专利名称：基于酰肼基的微粒表面多重生物功能因子组装方法
技术领域：
本发明涉及一种基于酰肼基的微粒表面多重生物功能因子组装方法，属于多重生物功能因子组装方法。
背景技术：
纳米粒子或微球由于其较小的粒径，较长的体内循环时间，且对药物起到保护和控释、缓释的作用，是药物的理想载体。然而，理想的疾病治疗，如癌症治疗，要求药物只作用于病变组织或细胞，而对正常组织没有影响，即药物的靶向释放；而有些疗法则要求载体既具有较强的负载能力，又具有良好的靶向性，如表皮生长因子、内皮生长因子、神经生长因子的运输。上述各种功能因子需要与载体相结合，而聚乳酸等生物可降解材料为基质的粒子或微球虽然具有良好的生物相容性，但其结构上却缺乏可反应性基团，从而限制了功能因子与载体结合。葡聚糖、普鲁兰、淀粉、透明质酸等天然大分子及其改性物结构中富含可反应性基团，且具有良好的生物相容性、可降解性，表面以多糖修饰的纳米粒子与微球具有与聚乙二醇相似的延长体内循环周期的作用。
药物载体与靶向功能因子结合方式的设计对靶向制剂的成功实施是十分关键的。近年来大部分的研究只局限于纳米粒子及微球表面的单功能化，即只在纳米粒子或微球表面连接一种功能因子。常用的连接方式包括硫醚键、二硫键、酯键、酰胺键、酰腙键、西夫碱等共价偶连和生物素-亲和素物理作用实现连接。上述方法实现的单功能化粒子在一些情况下并不能很好的解决问题，如用于癌症治疗的纳米粒子在体内的靶向效果受到各种生物屏障(如血脑屏障，BBB)的影响，阻碍了他们顺利到达靶向部位，即使它们的表面连有靶向物质，一种有效的解决方法就是在粒子表面引入多种功能化因子，其中某种因子引导粒子通过诸如BBB等生物屏障，而其它因子则引导粒子顺利到达靶向部位；又如上述提及的表皮生长因子、内皮生长因子、神经生长因子的运输，在负载的同时还要求靶向性，也可通过多重生物因子在载体表面的功能化来解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于酰肼基的微粒表面多重生物功能因子组装方法。该方法以微粒表面的酰肼基及基于酰肼基的生物素为生物性分子的结合位点，通过简便的酰腙键反应和生物素-亲和素物理作用将多种生物活性分子偶联于微粒表面，并引导载药微粒的靶向药物释放。
本发明是通过下述的技术方案加以实现的，一种基于醛基的微粒表面多重生物功能因子组装方法，其特征在于包括如下步骤1.双亲性多糖衍生物的制备1)醛化多糖的制备在4℃避光条件下，在水体系中按高碘酸钠(NaI04)与多糖化合物中糖单元的摩尔比1∶2～50投料反应0.5～8h，将反应液用截留分子量10,00～40,000半透膜对去离子水透析10～144h，冷冻干燥得固态产物；所述的多糖选自相对分子质量10,000～1,000,000的葡聚糖或淀粉或普鲁兰。
2)双亲性改性醛化多糖的制备a.胆固醇改性醛化多糖的制备将胆固醇与丁二酸酐按摩尔比1∶1～5投料，70℃在吡啶催化下反应3～8h生成胆固醇-3-半琥珀酸(Chol-Succ)，乙醇重结晶1～3次，真空干燥；将胆固醇-3-半琥珀酸与二氯亚砜按摩尔比1∶2～10溶于10～50mL干燥三氯甲烷中，70℃反应1～10h，生成胆固醇-3-半琥珀酸酰氯(Chol-Succ酰氯)，真空蒸出液体，将残余固体复溶于20mL干燥三氯甲烷中待用；将上述冻干得到的醛化多糖溶于40mL干燥DMSO中，滴加数滴三乙胺，按酰氯与糖单元的摩尔比为1∶2～50量取Chol-Succ酰氯滴加入醛化多糖溶液中，氮气保护，80℃反应3～8h，产物对去离子水透析10～144h，透析液冷冻干燥，得胆固醇改性醛化多糖。
b.胆酸改性醛化多糖的制备将1g胆酸溶于20～60mL乙醇中，40～78℃在1～5mL浓盐酸催化下形成胆酸乙酯，将胆酸乙酯的乙醇溶液在40～78℃下向溶有0.5～10mL水合肼的乙醇溶液中缓慢滴加，反应3～8h，冷却析出物用乙醇重结晶，得胆酸酰肼(CAH)；将100mg醛化多糖溶于8mL水中，CAH溶于16mL DMF中，两溶液混合得到一均相体系，体系中糖单元与CAH的摩尔比为1∶2～50；体系的pH值调节到4，室温反应1～24h，反应溶液倒入大量的甲醇中沉淀出产物，过滤，用甲醇充分洗涤多次，室温下真空干燥，得胆酸改性醛化多糖。
