钠(152mg，4.0mmol)。在室温下搅拌20分钟后，将反应混合物浓缩。将残余物经硅胶色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯洗脱，得到化合物14-1(230mg，60％收率)。
步骤14C将含有14-1(30mg，0.08mmol，1当量)、碘化亚铜(I)(15mg，0.08mmol，1当量)、碳酸铯(52mg，0.16mmol，2当量)和1，10-菲咯啉(14mg，0.08mmol，1当量)的混合物在110℃的密闭管中的1mL甲苯中加热17小时。冷却的混合物通过Celite_过滤，然后浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为固体的14-2(5mg)。
除化合物14-1之外，根据步骤14C的方法中使用的芳基卤化物，合成并通过制备型LC-MS纯化得到下表中列举的化合物。

*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例157-咪唑-1-基甲基-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤15A将甲磺酰氯(100mg，0.86mmol，1.5当量)的DCM(0.5mL)溶液逐滴加入至0℃的化合物3-3(200mg，0.57mmol，1当量)在5mL DCM中的溶液中。将混合物在1小时内温热至室温，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液，混合物用2×20mL DCM萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为黄色泡沫的15a(180mg，49％收率)。
步骤15B将碳酸钾(20mg，0.14mmol，2.6当量)和咪唑(20mg，0.30mmol，5.5当量)加入至15a(23mg，0.054mmol，1当量)的DMF(1mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后加入甲醇(1mL)，并将反应混合物通过制备型HPLC/MS直接纯化，得到为TFA盐的15-1(10mg)。
根据所使用的亲核杂环或胺，合成并通过制备型LC-MS纯化得到下表中列举的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例164-甲基-2-吡咯-1-基-5-吡啶基硼酸
步骤16A在密闭试管中，将2-氨基-5-溴-4-甲基吡啶(1g，5.4mmol)和2，5-二羟基四氢呋喃(2.8g，27mmol)的乙酸(10mL)溶液在90℃下加热2小时。将反应混合物浓缩后，将残余物通过使用4∶1己烷/乙酸乙酯的硅胶色谱法纯化，得到为浅黄色油状物的16a(900mg，71％收率)。
步骤16B在-78℃下，将正丁基锂(3.6mL的2.0M的戊烷溶液，7.2mmol)逐滴加入至化合物16a(860mg，3.6mmol)和三异丙基硼酸酯(1.4g，7.3mmol)在6mL THF中的溶液中。将混合物在1小时内温热至室温，然后加入0.5mL的4N盐酸，将混合物搅拌10分钟。将混合物用2×25mL DCM萃取，然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为黄色油状物的16-1(250mg)。将水层浓缩，然后将固体残余物用乙醇洗涤。浓缩合并的乙醇滤液，得到另外的黄色油状物的16-1(500mg)。
实施例177-乙基-2，5-二甲基-3-{2-[2-(1-甲基-吡咯烷-2-基)-乙氧基]-4-吡唑-1-基-苯基}-吡唑并[1，5-A]嘧啶 步骤17A
向化合物2-6(350mg)的氯仿(5mL)溶液中加入BBr3(1.0M的DCM溶液，5mL)。混合物在室温下搅拌过夜后，用水猝灭。混合物用氯仿萃取(2×10mL)，然后将合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为油状物的化合物17-1(280mg)。将等分部分(aliquot)(10mg)通过制备型HPLC/MS纯化，得到纯的化合物17-1(2.9mg)。
步骤17B在150℃下，将含有化合物17-1(45mg，0.14mmol，1当量)、碳酸钾(56mg，0.41mmol，3当量)、碘化钠(20mg，0.13mmol，1当量)、2-(2-氯乙基)-1-甲基吡咯烷盐酸盐(39mg，0.21mmol，1.5当量)、丙酮(1mL)和水(1mL)的混合物在微波反应器中在密闭试管中加热25分钟。蒸发除去丙酮，然后将残余物用甲醇稀释，过滤并经制备型HPLC/MS直接纯化，得到为TFA盐的化合物17-2(14mg，20％)；MW444.58；LC/MS444[MH]+；tR6.010，分析方法2。
