专利名称：用抗血清筛选插入突变体文库鉴定抗原性重要的奈瑟氏球菌属抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗，尤其涉及一种鉴定作为疫苗候选物的微生物多肽的方法。
在此说明书中先前公开的资料列表或其讨论必定不能被认为此资料是现有技术部分或是公知技术。因此，说明书中列出的资料以引用的方式并入本文中。
微生物感染仍旧严重威胁人类和动物的健康，尤其根据这样的事实，即许多病原微生物，尤其是细菌对抗微生物剂如抗生素具有或变得具有耐药性。
接种疫苗提供了另一种抗微生物感染的方法，但是鉴定用于安全以及有效地针对一系列不同病原微生物分离株，尤其是遗传多样性微生物的疫苗的合适的免疫原常常是困难的。尽管开发基本完整的微生物作为免疫原的疫苗(例如通常在决定毒力基因中含有一种或多种突变的活减毒细菌)是可能的，并非所有微生物适用于此方法，并且对于不能总是保证安全性的特殊微生物来说不总是期望采用此方法。另外，某些微生物表达模拟宿主蛋白的分子，这在疫苗中是不期望的。
进一步开发疫苗是重要的一特殊群微生物是奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)，可引起脑膜炎球菌疾病，该疾病为威胁生命的感染，尽管引入了偶联型血清群C多糖疫苗，其在欧洲、北美、发展中国家及其它地方仍是儿童死亡的重要原因。这是因为表达α2-8连接的多聚唾液酸夹膜的B血清群菌株(NmB)引起的感染仍旧流行。奈瑟氏脑膜炎球菌相关的术语“血清群(serogroup)”是指表达在细菌上的多糖夹膜。在英国引起疾病的常见血清群为B群，而在非洲为A群。脑膜炎球菌败血病持续导致高病死率，而且幸存者常遗留有严重的心理及/或躯体残疾。在非特异性前驱期疾病之后，脑膜炎球菌败血症可表现为对适当的抗微生物感染治疗及完全支持性措施难以治疗的暴发疾病。因此，抵抗脑膜炎球菌疾病公共健康威胁的最佳方法是通过预防接种。
脑膜炎球菌感染的非特异性早期临床症状和暴发病程表明治疗措施常常是无效的。因此，认为预防接种是减少此病原体引起的全球疾病负担的最有效策略(Feavers(2000)ABC of meningococcal diversity.Nature 404，451-2)。目前预防A、C、W135及Y血清群奈瑟氏脑膜炎球菌感染的疫苗以细菌表面的多糖夹膜为基础(Anderson et al(1994)Safety andimmunogenicity of meningococcal A and C polysaccharide conjugate vaccine inadults.Infect Immun.62，3391-33955；Leach et al(1997)Induction ofimmunologic memory in Gambian children by vaccination in infancy with agroup A plus group C meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine.J Infect Dis.175，200-4；Lieberman et al(1996).Safety and immunogenicity of aserogroups A/C Neisseria meningitidfis oligosaccharide-protein conjugatevaccine in young children.A randomized controlled tria.J.American Med.Assoc.275，1499-1503)。由于B血清群夹膜(一种α2-8连接的唾液酸的均聚物)是对人相对较差的免疫原，其疫苗的进展较为困难。这是因为其共有表达在人类细胞粘附分子N-CAM1上的抗原表位(Finne et al(1983)Antigenicsimilarities between brain components and bacteria causing meningitis.Implications for vaccine development and pathogenesis.Lancet 2，355-357)。的确，针对血B清群夹膜产生免疫反应实际上是有害的。因此，仍需要新型疫苗以预防B血清群奈瑟氏脑膜炎球菌感染。
针对脑膜炎球菌疾病的保护性有关的最有效免疫学检测方法是血清杀菌试验(SBA)。SBA评估血清中抗体(通常IgG2a亚类)介导细菌细胞表面补体沉积、膜攻击复合体组装及细菌裂解的能力。在SBA，已知数量的细菌被暴露于含确定补体来源的系列稀释血清。确定存活细菌数目，SBA被定义为介导50％杀伤的最高血清稀释度的倒数。SBA可提示针对C血清群感染的保护性，普通用作针对NmB感染免疫的代用词。重要的是，SBA是疫苗临床前评价免疫的标志，在临床试验中提供合适的终点。
对于NmB疫苗开发的大多数努力是针对确定的有效蛋白亚单位。在“反向疫苗学”具有较多的投入，其中对基因组序列的潜在表面表达蛋白进行了探讨，该蛋白被表达为异种抗原并对其在动物产生有意义的反应进行了试验。然而，此方法受到以下几个方面的限制1)预测表面表达抗原的计算机算法，2)不能表达许多潜在抗原，以及3)对鼠免疫反应的总体依赖。
成功免疫的关键是确定针对无关血清群或克隆群的广泛疾病分离株引发的保护性的抗原。本发明的目的是使用抗原筛选方法(我们定义为免疫原遗传筛选方法或GSI)分离微生物菌株遗传多样性保守的抗原，并关于脑膜炎球菌菌株作示例说明。如下面更为详细的描述，这可以通过GSI鉴定微生物抗原如奈瑟氏脑膜炎球菌抗原实现，以及通过评价重组抗原引发的免疫反应的功能进行和评估抗原的保护效力来验证。
尽管以前在研究中对于疫苗候选物使用了遗传学方法，但迄今难以建立高流通量分析方法，并且难以区别免疫原和保护性抗原。
本发明首先提供了一种鉴定微生物多肽的方法，其中多肽与受微生物处理的动物免疫反应有关，该方法包括如下步骤(1)提供微生物的众多不同突变体；(2)使这些众多突变体微生物与对该微生物或其部分产生免疫反应的动物的抗体接触，其条件是如果抗体结合突变体微生物，突变体微生物被杀伤；(3)从步骤(2)选择存活的突变体微生物；(4)鉴定在存活突变体微生物中含有突变的基因；以及(5)鉴定该基因编码的多肽。
多肽相关的免疫反应在其可与抗微生物引起的动物感染有关的意义上是功能上重要的反应。
微生物可为任何微生物，例如细菌或酵母菌。优选地，微生物为病原微生物，尤其病原细菌，例如引起脑膜炎疾病的奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)或引起淋病的奈瑟氏淋病球菌(Neisseria gonorrhoeae)或引起至少一种类型流行性感冒及中耳感染的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。
对于“受微生物处理的动物的免疫反应相关的多肽”，我们包括任何此类多肽。本发明方法能够鉴定微生物多肽，在动物体内当动物免疫系统与该微生物多肽接触时产生针对此多肽的抗体。通常该多肽为表达在微生物表面的多肽。动物的免疫反应为抗体反应，通常为IgG反应。
在本发明的一个优选实施方案中，通过微生物感染例如自然感染使动物受微生物处理。因此，动物通常是微生物宿主。在本发明的另一个实施方案中，有目的地给予动物接种微生物(无论是活的还是被杀伤的)或其部分。通过任一种方法，动物免疫反应均产生针对微生物的抗体，其中某些抗体选择性针对微生物的特有多肽，通过本发明方法可用于鉴定多肽。
应该知道术语“动物”包括人，在本发明特殊优选的实施方案中，如下文更为详细的描述，步骤(2)中使用的抗体来源于被或已经被微生物感染或已经以微生物部分免疫的人。
通过使用针对微生物或其部分产生免疫反应的动物的抗体，可以鉴定免疫相关多肽(在免疫原性和疫苗设计的上下文中，尤其可以鉴定具有保护性的多肽)。
因此，应该知道使用本发明的方法鉴定的多肽为抗原或免疫原(这些术语在说明书中可替换使用)，通常暴露于表面，在动物产生免疫反应，因此为疫苗候选物。
不同突变体微生物的众多成员(或库)的量通常足够大以给予微生物的每一基因被突变的高机会(通常＞95％)。所需突变数量取决于微生物基因组中的基因数。当突变体为随机突变体时，给予基因组中每一基因一个突变体高突变机会的所需突变体数大约为基因数的10倍。因此，步骤(1)中提供的突变体微生物数通常地为微生物中基因数的大约10-20倍，通常，细菌具有500-5000个基因，所使用的随机突变体数为5000-100,000左右，在奈瑟氏脑膜炎球菌，随机突变体的合适数目为40,000。
随机突变体可为任何类型的随机突变体，例如化学诱导的随机突变体，优选地，突变体为插入突变体，例如转座子突变体，这是由于鉴定插入位置直接(如使用选择性针对插入元件如转座子的探针或PCR引物)，而且通常转座子携带可选择含转座子的突变体的抗生素抗性标记。
适于整合入革兰氏阴性菌基因组的转座子包括Tn5、Tn10及其衍生物。适于整合入革兰氏阳性菌基因组的转座子包括Tn916及其衍生物或类似物。尤其适于金黄色葡萄球菌使用的转座子包括Tn917(Cheung et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6462-6466)及Tn918(Albus et al(1991)Infect.Immun.59，1008-1014)。
如果转座子具有Camilli et al((1990)J.Bacteriol.172，3738-3744)描述的Tn917衍生物的特征，并由温度敏感载体如pE194Ts(Villafane et al(1987)J.Bacteriol.169，4822-4829)携带，则尤为优选。
对于奈瑟氏脑膜炎球菌，尽管任何转座子和具有体外活性的转座酶可以使用，但Tn10为优选的转座子(参见see Sun et al(2000)Nature Med.6，1269-1273)。
应该知道尽管转座子便于插入性使基因失活，但任何其它已知方法或未来开发的方法也可以被使用。便于插入性使基因失活的其它方法，尤其在某些细菌如链球菌中使用的其它方法是使用插入复制诱变作用，如Monison et al(1984)J.Bacteriol 159，870关于肺炎链球菌的描述。一般方法也可用于其它微生物，尤其细菌。
对于真菌，插入突变是通过使用DNA片断或优选地携带编码如抗潮霉素B或福来霉素的选择性标记的质粒转化而实现的(参见Smith et al(1994)Infect.Immunol.62，5247-5254)。已知使用限制酶介导的整合使编码潮霉素B抗性的DNA片断随机、单一整合入丝状真菌基因组(REMI；Schiestl & Petes(1991)；Lu et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12649-12653)。
霉菌的简单插入诱变技术参见Schiestl & Petes(1994)，以引用的方式并入本文中，包括例如酵母Ty元件及酵母核糖体DNA的使用。
转座子或其它DNA序列的随机整合使众多独立突变的微生物得以分离，其中在每一突变体不同基因被插入性失活。
对于某些微生物，已知每一基因通过转座子或其它插入元件突变的突变体文库。在此情况下，众多微生物可通过汇集文库的每一成员的一个或多个代表而产生。例如，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的综合转座子文库描述于Jacobs et al(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，14339-14344。
在方法的步骤(2)中，使众多突变微生物与产生针对微生物或其部分的免疫反应的动物的抗体接触。抗体可为任何适当的形式，来自动物(包括人)的任何适当、方便的来源。通常，抗体存在于来自动物的血清。然而，它们可以其它形式存在，例如IgG富集的级分。优选地抗体为IgG抗体，但其它抗体类型也可使用，例如IgA和IgM。尽管优选地抗体存在于或来自于血清，但抗体可存在或衍生于其它体液如唾液。
抗体通常来自被或已被微生物感染的动物。本发明方法中的实施方案其中一个优点是它使用来自产生相关免疫反应以抗微生物感染的动物的抗体，并且此类抗体可能结合用于疫苗的多肽。因此，优选的抗体为来自被或已被微生物感染的人，或被接种微生物的减毒株(如疫苗)的人或已被使用包含微生物一部分(例如外膜成分的部分)的疫苗免疫接种的人。通常，本发明方法的步骤(2)中使用的抗体来自已产生针对微生物的保护性反应的动物(如人)。
另外，抗体来自动物，例如实验动物，如鼠、兔、羊或马，这些动物已被接种微生物，或使其产生免疫反应，优选地保护性免疫反应。是否产生保护性反应可通过接种后使用活细菌攻击动物来确定。实验动物可以使用微生物的毒性致病菌株接种，或使用无毒性或减毒的菌株(无论是活的还是被杀死的)接种。
在优选的实施方案中，针对用于产生突变体微生物的菌株而言“异源(heterologous)”的微生物菌株产生抗体。许多病原微生物存在于不同血清群或菌株中，每一血清群或菌株可具有与其它血清群或菌株相同的多肽及血清群或菌株本身独有的多肽。使用针对一种或多种异源菌株的抗体的有利之处在于其可增加鉴定微生物所有血清群共有的多肽(即保守的、共有的抗原表位)的机会。此类多肽(或其片断或其变异体或其融合体)较可能针对特定微生物的一系列血清群有效。因此，在特殊的优选的实施方案中，微生物为奈瑟氏脑膜炎球菌，众多突变体微生物来自亲代B血清群菌株，而抗体则来自产生针对A血清群和/或C血清群菌株的反应的动物(如人)。应该知道抗体可由多个来源汇集。例如，来自A血清群菌株感染(或感染康复)的病人血清可与来自C血清群菌株感染(或感染康复)的病人血清汇集。B血清群菌株感染(或感染康复)的病人血清也可以被汇集。某些微生物除细胞壁或细胞膜的多肽成分外，还具有常为免疫原的多糖成分。在另一优选的实施方案中，很方便地使用微生物菌株，由于产生针对此菌株的抗体的该微生物中有些或所有多糖成分被去除。因此，许多细菌具有主要由多糖构成的夹膜，但通常菌株以无夹膜形式存在。这些“夹膜阴性”菌株可以方便地用于产生本发明方法的第二步骤中使用的抗体。
关于奈瑟氏脑膜炎球菌，抗体可方便地存在于下述血清来源中使用奈瑟氏脑膜炎球菌异源株(即相对用于筛选的突变株而言是异源的)通过全身途径免疫的小鼠；感染奈瑟氏脑膜炎球菌的急性期及恢复期病人；以衍生自B血清群NmB分离株H44/76的确定的外膜囊泡(OMVs)免疫的病人。由于病人对感染细菌产生显著的免疫反应，恢复期血清为优选。在某些情况下，由于急性期病人不会产生显著免疫反应，使用急性病人血清作为恢复期血清的对照是有用的。关于其它微生物可获得同样来源的抗体。