c.苯氧基改性醛化多糖的制备将苯基甘油醚(1，2-epoxy-3-phenoxypropane)醛化多糖糖单元的摩尔比为1∶2～50投料，在1M氢氧化钠(NaOH)溶液中室温反应10-48h，将产物在乙醇中沉降，再对去离子水透析，10～144h，冷冻干燥得苯氧基改性醛化多糖。
3)双亲性改性酰肼化多糖及进一步部分生物素化产物的制备取一定量双亲性改性醛化多糖溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢滴加到质量浓度5％、pH＝5的己二酰肼的醋酸钠(Na2AC)缓冲溶液中，室温反应5～24h后以甲醇沉淀，冷冻干燥得双亲性改性酰肼化多糖。
按生物素(Biotin)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)摩尔比1∶1.5∶1.5的比例加料至干燥DMF中，4～25℃反应24h，过滤，将滤液滴加至溶有双亲性改性酰肼化多糖的干燥二甲级亚砜(DMSO)体系中，反应5～24h，将反应液对去离子水透析48h，透析液冷冻干燥，得进一步部分生物素化的双亲性改性酰肼化多糖。控制Biotin与双亲性改性酰肼化多糖的配比控制Biotin的取代度。
2.载药微球制备1)透析法a.将脂溶性药物、可生物降解聚合物和双亲性改性酰肼化多糖按重量比为1∶0.5～100∶0.5～100共溶于1～1000体积份的二甲基亚砜(DMSO)或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中；所述的脂溶性药物包括卡氮芥、消炎痛、环孢菌素A、阿克拉霉素A、利福平、酮洛芬、他莫西芬、红霉素或阿苯达唑；所述的可生物降解聚合物包括相对分子质量5,000～100,000的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)；所述的双亲性改性酰肼化多糖选自经胆固醇、胆酸或苯氧基疏水改性的相对分子质量10,000～1,000,000的醛化葡聚糖或醛化淀粉或醛化普鲁兰的酰肼化产物，或进一步利用酰肼化产物中的酰肼基与生物素偶连，实现其部分生物素化的产物。
b.将上述共溶体系用截留分子量7,000～50,000的半透膜对去离子水透析1～144h，得到表面含酰肼基或部分生物素的载药可生物降解聚合物微粒；2)乳液法a.将脂溶性药物和聚合物按重量比为1∶0.5～100共溶于1～1,000体积份的丙酮、二氯甲烷或上述二者的混合溶液中形成油相，所述的脂溶性药物包括卡氮芥、消炎痛、环孢菌素A、阿克拉霉素A、利福平、酮洛芬、他莫西芬、红霉素或阿苯达唑；所述的可生物降解聚合物包括相对分子质量5,000～200,000的聚3-羟基丁酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或尼龙。
b.按脂溶性药物与双亲性改性酰肼化多糖的重量比为1∶0.5～100，将双亲性改性酰肼化多糖溶于1～1,000体积份的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(PBS)缓冲溶液中，得水相，所述的双亲性改性酰肼化多糖选自经胆固醇、胆酸或苯氧基疏水改性相对分子质量10,000～1,000,000的醛化葡聚糖或醛化淀粉或醛化普鲁兰的酰肼化产物，或进一步利用酰肼化产物中的酰肼基与生物素偶连，实现其部分生物素化的产物。
c.将步骤a制得的油相在转速500～1200转/分的搅拌下快速注入步骤b制得的水相中并继续在磁力条件下搅拌至粒子固化为止。
3.将步骤1制得的微球水溶液以10,000～16,000rpm下离心，去除上清液；再将离出微球超声分散于同体积份的不同的缓冲溶液中，与不同的生物活性因子进行偶联；