实施例187-(3-甲氧基-丙基)-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶 步骤18A向14-1(30mg)的无水DMF溶液中加入NaH(10mg，60％的分散体)。在室温下搅拌10分钟后，加入碘甲烷(0.015mL)。混合物搅拌1小时，然后加入甲醇(1mL)，将混合物经制备型HPLC/MS直接纯化，得到为TFA盐的化合物18-1(12mg)；MW391.47；LC/MS391[MH]+；tR7.050，分析方法2。
实施例192-[7-(2-甲氧基甲基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶-3-基]-5-吡唑-1-基-苯酚
步骤19A按照实施例18的步骤，使用化合物7-1作为起始原料，根据所使用的烷基卤化物，合成并通过制备型LC-MS纯化得到下表中列举的化合物。

*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例20
步骤20A在100℃下，将含有化合物1f(710mg，2.0mmol)、(2-乙氧基羰基)苯基硼酸(470mg，2.4mmol)、四(三苯基膦)钯(O)(116mg，0.1mmol)和碳酸钾(550mg，4.0mmol)的混合物在9∶1的二_烷/水(10mL)中加热2.5小时。加入氢氧化钠溶液(3N，10mL)，并将混合物在100℃下再搅拌30分钟。将冷却的混合物浓缩，然后加入水，使用盐酸调节pH至2。将混合物用氯仿萃取，然后将合并的氯仿萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到粗产物固体，将其由氯仿重结晶，得到为黄色固体的化合物20a(420mg，48％收率)。
步骤20B在70℃下，将化合物20a(420mg，0.96mmol)在10mL氯仿和亚硫酰氯(1.0mL，14mmol)中加热2小时。蒸发除去挥发物，得到为暗色固体的化合物20b(450mg)。
步骤20C在室温下，将20b(32mg，0.07mmol)的氯仿(1mL)溶液用吗啉(0.1mL，1mmol)处理。将混合物在室温下放置30分钟，然后蒸发除去溶剂。将残余物溶于甲醇中，过滤并通过制备型HPLC/MS直接纯化，得到为TFA盐的20-1(13mg，30％)。根据所使用的胺，合成并通过制备型HPLC-MS纯化得到下表中列举的化合物
*全部HPLC测定采用分析方法2。
实施例217-(1-乙基-1H-吡咯-2-基)-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤21A在110℃下，将含有化合物1f(210mg，0.6mmol)、N-Boc-吡咯-2-硼酸(158mg，0.75mmol)、四(三苯基膦)钯(O)(40mg，0.035mmol)和碳酸钾(166mg，1.2mmol)的混合物在密闭试管中的9∶1二_烷/水(5mL)中加热3小时。将冷却的混合物浓缩，然后加入水，混合物用氯仿萃取。将合并的氯仿萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到粗产物固体，将其在1∶1 TFA/DCM(3mL)中搅拌16小时。混合物用乙酸乙酯稀释，然后用氨水水溶液处理。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，然后将残余物经硅胶色谱法处理，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的21a(110mg，48％收率)。
步骤21B在室温下，向21a(110mg，0.28mmol)的无水DMF(2mL)溶液中加入氢化钠(20mg的60％矿物油分散体，0.5mmol)。混合物搅拌5分钟后，加入碘乙烷(0.050mL，0.60mmol)，将混合物在室温下搅拌2小时。加入水和乙酸乙酯，然后将乙酸乙酯层用水和盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的化合物21-1(84mg，73％收率)；MW412.50 LC/MS412[MH]+；tR7.630，分析方法2。
实施例227-(3-乙基-3H-咪唑-4-基)-3-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤22A将化合物1f(1.50g，4.25mmol)、2-苯乙烯基硼酸(692mg，4.68mmol)、碳酸钾(1.17g，8.50mmol)和四(三苯基膦)钯(O)(250mg，0.22mmol)在二_烷(9mL)和水(1mL)中的混合物在105℃下加热16小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，将残余物经硅胶色谱法处理，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的22a(1.60g，89％收率)。