提供条件以使当抗体结合突变体微生物时，突变体微生物被杀伤，而当抗体不结合突变体微生物时，突变体微生物则不被杀伤。这样，可以看到那些编码结合抗体的多肽的基因被突变，以致抗体不再结合此多肽的突变体微生物存活。这对于此突变体提供了非常强大的筛选，便于确定与感染微生物的动物的免疫反应相关的多肽。作为对照，可方便地使用在给定条件下被杀伤的野生型微生物，或开发所有野生型微生物被杀伤的条件。
很方便地，一旦使抗体与突变体微生物接触，即添加一来源的补体，例如来自人、兔、鼠、羊和马的补体。很方便地，补体来自和抗体相同的来源(即动物种类)。抗体(通常IgG 2a亚类)介导微生物表面的补体沉积，膜攻击复合体的组装和微生物的裂解。补体介导的杀伤不依赖于血液细胞的存在，但是需要血清的存在。补体介导的杀伤可以通过加热血清而失活。
优选地，在此实施方案中，微生物为细菌，革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。补体介导的杀伤在Walport(2001)N.Engl.J.Med.344，1140-1144及Walport(2001)N.Eng J.Med.344，1058-1066中有所描述。
由于以相同原理为基础的血清杀菌试验(SBA，参见Goldsclmeider et al(1969)J.Exp.Med.129，1307-1326)如引言中所述被使用，杀伤保留结合抗体能力的微生物的补体沉积途径尤其适用于奈瑟氏脑膜炎球菌。当然，在SBA，存活细菌数量用于评价血清在杀伤细菌中的有效性(并将此作为由用于产生抗体的菌株提供的保护程度的标志)。就发明者所知，尚未有此方法适用于鉴定微生物抗原的提议。
作为使用补体杀伤抗体结合细胞的替代方法，可使用选择性结合抗体(结合细胞)及递送细胞毒剂至细胞的部分。例如，此部分可为识别结合至微生物或递送细胞毒剂至细胞的抗体的另一个抗体。因此，当结合突变体微生物的抗体为人抗体时，另一抗体可为抗人抗体。细胞毒剂可为直接细胞毒性的或间接细胞毒性的。对于间接细胞毒性，我们包括一种能够激活对于细胞毒化合物而言相对无毒性的化合物的酶。使用肿瘤选择性抗体的相似技术已用于靶向肿瘤细胞，被称为ADEPT(抗体定向酶-前药物疗法，参见WO88/07378；Bagshawe(1987)Br.J.Cancer 56，531-532；Bagshawe et al(1988)Br.J.Cancer 58，700-703；及Senter et al(1988S)Proc.Natl.Acad.SciUSA 85，4842-4846，所有内容以引用的方式并入本文中)。
酶-前体药物对包括如下形式用于将含磷酸酯的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸酯的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨基酶；用于将含肽产物转化为游离药物的蛋白酶，例如灵杆菌蛋白酶(Serratiaprotease)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶及组织蛋白酶；用于转化含D-氨基酸替代物的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶(D-alanylcarboxypeptidase)；用于将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物酶，例如β-半乳糖苷酶及神经氨酸酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶以及用于将在其胺氮位置苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶。
其它酶和前体药物包括水解酶、酰胺酶、硫酸酯酶、脂肪酶、葡糖醛酸酶、磷酸酯酶以及羧肽酶，以及从不同类型抗肿瘤化合物制备的前体药物，例如烷化剂(氮芥)(包括环磷酰胺、bisulphan、苯丁酸氮芥(chlorambucil)及亚硝脲(nitrosoureas))、嵌入剂(包括阿霉素及更生霉素)、纺锤体抑制剂(例如长春花生物碱)、以及抗代谢药物(包括叶酸拮抗剂、抗嘌呤剂、抗嘧啶剂或羟基脲)。
还包括生氰前体药，例如使用碳水化合物剪切酶产生氰化物的苦杏仁甙(amygdalin)。
经历一定条件例如杀伤所有野生型(或亲代)微生物(及确切地是大多数突变体)的那些条件而存活的突变体微生物被选用于进一步的研究，这是由于这些突变体微生物可能在编码结合抗体的多肽的基因被突变(并因此与免疫反应有关)。在一个实施方案中，为确证存活突变体中的突变与赋予抵抗杀伤的能力有关，每一突变体的突变可以回交至亲代菌株中并且确定突变回交突变体在杀伤条件下存活的能力。
含突变的基因使用本技术领域为人熟知的方法鉴定。例如，突变为插入突变时，可方便地从微生物的侧翼DNA的插入处测序。当转座子用于制备突变体微生物时，可通过下述步骤方便地鉴定含转座子突变的基因使用剪切转座子外部的限制酶消化步骤(3)中选择的个体突变体基因组DNA、连接含进入质粒的转座子的大小不等的DNA以及根据转座子而非质粒提供的抗生素抗性选择质粒重组体。邻近转座子的微生物基因组DNA可通过使用退火至转座子终末区的两个引物及退火接近质粒的多聚接头(polylinker)序列的两个引物进行测序。序列可通过DNA数据库检索来确定转座子是否已中断已知基因。因此，由此方法获得的序列可方便地与存在于公共已知的数据库例如EMBL及GenBank中的序列或完整基因组序列(如果可以获得的话)进行比较。
对于“基因”我们不仅包括编码多肽的DNA区还包括DNA的调控区，例如调控转录、翻译及对于某些微生物的RNA的剪接的DNA区。因此，基因包括启动子、转录终止子、核糖体结合序列及某些微生物的内含子和剪接识别位点。
通常，步骤(4)中获得的被鉴定基因的序列信息是衍生的。接近转座子末端的序列被方便地用作测序引物的杂交位点。邻近失活基因本身的衍生序列或DNA限制性酶切片断被用来制备杂交探针以从相应的野生型微生物鉴定及分离野生型基因。
优选地杂交探测在严格的条件下进行以确保至少在鉴定基因时获得该基因而不是相关基因。
可使用标准方法对基因进行测序并例如通过翻译基因编码序列鉴定基因编码的多肽，或序列可以作为已测序的微生物基因组部分而获得。
如实施例中更详细描述，通过本发明方法鉴定的特殊基因为奈瑟氏脑膜炎球菌的NBM0341(TspA)、NMB0338、NMB1345、NMB0738、NBM0792(NadC家族)、NMB0279、NMB2050、NMB1335(CreA)、NMB2035、NMB1351(Fmu及Fmv)、NMB1574(IIvC)、NMB1298(rsuA)、NMB1856(LysR家族)、NMB0119、NMB1705(rfak)、NMB2065(HemK)、NMB0339、NMB0401(putA)、NMB1467(PPX)、NMB2056、NMB0808、NMB0774(upp)、NMA0078、NMB0337(支链氨基酸转移酶)、NMB0191(ParA家族)、NMB1710(谷氨酸脱氢酶(gdhA)、NMB0062(rfbA-1)以及NMB1583(hisB)基因。奈瑟氏脑膜炎球菌基因组从如美国基因组研究所(TIGR)www.tigr.org获得。尽管这些基因形成已经被测序的基因组部分，但就发明者所知，它们尚未被分离，它们编码的多肽尚未生产，并且无证据表明它们编码的多肽可用作疫苗成分。
因此，本发明包括上述及实施例中的分离基因及变异体和片断以及这些变异体和片断的融合体，并包括上述基因编码的多肽，连同其变异体和片断，以及这些片断和变异体的融合体。变异体、片断及融合体在下面较详细描述。优选地，上述给定基因的变异体、片断及融合体编码产生针对奈瑟氏脑膜炎球菌的中和抗体的多肽。相似地，优选地，上述给定序列的多肽的变异体、片断及融合体产生针对奈瑟氏脑膜炎球菌的中和抗体。本发明还包括编码多肽的分离的多核苷酸(其序列在实施例中给出(优选地为分离的编码区))或编码变异体、片断或融合体的多核苷酸。本发明还包括含有这些多核苷酸的表达载体及含有这些多核苷酸和载体的宿主细胞(如下更详细描述)。实施例中描述的多肽为通过本发明方法鉴定的抗原。
本发明方法实践中使用的分子生物学方法为本领域为人熟知的技术，例如可参见Sambrook & Russell(2001)(分子克隆，实验室手册，第三版，纽约，冷泉港，冷泉港实验室出版社)，以引用的方式并入本文中。
应该知道本发明还包括实施方法的步骤(1)-步骤(4)(但不一定包括步骤(5))，从而鉴定编码受微生物处理的动物免疫反应相关多肽的基因。基因可例如通过使用以其序列为基础的引物进行多聚酶链式反应被克隆及测序或被分离或合成。基因变异体可例如通过鉴定其它微生物中或微生物其它菌株中的相关基因，以及克隆、分离或合成基因进行制备。通常，基因的变异体与使用本发明方法分离的基因具有至少70％的序列同一性，更优选地至少85％的序列同一性，最优选地至少95％的序列同一性。当然，可容许替代、缺失及插入。某一核酸序列和其它核酸序列之间的相似程度可通过使用威斯康星大学Computer Group的GAP程序进行测定。
基因变异体还可在严格的条件下与基因杂交，对于“严格的”我们指基因与探针杂交的条件是基因被固定于膜上，探针(在此情况下为＞200核苷酸长度)处于溶液中并且被固定的基因/杂交探针在0.1×SSC65℃洗涤10分钟。SSC为0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠。
可制备总基因的例如20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％的基因片断(或变异体基因)。优选的片断包括编码序列的全部或部分。变异体或片断可被融合至其它无关多核苷酸。
因此，本发明还包括一种制备多核苷酸的方法，该方法包括实施本发明方法的步骤(1)-(4)制备多核苷酸，并分离或合成被鉴定的基因或其变异体或片断，或此基因或其变异体或片断的融合体。本发明还包括由本发明方法可获得或已获得的多核苷酸。
优选地，多核苷酸编码多肽，该多肽具有免疫原性并且与如下抗体反应，该抗体来源于经微生物处理的、所鉴定的基因来源的动物。
本发明还包括筛选编码多肽的基因突变的微生物的方法，所述多肽与受微生物处理的动物免疫反应相关。此方法包括实施本发明方法的步骤(1)-(3)(或者还实施步骤(4)和/或(5))。本发明还包括本发明方法可获得或已获得的不能结合抗体的突变体微生物。
尽管如上所述，本发明方法用于鉴定基因和选择突变体微生物，尤其优选地，如果本发明的方法用于鉴定来自微生物的多肽，那么该多肽与免疫反应相关。一旦被鉴定，根据该多肽制备抗原是需要的。
抗原可为被鉴定基因编码的多肽，多肽序列可容易地从基因序列推导出。在另一个实施方案中，抗原可为被鉴定多肽的片断或被鉴定多肽的变异体或该多肽和片断或变异体的融合体。
可制备总多肽的例如20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％的被鉴定多肽片断。通常，片断至少为10、15、20、30、40、50、100个或更多氨基酸，但少于500、400、300或200个氨基酸。可制备多肽的变异体。对于“变异体”，包括插入、缺失及替代(无论是保守还是非保守的)，这些变化不会在本质上改变蛋白质的正常功能。对于“保守替代”，指如甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨基酸；天冬氨酸、谷氨酸；天门冬酰胺、冬氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸之间的组合。此变异体可通过使用蛋白质工程和针对位点的诱变的已知方法进行制备。
特殊类型变异体由上述例如来自相关微生物或所述微生物的其它菌株的变异体基因所编码。通常，变异体多肽与使用本发明方法鉴定的多肽具有至少70％的序列同一性，更优选地至少85％的序列同一性，最优选地至少95％的序列同一性。
两个多肽之间的序列同一性百分数可以通过使用合适的计算机程序，例如威斯康星大学Genetic Computing Group的GAP程序进行确定，应该知道对已就其序列已进行过最佳比对的多肽计算序列同一性百分数。
另外，也可使用Clustal W程序进行序列比对(Thompson etal.，(1994)Nucleic Acids Res 22，4673-80)。所使用的参数如下快速配对比对参数K-tuple(字符)大小；1，窗口大小；5，差异补偿；3，顶端斜线数(number of top diagonals)；5.评分方法x％。
序列多重对比参数差异开放补偿(gap open penalty)；10，差异延伸补偿；0.05.得分矩阵BLOSUM。
融合体可为与任何合适的多肽的融合体。通常，多肽能够增强对其所融合的多肽的免疫反应。融合配对体可为使纯化容易进行的多肽，例如通过为能够被固定在例如亲和层析柱的部分构成结合位点。因此，融合配对体可含有结合钴或镍离子的寡组氨酸或其它氨基酸，还可以为单克隆抗体的抗原表位如Myc表位。
因此，本发明还包括按上述制备抗原的方法，以及由此方法可获得或已获得的抗原。
本发明的多核苷酸可被克隆至载体中，如本领域为人熟知的表达载体。这些载体可存在于宿主细胞中，例如细菌、酵母、哺乳动物及昆虫宿主细胞。本发明的抗原可容易地在合适的宿主细胞中从多核苷酸表达，并分离用于疫苗。
通常使用的表达系统包括可商购的pET表达载体系列及大肠杆菌宿主细胞例如BL21。所表达的多肽可通过本领域已知的方法纯化。很方便地，如上所述使抗原与结合至亲和层析柱的融合配对体融合，并使用亲和层析柱纯化融合体(例如镍离子或钴离子亲和柱)。
应该知道抗原或编码抗原的多核苷酸(如DNA分子)尤其适用于疫苗。在此情况下，从产生抗原的宿主中纯化抗原(或如果由肽合成产生则从任何合成的污染物中纯化)。通常抗原在其制备成制剂用于疫苗之前含有少于5％的污染物，优选地少于2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％。期望抗原基本上无热原。因此，本发明还包括含抗原的疫苗及制备包含使抗原与合适载体如磷酸盐缓冲盐水混合的疫苗的方法。尽管本发明的抗原可能被单独给药，但其优选地连同一种或多种可接受的载体作为制剂配方给药。载体必须在与本发明抗原匹配及对接受者无毒的意义上为“可接受的”。通常，载体为无菌及无热原的水或盐水。
疫苗还可包括佐剂。病人的主动免疫接种是优选的。在此方法中，一种或多种抗原以含有合适佐剂及载体的免疫原制剂形式制备，并以已知途径施用给病人。合适的佐剂包括福氏完全或不完全佐剂、胞壁酰二肽、EP 109942、EP 180 564及EP 231 039的“免疫刺激复合物(Iscoms)”、氢氧化铝、皂角甙、DEAE-葡聚糖、中性油脂(例如miglyol)、植物油(例如花生油)、脂质体、Pluronic多元醇或Ribi佐剂系统(参见如GB-A-2 189 141)。“Pluronic”是注册商标。待免疫病人是需要被保护免受微生物感染的病人。