4.1)若利用微球表面游离酰肼基与生物功能因子结构中的羧基进行化学偶连，则冰浴条件下，按体积比1∶0.1～4.0将pH＝4.0～6.0 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液环境的微球溶液滴加至溶有0.1～2.0mg/mL两种或两种以上生物因子和0.005～0.5g/mL1-[3-(二甲胺基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(EDC)的pH＝4.0～6.0MES缓冲溶液中，孵化1～24h；所述生物因子包括转铁蛋白、兔IgG、表皮生长因子受体EGFR、转铁蛋白受体CD71、单抗OX26、内皮生长因子和神经生长因子。
2)若通过对某些结构中具有糖原结构的生物功能因子中的糖单元进行氧化，再与微球表面游离酰肼基实现偶连，在4～25℃下，按体积比1∶0.1～4.0将pH为4.0～6.0磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液环境的微球溶液向溶有0.1～2.0mg/mL两种或两种以上生物因子的pH为4.0～6.0磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液滴加，孵化1～5h；所述生物因子包括氧化转铁蛋白、氧化兔IgG。
3)若上述双亲性多糖采用部分生物素化改性物，则按体积比1∶0.1～4.0将pH为7.4～9.18的Na2CO3-NaHCO3缓冲液环境的微球溶液向溶有0.1～2.0mg/mL两种或两种以上亲和素化生物因子的pH为7.4～9.18的Na2CO3-NaHCO3缓冲液滴加，37℃孵化1～5h；所述生物因子包括亲和素化转铁蛋白、亲和素化兔IgG、亲和素化EGFR、亲和素化CD71、亲和素化OX26、亲和素化内皮生长因子、亲和素化神经生长因子。
5.将孵化液在10,000～16,000rpm下离心，去离子水洗涤三次，分散于同体积份的生理盐水中。
本发明中，多功能因子在微粒表面的组装方式是利用微球表面游离酰肼基与生物功能因子结构中的羧基或糖原氧化得到的酰肼基进行化学偶连，或通过酰肼基生物素化后与亲和素化因子发生物理结合。利用本发明中基于酰肼基的微粒表面多重生物功能因子组装方法及其制备方法，可制得形状规整，粒径范围50-1,000nm且粒径分布窄的表面多重功能化组装的微球或颗粒。本发明操作简单，通过制备表面含反应性基团—酰肼基的微粒，控制反应条件与反应步骤，可以在微粒表面组装两种或两种以上的生物功能因子，以满足不同的应用要求，所制备的表面生物多功能化微粒在药物投递、控释缓释等方面具有重要的应用前景。
图1为实施例2制备的双功能化微球的透射电子显微镜照片，平均粒径约为250nm左右，且粒径分布较窄，微球表面极其光滑；图2为实施例2制备的双功能化微球的动态光散射测试图片；图3为实施例2制备的双功能化微球的荧光显微镜照片，粒子溶液呈现绿色荧光，证明了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的转铁蛋白(Tf)在粒子表面的结合；
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明实施例11.胆固醇疏水改性酰肼化葡聚糖(Chol-Dex-CHO)的制备(1)将1g胆固醇与1g丁二酸酐溶于30mL干燥吡啶中，70℃下反应5h，乙醇重结晶2次，真空干燥24h，得胆固醇-3-半琥珀酸(Chol-Succ)；(2)1g胆固醇-3-半琥珀酸溶于20mL干燥三氯甲烷中，70℃下向体系滴加2mL二氯亚砜，反应6h，生成胆固醇-3-半琥珀酸酰氯(Chol-Succ酰氯)，将反应液蒸干，再加入20mL干燥三氯甲烷复溶；(3)4℃避光条件下，2g葡聚糖溶于20mL去离子水中，按高碘酸钠(NaIO4)与糖单元的摩尔比为1∶5投料反应8h，将反应液用截留分子量14,000半透膜对去离子透析48h，冷冻干燥得醛化葡聚糖；(4)将上述冻干得到得醛化多糖溶于40mL干燥DMSO中，滴加数滴三乙胺，按酰氯与糖单元的摩尔比为1∶10量取Chol-Succ酰氯滴加入醛化葡聚糖溶液中，氮气保护，80℃反应6h，产物对去离子水透析48h，透析液冷冻干燥，得胆固醇改性醛化葡聚糖；(5)取0.5g胆固醇改性醛化葡聚糖溶于100mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢滴加到100mL pH＝5的含0.5g己二酰肼的醋酸钠(Na2AC)缓冲溶液中，室温反应24h后以甲醇沉淀，冷冻干燥得胆固醇改性酰肼化葡聚糖。