步骤22B在-70℃下，将臭氧/氧气混合物鼓泡通过22a(1.60g，3.8mmol)在无水2∶1 DCM/甲醇(20mL)中的溶液中8分钟。加入甲硫醚(1.5mL)，将混合物搅拌后，在16小时内温热至室温。蒸发除去溶剂，将残余物经硅胶色谱法处理，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的化合物22b(1.0g，76％收率)。
步骤22C将22b(35mg，0.10mmol)、乙胺(1.0mL的2.0M的THF溶液，2.0mmol)、和硫酸镁在1，2-二氯乙烷中的混合物在室温下搅拌15小时。混合物过滤后，滤液蒸发至干。将残余物溶于1∶1乙醇/DME(2mL)中，然后加入TOSMIC(38mg，0.19mmol)和碳酸钾(55mg，0.4mmol)，将混合物回流17小时。加水后将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为油状物的化合物22-1(5mg)；MW413.48；LC/MS413[MH]+；tR5.000，分析方法2。
实施例233-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-7-(4-甲基-_唑-5-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶 将22b(208mg，0.60mmol)、α-甲基-TOSMIC(251mg，1.2mmol)和碳酸钾(248mg，1.8mmol)在5mL 1∶1 DME/乙醇中的混合物在80℃下加热14小时。加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为油状物的23-1(60mg，23％)；MW400.44；LC/MS400[MH]+；tR5.250，分析方法2。
实施例247-(4-氟-苄基)-2，5-二甲基-3-(4-甲基-6-吡咯-1-基-吡啶-3-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤24A向4-氟苯基氯化锌溶液(20mL的0.5M的THF溶液，10mmol)中加入化合物10b(1.0g，5.5mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(300mg，0.26mmol)。将反应混合物在密闭试管中于90℃加热3小时。将冷的反应混合物用4N盐酸(4mL)处理，然后加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化，用30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到为灰白色固体的24a(1.0g，71％收率)。
步骤24B将化合物24a(1.0g，3.9mmol)溶解于15mL甲醇中。向溶液中逐滴加入溴(0.62g，3.9mmol)，形成白色沉淀。将固体收集在烧结玻璃过滤器(frittedglass filter)上，用甲醇冲洗。将上述化合物进一步通过硅胶柱色谱法纯化，用4∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，首先得到二溴化产物(110mg，7％收率)，随后得到为白色固体的24b(1.0g，77％收率)。
步骤24C在密闭试管中，将化合物24b(800mg，2.4mmol)、化合物16-1(500mg，2.5mmol)、四(三苯基膦)钯(O)(280mg，0.24mmol)和碳酸钾(600mg，4.3mmol)的混合物在9∶1二_烷/水(3.5mL)中于95℃加热3小时。向冷却的混合物中加入碳酸氢钠水溶液(5mL)，然后将其用DCM萃取两次。将合并的DCM萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到粗产物油状物，将其部分地通过制备型HPLC/MS纯化。然后将部分纯化后的产物在硅胶上色谱处理，使用4∶1己烷/乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的化合物24-1(3mg)；MW411.48 LC/MS412[MH]+；tR9.160，分析方法2。
实施例253-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-7-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶
步骤25A向冷却至-70℃的1-甲基咪唑(246mg，3.0mmol)的无水THF(3mL)溶液中逐滴加入n-BuLi(2.5M的己烷溶液，1.7mL，4.2mmol)。将反应混合物在-70℃下搅拌10分钟，然后在5分钟内加入ZnCl2(0.5M的THF溶液，20mL，10mmol)。将混合物在-70℃下搅拌1小时，然后温热至0℃。加入化合物1f(106mg，0.30mmol)和四(三苯基膦)钯(O)(70mg，0.06mmol)。将混合物加热回流3小时。将冷却后的反应混合物用水猝灭，蒸发除去THF，将所得到的含水混合物用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，将残余物在硅胶上经色谱法处理，使用乙酸乙酯作为洗脱液，得到为黄色固体的25-1(15mg)；HPLC保留时间为4.13分钟(方法2)；MW 399.5；观察值MS 399。