本发明前述抗原(或编码此抗原的多核苷酸)或其制剂可以通过包括口服及全身(如皮下或肌肉)注射的任何传统方法施用。治疗可包括单剂量或一段时间的多剂量给药。
应该知道本发明的疫苗根据其抗原成分(或多核苷酸)，可以用于人用药和兽用药领域。
微生物引起的疾病在许多动物如家畜为已知。本发明的疫苗当含有合适的抗原或编码抗原的多核苷酸时，可用于人，还用于家畜如牛、羊、猪、马、狗及猫，以及家禽，如鸡、火鸡、鸭及鹅。
因此，本发明还包括给予个体免疫接种抗微生物的方法，此方法包括将抗原(或编码抗原的多核苷酸)或上述疫苗施予个体。本发明还包括上述抗原(或编码抗原的多核苷酸)用于免疫接种个体的疫苗的制备。
本发明的抗原可用作疫苗中唯一的抗原或与针对相同或不同疾病微生物的其它抗原联合使用。关于奈瑟氏脑膜炎球菌，所获得的对NmB具有反应性的抗原可与用于A和/或C血清群的疫苗的成分联合。还可以联合对嗜血杆菌和/或肺炎链球菌提供保护的抗原成分。其它的抗原成分可为多肽或可为其它抗原成分例如多糖。多糖也可用于增强免疫反应(参见如Makela etal(2002)Expert Rev.Vaccines 1，399-410)。
在上述的疫苗和免疫接种方法中尤其优选地，如果抗原为上述(及在实施例中)任何基因如NMB0338基因编码的多肽、或上述变异体或片断或融合体(或编码所述抗原的多核苷酸)，待免疫接种抵抗的疾病为奈瑟氏脑膜炎球菌感染(脑膜炎球菌疾病)。本发明将通过参照下述的非限制性实施例及附图更详细描述。其中
图1是本发明方法的一个优选实施方案的图示。
实施例1奈瑟氏脑膜炎球菌免疫原(GSI)的基因筛选GSI在此实施例中的应用涉及为较不易被杀菌抗体杀伤的菌株筛选奈瑟氏脑膜炎球菌的插入突变文库。
通过使用在抗夹膜阴性相同菌株的小鼠中产生的血清，筛选已测序的NmB分离株MC58的突变体文库，我们确证了GSI的有效性。在小鼠通过腹膜内免疫接种同源菌株产生的血清分析了总共40,000个突变体，此血清针对野生型菌株的血清杀菌效价(SBA)大约为2,000。当基因文库暴露于以1∶560(杀伤所有野生型细菌)稀释的血清时，检测了存活突变体。为确定存活突变体中的转座子插入是否与抵抗杀伤的能力有关，将突变体回交至亲代菌株，在SBA方面回交的突变体因其较野生型对杀伤更具抵抗力而得以确认。受转座子影响的基因序列通过由标记获救(marker rescue)分离转座子插入位点而测定。我们发现两个受影响的基因为TspA和NMB0338。TspA是引发强CD4+T细胞反应的表面抗原，并由病人血清识别(Kizil et al(1999)Infect Immun.67，3533-41)。NMB0338是先前未知功能的基因，该基因编码被预测含有两个跨膜结构域、位于细胞表面的多肽。
NMB0338编码的氨基酸序列是MERNGVFGKIVGNRILRMSSEHAAASYPKPCKSFKLAQSWFRVRSCLGGVFIYGANMKLIYTVIKIIILLLFLLLAVINTDAVTFSYLPGQKFDLPLIVVLFGAFVVGIIFGMFALFGRLLSLRGENGRLRAEVKKNARLTGKELTAPPAQNAPESTKQP。
使用用于GSI的NmB除了紧急的公共健康需要外还具有几个实际优点a)细菌在遗传学上易于操作；b)通过效应子免疫机制杀伤细菌可直接进行分析；c)对于不同血清群及克隆谱系的三个分离株(分别为A、B及C血清群的IV-A、ET-5、及ET-37)可获得基因组序列；以及d)良好表征的临床资源可用于本工作。
GSI具有两个潜在的限制性。首先，必需有杀菌抗体的靶目标。由于在NmB杀菌抗体的所有已知靶目标却是非必需的，而且目前无获得批准的细菌疫苗靶向必需基因产物，因此这是不可能的。第二，血清含有针对多抗原的抗体，且单抗原的丢失不会影响突变体的存活。我们已经确证即使在使用产生的抗同源菌株血清筛选过程中，相关抗原仍使用适当的血清稀释物进行鉴定。
GSI的主要优点为1)高通量步骤不涉及技术上费力或昂贵的程序(例如蛋白表达/纯化及免疫接种)，以及2)人样本可用于分析中，而不单独依靠动物数据。GSI将快速突显引发杀菌活性的表面蛋白亚类，使得较小数量疫苗候选物得以更为详细的分析。
1.使用GSI鉴定杀菌抗体的靶目标抗异源菌株的鼠血清及人血清用于鉴定交叉反应抗原。血清来源于i)通过系统途径使用异源菌株免疫小鼠，选择和/或构建此菌株以避免带有相同免疫型和亚血清型的分离株。
ii)感染奈瑟氏脑膜炎球菌的已知分离株的病人急性期及恢复期血清(Northwick Park的R.Wall博士提供)。
iii)从接受由NmB分离株H44/76衍生的确定的外膜囊泡(OMVs)疫苗的志愿者采集的免疫前和免疫后样本(由脑膜炎球菌参考实验室提供)。
这些血清的每一来源具有特有的优点和缺点。
a)使用异源菌株(即已测序的A或C血清群菌株)免疫的动物血清用于GSI以选择MC58突变体文库。我们已经证明了使用活的减毒NmB免疫引发针对A及C血清群菌株的交叉反应的杀菌抗体反应。对人血清具有增强的存活率的突变体中不存在的抗原通过断裂基因的标记获救进行鉴定。
b)鉴定了给予针对异源血清杀伤的抵抗力的突变，确定了基因产物是否还分别是已测序的A及C血清群菌株Z2491及FAM18杀伤的靶目标。检查了基因同源序列的基因组数据库。如果同源序列存在，从MC58突变体扩增转座子插入部分，并通过转化将其导入A及C血清群。比较了每一血清群的突变体及野生型菌株的相对存活率。因此，GSI可迅速提供信息表明在奈瑟氏脑膜炎球菌不同菌株中杀菌活性的靶目标是否是保守及易受攻击的，而不考虑血清群、免疫型及亚血清型。
c)使用恢复期病人或接受异源OMV疫苗(由H44/76衍生)的被接种者血清检测针对小鼠所产生的血清具有增加的存活率的突变株。这说明了一个重要问题，即靶目标是否能够在人体引发产生杀菌抗体。使用其它疫苗方法，仅仅在需要疫苗候选物的GMP生产的晚期、费用昂贵的临床试验阶段可以获得此信息。
优点是GSI是使用简单、可用技术方法进行的高通量分析。引发人体产生杀菌抗体及介导多菌株杀伤的抗原可被迅速鉴定，这是因为对于所使用的杀菌菌株和血清而言GSI是可改变的。采用由鼠血清筛选的突变体相同的方法分析了使用人血清筛选的突变体。
2.重组GSI抗原的抗体反应评价使用商购的载体在大肠杆菌中表达由来自恢复期病人的血清识别的为杀菌抗体的靶目标的蛋白和疫苗。相应的开放阅读框从MC58通过PCR扩增，并连接至载体如pCR Topo CT或pBAD/His，以使蛋白分别在T7或阿拉伯糖可诱导的启动子控制下得以表达。在镍或钴柱上，通过与蛋白C末端融合的His Tag从总细胞蛋白纯化重组蛋白。
使用添加福氏不完全佐剂的25μg纯化蛋白皮下注射分两次间隔四周免疫成年新西兰白兔。免疫之前使用全血细胞ELISA检查动物血清已存在的抗Nm抗体。起始血清滴度＜1∶2的动物用于免疫实验。免疫后血清在第二次免疫后两周获得。为确证已产生了特定抗体，免疫前及免疫后血清采用下列方法检测i)针对纯化蛋白的Western分析及ii)使用野生型及相应突变体(由GSI产生)的细胞的ELISA。
使用兔免疫血清进行抗MC58(同源菌株)及已测序的A及C血清群菌株的SBA分析，该分析以平行三份至少两次进行。认为＞8的SBA是有意义的。结果提供证据表明蛋白候选物作为重组蛋白可引发产生杀菌抗体。
3.确定GSI抗原的保护效力对所有候选物检测了其保护动物免受活细菌攻击的能力，这可使得免疫任何方面(细胞免疫或体液免疫)在单一方法中得以评价。我们已经建立了主动免疫及抗活菌感染保护模型。在此模型中，成年鼠于第0天及第21天被免疫，在第28天接受溶于右旋糖酐铁(作为补充的铁源)的106或107CFU的MC58的活菌攻击。此模型与Danve et al(1993)Vaccine 11，1214-1220对使用Tbps免疫的保护效力的评价的描述相似。未免疫动物在感染4小时内发展成菌血症，并于24小时表现全身疾病症状。我们已经能够确证减毒Nm菌株及蛋白抗原针对活的脑膜炎球菌攻击的保护效力。PorA为引发产生杀菌抗体的外膜蛋白，因其广泛的抗原变异(Bart et al(1999)Infect Immun.67，332-3846)而非首要的疫苗候选物。
6周龄BALB/c小鼠(组大小，35只动物)于第0天和21天皮下注射接受添加福氏不完全佐剂的25μg重组蛋白，然后于第28天使用106(15只动物)或107(15只动物)CFU的MC58皮下注射攻击。两种攻击剂量用于检测高攻击剂量及低攻击剂量下的免疫效力，于第28天从每组余下的5只动物及5只第一次免疫前动物获得血清，保存在-70℃以备进一步的免疫学分析。对照组中的动物接受如下处理i)仅佐剂，ii)重组的再折叠PorA，或iii)活的减毒Nm菌株。为减少对照组中的动物总数，在同一时间检测几组候选物(每组5个)(组数＝5个候选物+3个对照)。使用MannWhitney U检验比较各组动物的存活率。在15只小鼠/剂量的组中，实验显示组间存活率差异为25％。
对于针对攻击显示显著保护性的疫苗来说，进行重复实验以验证结果。另外，为确定使用候选物免疫接种也引发针对菌血症的保护作用，在第二次实验中检测了菌血症水平，于免疫及非免疫动物感染后22小时采集血样(此时菌血症为最严重)。使用双尾Student-T检验确定免疫接种动物中菌血症有无显著减轻。
其它使用材料和方法奈瑟氏脑膜炎球菌诱变对于奈瑟氏脑膜炎球菌的实验，通过体外诱变构建突变体。使用含编码卡那霉素抗性标记的Tn5衍生物及在大肠杆菌具有功能性的复制起始区对奈瑟氏脑膜炎球菌的基因组DNA进行诱变。这些元件由复合Tn5末端连接。使用高活性(hyperactive)Tn5变异体进行转座反应，并在ATP和核苷酸存在下使用T4 DNA聚合酶和连接酶修补DNA。修补的DNA用于将奈瑟氏脑膜炎球菌转化为卡那霉素抗性。Southern分析确证每一突变仅含有所述转座子单一插入。
血清杀菌试验(SBA)细菌在固体培养基(添加Levanthals添加物的脑心浸液)生长过夜，然后在实验早晨于固体培养基再划线培养4小时。之后，将细菌收获至磷酸盐缓冲盐水并计数。以含有补体源(幼兔或人)及大约105个菌落形成单位的1ml体积进行血清杀菌试验(SBA)。培养结束时收集细菌，并铺板至固体培养基以恢复存活细菌。
分离转座子插入位点使用标准方法恢复目的突变体的基因组DNA，并使用PvuII、EcoRV及DraI消化3小时，然后通过苯酚提取纯化。然后，在100μl体积T4 DNA连接酶存在下16℃过夜自连接，沉淀，然后通过电穿孔术用于转化大肠杆菌卡那霉素抗性。
实施例2进一步筛选及其结果GSI已用于筛选大约40,000种MC58插入突变的文库。使用含有来自pACYC184的复制起始区的转座子通过体外Tn5诱变而构建该文库。
之所以选择MC58是因为它是奈瑟氏脑膜炎球菌的B血清群分离株，并且该菌株的完整基因组序列为已知。
总是同时以野生型菌株作为对照筛选文库，并示出了自所述文库及野生型恢复的克隆数。
使用鼠血清筛选一开始使用来自以减毒菌株YH102免疫的动物血清分析文库。成年鼠(BALB/c)接受三次腹膜内注射108个菌落形成单位，在最后一次免疫后10天收集血清。
筛选鉴定对血清杀伤具有增强抵抗力的几株突变体。这是通过分离个体突变株、在原始基因背景重新构建突变，以及重新检测各个突变体对针对野生型的补体介导的裂解的易感性来确证。转座子插入于以下基因中NMB0341(TspA)DNA序列ATGCCCGCCGGCCGACTGCCCCGCCGATGCCCGATGATGACGAAATTTACAGACTGTACGCGGTCAAACCGTATTCAGCCGCCAACCCACAGGGGATACATCTTGAAAAACAACAGACAAATCAAACTGATTGCCGCCTCCGTCGCAGTTGCCGCATCCTTTCAGGCACATGCTGGACTGGGCGGACTGAATATCCAGTCCAACCTTGACGAACCCTTTTCCGGCAGCATTACCGTAACCGGCGAAGAAGCCAAAGCCCTGCTAGGCGGCGGCAGCGTTACCGTTTCCGAAAAAGGCCTGACCGCCAAAGTCCACAAGTTGGGCGACAAAGCCGTCATTGCCGTTTCTTCCGAACAGGCAGTCCGCGATCCCGTCCTGGTGTTCCGCATCGGCGCAGGCGCACAGGTACGCGAATACACCGCCATCCTCGATCCTGTCGGCTACTCGCCCAAAACCAAATCTGCACTTTCAGACGGCAAGACACACCGCAAAACCGCTCCGACAGCAGAGTCCCAAGAAAATCAAAACGCCAAAGCCCTCCGCAAAACCGATAAAAAAGACAGCGCGAACGCAGCCGTCAAACCGGCATACAACGGCAAAACCCATACCGTCCGCAAAGGCGAAACGGTCAAACAGATTGCCGCCGCCATCCGCCCGAAACACCTGACGCTCGAACAGGTTGCCGATGCGCTGCTGAAGGCAAACCCAAATGTTTCCGCA
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ATGGAAAGGAACGGTGTATTTGGTAAAATTGTCGGCAATCGCATACTCCGTATGTCGTCCGAACACGCTGCCGCATCCTATCCGAAACCGTGCAAATCGTTTAAACTAGCGCAATCTTGGTTCAGAGTGCGAAGCTGTCTGGGCGGCGTTTTTATTTACGGAGCAAACATGAAACTTATCTATACCGTCATCAAAATCATTATCCTGCTGCTCTTCCTGCTGCTTGCCGTCATTAATACGGATGCCGTTACCTTTTCCTACCTGCCGGGGCAAAAATTCGATTTGCCGCTGATTGTCGTATTGTTCGGCGCATTTGTAGTCGGTATTATTTTTGGAATGTTTGCCTTGTTCGGACGGTTGTTGTCGTTACGTGGCGAGAACGGCAGGTTGCGTGCCGAAGTAAAGAAAAATGCGCGTTTGACGGGGAAGGAGCTGACCGCACCACCGGCGCAAAATGCGCCCGAATCTACCAAACAGCCTTAANMB0338蛋白序列MERNGVFGKIVGNRILRMSSEHAAASYPKPCKSFKLAQSWFRVRSCLGGVFIYGANMKLIYTVIKIIILLLFLLLAVINTDAVTFSYLPGQKFDLPLIVVLFGAFVVGIIFGMFALFGRLLSLRGENGRLRAEVKKNARLTGKELTAPPAQNAPESTKQP多肽分析表明预测其具有从残基54-70及88-107的两个跨膜结构域。因此，从区域1-53及108-末端(C末端)片断作为免疫原尤为有用。
