一种禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN及应用的制作方法

专利名称：一种禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN及应用的制作方法
专利说明一种禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN及应用 本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN及应用。
禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性的传染病，其特征为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。禽传染性支气管炎病毒可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌病等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。
禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，其抗原性异常复杂，目前世界上分离的临床毒株已超过100多株，分属30种以上血清型。禽传染性支气管炎病毒属于单股正链的RNA病毒，基因组全长27.6kb，主要编码三种结构蛋白纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核蛋白(N)。许多研究表明，S蛋白裂解为S1和S2两个亚单位，其中S1蛋白可诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体，为IBV的主要免疫原。N蛋白携带着T细胞表位，在免疫和保护上可能发挥作用。M蛋白的免疫原性较低，也有报道M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应(参见殷震，刘景华等。动物病毒学(第二版)。北京科学出版社，1997)。
禽传染性支气管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血清型毒株之间交叉保护力弱。在防制上，常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道，多价疫苗可较好解决防治问题。灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。其不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，因而成本较高。加之灭活疫苗不能诱发机体产生细胞免疫，而一系列的研究证实在IBV的免疫保护中，体液免疫和细胞免疫占有重要地位(参见王红宁主编。禽呼吸系统疾病。北京农业科技出版社，2002；B W卡尔尼克主编。禽病学(第九版)。北京北京农业大学出版社，1991，407-418；Kusters J G，Niesters，H G M，et al.Virology，1989，169217-221；AvellanedaG E，Villeges P，Jackwood M W，et al.Avian Dis，1994，38589-597)。随着禽传染性支气管炎病毒流行病学调查、分子生物学研究、免疫机制等研究的逐步深入，构建该病毒的主要结构蛋白基因的真核表达载体，研制DNA疫苗用于该病预防具有重要意义。
近年来许多研究者试图研究禽传染性支气管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的进展。步志高等(参见步志高，江国托等。中国兽医学报，1998，18(6)527-530)以国内类M41地方流行株IBV纤突糖蛋白S1基因为免疫原基因，构建了DNA免疫表达质粒，并对其免疫原性进行了初步分析。结果表明该表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应。陈洪岩等(参见陈洪岩，江国托，杨奇伟等。中国预防兽医学报，1999，21(4)250-253)将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株S1基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质粒，经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高，至35日龄左右达到高峰，但血清IgG抗体升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40％的鸡可耐过强毒的攻击。刘思国等(参见刘思国，康丽鹃，江国托等。中国兽医学报，2001，21(1)14-16)将鸡传染性支气管炎HB株的N基因亚克隆到pcDNA3，构建了真核表达质粒pcDNA-N。用该质粒两次免疫SPF雏鸡一周后进行攻毒试验，结果保护率为40％，表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用。
王红宁等(参见Wang H N，Wu Q Z，Huang Y，et al.Avian Disease，1997，41(2)279-282)完成了我国主要养鸡地区禽传染性支气管炎冠状病毒流行病学调查，探明了禽传染性支气管炎冠状病毒主要流行株类型及其分布分离，并用RT-PCR对多株国内分离株的S1、M、N基因进行扩增、克隆和序列测定分析，在国际基因库Genbank中注册禽传染性支气管炎病毒中国株的3个S1基因序列(AY397527～AY397529)、8个M基因序列(AY302742～AY302749)和3个N基因序列(AY167729～AY167731)。本发明根据Genbank中注册的禽传染性支气管炎病毒N基因序列设计引物，以N基因的重组质粒pUCN为模板，用PCR方法扩增禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株的N基因，并将PCR产物经HindIII和XhoI双酶切定向插入以HindIII和XhoI双酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)中，经双酶切和PCR鉴定，构建了禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株的N基因真核表达质粒，研制DNA疫苗pIBN。该禽传染性支气管炎N基因DNA疫苗可用于预防禽传染性支气管炎。1.本发明使用的真核表达载体pcDNA3.1(+)为Invitrogen公司的产品。禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株N基因的重组质粒pUCN为四川农业大学预防医学生物工程实验室克隆并保存。使用的限制性内切酶HindIII、XhoI，T4 DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶等均购自成都天泰生命科技有限公司。
