专利名称：治疗脑缺血再灌注损伤的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及治疗脑缺血再灌注损伤的药物。尤其是涉及含活性组分水飞蓟宾-卵磷脂复合物的治疗脑缺血再灌注损伤的药物。
背景技术：
缺血再灌注损伤一直是脑血管病治疗的重点课题。中性粒细胞在缺血再灌注损伤中起着极其重要的作用。再灌注期间，中性粒细胞大量浸润于病变组织，一方面可机械性堵塞微循环通道，影响组织(特别是缺血半影区)的血液供应，另一方面，活化的白细胞可释放大量的毒性氧自由基和蛋白水解酶，损害局部的血管，导致血管通透性加强，造成组织水肿。进入组织的白细胞可进一步释放上述毒性物质，破坏残存的神经元和胶质细胞，从而加重神经组织的损伤。此外，白细胞还释放一些炎性介质和细胞因子，加重炎性反应，从而吸引更多的白细胞进入组织，形成恶性循环，直到组织完全破坏。而这种恶性循环的形成，是通过缺血/再灌注损伤细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的上调来实现的。
溶栓疗法是近年来缺血性卒中治疗上的一个重要进展，通过重建脑血流，使缺血区在产生不可逆性损伤前恢复供血，可以明显改善神经功能，但伴发而来的再灌注损伤，包括血脑屏障的破坏、严重脑水肿以及脑出血，限制了急性溶栓疗法的疗效。即使不进行该治疗，自发的血栓或栓子溶解也可导致再灌注损伤，只有渗透性利尿剂或开颅减压等降低颅内压的措施可起到部分作用，目前尚无真正有效的治疗再灌注损伤的方法。而炎症反应是脑缺血再灌注损伤的主要成分，对抗炎症的各项研究具有深远的临床意义。此外，炎症反应持续至缺血后数天，因此抗炎治疗可以扩大治疗时间窗，而后者是缺血性卒中治疗中的关键点。所以准确确定炎症通路中的各种成分及其相互作用和研究开发抑制ICAM-1表达、抑制中性粒细胞的药物是一个新的研究课题，为缺血再灌注损伤的治疗提供新的途径。
发明内容
本发明提供的治疗脑缺血再灌注损伤的药物含有50％以上的活性组分水飞蓟宾-卵磷脂复合物(SLC)。
水飞蓟宾(silybin)是一种黄酮类天然抗氧化剂，1968年由Wagner等从菊科植物水飞蓟中提取，对血小板聚集及血栓的形成有很好的抑制作用，有证据表明水飞蓟宾具有抗菌、抗毒素、抗氧化和减少自由基的作用。一般认为，核转录因子NF-κB是介入细胞因子刺激内皮细胞表面粘附分子表达的中心转录因子。抗氧化合物能有效地抑制NF-κB的活性，因而抑制粘附因子的表达。
细胞间粘附分子、中性粒细胞在缺血再灌注脑区的上调和浸润中起着极其重要的作用。缺血再灌注期间ICAM-1的表达和中性粒细胞的浸润不仅影响了局部的血液供应而且还可直接破坏脑组织结构。本发明从水飞蓟宾-卵磷脂复合物(SLC)具有抗自由基和抗脂质过氧化的作用来改变ICAM-1的表达和中性粒细胞浸润的原理出发，发现了水飞蓟宾-卵磷脂复合物复合物对脑缺血再灌注损伤的保护作用。
脑缺血再灌注后，ICAM-mRNA和ICAM-1蛋白质表达明显增加，中性粒细胞浸润数亦明显增加，脑梗塞面积扩大和组织含水量增加。水飞蓟宾-卵磷脂复合物复合物能下调ICAM-1的表达和抑制白细胞的聚集，特别是减少中性粒细胞的聚集和粘附，从而减少蛋白水解酶、溶酶体酶、氧自由基和其他效应分子的释放，使酶类和自由基引起的链锁反应削弱，阻止细胞膜的崩解。同时，抑制缺血再灌注损伤时的PAF和EAA的大量释放，改善神经症状，缩小梗塞面积和减轻脑水肿，对缺血再灌注脑损伤有一定的保护作用。