NMB1345 DNA序列ATGAAAAAACCTTTGATTTCGGTTGCGGCAGCATTGCTCGGCGTTGCTTTGGGCACGCCTTATTATTTGGGTGTCAAAGCCGAAGAAAGCTTGACGCAGCAGCAAAAAATATTGCAGGAAACGGGCTTCTTGACCGTCGAATCGCACCAATATGAGCGCGGCTGGTTTACCTCTATGGAAACGACGGTCATCCGTCTGAAACCCGAGTTGCTGAATAATGCCCGAAAATACCTGCCGGATAACCTGAAAACAGTGTTGGAACAGCCGGTTACGCTGGTTAACCATATCACGCACGGCCCTTTCGCCGGCGGATTCGGCACGCAGGCGTACATTGAAACCGAGTTCAAATACGCGCCTGAAACGGAAAAAGTTCTGGAACGCTTTTTTGGAAAACAAGTCCCGGCTTCCCTTGCCAATACCGTTTATTTTAACGGCAGCGGTAAAATGGAAGTCAGTGTTCCCGCCTTCGATTATGAAGAGCTGTCGGGCATCAGGCTGCACTGGGAAGGCCTGACGGGAGAAACGGTTTATCAAAAAGGTTTCAAAAGCTACCGGAACGGCTATGATGCCCCCTTGTTTAAAATCAAGCTGGCAGACAAAGGCGATGCCGCGTTTGAAAAAGTGCATTTCGATTCGGAAACTTCAGACGGCATCAATCCGCTTGCTTTGGGCAGCAGCAATCTGACCTTGGAAAAATTCTCCCTAGAATGGAAAGAGGGTGTCGATTACAACGTCAAGTTAAACGAACTGGTCAATCTTGTTACCGATTTGCAGATTGGCGCGTTTATCAATCCCAACGGCAGCATCGCACCTTCCAAAATCGAAGTCGGCAAACTGGCTTTTTCAACCAAGACCGGGGAATCAGGCGCGTTTATCAACAGTGAAGGGCAGTTCCGTTTCGATACACTGGTGTACGGCGATGAAAAATACGGCCCGCTGGACATCCATATCGCTGCCGAACACCTCGATGCTTCTGCCTTAACCGTATTGAAACGCAAGTTTGCACAAATTTCCGCCAAAAAAATGACCGAGGAACAAATCCGCAATGATTTGATTGCCGCCGTCAAAGGAGAGGCTTCCGGACTGTTCACCAACAATCCCGTATTGGACATTAAAACTTTCCGATTCACGCTGCCATCGGGAAAAATCGATGTGGGCGGAAAAATCATGTTTAAAGACATGAAGAAGGAAGATTTGAATCAATTGGGTTTGATGCTGAAGAAAACCGAAGCCGACATCAGAATGAGTATTCCCCAAAAAATGCTGGAAGACTTGGCGGTCAGTCAAGCAGGCAATATTTTCAGCGTCAATGCCGAAGATGAGGCGGAAGGCAGGGCAAGTCTTGACGACATCAACGAGACCTTGCGCCTGATGGTGGACAGTACGGTTCAGAGTATGGCAAGGGAAAAATATCTGACTTTGAACGGCGACCAGATTGATACTGCCATTTCTCTGAAAAACAATCAGTTGAAATTGAACGGTAAAACGTTGCAAAACGAACCGGAGCCGGATTTTGATGAAGGCGGTATGGTTTCAGAGCCGCAGCAGTAANMB1345蛋白序列
MKKPLISVAAALLGVALGTPYYLGVKAEESLTQQQKILQETGFLTVESHQYERGWFTSMETTVIRLKPELLNNARKYLPDNLKTVLEQPVTLVNHITHGPFAGGFGTQAYIETEFKYAPETEKVLERFFGKQVPASLANTVYFNGSGKMEVSVPAFDYEELSGIRLHWEGLTGETVYQKGFKSYRNGYDAPLFKIKLADKGDAAFEKVHFDSETSDGINPLALGSSNLTLEKFSLEWKEGVDYNVKLNELVNLVTDLQIGAFINPNGSIAPSKIEVGKLAFSTKTGESGAFINSEGQFRFDTLVYGDEKYGPLDIHIAAEHLDASALTVLKRKFAQISAKKMTEEQIRNDLIAAVKGEASGLFTNNPVLDIKTFRFTLPSGKIDVGGKIMFKDMKKEDLNQLGLMLKKTEADIRMSIPQKMLEDLAVSQAGNIFSVNAEDEAEGRASLDDINETLRLMVDSTVQSMAREKYLTLNGDQIDTAISLKNNQLKLNGKTLQNEPEPDFDEGGMVSEPQQ用被接种者血清筛选我们可获得来自曼彻斯特的脑膜炎球菌参考实验室的血清。该血清来自志愿者OMV免疫的临床试验。
由被接种者C1血清筛选的突变体(筛选一次)下列序列为分离的NMB0338(如上文所述)NMB0738 DNA序列ATGAAGATCGTCCTGATTAGCGGCCTGTCCGGTTCGGGCAAGTCCGTCGCACTCCGCCAAATGGAAGATTCGGGTTATTTCTGCGTGGACAATTTGCCTTTGGAAATGTTGCCCGCGCTGGTGTCGTATCATATCGAACGTGCGGACGAAACCGAATTGGCGGTCAGCGTCGATGTGCGTTCCGGCATTGACATCGGACAGGCGCGGGAACAGATTGCCTCTCTGCGCAGACTGGGGCACAGGGTTGAAGTTTTGTTTGTCGAGGCGGAAGAAAGCGTGTTGGTCCGCCGGTTTTCCGAAACCAGGCGAGGACATCCTCTGAGCAATCAGGATATGACCTTGTTGGAAAGCTTAAAGAAAGAACGGGAATGGCTGTTCCCGCTTAAAGAAATCGCCTATTGTATCGACACTTCCAAGATGAATGCCCAACAGCTCCGCCATGCAGTCCGGCAGTGGCTGAAGGTCGAACGTACCGGGCTGCTGGTGATTTTGGAGTCCTTCGGGTTCAAATACGGTGTGCCGAACAACGCGGATTTTATGTTCGATATGCGCAGCCTGCCCAACCCGTATTACGATCCCGAGTTGAGGCCTTACACCGGTATGGACAAGCCCGTTTGGGATTATTTGGACGGACAGCCGCTTGTGCAGGAAATGGTTGACGACATCGAAAGGTTTGTTACGCATTGGTTACCGCGTTTGGAGGATGAAAGCAGGAGCTACGTTACCGTCGCCATCGGTTGCACGGGAGGACAGCACCGTTCGGTCTATATTGTCGAAAAACTCGCCCGAAGGTTGAAAGGGCGTTATGAATTGCTGATACGGCACAGACAGGCGCAAAACCTGTCAGACCGCTAANMB0738蛋白序列MKIVLISGLSGSGKSVALRQMEDSGYFCVDNLPLEMLPALVSYHIERADETELAVSVDVRSGIDIGQAREQIASLRRLGHRVEVLFVEAEESVLVRRFSETRRGHPLSNQDMTLLESLKKEREWLFPLKEIAYCIDTSKMNAQQLRHAVRQWLKVERTGLLVILESFGFKYGVPNNADFMFDMRSLPNPYYDPELRPYTGMDKPVWDYLDGQPLVQEMVDDIERFVTHWLPRLEDESRSYVTVAIGCTGGQHRSVYIVEKLARRLKGRYELLIRKRQAQNLSDRNMB0792 NadC家族(运载体)DNA序列
ATGAACCTGCATGCAAAGGACAAAACCCAGCATCCCGAAAACGTCGAGCTGCTCAGTGCGCAGAAGCCGATTACCGACTTTAAGGGCCTGCTGACCACCATTATTTCCGCCGTCGTCTGTTTCGGCATTTACCACATCCTGCCTTACAGCCCCGATGCCAATAAAGGTATCGCGCTGCTGATTTTCGTTGCCGCACTTTGGTTTACCGAGGCCGTCCACATTACCGTAACCGCACTGATGGTGCCGATTCTCGCCGTCGTACTCGGTTTCCCCGACATGGACATCAAAAAGGCGATGGCTGATTTTTCCAACCCGATTATCTACATTTTTTTCGGCGGCTTCGCGCTTGCCACCGCCCTGCATATGCAGCGGCTGGACCGTAAAATCGCCGTCAGCCTGTTGCGCCTGTCGCGCGGCAATATGAAAGTGGCGGTTTTGATGTTGTTCCTCGTTACCGCCTTTCTGTCCATGTGGATCAGCAACACCGCCACCGCCGCGATGATGCTGCCTCTAGCAATGGGTATGCTGAGCCACCTCGACCAGGAAAAAGAACACAAAACCTACGTCTTCCTCCTGCTCGGCATCGCCTATTGCGCCAGCATCGGCGGCTTGGGCACGCTCGTCGGCTCGCCGCCCAACCTGATTGCCGCCAAAGCCCTAAATCTGGACTTCGTCGGCTGGATGAAGCTCGGCCTGCCGATGATGCTGTTGATTCTGCCCTTGATGCTGCTCTCCCTGTACGTCATCCTCAAACCTAATTTGAACGAACGCGTGGAAATCAAAGCCGAATCCATCCCTTGGACGCTGCACCGCGTGATCGCGCTGTTGATTTTCCTTGCCACAGCCGCCGCGTGGATATTCAGCTCCAAAATCAAAACCGCCTTCGGCATTTCCAATCCCGACACCGTTATCGCCCTGAGTGCCGCCGTCGCCGTCGTCGTCTTCGGCGTGGCGCAATGGAAGGAAGTCGCCCGCAATACCGACTGGGGCGTGTTGATGCTCTTCGGCGGCGGCATCAGCCTGAGCACGCTGTTGAAAACATCCGGCGCGTCCGAAGCCTTGGGACAGCAGGTTGCCGCCACCTTTTCCGGCGCGCCCGCATTTTTGGTGATACTCATCGTCGCCGCCTTCATTATTTTTCTGACCGAGTTCACCAGCAACACCGCCTCCGCCGCATTGCTTGTACCGATTTTCTCCGGCATCGCTATGCAGATGGGGCTGCCCGAACAAGTCTTGGTATTCGTCATCGGCATCGGCGCATCTTGTGCCTTCATGCTGCCGGTTGCCACACCGCCTAACGCGATTGTGTTCGGCACGGGCTTAATCAAGCAACGCGAAATGATGAATGTCGGCATACTGCTGAACATCCTCTGCGTAGTATTGGTTGCTCTGTGGGCTTATGCTGTACTGATGTAANMB0792蛋白序列MNLHAKDKTQHPEKVELLSAQKPITDFKGLLTTIISAVVCFGIYHILPYSPDANKGIALLIFVAALWFTEAVHITVTALMVPILAVVLGFPDMDIKKAMADFSNPIIYIFFGGFALATALHMQRLDRKIAVSLLRLSRGNMKVAVLMLFLVTAFLSMWISNTATAAMMLPLAMGMLSHLDQEKEHKTYVFLLLGIAYCASIGGLGTLVGSPPNLIAAKALNLDFVGWMKLGLPMMLLILPLMLLSLYVILKPNLNERVEIKAESIPWTLHRVIALLIFLATAAAWIFSSKIKTAFGISNPDTVIALSAAVAVVVFGVAQWKEVARNTDWGVLMLFGGGISLSTLLKTSGASEALGQQVAATFSGAPAFLVILIVAAFIIFLTEFTSNTASAALLVPIFSGIAMQMGLPEQVLVFVIGIGASCAFMLPVATPPNAIVFGTGLIKQREMMNVGILLNILCVVLVALWAYAVLMNMB0279DNA序列ATGCAACGACAAATCAAACTGAAAAATTGGCTTCAGACCGTTTATCCCGAACGGGACTTCGATCTGACTTTTGCGGCGGCGGATGCTGATTTCCGCCGCTATTTCCGTGCAACGTTTTCAGACGGCAGCAGTGTCGTCTGCATGGATGCACCGCCCGACAAGATGAGTGTCGCACCTTATTTGAAAGTGCAGAAACTGTTTGACATGGTCAATGTGCCGCAGGTATTGCACGCGGACACGGATCTGGGGTTTGTGGTATTGAACGACTTGGGCAATACGACGTTTTTGACCGCAATGCTTCAGGAACAGGGCGAAACGGCGCACAAAGCCCTGCTTTTGGAGGCAATCGGCGAGTTGGTCGAATTGCAGAAGGCGAGCCGTGAAGGGGTTTTGCCCGAATATGACCGTGAAACGATGTTGCGCGAAATCAACCTGTTCCCGGAATGGTTTGTCGCAAAAGAATTGGGGCGCGAATTAACATTCAAACAACGCCAACTTTGGCAGCAAACCGTCGATACGCTGCTGCCGCCCCTGTTGGCGCAGCCCAAAGTCTATGTGCACCGCGACTTTATCGTCCGCAACCTGATGCTGACGCGCGGCAGGCCGGGCGTTTTAGACTTCCAAGACGCGCTTTACGGCCCGATTTCCTACGATTTGGTGTCGCTGTTGCGCGATGCCTTTATCGAATGGGAAGAAGAATTTGTCTTGGACTTGGTTATCCGCTACTGGGAAAAGGCGCGGGCTGCCGGCTTGCCCGTCCCCGAAGCGTTTGACGAGTTTTACCGCTGGTTCGAATGGATGGGCGTGCAGCGGCACTTGAAGGTTGCAGGCATCTTCGCACGCCTGTACTACCGCGACGGCAAAGACAAATACCGTCCGGAAATCCCGCGTTTCTTAAACTATCTGCGCCGCGTATCGCGCCGTTATGCCGAACTCGCCCCGCTCTACGCGCTCTTGGTCGAACTGGTCGGCGATGAAGAACTGGAAACGGGCTTTACGTTTTAA