2.微球制备(1)称取4mg胆固醇疏水改性酰肼化葡聚糖(Chol-Dex-CHO)，8mgPLGA 50,000及4mg消炎痛共溶于6mL DMSO中；(2)室温将上述溶液用截留分子量7,000的半透膜对去离子水透析48h，得到具有明显浊光的微球水溶液体系；(3)将微球水溶液16,000rpm离心，去除上清液；(4)离出微球超声分散于4mL pH＝5.4MES缓冲液中；3.功能化(1)冰浴条件下，将微球溶液滴加到2mL溶有2mg EDC、2mg IgG和50ug内皮生长因子的pH＝5.4MES缓冲液中，孵化反应12h；(3)16,000rpm下离心并超声清洗三次以除去未结合的生物因子和EDC，得表面双功能化的葡聚糖修饰PLGA微球。
实施例21.部分生物素化的胆固醇疏水改性酰肼化葡聚糖的制备(1)制备胆固醇疏水改性酰肼化葡聚糖(同实例1)；(2)将生物素(Biotin)0.01mmol与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.015mmol和N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)0.015mmol溶于5mL干燥N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴反应24h，过滤；(3)取1mL滤液滴加至20mL溶有50mg胆固醇改性酰肼化葡聚糖的干燥二甲基亚砜(DMSO)体系中，室温反应12h，将反应液对去离子水透析48h，透析液冷冻干燥，得进一步部分生物素化的胆固醇改性酰肼化葡聚糖。
2.微球制备(1)将4mg部分生物素化的胆固醇疏水改性酰肼化葡聚糖Chol-Dex-NH-NH-Biotin(含酰肼基团)与8mg PLA 3,0000及3mg环孢菌素A共溶于4mLDMSO中；(2)室温下对pH＝5.0Na2AC缓冲溶液透析(cut-off＝14000g/mol)48h，形成稳定的具有带浊光的溶液；(3)溶液离心并超声分散于5mL pH＝5.0磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液中；3.功能化(1)冰浴下，将微球溶液室温滴加至1mL含有2mg NaIO4氧化并经FITC标记的转铁蛋白(Tf)的pH＝5.0磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液中，室温孵化12h，16,000rpm高速离心，离出微球以缓冲液超声清洗三次以除去未结合Tf；(2)将微球超声分散于pH＝7.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，加入亲和素化的兔IgG，37℃孵化1h，16,000rpm下离心并超声清洗三次以除去未结合兔IgG，得表面双功能化的葡聚糖修饰PLA超微粒子。
实施例31.苯氧基疏水改性酰肼化普鲁兰(Ph-Pull-NH-NH2)的制备(1)将0.5g醛化普鲁兰(制备工艺同实例1中的醛化葡聚糖的制备)溶于20mL 1M氢氧化钠(NaOH)溶液中，将苯基甘油醚(1，2-epoxy-3-phenoxypropane)按苯基甘油醚∶醛化普鲁兰糖单元的摩尔比为1∶10投料，室温反应24h，将产物在乙醇中沉降，再对去离子水透析，24h，冷冻干燥得苯氧基改性醛化普鲁兰；(2)取0.5g苯氧基改性醛化普鲁兰溶于100mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢滴加到100mL pH＝5的含0.5g己二酰肼的醋酸钠(Na2AC)缓冲溶液中，室温反应24h后以甲醇沉淀，冷冻干燥得苯氧基改性酰肼化普鲁兰。
