专利名称：去乙酰车叶草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可以从黄毛耳草中分离的物质—去乙酰车叶草酸的新用途，特别是在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
背景技术：
去乙酰车叶草酸(asperuloside)其化学结构式如下。
去乙酰车叶草酸可以从黄毛耳草(Hedyotis chrysotricha)、杜仲(Eucommia ulmoidesOliver)等植物中分离，去乙酰车叶草酸也可以从其他植物中分离。去乙酰车叶草酸作为一种已经有的物质，尽管有确切的分子式和结构式，但其研究的活跃性不高，作为单体在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用还没有见报道。
RA是Rheumatoid arthritis的简称。
RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，目前仍无治疗良策。RA的早期病变主要在滑膜，由于感染或创伤等因素的刺激，滑膜细胞迅速增殖，合成多种细胞因子，如白细胞介素1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等。各种细胞因子联合介导RA炎症和组织损伤，其中以TNF-α的作用较为突出，TNF-α是能够引起肿瘤组织出血坏死、并具有多方面的细胞因子。在活动性RA中，TNF-α参与三种主要病理过程(1)激活血管内皮细胞，增强内皮细胞黏附分子的表达，在关节炎时，血液中的白细胞正是通过与黏附分子互相作用被汇集到关节腔的。(2)刺激结缔组织细胞和多形核细胞产生前列腺素等小分子炎症介质。(3)通过刺激滑膜细胞、软骨细胞和破骨细胞，减少糖蛋白合成，增加蛋白降解，并产生胶原酶和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨和软骨的破坏及骨关节运动障碍。因此通过抑制TNF-α的产生，从而阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖是RA治疗的可取途径之一。
另外IL-1β的作用也较为突出，几乎各种有核细胞都能产生IL-1β，但大多数细胞在正常时并不合成IL-1β，只在激活后才被诱导合成IL-1β和IL-1β前体蛋白。脂多糖(LPS)是最有效的IL-1β诱导剂，能快速诱导多种细胞表达IL-1β。IL-1β能刺激滑膜成纤维细胞和毛细血管内皮细胞高度增殖，构成RA特征性血管翳；刺激软骨细胞和破骨细胞产生前列腺素(PGE2)以及胶原酶等多种蛋白水解酶；激活中性粒细胞，释放溶酶体酶、自由基等炎性递质，引起关节软骨、骨质等组织破坏，导致关节炎粘连以及后期关节畸形。因此通过抑制IL-1β的产生；从而阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖是RA治疗的可取途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供去乙酰车叶草酸的新用途，去乙酰车叶草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
去乙酰车叶草酸的获得首先用黄毛耳草(Hedyotis chrysotricha)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml，再过滤，取上清液；将上清液拌入硅胶，进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别洗脱，收集丙酮洗脱液，减压浓缩至干；取丙酮提取物用乙醇溶解，拌入3倍量的硅胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，再进行一次反相硅胶柱色谱分离，为等比例重量的甲醇∶水混合液洗脱，洗脱流速为60毫升/小时，薄层色谱检查，合并相同部分，得到去乙酰车叶草酸，去乙酰车叶草酸的得率是0.377％。
或者，首先用黄毛耳草(Hedyotis chrysotricha)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml，再过滤，取上清液；将上清液进行大孔树脂柱层析，用等比例重量的乙醇-水洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩至干；取乙醇洗脱物用甲醇溶解，拌入3倍量的硅胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，进行凝胶柱色谱纯化，等比例重量的甲醇∶水混合液洗脱，薄层色谱检查，合并相同部分，洗脱液合并后再进行一次硅胶柱色谱，氯仿∶甲醇混合液洗脱，洗脱流速为200毫升/小时，得到去乙酰车叶草酸，去乙酰车叶草酸的得率是0.285％。
去乙酰车叶草酸还可以采用其他方法获得。