NMB0279蛋白序列MQRQIKLKNWLQTVYPERDFDLTFAAADADFRRYFRATFSDGSSVVCMDAPPDKMSVAPYLKVQKLFDMVNVPQVLHADTDLGFVVLNDLGNTTFLTAMLQEQGETAHKALLLEAIGELVELQKASREGVLPEYDRETMLREINLFPEWFVAKELGRELTFKQRQLWQQTVDTLLPPLLAQPKVYVHRDFIVRNLMLTRGRPGVLDFQDALYGPISYDLVSLLRDAFIEWEEEFVLDLVIRYWEKARAAGLPVPEAFDEFYRWFEWMGVQRHLKVAGIFARLYYRDGKDKYRPEIPRFLNYLRRVSRRYAELAPLYALLVELVGDEELETGFTFNMB2050DNA序列ATGGAACTGATGACTGTTTTGCTGCCTTTGGCGGCGTTGGTGTCGGGCGTGTTGTTTACATGGTTGCTGATGAAGGGCCGGTTTCAGGGCGAGTTTGCCGGTTTGAACGCGCACCTGGCGGAAAAGGCGGCAAGATGTGATTTTGTCGAACAGGCACACGGCAAAACCGTGTCGGAATTGGCGGTGTTGGACGGGAAATACCGGCATTTGCAGGACGAAAATTATGCTTTGGGCAACCGTTTTTCCGCAGCCGAAAAGCAGATTGCCCATTTGCAGGAAAAAGAGGCGGAGTCGGCGCGGCTGAAGCAGTCGTATATCGAGTTGCAGGAAAAGGCACAGGGTTTGGCGGTTGAAAACGAACGTTTGGCAACGCAGCTCGGACAGGAACGGAAGGCGTTTGCCGACCAATATGCCTTGGAACGCCAAATCCGCCAAAGAATCGAAACCGATTTGGAAGAAAGCCGCCAAACTGTCCGCGACGTGCAAAACGACCTTTCCGATGTCGGCAACCGTTTTGCCGCAGCCGAAAAACAGATTGCCCATTTGCAGGAAAAAGAGGCGGAAGCGGAGCGGTTGAGGCAGTCGCATACCGAGTTGCAGGAAAAGGCACAGGGTTTGGCGGTTGAAAACGAACGTTTGGCAACGCAAATCGAACAGGAACGCCTTGCTTCTGAAGAGAAGCTGTCCTTGCTGGGCGAGGCGCGCAAAAGTTTGAGCGATCAGTTTCAAAATCTTGCCAACACGATTTTGGAAGAAAAAAGCCGCCGTTTTACCGAGCAGAACCGCGAGCAGCTCCATCAGGTTTTGAACCCGCTAAACGAACGCATCCACGGTTTCGGCGAGTTGGTCAAGCAAACCTATGATAAAGAATCGCGCGAGCGGCTGACGTTGGAAAACGAATTGAAACGGCTTCAGGGGTTGAACGCGCAGCTGCACAGCGAGGCAAAGGCCCTGACCAACGCGCTGACCGGTACGCAGAATAAGGTTCAGGGCAATTGGGGCGAGATGATTCTGGAAACGGTTTTGGAAAATTCCGGCCTTCAGAAAGGGCGGGAATATGTGGTTCAGGCGGCATCCGTCCGAAAAGAGGAAGACGGCGGCACGCGCCGCCTCCAGCCCGACGTTTTGGTCAACCTGCCCGACAACAAGCAGATTGTGATTGATTCCAAGGTCTCGCTGACAGCTTATGTGCGCTACACGCAGGCGGCGGATGCGGATACGGCGGCACGCGAACTGGCGGCACACGTTGCCAGCATCCGTGCACACATGAAAGGCTTGTCGCTGAAGGATTACACCGATTTGGAAGGTGTGAACACATTGGATTTCGTCTTTATGTTTATCCCTGTCGAACCGGCCTACCTGTTGGCGTTGCAGAATGACGCGGGCTTGTTCCAAGAGTGTTTCGACAAACGGATTATGCTGGTCGGCCCCAGTACGCTGCTGGCGACTTTGAGGACGGTGGCGAATATTTGGCGCAACGAACAGCAAAATCAGAACGCACTGGCGATTGCGGACGAAGGCGGCAAGCTGTACGACAAGTTTGTCGGCTTCGTACAGACGCTCGAAAGCGTCGGCAAAGGCATCGATCAGGCGCAAAGCAGTTTTCAGACGGCATTCAAGCAACTTGCCGAAGGGCGCGGGAATCTGGTCGGACGCGCCGAGAAACTGCGTCTGTTGGGCGTGAAGGCAGGCAAACAACTTCAACGGGATTTGGTCGAGCGTTCCAATGAAACAACGGCGTTGTCGGAATCTTTGGAATACGCGGCAGAAGATGAAGCAGTCTGANMB2050蛋白序列MELMTVLLPLAALVSGVLFTWLLMKGRFQGEFAGLNAHLAEKAARCDFVEQAHGKTVSELAVLDGKYRHLQDENYALGNRFSAAEKQIAHLQEKEAESARLKQSYIELQEKAQGLAVENERLATQLGQERKAFADQYALERQIRQRIETDLEESRQTVRDVQNDLSDVGNRFAAAEKQIAHLQEKEAEAERLRQSHTELQEKAQGLAVENERLATQIEQERLASEEKLSLLGEARKSLSDQFQNLANTILEEKSRRFTEQNREQLHQVLNPLNERIHGFGELVKQTYDKESRERLTLENELKRLQGLNAQLHSEAKALTNALTGTQNKVQGNWGEMILETVLENSGLQKGREYVVQAASVRKEEDGGTRRLQPDVLVNLPDNKQIVIDSKVSLTAYVRYTQAADADTAARELAAHVASIRAHMKGLSLKDYTDLEGVNTLDFVFMFIPVEPAYLLALQNDAGLFQECFDKRIMLVGPSTLLATLRTVANIWRNEQQNQNALAIADEGGKLYDKFVGFVQTLESVGKGIDQAQSSFQTAFKQLAEGRGNLVGRAEKLRLLGVKAGKQLQRDLVERSNETTALSESLEYAAEDEAVNMB1335 CreA蛋白DNA序列
ATGAACAGACTGCTACTGCTGTCTGCCGCCGTCCTGCTGACTGCCTGCGGCAGCGGCGAAACCGATAAAATCGGACGGGCAAGTACCGTTTTCAACATACTGGGCAAAAACGACCGTATCGAAGTGGAAGGATTCGACGATCCCGACGTTCAAGGGGTTGCCTGTTATATTTCGTATGCAAAAAAAGGCGGCTTGAAGGAAATGGTCAATTTGGAAGAGGACGCGTCCGACGCATCGGTTTCGTGCGTTCAGACGGCATCTTCGATTTCTTTTGACGAAACCGCCGTGCGCAAACCGAAAGAAGTTTTCAAACACGGTGCGAGCTTCGCGTTCAAGAGCCGGCAGATTGTCCGTTATTACGACCCCAAACGCAAAACCTTCGCCTATTTGGTGTACAGCGATAAAATCATCCAAGGCTCGCCGAAAAATTCCTTAAGCGCGGTTTCCTGTTTCGGCGGCGGCATACCGCAAACCGATGGGGTGCAAGCCGATACTTCCGGCAACCTGCTTGCCGGCGCCTGCATGATTTCCAACCCGATAGAAAATCTCGACAAACGCTGANMB1335蛋白序列MNRLLLLSAAVLLTACGSGETDKIGRASTVFNILGKNDRIEVEGFDDPDVQGVACYISYAKKGGLKEMVNLEEDASDASVSCVQTASSISFDETAVRKPKEVFKHGASFAFKSRQIVRYYDPKRKTFAYLVYSDKIIQGSPKNSLSAVSCFGGGIPQTDGVQADTSGNLLAGACMISNPIENLDKRNMB2035DNA序列ATGACCGCCTTTGTCCACACCCTTTCAGACGGCATGGAACTGACCGTCGAAATCAAGCGCCGTGCCAAGAAAAACCTGATTATCCGCCCCGCCGGCACACATACCGTCCGCATCAGCGTCCCACCCTGCTTCTCCGTCTCCGCTCTAAACCGCTGGCTGTATGAAAACGAAGCCGTCCTGCGGCAAACACTGGCGAAAACACCGCCGCCGCAAACTGCCGAAAACCGGCTGCCCGAATCCATCCTCTTCCACGGCAGACAGCTTGCCCTCACCGCCCATCAAGACACGCAAATCCTGCTGATGCCGTCTGAAATCCGTGTTCCCGAAGGCGCACCCGAAAAACAGCTTGCGCTGCTGCGGGACTTTTTGGAACGGCAGGCGCACAGTTACCTGATTCCCCGCCTCGAACGCCACGCCCGCACCACACAACTGTTCCCCGCCTCCTCCTCGCTGACCTCTGCCAAAACCTTCTGGGGCGTGTGCCGCAAAACCACAGGCATACGCTTCAACTGGCGGCTGGTCGGCGCACCGGAATACGTTGCCGACTATGTCTGCATACACGAACTCTGCCACCTCGCCCATCCCGACCACAGCCCCGCCTTTTGGGAACTGACCCGCCGCTTCGCCCCCTACACGCCCAAAGCGAAACAGTGGCTCAAAATCCACGGCAGGGAACTTTTCGCCTTAGGCTGANMB2035蛋白序列MTAFVHTLSDGMELTVEIKRRAKKNLIIRPAGTHTVRISVPPCFSVSALNRWLYENEAVLRQTLAKTPPPQTAENRLPESILFHGRQLALTAHQDTQILLMPSEIRVPEGAPEKQLALLRDFLERQAHSYLIPRLERHARTTQLFPASSSLTSAKTFWGVCRKTTGIRFNWRLVGAPEYVADYVCIHELCHLAHPDHSPAFWELTRRFAPYTPKAKQWLKIHGRELFALGNMB1351Fmu及Fmv蛋白DNA序列ATGAACGCCGCACAACTCGACCATACCGCCAAAGTTTTGGCTGAAATGCTGACTTTCAAACAGCCTGCCGATGCCGTCCTCTCCGCCTATTTCCGCGAACACAAAAAGCTCGGCAGTCAAGATCGCCACGAAATCGCCGAAACCGCCTTTGCCGCGCTGCGCCACTATCAAAAAATCAGTACCGCCCTACGCCGTCCGCACGCGCAGCCGCGCAAAGCCGCTCTCGCCGCACTGGTTCTCGGCAGAAGCACCAACATCAGCCAAATCAAAGACCTGCTTGATGAAGAAGAAACAGCGTTCCTCGGCAATTTGAAAGCCCGTAAAACCGAGTTTTCAGACAGCCTGAATACCGCCGCAGAATTGCCGCAATGGCTGGTGGAACAACTGAAACAGCATTGGCGCGAAGAAGAAATCCTCGCTTTCGGCCGCAGCATCAACCAGCCTGCCCCGCTCGACATCCGCGTCAACACTTTGAAAGGCAAACGCGATAAAGTGCTGCCGCTGTTGCAAGCCGAAAGTGCCGATGCAGAGGCAACGCCTTATTCGCCTTGGGGCATCCGCCTGAAAAACAAAATCGCGCTTAACAAACACGAACTGTTTTTAGACGGCACACTGGAAGTCCAAGACGAAGGCAGCCAGCTGCTTGCCTTATTGGTGGGCGCAAAACGAGGCGAAATCATTGTCGATTTCTGTGCCGGTGCCGGCGGTAAAACCTTGGCTGTCGGTGCGCAAATGGCGAACAAAGGCAGAATCTACGCCTTCGATATCGCCGAAAAACGCCTTGCCAACCTCAAACCGCGTATGACCCGCGCCGGACTGACCAATATCCACCCCGAACGCATCGGCAGCGAACACGATGCCCGTATCGCCCGACTGGCAGGCAAAGCCGACCGTGTGTTG