实施例263-(2-甲氧基-4-吡唑-1-基-苯基)-2，5-二甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基)-吡唑并[1，5-A]嘧啶 步骤26A
向冷却至-70℃的1-甲基吡唑(820mg，10mmol)的无水THF(20mL)溶液中逐滴加入n-BuLi(1.6M的己烷溶液，6.3mL，10mmol)。将反应混合物在-70℃下搅拌5分钟，然后在5分钟内加入三异丙基硼酸酯(2.5mL，11mmol)。将混合物在1小时内温热至室温，然后加入6N盐酸(5ml)。将混合物搅拌30分钟，然后蒸发至干，得到为固体的粗产物26a，将其直接使用不再纯化。
步骤26B将化合物1f(530mg，1.5mmol)和粗产物26a(全部用量，大约10mmol)按照实施例1的步骤进行Suzuki反应。反应混合物浓缩后，加入水，混合物用氯仿萃取。合并的有机萃取液用硫酸钠干燥，过滤并浓缩后，然后将残余物通过硅胶色谱法纯化，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液。产物由乙腈结晶来进一步纯化，得到为黄色固体的化合物26-1(280mg)；HPLC保留时间为6.42分钟(方法2)；MW 399.5；观察值MS 399。
实施例27CRF受体结合活性按照通常如Grigoriadis等人(Mol.Pharmacol vol 50，pp 679-686，1996)和Hoare等人(Mol.Pharmacol vol 63，pp 751-765，2003)描述的标准放射性配体结合测定，可以评价本发明化合物对CRF受体的结合活性。利用放射性标记的CRF配体，该测定可用于评价本发明化合物对任何CRF受体亚型的结合活性。
简单地说，该结合测定涉及从CRF受体中置换出放射性标记的CRF配体。更具体地说，该结合测定是在96孔测定板中，使用1-10μg来自稳定转染有人类CRF受体的细胞上的细胞膜来完成的。每个孔接受大约0.05ml测定缓冲液(例如Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水、10mM氯化镁、2mM EGTA)，其中含有感兴趣化合物或参照配体(例如蛙皮降压肽、尿皮质醇I或CRF)、0.05mL的[125I]酪氨酸-蛙皮降压肽(最终浓度为～150pM或者大约为根据Scatchard分析测得的KD)和0.1mL含有CRF受体的细胞膜悬浮液。将混合物在22℃下培养2小时后，在玻璃纤维过滤器上通过快速过滤使被结合与游离的放射性配体分离。洗涤三次后，将过滤器干燥，使用闪烁计数器对放射性进行计数(来自125I的俄歇(Auger)电子)。全部放射性配体结合数据可以使用非线性最小二乘法曲线拟合程序Prism(GraphPad Software Inc)或XLfit(ID Business Solutions Ltd)分析。
实施例28CRF-刺激的腺苷酸环化酶活性也可以通过各种功能测试对本发明化合物进行评价。例如可以根据CRF-刺激的腺苷酸环化酶活性来筛选本发明的化合物。用于测量CRF-刺激的腺苷酸环化酶活性的测定可以按照通常如Battaglia等人描述的方法(Synapse 1572，1987)进行，并作适当修饰使上述测定适用于全细胞制备物。
更具体地说，标准测定混合物在0.1ml的最终体积中可以含有下述组分2mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES和1mM IMBX的DMEM缓冲液。在刺激研究中，为了建立特定受体亚型的药理学等级次序，将转染有CRF受体的全细胞平板接种(plated)在96孔板中，然后在37℃下用不同浓度的CRF相关和不相关的肽培养30分钟。培养后，使用可商购得到的标准试剂盒例如来自Applied Biosystems的cAMP-ScreenTM，测量样本中的cAMP。为了对化合物进行功能性评价，将引起50％刺激cAMP产生的细胞以及单一浓度的CRF或相关肽与不同浓度的竞争性化合物在37℃下一起培养30分钟，并按照上述方法测量cAMP。
应该理解的是，尽管出于示例性说明的目的，已经对本发明的各种具体实施方案进行了描述，但是仍然可以在不偏离本发明的主旨和范围的情况下进行各种变型。因此，本发明并不受后面权利要求书的限制。
权利要求