2.微球制备(1)称取4mg Ph-Pull-NH-NH2与8mg聚乙醇酸50,000及1mg阿克拉霉素A共溶于4mL DMF中；(2)冰浴条件下，对pH＝5.0Na2AC缓冲溶液透析48h，形成稳定的具有带浊光的溶液；(3)溶液离心并超声分散于5mL pH＝5.4MES缓冲液中；3.功能化将微球溶液向2mL溶有100ug EGFR(表皮生长因子受体)、100ul CD71和0.01g EDC的pH＝5.4 MES缓冲液中滴加，冰浴孵化12h，16,000rpm高速离心后离出微球以缓冲液超声清洗三次以除去未结合的生物因子，得表面双功能化的普鲁兰修饰聚乙醇酸超微粒子。
实施例41.胆酸疏水改性酰肼化淀粉(Cholic-Sta-NH-NH2)的制备(1)将1g胆酸溶于30mL乙醇中，78℃在4mL浓盐酸催化下形成胆酸乙酯，将胆酸乙酯的乙醇溶液在78℃下向溶有5mL水合肼的乙醇溶液中缓慢滴加，反应8h，冷却析出物用乙醇重结晶，得胆酸酰肼(CAH)；(2)将100mg醛化淀粉(制备工艺同实例1中的醛化葡聚糖)溶于8mL水中，CAH溶于16mL DMF中，两溶液混合得到一均相体系，体系中糖单元与CAH的摩尔比为1∶2～50；体系的pH值调节到4，室温反应8h，反应溶液倒入大量的甲醇中沉淀出产物，过滤，用甲醇充分洗涤多次，室温下真空干燥，得胆酸改性醛化淀粉；(3)取0.5g胆酸改性醛化淀粉溶于100mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢滴加到100mL pH＝5的含0.5g己二酰肼的醋酸钠(Na2AC)缓冲溶液中，室温反应24h后以甲醇沉淀，冷冻干燥得胆酸改性酰肼化淀粉。
2.微球制备(1)将40mg聚苯乙烯溶于15mL丙酮与二氯甲烷混合溶液中(v/v＝1∶1)得到油相；(2)将35mg Cholic-Sta-NH-NH2溶于50mL的pH＝7.4PBS缓冲溶液中，在磁力条件下搅拌6h，转速800转/分，得水相；(3)将油相在转速800转/分的搅拌下快速注入水相中并继续在磁力条件下搅拌至超微载体固化为止；(4)将步骤(3)得到的微球液在10,000rpm离心分离、水洗；(5)将固化微球分散于10mL pH＝5.4MES缓冲液中；3.功能化(1)冰浴条件下，将微球溶液滴加到3mL溶有3mgEDC、2mg IgG和2mg Tf的pH＝5.4MES缓冲液中，孵化反应8h；(7)16,000rpm下离心并超声清洗三次以除去未结合的生物因子和EDC，得表面双功能化的淀粉修饰聚苯乙烯微球。
实施例51.胆酸疏水改性酰肼化葡聚糖(Cholic-Dex-NH-NH2)的制备制备工艺同实例4中胆酸疏水改性酰肼化淀粉(Cholic-Sta-NH-NH2)的制备，仅将多糖换为葡聚糖。
2.微球制备(1)将40mg聚3-羟基丁酸酯溶于20mL丙酮与二氯甲烷混合溶液中(v/v＝1∶3)得到油相；(2)将40mg Cholic-Dex-NH-NH2溶于50mL的pH＝7.4PBS缓冲溶液中，在磁力条件下搅拌6h，转速800转/分，得水相；(3)将油相在转速800转/分的搅拌下快速注入水相中并继续在磁力条件下搅拌至微球固化为止；(4)将步骤(3)得到的微球液在10,000rpm离心分离、水洗；(5)将固化微球分散于10mL pH＝5.4MES缓冲液中；3.功能化(1)冰浴条件下，将微球溶液滴加到2mL溶有1mg EDC、25ul Ox26和2mg Tf的pH＝5.4MES缓冲液中，孵化反应8h；(7)16,000rpm下离心并超声清洗三次以除去未结合的生物因子和EDC，得表面双功能化的葡聚糖修饰聚3-羟基丁酸酯微球。
权利要求