GTGGACGCGCCCTGCTCCGGTTTGGGCACTTTACGCCGCAATCCCGACCTCAAATACCGCCAATCCGCCGAAACCGTCGCCAACCTTTTGGAACAGCAACACAGCATCCTCGATGCCGCCTCCAAACTGGTAAAACCGCAAGGACGTTTGGTGTACGCCACTTGCAGCATCCTGCCCGAAGAAAACGAGCTGCAAGTCGAACGTTTCCTGTCCGAACATCCCGAATTTGAACCCGTCAACTGCGCCGAACTGCTTGCCGGTTTGAAAATCGATTTGGATACCGGCAAATACCTGCGCCTCAACTCCGCCCGACACCAAACCGACGGCTTCTTCGCCGCCGTATTGCAACGCAAATAANMB1351蛋白序列MNAAQLDHTAKVLAEMLTFKQPADAVLSAYFREHKKLGSQDRHEIAETAFAALRHYQKISTALRRPHAQPRKAALAALVLGRSTNISQIKDLLDEEETAFLGNLKARKTEFSDSLNTAAELPQWLVEQLKQHWREEEILAFGRSINQPAPLDIRVNTLKGKRDKVLPLLQAESADAEATPYSPWGIRLKNKIALNKHELFLDGTLEVQDEGSQLLALLVGAKRGEIIVDFCAGAGGKTLAVGAQMANKGRIYAFDIAEKRLANLKPRMTRAGLTNIHPERIGSEHDARIARLAGKADRVLVDAPCSGLGTLRRNPDLKYRQSAETVANLLEQQHSILDAASKLVKPQGRLVYATCSILPEENELQVERFLSEHPEFEPVNCAELLAGLKIDLDTGKYLRLNSARHQTDGFFAAVLQRKNMB1574IlvC DNA序列ATGCAAGTCTATTACGATAAAGATGCCGATCTGTCCCTAATCAAAGGCAAAACCGTTGCCATCATCGGTTACGGTTCGCAAGGTCATGCCCATGCCGCCAACCTGAAAGATTCGGGTGTAAACGTGGTGATTGGTCTGCGCCAAGGTTCTTCTTGGAAAAAAGCCGAAGCAGCCGGTCATGTCGTCAAAACCGTTGCTGAAGCGACCAAAGAAGCCGATGTCGTTATGCTGCTGCTGCCTGACGAAACCATGCCTGCCGTCTATCACGCCGAAGTTACAGCCAATTTGAAAGAAGGCGCAACGCTGGCATTTGCACACGGCTTCAACGTGCACTACAACCAAATCGTTCCGCGTGCCGACTTGGACGTGATTATGGTTGCCCCCAAAGGTCCGGGCCATACCGTACGCAGTGAATACAAACGCGGCGGCGGCGTGCCTTCTCTGATTGCCGTTTACCAAGACAATTCCGGCAAAGCCAAAGACATCGCCCTGTCTTATGCGGCTGCCAACGGCGGCACCAAAGGCGGTGTGATTGAAACCACTTTCCGCGAAGAAACCGAAACCGATCTGTTCGGCGAACAAGCCGTATTGTGCGGCGGCGTGGTCGAGTTGATCAAGGCGGGTTTTGAAACCCTGACCGAAGCCGGTTACGCGCCTGAAATGGCTTACTTCGAATGTCTGCACGAAATGAAACTGATCGTTGACCTGATTTTCGAAGGCGGTATTGCCAATATGAACTACTCCATTTCCAACAATGCGGAGTACGGCGAATACGTTACCGGCCCTGAAGTGGTCAATGCTTCCAGCAAAGAAGCCATGCGCAATGCCCTGAAACGCATTCAAACCGGCGAATACGCAAAAATGTTTATCCAAGAGGGTAATGTCAACTATGCGTCTATGACTGCCCGCCGCCGTCTGAATGCCGACCACCAAGTTGAAAAAGTCGGCGCACAACTGCGTGCCATGATGCCTTGGATTACTGCCAACAAATTGGTTGACCAAGACAAAAACTGANMB1574蛋白序列MQVYYDKDADLSLIKGKTVAIIGYGSQGHAHAANLKDSGVNVVIGLRQGSSWKKAEAAGHVVKTVAEATKEADVVMLLLPDETMPAVYHAEVTANLKEGATLAFAHGFNVHYNQIVPRADLDVIMVAPKGPGHTVRSEYKRGGGVPSLIAVYQDNSGKAKDIALSYAAANGGTKGGVIETTFREETETDLFGEQAVLCGGVVELIKAGFETLTEAGYAPEMAYFECLHEMKLIVDLIFEGGIANMNYSISNNAEYGEYVTGPEVVNASSKEAMRNALKRIQTGEYAKMFIQEGNVNYASMTARRRLNADHQVEKVGAQLRAMMPWITANKLVDQDKNNMB1298 rsuA DNA序列ATGAAACTTATCAAATACCTGCAATATCAAGGCATAGGAAGCCGCAAGCAGTGCCAATGG
CTGATTGCCGGCGGTTATGTTTTCATCAACGGAACCTGCATGGACGACACCGATGCAGACATCGATTCCTCATCCGTCGAAACGTTGGATATTGACGGGGAAGCAGTAACCGTCGTTCCCGAACCCTATTTCTACATCATGCTCAACAAGCCTGAAGATTACGAAACTTCGCACAAACCCAAGCACTACCGCAGCGTATTCAGCCTGTTCCCCGACAATATGCGGAACATCGATATGCAGGCGGTCGGCAGGCTGGATGCAGATACGACCGGCGTATTGCTGATTACCAACGACGGCAAACTGAACCACAGCCTGACTTCGCCGAGCAGAAAAATTCCCAAGCTGTACGAAGTAACGCTCAAACACCCCACAGGAGAAACGCTCTGCGAAACCTTGAAAAACGGCGTGCTGCTCCACGACGAAAACGAAACCGTTTGTGCCGCCGATGCCGTTTTGAAAAACCCGACCACCCTGCTGCTGACCATTACCGAAGGAAAATACCACCAAGTCAAACGCATGATCGCCGCCGCCGGCAACCGCGTGCAACACCTTCATCGCCGGCGATTCGCACATCTGGAAACAGAAAACCTCAAACCCGGGGAATGGAAATTTATCGAATGTCCAAAATTCTGANMB1298蛋白序列MKLIKYLQYQGIGSRKQCQWLIAGGYVFINGTCMDDTDADIDSSSVETLDIDGEAVTVVPEPYFYIMLNKPEDYETSHKPKHYRSVFSLFPDNMRNIDMQAVGRLDADTTGVLLITNDGKLNHSLTSPSRKIPKLYEVTLKHPTGETLCETLKNGVLLHDENETVCAADAVLKNPTTLLLTITEGKYHQVKRMIAAAGNRVQHLHRRRFAHLETENLKPGEWKFIECPKFNMB1856 Lys R家族(转录调控子)DNA序列ATGAAAACCAATTCAGAAGAACTGACCGTATTTGTTCAAGTGGTGGAAAGCGGCAGCTTCAGCCGTGCGGCGGAGCAGTTGGCGATGGCAAATTCTGCCGTAAGCCGCATCGTCAAACGGCTGGAGGAAAAGTTGGGTGTGAACCTGCTCAACCGCACCACGCGGCAACTCAGTCTGACGGAAGAAGGCGCGCAATATTTCCGCCGCGCGCAGAGAATCCTGCAAGAAATGGCAGCGGCGGAAACCGAAATGCTGGCAGTGCACGAAATACCGCAAGGCGTGTTGAGCGTGGATTCCGCGATGCCGATGGTGCTGCATCTGCTGGCGCCGCTGGCAGCAAAATTCAACGAACGCTATCCGCATATCCGACTTTCGCTCGTTTCTTCCGAAGGCTATATCAATCTGATTGAACGCAAAGTCGATATTGCCTTACGGGCCGGAGAATTGGACGATTCCGGGCTGCGTGCACGCCATCTGTTTGACAGCCGCTTCCGCGTAATCGCCAGTCCTGAATACCTGGCAAAACACGGCACGCCGCAATCTACAGAAGAGCTTGCCGGCCACCAATGTTTAGGCTTCACCGAACCCGGTTCTCTAAATACATGGGCGGTTTTAGATGCGCAGGGAAATCCCTATAAGATTTCACCGCACTTTACCGCCAGCAGCGGTGAAATCTTACGCTCGTTGTGCCTTTCAGGTTGCGGTATTGTTTGCTTATCAGATTTTTTGGTTGACAACGACATCGCTGAAGGAAAGTTAATTCCCCTGCTCGCCGAACAAACCTCCGATAAAACACACCCCTTTAATGCTGTTTATTACAGCGATAAAGCCGTCAATCTCCGCTTACGCGTATTTTTGGATTTTTTAGTGGAGGAACTGGGAAACAATCTCTGTGGATAANMB1856蛋白序列MKTNSEELTVFVQVVESGSFSRAAEQLAMANSAVSRIVKRLEEKLGVNLLNRTTRQLSLTEEGAQYFRRAQRILQEMAAAETEMLAVHEIPQGVLSVDSAMPMVLHLLAPLAAKFNERYPHIRLSLVSSEGYINLIERKVDIALRAGELDDSGLRARHLFDSRFRVIASPEYLAKHGTPQSTEELAGHQCLGFTEPGSLNTWAVLDAQGNPYKISPHFTASSGEILRSLCLSGCGIVCLSDFLVDNDIAEGKLIPLLAEQTSDKTHPFNAVYYSDKAVNLRLRVFLDFLVEELGNNLCGNMB0119DNA序列ATGATGAAGGATTTGAATTTGAGCAACAGCCTGTTCAAAGGCTACAACGACAAACATGGCTTAATGATTTGTGGCTATGAATGGGGTTGGAGTAAAGCCGATGAGGCTGCTTATGTAGCAGGTGAATACAAACTCCCTGAAAACAAAATCGACCATACATTTGCAAACAAATCCCTCTATTTCGGAGAGCAGGCAAAAAAGTGGCGTTACGACAATACGATAAAAAATTGGTTTGAAATG
TGGGGACACCCCTTAGACGAAAATGGATTGGGCGGTGCATTTGAAAAATCCCTGGTTCAAACCAACTGGGCTGCTACACAGGGCAACACTATCGACAATCCCGACAAGTTCACACAACCCGAGCACATCGATAATTTTCTCTACCACATCGAAAAACTGCGTCCGAAAGTCATCCTCTTCATGGGCAGCAGGTTGGCGGATTTTCTGAACAACCAAAATGTACTGCCACGCTTCGAGCAGTTGGTCGGTAAGCAGACCAAACCGCTGGAGACGGTGCAAAAAGAATTTGACGGTACACGTTTCAATGTCAAATTCCAATCGTTTGAAGATTGCGAAGTCGTCTGCTTTCCCCATCCCAGTGCCAGTCGCGGTCTATCTTACGATTACATCGCCTTGTTTGCGCCTGAAATGAACCGGATTTTATCGGACTTTAAAACAACACGCGGATTCAAATAANMB0119蛋白序列MMKDLNLSNSLFKGYNDKHGLMICGYEWGWSKADEAAYVAGEYKLPENKIDHTFANKSLYFGEQAKKWRYDNTIKNWFEMWGHPLDENGLGGAFEKSLVQTNWAATQGNTIDNPDKFTQPEHIDNFLYHIEKLRPKVILFMGSRLADFLNNQNVLPRFEQLVGKQTKPLETVQKEFDGTRFNVKFQSFEDCEVVCFPHPSASRGLSYDYIALFAPEMNRILSDFKTTRGFKNMB1705 rfak DNA序列ATGGAAAAAGAATTCAGGATATTAAATATCGTATCGGCCAAGATTTGGGGTGGAGGCGAACAATATGTCTATGATGTTTCAAAAGCATTGGGGCTTCGGGGCTGCACAATGTTTACCGCCGTCAATAAAAATAATGAATTGATGCACAGGCGATTTTCCGAAGTTTCTTCCGTTTTCACAACGCGCCTTCACACGCTCAACGGGCTGTTTTCGCTCTACGCACTTACCCGCTTTATCCGGAAAAACCGCATTTCCCACCTGATGATACACACCGGCAAAATTGCCCCCTTATCCATACTTTTGAAAAAACTGACCGGGGTGCGCCTGATATTTGTCAAACATAATGTCGTCGCCAACAAAACCGATTTTTACCACCGCCTGATACAGAAAAACACAGACCGCTTTATTTGCGTTTCCCGTCTGGTTTACGATGTGCAAACCGCCGACAATCCCTTTAAAGAAAAATACCGGATTGTTCATAACGGTATCGATACCGGCCGTTTCCCTCCCTCTCAAGAAAAACCCGACAGCCGTTTTTTTACCGTCGCCTACGCCGGCAGGATCAGTCCAGAAAAAGGATTGGAAAACCTGATTGAAGCCTGTGTGATACTGCATCGGAAATATCCTCAAATCAGGCTCAAATTGGCAGGGGACGGACATCCGGATTATATGTGCCGCCTGAAGCGGGACGTATCTGCTTCAGGAGCAGAACCATTTGTTTCTTTTGAAGGGTTTACCGAAAAACTTGCTTCGTTTTACCGCCAAAGCGATGTCGTGGTTTTGCCCAGCCTCGTCCCGGAGGCATTCGGTTTGTCATTATGCGAGGCGATGTACTGCCGAACGGCGGTGATTTCCAATACTTTGGGGGCGCAAAAGGAAATTGTCGAACATCATCAATCGGGGATTCTGCTGGACAGGCTGACACCTGAATCTTTGGCGGACGAAATCGAACGCCTCGTCTTGAACCCTGAAACGAAAAACGCACTGGCAACGGCAGCTCATCAATGCGTCGCCGCCCGTTTTACCATCAACCATACCGCCGACAAATTATTGGATGCAATATAANMB1705蛋白序列MEKEFRILNIVSAKIWGGGEQYVYDVSKALGLRGCTMFTAVNKNNELMHRRFSEVSSVFTTRLHTLNGLFSLYALTRFIRKNRISHLMIHTGKIAALSILLKKLTGVRLIFVKHNVVANKTDFYHRLIQKNTDRFICVSRLVYDVQTADNPFKEKYRIVHNGIDTGRFPPSQEKPDSRFFTVAYAGRISPEKGLENLIEACVILHRKYPQIRLKLAGDGHPDYMCRLKRDVSASGAEPFVSFEGFTEKLASFYRQSDVVVLPSLVPEAFGLSLCEAMYCRTAVISNTLGAQKEIVEHHQSGILLDRLTPESLADEIERLVLNPETKNALATAAHQCVAARFTINHTADKLLDAINMB2065 Hemk蛋白DNA序列ATGCAGGAACAGAATCGGAAACCAAGTTTTCCCATAGTGATGTTGCTGGTGTCGGTTGCCCTGTGGATAGCGTCTTTATCCAATGTTGCATTTTATTTGGGCAATCATGGAAGCATGGAGGGTTTGACCGTTTTGATTTTGGGGTCGATATTTGCTTCTTTGGATATCAGGTATTGTGCG