1.具有下述结构的化合物，或者其可药用盐、酯、溶剂化物、立体异构体或前药， 其中“---”表示任选的双键中的第二个键；R1是氢、烷基、被取代的烷基、杂芳基、被取代的杂芳基、-NH2、或者卤素；R2是烷基、被取代的烷基、-C(O)NR7R8、芳基、被取代的芳基、芳氧基烷基、被取代的芳氧基烷基、杂芳基烷氧基烷基、被取代的杂芳基烷氧基烷基、杂环烷基、被取代的杂环烷基、芳烷基、被取代的芳烷基、杂芳基、或者被取代的杂芳基，其中所述杂芳基或者被取代的杂芳基通过碳-碳键与嘧啶环相连；R3不存在，或者是氢、或烷基；Y是＝(CR4)-或-(C＝O)-；R4是氢、烷基、被取代的烷基、烷硫基、烷基亚磺酰基、或烷基磺酰基；Ar是苯基、被1或2个R5取代的苯基、吡啶基或者被1或2个R5取代的吡啶基；R5在各种情况下是羟基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、氰基、卤素、烷基磺酰基、或者烷基亚磺酰基；Het是任选被1或2个R6取代的杂芳基；R6在各种情况下是羟基、烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、氰基、或者卤素；以及R7和R8独立地是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂环、被取代的杂环、芳烷基、被取代的芳烷基、杂环烷基或者被取代的杂环烷基；或者R7和R8与它们相连的氮一起形成杂环或被取代的杂环。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1是氢、烷基、被取代的烷基、-NH2、或卤素。
3.根据权利要求1的化合物，其中R2是烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、或者被取代的杂芳基，其中所述杂芳基或被取代的杂芳基通过碳-碳键与嘧啶环相连。
4.根据权利要求1的化合物，其中R3不存在。
5.根据权利要求4的化合物，其中Y是＝(CR4)-。
6.根据权利要求5的化合物，其中R4是氢、烷基、或被取代的烷基。
7.粮拓权利要求1的化合物，其中R3是氢或烷基。
8.根据权利要求7的化合物，其中Y是-(C＝O)-。
9.根据权利要求1的化合物，其中Ar是被1个R5取代的苯基。
10.根据权利要求9的化合物，其中R5是烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、氰基、卤素、烷基磺酰基、或者烷基亚磺酰基。
11.根据权利要求1的化合物，其中Het被1个R6取代。
12.根据权利要求11的化合物，其中R6是烷基、被取代的烷基、烷氧基、被取代的烷氧基、氰基、或卤素。
13.根据权利要求1的化合物，其中R1是氢、烷基或被取代的烷基；R3不存在；Y是＝(CR4)-；R4是氢、烷基或被取代的烷基；Ar是被一个R5取代的苯基；R5是烷基、被取代的烷基、烷氧基或被取代的烷氧基；以及Het是杂芳基。
14.根据权利要求13的化合物，其中R1是低级烷基；R4是低级烷基；R5是烷氧基；以及Het是吡唑基。
15.根据权利要求14的化合物，其中R1是甲基；R4是甲基；以及R5是甲氧基。
16.根据权利要求15的化合物，其中R2是烷基、被取代的芳烷基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、被取代的杂芳基烷氧基烷基、杂芳基烷基或者被取代的杂芳基烷基。
17.根据权利要求16的化合物，其中R2是裱取代的芳烷基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基。
18.根据权利要求17的化合物，其中R2是被取代的苄基、被取代的苯基、被取代的吡唑基、吡啶基或者被取代的吡啶基。
19.根据权利要求18的化合物，其中R2是被取代的吡唑基、吡啶基或被取代的吡啶基。
20.根据权利要求19的化合物，其中R2是被取代的吡啶基。
21.根据权利要求20的化合物，其中R2是被甲基取代的吡啶基或被甲氧基取代的吡啶基。
22.根据权利要求21的化合物，其中所述化合物如下式所示
23.药物组合物，所述组合物含有权利要求1的化合物和可药用载体或稀释剂。
24.治疗哺乳动物中显示为CRF分泌过多的疾病的方法，所述方法包括向该动物给药有效量的权利要求23的药物组合物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述疾病是中风。
26.根据权利要求24的方法，其中所述疾病是抑郁症。
27.根据权利要求24的方法，其中所述疾病是焦虑相关疾病。
28.根据权利要求24的方法，其中所述疾病是强迫观念与行为的障碍。
29.根据权利要求24的方法，其中所述疾病是过敏性肠综合征。
30.根据权利要求24的方法，其中所述疾病是神经性厌食症。
全文摘要
本发明公开了可用于治疗各种疾病的CRF受体拮抗剂，其中包括治疗温血动物中表现为CRF分泌过多的疾病(例如中风)。本发明的CRF受体拮抗剂具有下述结构(I)包括其立体异构体、前药和可药用盐，其中R
文档编号A61K31/495GK1938309SQ200480042012
公开日2007年3月28日 申请日期2004年12月20日 优先权日2003年12月22日
发明者罗志勇, 德博拉·斯利, 约翰·E·特卢, 约翰·威廉斯, 张小虎 申请人:Sb药物波多黎各公司, 纽罗克里恩生物科学公司