专利名称：栀子提取物通过特异性抑制ucp2提高胰岛素分泌的方法
技术领域：
本发明属于分子内分泌学和细胞生物学技术领域，具体涉及栀子提取物体外培养小鼠胰岛细胞，通过特异性抑制解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表达，从而刺激胰岛素分泌的方法。
二、技术背景胰岛细胞的功能异常以及胰岛素抵抗，常导致II型糖尿病。胰岛细胞功能异常是一种复杂的现象，包括对葡萄糖感应的丧失，导致GSIS(glucose-stimulated insulinsecretion)损害。
UCP2是胰岛素分泌的负调节分子。首先，它介导了线粒体内膜的质子渗漏，这已被一系列的研究所证明，这些研究的对象涵盖了原脂质体、线粒体以及完整细胞(Krauss S，et a1.Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.99118-122，2002)。在胰岛β细胞中，UCP2介导的质子渗漏使得糖生成的ATP数量降低，从而负调节GSIS。ob/ob小鼠是肥胖导致的糖尿病动物模型，在该小鼠胰岛中，UCP2表达显著升高。另外，高血糖也能导致胰岛内UCP2表达升高。更重要的是，在ob/ob小鼠中敲除UCP2，胰岛素分泌的第一相能得到恢复，并且血清中胰岛素含量升高，高血糖症状也得到改善(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)。这些结果充分说明，UCP2在高血糖以及肥胖导致的胰岛功能异常中发挥了重要作用。因此，设法抑制UCP2在胰岛细胞中的表达在糖尿病的治疗中具有广阔的前景。
在祖国的医学宝典中，栀子是一味治疗糖尿病的良药。中医讲究的是“阴阳调和”，认为疾病是由于寒热失调所引起的，这些理论体系显得过于虚幻，缺少现代分子生物学研究支持。因此，我们想以栀子提取物为研究对象，充分运用分子生物学和细胞生物学的实验手段，试图揭示栀子治疗糖尿病的分子机制。并且我们推测，UCP2很有可能是中医寒热理论的其中一个重要效应分子，并成为栀子作用的靶位点。
发明内容
本发明的目的是提出一种栀子提取物，通过特异性抑制UCP2蛋白的表达而提高胰岛素分泌的方法。
本发明的技术解决方案一种栀子提取物通过特异性抑制UCP2蛋白的表达，从而提高胰岛素分泌的实验方法，其特征在于a.栀子的提取和浓缩过程1.0kg的栀子加入10kg的蒸馏水，煎煮1.5h。经过D101大孔树脂的吸附萃取，用蒸馏水过柱洗去杂质，再用60％乙醇洗脱，并在70℃低温下减压干燥成粉末。最后用蒸馏水重溶，得到1L栀子提取物溶液；b.栀子提取物特异性抑制UCP2蛋白的表达，提高体外培养的胰岛细胞的胰岛素分泌量用5.5mM葡萄糖常规培养胰岛细胞，然后加入栀子提取物，发现对于野生型胰岛，胰岛素的分泌量从3.5025提高到11.81625(n＝8，单位ng/islet/h)。而对UCP2表达缺失的胰岛细胞，栀子提取物不能刺激胰岛素分泌(对照组15.386，加药组9.72，n＝5，单位ng/islet/h)。
所述栀子的提取和浓缩过程，其特征在于栀子的用量、煎煮时间、大孔树脂的萃取、乙醇洗脱以及减压干燥的过程。
所述栀子提取物通过特异性抑制UCP2蛋白的表达，提高胰岛素分泌量的过程，其特征在于栀子提取物能提高野生型胰岛细胞的胰岛素分泌量，但对UCP2表达缺失的胰岛细胞没有此种效果，说明UCP2是栀子提取物作用的靶位点。
本发明首次阐明了栀子提取物具有刺激胰岛素分泌的效应，更重要的是，该效应是通过特异性抑制UCP2的表达实现的。目前中医和现代分子生物学的研究还没有很好的结合起来，中药作用的特异性靶位点更是知之甚少。本研究室首次提出UCP2是胰岛素分泌的负调控因子(Zhang CY，et.al.Cell 105745-755，2001)，在肥胖导致的胰岛功能异常中扮演了重要角色。在此基础上，又进一步发现栀子提取物作用的靶位点就是UCP2，通过特异性抑制UCP2的表达来提高胰岛素分泌。本发明所述栀子提取物可在制备治疗II型糖尿病药物中应用。
本发明的有益效果是为中医治疗II型糖尿病提供了现代分子生物学的理论依据，揭示了栀子治疗糖尿病的分子机制；证实UCP2是中医寒热理论中的一个重要效应分子。
四
图1为纯化后的小鼠胰岛细胞。
图2为栀子提取物分别刺激野生型和UCP2表达缺失的胰岛细胞，胰岛素分泌量的测定数据图。
五具体实施例方式
本发明把栀子经过水煎煮、大孔树脂吸附萃取、乙醇稀释及减压干燥等一系列步骤，得到栀子提取物。从野生型小鼠和UCP2基因敲除小鼠中分别分离纯化胰岛细胞，再施加栀子提取物刺激，然后测定胰岛素的分泌量。结果证实栀子提取物提高了野生型胰岛细胞的胰岛素分泌量，而对于UCP2表达缺失的胰岛细胞，栀子提取物不具有该效应。