1.一种基于酰肼基的微粒表面多重生物功能因子组装方法，其特征在于包括以下步骤1)双亲性多糖衍生物的制备(1)醛化多糖的制备在4℃避光条件下，在水体系中按高碘酸钠与多糖化合物中糖单元的摩尔比1∶2～50投料反应0.5～8h，将反应液用截留分子量10,00～40,000半透膜对去离子水透析10～144h，冷冻干燥得固态产物；所述的多糖选自相对分子质量10,000～1,000,000的葡聚糖或淀粉或普鲁兰；(2)双亲性改性醛化多糖的制备a.胆固醇改性醛化多糖的制备将胆固醇与丁二酸酐按摩尔比1∶1～5投料，70℃在吡啶催化下反应3～8h生成胆固醇-3-半琥珀酸，乙醇重结晶1～3次，真空干燥；将胆固醇-3-半琥珀酸与二氯亚砜按摩尔比1∶2～10溶于10～50mL干燥三氯甲烷中，70℃反应1～10h，生成胆固醇-3-半琥珀酸酰氯，真空蒸出液体，将残余固体复溶于20mL干燥三氯甲烷中待用；将上述冻干得到的醛化多糖溶于40mL干燥的二甲基亚砜中，滴加数滴三乙胺，按酰氯与糖单元的摩尔比为1∶2～50量取胆固醇-3-半琥珀酸酰氯滴加入醛化多糖溶液中，氮气保护，80℃反应3～8h，产物对去离子水透析10～144h，透析液冷冻干燥，得胆固醇改性醛化多糖；b.胆酸改性醛化多糖的制备将1g胆酸溶于20～60mL乙醇中，40～78℃在1～5mL浓盐酸催化下形成胆酸乙酯，将胆酸乙酯的乙醇溶液在40～78℃下向溶有0.5～10mL水合肼的乙醇溶液中缓慢滴加，反应3～8h，冷却析出物用乙醇重结晶，得胆酸酰肼；将100mg醛化多糖溶于8mL水中，胆酸酰肼溶于16mL的N，N-二甲基甲酰胺中，两溶液混合得到一均相体系，体系中糖单元与胆酸酰肼的摩尔比为1∶2～50；体系的pH值调节到4，室温反应1～24h，反应溶液倒入大量的甲醇中沉淀出产物，过滤，用甲醇充分洗涤多次，室温下真空干燥，得胆酸改性醛化多糖；c.苯氧基改性醛化多糖的制备按苯基甘油醚与醛化多糖糖单元的摩尔比为1∶2～50投料，在1M氢氧化钠溶液中室温反应10-48h，将产物在乙醇中沉降，再对去离子水透析，10～144h，冷冻干燥得苯氧基改性醛化多糖；3)双亲性改性酰肼化多糖及进一步部分生物素化产物的制备取双亲性改性醛化多糖溶于N，N-二甲基甲酰胺中，缓慢滴加到质量浓度5％、pH为5的己二酰肼的醋酸钠缓冲溶液中，室温反应5～24h后以甲醇沉淀，冷冻干燥得双亲性改性酰肼化多糖；按生物素与N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺摩尔比1∶1.5∶1.5的比例加料至干燥N，N-二甲基甲酰胺中，4～25℃反应24h，过滤，将滤液滴加至溶有双亲性改性酰肼化多糖的干燥的二甲级亚砜体系中，反应5～24h，将反应液对去离子水透析48h，透析液冷冻干燥，得进一步部分生物素化的双亲性改性酰肼化多糖，以控制生物素与双亲性改性酰肼化多糖的配比，控制生物素的取代度；2)载药微球制备(1)透析法a.将脂溶性药物、可生物降解聚合物和双亲性改性酰肼化多糖按重量比为1∶0.5～100∶0.5～100共溶于1～1,000体积份的二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺中；所述的脂溶性药物包括卡氮芥、消炎痛、环孢菌素A、阿克拉霉素A、利福平、酮洛芬、他莫西芬、红霉素或阿苯达唑；所述的可生物降解聚合物包括相对分子质量5,000～100,000的聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物；所述的双亲性改性酰肼化多糖选自经胆固醇、胆酸或苯氧基疏水改性的相对分子质量10,000～1,000,000的醛化葡聚糖或醛化淀粉或醛化普鲁兰的酰肼化产物，或进一步利用酰肼化产物中的酰肼基与生物素偶连，实现其部分生物素化的产物；b.将上述共溶体系用截留分子量7,000～50,000的半透膜对去离子水透析1～144h，得到表面含酰肼基或部分生物素的载药可生物降解聚合物微粒；(2)乳液法a.将脂溶性药物和聚合物按重量比为1∶0.5～100共溶于1～1,000体积份的丙酮、二氯甲烷或上述二者的混合溶液中形成油相，所述的脂溶性药物包括卡氮芥、消炎痛、环孢菌素A、阿克拉霉素A、利福平、酮洛芬、他莫西芬、红霉素或阿苯达唑；所述的可生物降解聚合物包括相对分子质量5,000～200,000的聚3-羟基丁酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或尼龙；b.