在类风湿性关节炎药物领域，有很多文献报道药物成分对对滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2和IL-1β的影响，用动物实验的数据来考察药物治疗RA的效果。这些文献有[1]鞠大宏，贾红伟，吴皓，等，鹿瓜多肽注射液对C II诱导的免疫性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-6以及C II抗体活性的影响，中国中医基础医学杂志，2003，9(11)17。[2]何金华，梁清华，张花先，等，痹肿消汤对实验性关节炎大鼠血浆TNF-α的影响，湖南医科大学学报，2002，27(5)524。[3]黄清春，张声鹏，徐秋英，复方丹参对II型胶原蛋白诱导大鼠模型滑膜细胞分泌及肿瘤坏死因子的影响，现代康复，2001，5(10)54-55。[4]郑治钢，细胞因子及其检测方法和临床意义，陕西医学检验，2001，16(2)59。[5]周军，方素萍，齐云，等，葛根汤对佐剂性关节炎大鼠关节液炎症介质的影响，中国实验方剂学杂志，2001，7(3)29。[6]马骥，卢秉久，朱晓明，等，通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的药效学研究，中医药学刊，2001，19(6)734。[7]朱江，谢文利，晋玉章，等，栀子对类风湿性关节炎大鼠血清IL-1β和TNF α的影响，中成药，2005，27(7)801。[8]黄清春，张声鹏，黄伟毅，等，复方丹参注射液对CIA大鼠滑膜细胞IL-1βmRNA表达的影响，安徽中医学院学报，2002，21(5).-39-41。
取本发明方法获得的去乙酰车叶草酸，按文献[3]提供的方法进行模型制备、药物分组、大鼠滑膜细胞培养及上清液的制备。
按文献[3]提供的方法考察药物成分对对滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2的影响。按文献[8]提供的方法考察药物成分对对滑膜细胞分泌IL-1β的影响。
去乙酰车叶草酸大剂量组(20mg/kg.d)；去乙酰车叶草酸小剂量组(10mg/kg.d)与正常对照、氯化钠组的实验数据如下表1滑膜细胞培养上清液中TNF-α的含量(x±s，ng/ml)
与正常对照组比较，*P＜0.05；与氯化钠组比较，△P＜0.05表2滑膜细胞培养上清液中IL-1β含量(x±s，ng/ml)
与正常对照组比较，*P＜0.05；与氯化钠组比较，△P＜0.05表3滑膜细胞培养上清液中PGE2的含量(x±s，ng/ml)
与正常对照组比较，*P＜0.05；与氯化钠组比较，△P＜0.05本发明采用文献1、2、3、4、5、6、7、8提供的方法考察去乙酰车叶草酸成分对对滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2、IL-1β的影响。也有类似趋势。
本发明以大鼠为人类RA动物模型，采用滑膜细胞原代培养的方法，观察了去乙酰车叶草酸对滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2和IL-1β的影响，结果表明，大剂量组、小剂量组均能显著下调TNF-α，PGE2和IL-1β的含量，与空白组存在显著性差异，不能恢复至空白组水平，且三组间无显著性差异，这表明去乙酰车叶草酸能抑制TNF-α的产生，减少IL-1β的产生，从而减少PGE2等炎症介质产生，达到减轻致骨和软骨的破坏恢复关节活动功能，发挥治疗RA效果。
具体实施例方式
实施例1、首先用黄毛耳草(Hedyotis chrysotricha)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml，再过滤，取上清液；将上清液拌入硅胶，进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别洗脱，收集丙酮洗脱液，减压浓缩至干；取丙酮提取物用乙醇溶解，拌入3倍量的硅胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，再进行一次反相硅胶柱色谱分离，为等比例重量的甲醇∶水混合液洗脱，洗脱流速为60毫升/小时，薄层色谱检查，合并相同部分，得到去乙酰车叶草酸，去乙酰车叶草酸的得率是0.377％。
实施例2、首先用黄毛耳草(Hedyotis chrysotricha)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml，再过滤，取上清液；将上清液进行大孔树脂柱层析，用等比例重量的乙醇-水洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩至干；取乙醇洗脱物用甲醇溶解，拌入3倍量的硅胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，进行凝胶柱色谱纯化，等比例重量的甲醇∶水混合液洗脱，薄层色谱检查，合并相同部分，洗脱液合并后再进行一次硅胶柱色谱，氯仿∶甲醇混合液洗脱，洗脱流速为200毫升/小时，得到去乙酰车叶草酸，去乙酰车叶草酸的得率是0.285％。
实施例3、取按实施例1的方法获得的去乙酰车叶草酸200克，低取代羟丙纤维素20克，PEG 6000 20克，微晶纤维素210克，PVP 50克，乳糖440克，硬脂酸镁60克分别粉碎均匀后，混合压制成1000片。
治疗方法类风湿病人每天服用两次，每次1-2片。疗程7-21天。
实施例4、取按实施例2的方法获得的去乙酰车叶草酸100克，低取代羟丙纤维素20克，交联聚乙烯吡咯烷酮30克，微晶纤维素100克，蔗糖650克，硬脂酸镁50克分别粉碎均匀后，混合压制成1000片。
治疗方法类风湿病人每天服用两次，每次2-4片。疗程7-21天。
权利要求
1.去乙酰车叶草酸在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可以从黄毛耳草中分离的物质—去乙酰车叶草酸的新用途，特别是在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明以大鼠为人类RA动物模型，采用滑膜细胞原代培养的方法，观察了去乙酰车叶草酸对滑膜细胞分泌TNF－α，PGE
文档编号A61P29/00GK1915235SQ20051001932
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者李斌 申请人:李斌