2.引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的IBV M基因序列经多重比较后设计。根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计在起始密码子处，并加上HindIII酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上XhoI酶切位点。
引物序列为上游引物5′-CTgAAgCTTATCATggCAAgCAgTAAggCA-3′；下游引物5′-CTCCTCgAgTTAgAgTTCATTTTCACCAAg-3′。
3.N基因的PCR获取，以pUCN质粒为模板，加入Ex Taq DNA聚合酶、上下游引物、dNTP进行扩增反应。PCR的反应体系为10×buffer 5μL，4×dNTP mix(2.5mmol/L)4μL，上、下游引物(20μmol/L)各1μL，Mgcl24μL，pUCN质粒1μL，ddH2O 33.5μL，Ex Taq酶(5u/μL)0.5μL。反应参数为95℃处理5min，然后94℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 2min，共31个循环，72℃延伸10min。PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约为1.2kb的扩增条带，大小与预期的结果一致。
4.N基因真核表达质粒pIBN的构建，将N基因的PCR产物用酚氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。N基因的PCR纯化产物用HindIII、XhoI进行双酶切处理，胶回收1.2kb的条带。以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右DNA片段。
分别取5μL双酶切后胶回收的N基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，酶切处理载体pcDNA3.1(+)1μL，ddH2O 2μL，16℃连接18小时。将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养。
5.N基因真核表达质粒pIBN的双酶切鉴定，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定。将N基因真核表达质粒pIBN分别用Hind III、Xho I进行双酶切，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳观察，pIBN双酶切后产生约为5.4kb和1.2kb左右的两条带，证明已经成功构建了N基因真核表达质粒pIBN。
6.N基因真核表达质粒pIBN的PCR鉴定，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，抽提质粒DNA进行PCR鉴定。以pIBN质粒为模板，加入Ex Taq DNA聚合酶、上下游引物、dNTP进行扩增反应。PCR的反应体系为10×buffer 5μL，4×dNTP mix(2.5mmol/L)4μL，上、下游引物(20μmol/L)各1μL，Mgcl24μL，pIBN质粒1μL，ddH2O 33.5μL，Ex Taq酶(5u/μL)0.5μL。反应参数为95℃处理5min，然后94℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 2min，共31个循环，72℃延伸10min。PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约为1.2kb的扩增条带，证明已经成功构建了N基因真核表达质粒pIBN。
7.禽传染性支气管炎N基因DNA疫苗pIBN的研制。从LB固体培养基中挑取单菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养。在1000ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入5ml的菌种，37℃，200rpm/min，培养20h。用常规提取质粒的碱裂解方法进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法进行纯化。电泳鉴定质粒的纯度和含量。质粒用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，即为禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN。该DNA疫苗用肌肉注射的方法进行预防接种。
权利要求
1.一种禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN及应用，其特征在于用分子生物学方法将禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株N基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建能表达N基因抗原决定簇的真核表达质粒，研制DNA疫苗pIBN，该DNA疫苗pIBN能用于预防禽传染性支气管炎。
2.权利要求1所述的禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN，其特征在于用禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株N基因经Hind III和Xho I双酶切后，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建真核表达质粒，研制DNA疫苗pIBN。
3.权利要求2所述的禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN用于预防禽传染性支气管炎。
全文摘要
本发明涉及动物医药生物工程研究领域，是一种禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN及应用。本发明根据Genbank中注册的禽传染性支气管炎病毒N基因序列设计引物，以N基因的重组质粒pUCN为模板，用PCR方法扩增禽冠状病毒中国分离株SAIBk株的N基因，并将PCR产物经HindIII和XhoI双酶切定向插入以HindIII和XhoI双酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)中，经双酶切和PCR鉴定，成功的构建了禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株的N基因真核表达质粒，研制出禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN。该禽传染性支气管炎DNA疫苗pIBN可用于预防禽传染性支气管炎。
文档编号A61P11/00GK1903371SQ20051002132
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者王红宁, 周生, 唐梦君, 黄勇, 吴琦, 陈惠 , 柳萍, 胡慧琼, 李晓英, 陈萍, 余祖华, 汪洋, 白天, 潘胜 申请人:四川农业大学, 王红宁, 周生