按脂溶性药物与双亲性改性酰肼化多糖的重量比为1∶0.5～100，将双亲性改性酰肼化多糖溶于1～1,000体积份的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，得水相，所述的双亲性改性酰肼化多糖选自经胆固醇、胆酸或苯氧基疏水改性相对分子质量10,000～1,000,000的醛化葡聚糖或醛化淀粉或醛化普鲁兰的酰肼化产物，或进一步利用酰肼化产物中的酰肼基与生物素偶连，实现其部分生物素化的产物；c.将步骤a制得的油相在转速500～1200转/分的搅拌下快速注入步骤b制得的水相中并继续在磁力条件下搅拌至粒子固化为止；3)将步骤2)制得的微球水溶液以10,000～16,000rpm下离心，去除上清液；再将离出微球超声分散于同体积份的不同的缓冲溶液中，与不同的生物活性因子进行偶联；4)a.若利用微球表面游离酰肼基与生物功能因子结构中的羧基进行化学偶连，则冰浴条件下，按体积比1∶0.1～4.0将pH＝4.0～6.02-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液环境的微球溶液滴加至溶有0.1～2.0mg/mL两种或两种以上生物因子和0.005～0.5g/mL 1-[3-(二甲胺基)丙基]-3-乙基碳二亚胺的pH＝4.0～6.02-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，孵化1～24h；所述生物因子包括转铁蛋白、兔IgG、表皮生长因子受体EGFR、转铁蛋白受体CD71、单抗OX26、内皮生长因子和神经生长因子；b.若通过对某些结构中具有糖原结构的生物功能因子中的糖单元进行氧化，再与微球表面游离酰肼基实现偶连，在4～25℃下，按体积比1∶0.1～4.0将pH为4.0～6.0磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液环境的微球溶液向溶有0.1～2.0mg/mL两种或两种以上生物因子的pH为4.0～6.0磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液滴加，孵化1～5h；所述生物因子包括氧化转铁蛋白、氧化兔IgG；c.若上述双亲性多糖采用部分生物素化改性物，则按体积比1∶0.1～4.0将pH为7.4～9.18的Na2CO3-NaHCO3缓冲液环境的微球溶液向溶有0.1～2.0mg/mL两种或两种以上亲和素化生物因子的pH为7.4～9.18的Na2CO3-NaHCO3缓冲液滴加，37℃孵化1～5h；所述生物因子包括亲和素化转铁蛋白、亲和素化兔IgG、亲和素化EGFR、亲和素化CD71、亲和素化OX26、亲和素化内皮生长因子、亲和素化神经生长因子；5)将孵化液在10,000～16,000rpm下离心，去离子水洗涤三次，分散于同体积份的生理盐水中。
全文摘要
本发明公开了一种基于酰肼基的微粒表面的多重生物功能因子组装方法，属于多重生物功能因子组装技术。该方法包括以下步骤将葡聚糖、淀粉或普鲁兰进行双亲性改性和酰肼化，或进一步利用酰肼基与生物素偶联实现其部分生物素化；将双亲性改性酰肼化多糖或部分生物素化衍生物与脂溶性药物及可生物降解聚合物制备载药微球，微球水溶液经分离再分散于缓冲溶液中，形成微球溶液；将微球溶液滴加至溶有生物因子的缓冲溶液中孵化，用去离子水洗涤，得到表面组装有多重生物功能因子的微粒。本发明操作简单，所制备的表面生物多功能化微粒在药物投递、控释缓释等方面具有重要的应用前景。
文档编号A61K9/16GK1768860SQ20051001557
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月24日 优先权日2005年10月24日
发明者原续波, 顾鸣岐, 田恩江, 贺晓婷, 盛京 申请人:天津大学