材料与来源试剂D101大孔树脂购自Sigma公司；Liberase RI酶购自Roche公司(Cat.No.11815032001)；Ficoll 400购自Pharmacia公司；RPMI 1640培养液(含11mM D-葡萄糖)和低糖DMEM培养液(含5.5mM D-葡萄糖)购自Invitrogen公司；PBS缓冲液自配。
手术器械剪刀，止血钳，弯头小镊，动脉夹，输液皮管以及10ml无菌注射器购自江苏思来科技有限公司。
其它器材减压干燥器；UCP2基因敲除小鼠；小鼠胰岛素测定试剂盒购自美国Crystal公司实施例1.栀子的提取和浓缩1.0kg的栀子加入10kg的蒸馏水，煎煮1.5h。经过D101大孔树脂的吸附萃取，用蒸馏水过柱洗去杂质，再用60％乙醇洗脱，并在70℃低温下减压干燥成粉末。最后用蒸馏水重溶，得到1L栀子提取物溶液；2.小鼠胰岛的分离与纯化实验用小鼠为SPF级的野生型小鼠和UCP2基因敲除小鼠，品系c57/B6，体重15-20g，本室保存。小鼠颈椎脱臼法处死，开腹，用动脉夹夹住胆总管入十二指肠端。肝脏上翻，游离胆总管。通过胆总管往胰腺灌注预冷的Liberase RI酶工作液(0.167mg/ml)约2ml，使胰腺充分膨胀。钝性分离完整的胰腺，置于37℃水浴静止消化27.5min。消化结束后，用漩涡振荡器上剧烈振荡10s，此时胰腺已被分解成糜状的组织，加入预冷PBS终止消化。用PBS洗消化物两次，每次1000rpm 15s。往组织沉淀加入4ml 25％(w/v)Ficoll，振荡混匀，再依次小心加入23％，21％，11％的Ficoll各2ml，形成界面清晰的密度梯度分离液。把离心管放入吊桶式的转头，1000rpm离心10min。离心结束后，取出管子，可以看见在21％和11％的界面上散在分布着一层沙状的白色小颗粒，此即为初步纯化的胰岛细胞。用巴氏吸管小心的吸出细胞团，用PBS洗两次，每次1000rpm 15s，然后用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液(含11mM D-葡萄糖)，在95％air+5％CO2的环境下培养过夜。纯化后的胰岛见图1。
3.胰岛素分泌量的测定胰岛培养过夜后，用小号枪头逐一挑出，置于低糖DMEM培养液中(含5.5mM D-葡萄糖)，并随机分成四组，即野生型胰岛正常培养组；野生型胰岛施加栀子提取物刺激组；UCP2基因敲除胰岛正常培养组；UCP2基因敲除胰岛施加栀子提取物刺激组。栀子提取物的用量是40μg/ml，培养时间72h。实验结束后，把胰岛挑出置于Eppendorf管中，每3个大小均一，直径约为150μm的胰岛归于一管，管中已加入1ml低糖DMEM培养液。把管子放入CO2培养箱培养1h，简短离心，取上清，用小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素释放量(图2)。
权利要求
1.一种栀子提取物通过特异性抑制UCP2蛋白的表达，从而提高胰岛素分泌的方法，其特征在于栀子的提取和浓缩过程栀子加入蒸馏水，煎煮1.5h；经过D101大孔树脂的吸附萃取，用蒸馏水过柱洗去杂质，再用60％乙醇洗脱，并在70℃低温下减压干燥成粉末；最后用蒸馏水重溶，得到栀子提取物溶液；用5.5mM葡萄糖常规培养胰岛细胞，然后加入栀子提取物。
2.根据权利要求1所述的栀子提取物提高胰岛素分泌的方法，其特征在于栀子提取物能提高野生型胰岛细胞的胰岛素分泌量，但对UCP2表达缺失的胰岛细胞没有此种效果，说明UCP2是栀子提取物作用的靶位点。
3.根据权利要求1所述栀子提取物在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于分子内分泌学和细胞生物学技术领域，是具体涉及用栀子提取物体外培养小鼠胰岛细胞，通过特异性抑制解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表达，从而刺激胰岛素分泌的方法。本发明将栀子经过水煎煮，大孔树脂萃取，乙醇稀释以及减压冻干，得到浓缩提取物。用该提取物培养小鼠胰岛细胞，能显著刺激野生型胰岛细胞的胰岛素分泌量，但对UCP2表达缺失的胰岛细胞没有此种效应。本发明阐明了栀子提取物通过特异性抑制UCP2蛋白的表达，提高胰岛素分泌的重要生物学现象，揭示了栀子治疗糖尿病的分子机制；为中医治疗II型糖尿病提供了现代分子生物学的理论依据。
文档编号A61P3/00GK1823964SQ200510022659
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者项阳, 张燕, 张红杰, 张辰宇, 刘畅, 孙国勋 申请人:南京大学