GTCTATGCGAATTATGTTTGGTTGGCGGCCATTGTTTTGCTGGCGTTGCGGAAGAAGGTCGTGCCTGTCCATGCGGCACTTTGGGGCTTGGCGTTGGTGGCTTTCAGTGTGAAAGCCGTATACGTCGATGAAGCAGGGAATACATCGGATATTGTGCGCTACGGTGCAGGATTTTATTTGTGGTATGCCGCATTTGCGGTTGCCACCATCGGTACGTTTGCCGGAAAGAATAAGGAAAGAAAAGCCGCATCAGCGGCAGACGGGATAAAAATGACGTTTGATAAATGGTTGGGCTTGTCAAAACTGCCTAAAAATGAAGCAAGAATGCTGCTACAATATGTTTCGGAATATACGCGCGTGCAGTTGTTGACGCGGGGCGGGGAAGAAATGCCGGACGAAGTCCGACAGCGGGCGGACAGGCTGGCGCAACGCCGTCTGAACGGCGAGCCGGTTGCCTATATTTTAGGTGTGCGCGAATTTTATGGCAGACGCTTTACAGTCAATCCGAGCGTGCTGATTCCGCGCCCCGAAACCGAACATTTGGTCGAAGCCGTATTGGCGCGCCTGCCCGAAAACGGGCGCGTGTGGGATTTGGGGACGGGCAGCGGCGCGGTTGCCGTAACCGTCGCGCTCGAACGCCCCGATGCGTTTGTGCGCGCATCCGACATCAGCCCGCCCGCCCTTGAAACGGCGCGGAAAAATGCGGCGGATTTGGGCGCGCGGGTCGAATTTGCACACGGTTCGTGGTTCGACACCGATATGCCGTCTGAAGGGAAATGGGACATCATCGTGTCCAACCCGCCCTATATCGAAAACGGCGATAAACATTTGTTGCAAGGCGATTTGCGGTTTGAGCCGCAAATCGCGCTGACCGACTTTTCAGACGGCCTAAGCTGCATCCGCACCTTGGCGCAAGGCGCGCCCGACCGTTTGGCGGAAGGCGGTTTTTTATTGCTGGAACACGGTTTCGATCAGGGCGCGGCGGTGCGCGGCGTGTTGGCGGAGAATGGTTTTTCAGGAGTGGAAACCCTGCCGGATTTGGCGGGTTTGGACAGGGTTACGCTGGGGAAGTATATGAAGCATTTGAAATAANMB2065蛋白序列MQEQNRKPSFPIVMLLVSVALWIASLSNVAFYLGNHGSMEGLTVLILGSIFASLDIRYCAVYANYVWLAAIVLLALRKKVVPVHAALWGLALVAFSVKAVYVDEAGNTSDIVRYGAGFYLWYAAFAVATIGTFAGKNKERKAASAADGIKMTFDKWLGLSKLPKNEARMLLQYVSEYTRVQLLTRGGEEMPDEVRQRADRLAQRRLNGEPVAYILGVREFYGRRFTVNPSVLIPRPETEHLVEAVLARLPENGRVWDLGTGSGAVAVTVALERPDAFVRASDISPPALETARKNAADLGARVEFAHGSWFDTDMPSEGKWDIIVSNPPYIENGDKHLLQGDLRFEPQIALTDFSDGLSCIRTLAQGAPDRLAEGGFLLLEHGFDQGAAVRGVLAENGFSGVETLPDLAGLDRVTLGKYMKHLK由被接种者17D血清选择的突变体(仅筛选一次)NMB0339 DNA序列ATGGACAACGAATTGTGGATTATCCTGCTGCCGATTATCCTTTTGCCCGTCTTCTTCGCGATGGGCTGGTTTGCCGCCCGCGTGGATATGAAAACCGTATTGAAGCAGGCAAAAAGCATCCCTTCGGGATTTTATAAAAGCTTGGACGCTTTGGTCGACCGCAACAGCGGGCGCGCGGCAAGGGAGTTGGCGGAAGTCGTCGACGGCCGGCCGCAATCGTATGATTTGAACCTCACCCTCGGCAAACTTTACCGCCAGCGTGGCGAAAACGACAAAGCCATCAACATACACCGGACAATGCTCGATTCTCCCGATACGGTCGGCGAAAAGCGCGCGCGCGTCCTGTTTGAATTGGCGCAAAACTACCAAAGTGCGGGGTTGGTCGATCGTGCCGAACAGATTTTTTTGGGGCTGCAAGACGGTAAAATGGCGCGTGAAGCCAGACAGCACCTGCTCAATATCTACCAACAGGACAGGGATTGGGAAAAAGCGGTTGAAACCGCCCGGCTGCTCAGCCATGACGATCAGACCTATCAGTTTGAAATCGCCCAGTTTTATTGCGAACTTGCCCAAGCCGCGCTGTTCAAGTCCAATTTCGATGTCGCGCGTTTCAATGTCGGCAAGGCACTCGAAGCCAACAAAAAATGCACCCGCGCCAACATGATTTTGGGCGACATCGAACACCGACAAGGCAATTTCCCTGCCGCCGTCGAAGCCTATGCCGCCATCGAGCAGCAAAACCATGCATACTTGAGCATGGTCGGCGAGAAGCTTTACGAAGCCTATGCCGCGCAGGGAAAACCTGAAGAAGGCTTGAACCGTCTGACAGGATATATGCAGACGTTTCCCGAACTTGACCTGATCAATGTCGTGTACGAGAAATCCCTGCTGCTTAAGTGCGAGAAAGAAGCCGCGCAAACCGCCGTCGAGCTTGTCCGCCGCAAGCCCGACCTTAACGGCGTGTACCGCCTGCTCGGTTTGAAACTCAGCGATATGAATCCGGCTTGGAAAGCCGATGCCGACATGATGCGTTCGGTTATCGGACGGCAGCTACAGCGCAGCGTGATGTACCGTTGCCGCAACTGCCACTTCAAATCCCAAGTCTTTTTCTGGCACTGCCCCGCCTGCAACAAATGGCAGACGTTTACCCCGAATAAAATCGAAGTTTAANMB0339蛋白序列
MDNELWIILLPIILLPVFFAMGWFAARVDMKTVLKQAKSIPSGFYKSLDALVDRNSGRAARELAEVVDGRPQSYDLNLTLGKLYRQRGENDKAINIHRTMLDSPDTVGEKRARVLFELAQNYQSAGLVDRAEQIFLGLQDGKMAREARQHLLNIYQQDRDWEKAVETARLLSHDDQTYQFEIAQFYCELAQAALFKSNFDVARFNVGKALEANKKCTRANMILGDIEHRQGNFPAAVEAYAAIEQQNHAYLSMVGEKLYEAYAAQGKPEEGLNRLTGYMQTFPELDLINVVYEKSLLLKCEKEAAQTAVELVRRKPDLNGVYRLLGLKLSDMNPAWKADADMMRSVIGRQLQRSVMYRCRNCHFKSQVFFWHCPACNKWQTFTPNKIEV使用病人血清筛选我们收集了筛选用的急性期和恢复期血清。这来自奈瑟氏脑膜炎球菌不同血清群感染的个体。已使用急性期(A)或恢复期(C)血清进行了筛选。在急性感染和血清收集之间为2周至3个月。
NMB0401 putA DNA序列ATGTTTCATTTTGCATTTCCGGCACAAACTGCCCTGCGCCAAGCGATAACCGATGCCTACCGCCGTAATGAAATCGAAGCCGTACAGGATATGTTGCAACGTGCACAGATGAGCGACGAAGAGCGCAACGCCGCCTCCGAGCTTGCCCGCCGTTTGGTTACCCAAGTCCGCGCCGGCCGCACCAAAGCCGGCGGCGTGGATGCGCTGATGCACGAGTTTTCACTCTCCAGCGAAGAAGGCATCGCGCTGATGTGTCTGGCAGAAGCCCTGCTGCGTATCCCCGACAACGCCACGCGCGACCGCCTGATTGCCGACAAGATTTCAGACGGCAACTGGAAAAGCCATTTGAACAACAGCCCTTCCCTCTTCGTCAATGCTGCCGCCTGGGGCCTGCTGATTACCGGCAAACTGACCGCCACAAACGACAAACAAATGAGTTCCGCACTCAGCCGCCTGATCAGCAAAGGCGGCGCACCGCTCATCCGCCAAGGCGTAAATTACGCCATGCGGCTTCTGGGCAAACAGTTCGTAACCGGACAGACCATTGAAGAAGCCCTGCAAAACGGCAAAGAACGCGAAAAAATGGGCTACCGCTTCTCCTTCGATATGTTGGGCGAAGCCGCCTACACCCAAGCCGATGCCGACCGCTACTACCGCGACTATGTCGAAGCCATCCACGCCATCGGCAAAGATGCGGCAGGACAAGGCGTTTACGAAGGTAACGGTATTTCCGTCAAACTTTCCGCCATCCATCCGCGCTACTCGCGCACCCAACACGGCCGCGTGATGGGCGAACTGTTGCCGCGCCTGAAAGAGCTGTTCCTTTTGGGTAAAAAATACGATATCGGTATCAACATCGATGCCGAAGAAGCCAACCGTCTGGAGCTGTCTTTGGATTTGATGGAGGCTTTGGTTTCAGACCCTGACTTGGCTGGCTACAAAGGTATCGGTTTCGTTGTCCAAGCCTACCAAAAACGTTGTCCGTTCGTTATCGACTACCTGATCGACCTTGCCCGCCGCAACAACCAAAAACTAATGATCCGCCTCGTCAAAGGCGCGTATTGGGACAGCGAAATCAAATGGGCGCAAGTGGACGGCTTGAACGGCTATCCGACCTACACCCGCAAAGTCCACACCGACATCTCCTACCTCGCCTGCGCGCGCAAACTGCTTTCCGCGCAAGACGCGGTATTCCCGCAATTTGCCACCCACAACGCCTACACTTTGGGCGCAATCTACCAAATGGGTAAAGGCAAAGATTTTGAACACCAATGCCTGCACGGTATGGGCGAAACCCTGTACGACCAAGTCGTCGGCCCGCAAAACTTAGGCCGCCGCGTGCGCGTGTACGCCCCAGTCGGCACACACGAAACCCTGCTCGATGTCGGCGAAGCGCAACCGATTAAAAACCCTGCCGACCACGACGACATCGTCGGCACAGTCAGCTTTGCCGATGCCGCGCTTGCCCAAGAAGCGGTTGGCGCAGCCGTTGCCGCGTTCCCCGAATGGAGTGCGACACCTGCCGCCGAACGCGCCGCCTGCCTGCGCCGTTTTGCCGATTTGCTGGAGCAGCACACCCCAGCACTGATGATGCTTGCCGTGCGCGAAGCAGGCAAAACGCTGAACAACGCCATTGCCGAAGTGCGCGAAGCCGTCGATTTCTGCCGCTACTACGCAAACGAAGCCGAACATACCCTGCCTCAAGACGCAAAAGCCGTCGGCGCGATTGTCGCCATCAGCCCGTGGAACTTCCCGCTCGCCATCTTTACCGGCGAAGTCGTTTCCGCATTGGCGGCAGGCAACACCGTCATCGCCAAACCCGCCGAACAAACCAGCCTGATTGCCGGTTATGCCGTTTCCCTCATGCACGAAGCCGGCATCCCGACTTCCGCCCTGCAACTCGTCCTCGGCGCAGGCGACGTGGGTGCGGCATTGACCAACGATGCCCGCATCGGCGGCGTGATTTTCACCGGCTCGACC
GAAGTGGCGCGCCTGATCAACAAAGCCCTTGCCAAACGCGGCGACAATCCCGTCCTGATTGCCGAAACCGGCGGACAAAACGCCATGATTGTCGATTCCACCGCACTTGCCGAGCAAGTCTGCGCCGACGTATTGAACTCCGCCTTCGACAGCGCGGGACAACGCTGCTCCGCCCTGCGCATTTTGTGCGTCCAAGAAGACGTTGCCGACCGTATGCTCGACATGATCAAAGGCGCTATGGACGAACTCGTCGTCGGCAAACCGATTCAGCTCACTACCGATGTCGGCCCCGTCATCGATGCCGAAGCACAGCAAAACCTGTTGAACCACATCAACAAAATGAAAGGTGTTGCCAAGTCCTACCACGAAGTCAAAACCGCCGCCGATGTCGATTCCAAAAAATCCACGTTCGTTCGCCCCATCCTGTTTGAATTGAACAACCTCAACGAACTGCAACGCGAAGTCTTCGGTCCCGTCCTGCACGTCGTCCGCTACCGCGCCGACGAACTCGACAACGTCATCGACCAAATCAACAGCAAAGGCTACGCCCTGACCCACGGCGTACACAGCCGCATCGAAGGCACGGTACGCCACATCCGCAGCCGCATCGAAGCCGGCAACGTTTACGTCAACCGCAACATCGTCGGCGCAGTCGTCGGCGTACAGCCCTTCGGCGGACACGGTCTGTCCGGCACAGGCCCCAAAGCAGGCGGTTCGTTCTACCTGCAAAAACTGACCCGCGCCGGCGAATGGGTTGCCCCGACCCTGAGCCAAATCGGACAGGCGGACGAAGCCGCACTCAAACGCCTCGAAGCACTGGTTCACAAACTACCGTTCAACGCCGAAGAGAAAAAAGCCGCAGCGGCCGCTTTGGGACACGCCCGCATCCGCACCCTGCGCCGTGCCGAAACCGTCCTTACCGGACCGACCGGCGAGCGCAACAGCATCTCATGGCACGCGCCCAAACGCGTTTGGATACACGGCGGCAGCACGGTTCAAGCCTTTGCCGCACTGACCGAACTTGCCGCCTCCGGCATACAGGCAGTGGTCGAACCCGACAGCCCCTTGGCTTCCTACACTGCCGACTTGGAAGGTCTGCTGCTGGTCAACGGCAAACCCGAAACCGCCGGCATCAGCCACGTTGCCGCCCTGTCGCCTTTGGACAGCGCGCGCAAACAGGAACTTGCCGCCCACGACGGCGCACTCATCCGCATCCTCCCTTCGGAAAACGGACTCGACATCCTGCAAGTGTTTGAAGAAATCTCTTGCAGCGTCAACACCACAGCCGCCGGCGGCAACGCCAGCCTGATGGCGGTCGCCGACTGANMB0401蛋白序列MFHFAFPAQTALRQAITDAYRRNEIEAVQDMLQRAQMSDEERNAASELARRLVTQVRAGRTKAGGVDALMHEFSLSSEEGIALMCLAEALLRIPDNATRDRLIADKISDGNWKSHLNNSPSLFVNAAAWGLLITGKLTATNDKQMSSALSRLISKGGAPLIRQGVNYAMRLLGKQFVTGQTIEEALQNGKEREKMGYRFSFDMLGEAAYTQADADRYYRDYVEAIHAIGKDAAGQGVYEGNGISVKLSAIHPRYSRTQHGRVMGELLPRLKELFLLGKKYDIGINIDAEEANRLELSLDLMEALVSDPDLAGYKGIGFVVQAYQKRCPFVIDYLIDLARRNNQKLMIRLVKGAYWDSEIKWAQVDGLNGYPTYTRKVHTDISYLACARKLLSAQDAVFPQFATHNAYTLGAIYQMGKGKDFEHQCLHGMGETLYDQVVGPQNLGRRVRVYAPVGTHETLLAYLVRRLLENGANSSFVNQIVDENISIDTLIRSPFDTIAEQGIHLHNALPLPRDLYGKCRLNSQGVDLSNENVLQQLQEQMNKAAAQDFHAASIVNGKARDVGEAQPIKNPADHDDIVGTVSFADAALAQEAVGAAVAAFPEWSATPAAERAACLRRFADLLEQHTPALMMLAVREAGKTLNNAIAEVREAVDFCRYYANEAEHTLPQDAKAVGAIVAISPWNFPLAIFTGEVVSALAAGNTVIAKPAEQTSLIAGYAVSLMHEAGIPTSALQLVLGAGDVGAALTNDARIGGVIFTGSTEVARLINKALAKRGDNPVLIAETGGQNAMIVDSTALAEQVCADVLNSAFDSAGQRCSALRILCVQEDVADRMLDMIKGAMDELVVGKPIQLTTDVGPVIDAEAQQNLLNHINKMKGVAKSYHEVKTAADVDSKKSTFVRPILFELNNLNELQREVFGPVLHVVRYRADELDNVIDQINSKGYALTHGVHSRIEGTVRHIRSRIEAGNVYVNRNIVGAVVGVQPFGGHGLSGTGPKAGGSFYLQKLTRAGEWVAPTLSQIGQADEAALKRLEALVHKLPFNAEEKKAAAAALGHARIRTLRRAETVLTGPTGERNSlSWHAPKRVWIHGGSTVQAFAALTELAASGIQAVVEPDSPLASYTADLEGLLLVNGKPETAGISHVAALSPLDSARKQELAAHDGALIRILPSENGLDILQVFEEISCSVNTTAAGGNASLMAVADNMB1335 CreA上述给出的DNA及蛋白序列NMB1467 PPXDNA序列ATGACCACCACCCCCGCAAACGTCCTCGCCTCCGTCGATTTGGGTTCCAACAGTTTCCGCCTCCAGATTTGCGAAAACAACAACGGACAATTAAAAGTCATCGATTCGTTCAAACAGATGGTGCGCTTCGCCGCCGGACTGGACGAACAGAAAAATCTGAGTGCCGCTTCCCAAGAACAG
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NMB0337支链氨基酸氨基转移酶DNA序列ATGAGCAGACCCGTACCCGCCGTATTCGGCAGCGTTTTTCACAGTCAAATGCCCGTCCTCGCCTACCGCGAAGGCAAATGGCAGCCGACCGAATGGCAATCTTCCCAAGACCTCTCCCTCGCACCGGGCGCGCACGCCCTGCACTACGGCAGCGAATGTTTCGAGGGACTGAAAGCCTTCCGTCAGGCAGACGGCAAAATCGTGCTGTTCCGTCCGACTGCCAATATCGCGCGTATGCGGCAAAGTGCGGACATTTTGCACCTGCCGCGCCCCGAAACCGAAGCTTATCTTGACGCGCTAATCAAATTGGTCAAACGTGCCGCCGATGAAATTCCCGATGCGCCTGCCGCCCTGTACCTGCGTCCGACCTTAATCGGTACCGATCCCGTTATCGGCAAGGCCGGTTCTCCTTCCGAAACCGCCCTGCTGTATATTTTGGCTTCCCCCGTCGGCGACTATTTCAAAGTCGGATCGCCCGTCAAAATTTTGGTGGAAACCGAACACATCCGCTGCGCCCCGCATATGGGCCGCGTCAAATGCGGCGGCAACTACGCTTCCGCCATGCACTGGGTGCTGAAGGCGAAAGCCGAATATGGCGCAAATCAAGTCCTGTTCTGCCCGAACGGCGACGTGCAGGAAACCGGCGCGTCCAACTTTATCCTGATTAACGGCGATGAAATCATTACCAAACCGCTGACCGACGAGTTTTTGCACGGCGTAACCCGCGATTCCGTACTGACGGTTGCCAAAGATTTGGGCTATACCGTCAGCGAACGCAATTTCACGGTTGACGAACTCAAAGCTGCGGTGGAAAACGGTGCGGAAGCCATTTTGACCGGTACGGCAGCCGTCATCTCGCCCGTTACTTCCTTCGTCATCGGCGGCAAAGAAATCGAAGTGAAAAGCCAAGAACGCGGCTATGCCATCCGTAAGGCGATTACCGACATCCAGTATGGTTTGGCGGAAGACAAATACGGCTGGCTGGTTGAAGTGTGCTGANMB0337蛋白序列MSRPVPAVFGSVFHSQMPVLAYREGKWQPTEWQSSQDLSLAPGAHALHYGSECFEGLKAFRQADGKIVLFRPTANIARMRQSADILHLPRPETEAYLDALIKLVKRAADEIPDAPAALYLRPTLIGTDPVIGKAGSPSETALLYILASPVGDYFKVGSPVKILVETEHIRCAPHMGRVKCGGNYASAMHWVLKAKAEYGANQVLFCPNGDVQETGASNFILINGDEIITKPLTDEFLHGVTRDSVLTVAKDLGYTVSERNFTVDELKAAVENGAEAILTGTAAVISPVTSFVIGGKEIEVKSQERGYAIRKAITDIQYGLAFDKYGWLVEVCNMB0191 ParA家族蛋白DNA序列ATGAGTGCGAACATCCTTGCCATCGCCAATCAGAAGGGCGGTGTGGGCAAAACGACGACGACGGTAAATTTGGCGGCTTCGCTGGCATCGCGCGGCAAACGCGTGCTGGTGGTCGATTTGGATCCGCAGGGCAATGCGACGACGGGCAGCGGCATCGACAAGGCGGGTTTGCAGTCCGGCGTTTATCAGGTCTTATTGGGCGATGCGGACGTGCAGTCGGCGGCGGTACGCAGCAAAGAGGGCGGATACGCTGTGTTGGGTGCGAACCGCGCGCTGGCCGGCGCGGAAATCGAACTGGTGCAGGAAATCGCCCGGGAAGTGCGTTTGAAAAACGCGCTCAAGGCAGTGGAAGAAGATTACGACTTTATCCTGATCGACTGCCCGCCTTCGCTGACGCTGTTGACGCTTAACGGGCTGGTGGCGGCGGGCGGCGTGATTGTGCCGATGTTGTGCGAATATTACGCGCTGGAAGGGATTTCCGATTTGATTGCGACCGTGCGCAAAATCCGTCAGGCGGTCAATCCCGATTTGGACATCACGGGCATCGTGCGCACGATGTACGACAGCCGCAGCAGGCTGGTTGCCGAAGTCAGCGAACAGTTGCGCAGCCATTTCGGGGATTTGCTTTTTGAAACCGTCATCCCGCGCAATATCCGCCTTGCGGAAGCGCCGAGCCACGGTATGCCGGTGATGGCTTACGACGCGCAGGCAAAGGGTACCAAGGCGTATCTTGCCTTGGCGGACGAGCTGGCGGCGAGGGTGTCGGGGAAATAGNMB0191蛋白序列MSANILAIANQKGGVGKTTTTVNLAASLASRGKRVLVVDLDPQGNATTGSGIDKAGLQSGVYQVLLGDADVQSAAVRSKEGGYAVLGANRALAGAEIELVQEIAREVRLKNALKAVEEDYDFILIDCPPSLTLLTLNGLVAAGGVIVPMLCEYYALEGISDLIATVRKIRQAVNPDLDITGIVRTMYDSRSRLVAEVSEQLRSHFGDLLFETVIPRNIRLAEAPSHGMPVMAYDAQAKGTKAYLALADELAARVSGKNMB1710谷氨酸脱氢酶(gdhA)DNA序列
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权利要求
1.一种鉴定微生物多肽的方法，该多肽与受微生物处理的动物的免疫反应有关，该方法包括如下步骤(1)提供微生物的许多不同突变体；(2)使所述的许多突变体微生物与来自对微生物或其部分产生免疫反应的动物的抗体接触，其条件是如果抗体与突变体微生物结合，突变体微生物被杀伤；(3)从步骤(2)选择存活的突变体微生物；(4)鉴定在存活突变体微生物中含有突变的基因；以及(5)鉴定此基因编码的多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物是病原体微生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的受微生物处理的动物是微生物的宿主。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述的受微生物处理的动物是被或已被感染微生物的人。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的微生物是细菌。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的细菌是奈瑟氏脑膜炎球菌。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的突变体微生物具有插入突变。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的步骤(3)选择的存活突变体被回交至微生物的亲代株，并确定得到的回交对在步骤(2)中设定的条件下的杀伤是否具有抵抗性。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中在步骤(2)中补体介导结合抗体的微生物的杀伤。
10.一种鉴定编码微生物多肽基因的方法，该多肽与受微生物处理的动物的免疫反应有关，该方法包括实施权利要求1中定义的步骤(1)至(4)。
11.一种筛选编码多肽的基因突变的微生物的方法，该多肽与受微生物处理的动物的免疫反应有关，该方法包括实施权利要求1中定义的步骤(1)至(3)。
12.一种制备抗原的方法，该方法包括实施根据权利要求1至9任一项的方法，以及合成在步骤(5)中鉴定的多肽或其抗原片断或变异体，或此多肽或片断或变异体的融合体。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的变异体为相关微生物的同源多肽。
14.一种制备抗御微生物的疫苗的方法，该方法包括根据权利要求12或13的方法制备抗原或编码所述抗原的多核苷酸及使抗原或多核苷酸与合适的载体联合。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的抗原和多核苷酸与佐剂联合使用。
16.根据权利要求12或13的方法可获得的抗原或编码所述抗原的多核苷酸。
17.权利要求14或15的方法可获得的疫苗。
18.根据权利要求16用于疫苗的抗原或多核苷酸。
19.给予个体抗微生物免疫接种的方法，该方法包括给予根据权利要求16的抗原或多核苷酸，或给予根据权利要求17的疫苗至个体。
20.根据权利要求16的抗原或多核苷酸，或根据权利要求17的疫苗在制备免疫接种个体的抗御微生物的疫苗中的用途。
21.一种制备多核苷酸的方法，该方法包括实施权利要求10的步骤及分离或合成鉴定的基因或其变异体或片断，或此基因或变异体或片断的融合体。
22.权利要求20的方法可获得的多核苷酸。
23.权利要求11的方法可获得的突变体微生物。
24.本发明描述的任何鉴定微生物抗原的新方法。
25.包含选自序列号为4、2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56的任一序列的氨基酸序列的多肽，或其片断或变异体，或此片断或变异体的融合体。
26.编码根据权利要求25的多肽的多核苷酸。
27.根据权利要求25用于药剂的多肽或根据权利要求26用于药剂的多核苷酸。
28.根据权利要求25用于疫苗的多肽或根据权利要求26用于疫苗的多核苷酸。
29.根据权利要求25一种制备多肽的方法，该方法包括使权利要求26的多核苷酸在宿主细胞表达及分离所述多肽。
30.根据权利要求26的制备多肽的方法，该方法包括化学合成所述多肽。
31.一种给予个体免疫接种以抵抗奈瑟氏脑膜炎球菌的方法，所述方法包括给予个体根据权利要求25的多肽或根据权利要求26的多核苷酸。
32.根据权利要求25的多肽或根据权利要求26的多核苷酸在制备免疫接种个体以抵抗奈瑟氏脑膜炎球菌的疫苗中的用途。
33.根据本发明所公开的任何新型奈瑟氏脑膜炎球菌疫苗。
全文摘要
一种鉴定微生物多肽的方法，其中多肽与受微生物处理的动物的免疫反应有关，该方法包括如下几个步骤(1)提供众多不同突变体微生物；(2)使这些众多突变体微生物与对微生物或其部分产生免疫反应的动物的抗体接触，其条件是如果抗体结合突变体微生物，突变体微生物被杀伤；(3)从步骤(2)选择存活的突变体微生物；(4)鉴定在存活突变体微生物中含有突变的基因；以及(5)鉴定该基因编码的多肽。所鉴定的多肽或其变异体或片段或这些结构的融合体在疫苗中是有用的。多肽可以为由选自序列号SEQ ID Nos 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56的任一序列的氨基酸序列组成的多肽，或其片段或变异体或此片段或变异体的融合体，用于抗奈瑟氏脑膜炎球菌疫苗。
文档编号A61K39/095GK1925888SQ200480042050
公开日2007年3月7日 申请日期2004年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者克里斯托弗·M·唐, 李延文 申请人:帝国改革有限公司