经口服给药时，首先使本发明与常规的药用辅剂如赋形剂、润滑剂、崩解剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式；经非口服给药时，可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。
本发明另一方面提供制备治疗脑缺血再灌注损伤的药物的方法称取水飞蓟宾28～60g，溶入热丙酮1250～1450ml中，得暗红色澄明液体，45～58℃保温，加入卵磷脂47～70g，搅拌，直至溶液澄明，约5～15min，接回流装置，边加热保温边振荡反应0.5～1.5h，拆除回流装置，真空浓缩至反应液体积为135～315ml，迅速加入到正己烷2856～3686ml中，得黄色沉淀物，上层液体为黄白色乳浊液，加压过滤，用正己烷洗涤沉淀，置于真空干燥箱中室干燥，得黄色固体产物86～125g。
具体实施例方式
下面的实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 活性成分为SLC的治疗脑缺血再灌注损伤的药物的制备称取水飞蓟宾(上海朝晖药厂)43g，溶入热丙酮1350ml中，得暗红色澄明液体，55℃保温，加入卵磷脂(四川英格尔公司)68g，搅拌，约10min，直至溶液澄明，接回流装置，边加热保温边振荡反应1h，拆除回流装置，真空浓缩至反应液体积为270ml，迅速加入到正己烷3150ml中，得黄色沉淀物，上层液体为黄白色乳浊液，加压过滤，用正己烷洗涤沉淀，置于真空干燥箱中室干燥，得黄色固体产物103g。
通过下面的试验说明本发明药物的活性。数据资料x±S表示，应用单因素方差分析，直线回归分析处理数据，以P＜0.05差异有显著性，P＜0.01差异有非常显著性。
试验实施例1 按照实施例1制得的活性成分为SLC的药物对缺血再灌注时脑组织ICAM-1mRNA表达的影响实验方法动物和分组蒙古种沙土鼠，体重80-100克，雌雄不拘，由上海市生物制品研究所动物研究实验中心提供。按随机数字表，将动物分为假手术对照组、缺血组、缺血再灌注组、SLC(制备方法见实施例1)组和缺血再灌注溶剂组。SLC组又分为100mg/kg组、200mg/kg和300mg/kg三个亚组，除假手术组外，每组又设1h、3h、6h、12h、24h5个时相点，每组5只。
脑缺血再灌注动物模型的建立蒙古种沙土鼠再饲料和水供应充足条件下，饲养一周，经10％乌拉坦(1.25g/kg)腹腔注射麻醉后，将动物仰卧固定于解剖板上，沿颈中线切开皮肤，分离两侧腺体及颈肌，暴露气管及左右两侧颈动脉，将颈总动脉与神经分离，穿线备用，同时进行气管插管，实验室室温26±1℃，动物直肠温度通过电热毯维持在37±0.2℃。其中假手术组仅作手术，不结扎动脉。缺血再灌注组用无损伤血管夹钳夹两侧颈总动脉60min后，放开动脉夹。
ICAM-1mRNA原位杂交制备感受态JM109大肠杆菌，将质量转入大肠杆菌进行扩增，裂解细菌后离心，分离纯化质粒DNA，再用EcokI和Kpn I两种限制性内切酶双切质粒CDNA，经电泳分离和透析得到高纯度DNA探针片断。用地高辛随机引物法标记CDNA探针。脑组织做冰冻切片进行原位杂交，24小时(45℃孵育)；加地高辛抗体后NBI/BICP显色，封片。结果用CMIAS计算机医学图像分析仪处理，单位以面密度(目标总面积/统计场总面积)表示。
脑缺血60min时，脑组织中ICAM-1mRNA明显增加，而假手术对照组表达不明显。缺血再灌注组、溶剂组和SLC治疗组于缺血再灌注1h ICAM-1mRNA表达明显增加，再灌注6h达高峰，以后逐渐下降，至24h仍维持较高的表达水平。缺血前30min给予SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg后，缺血再灌注脑组织中ICAM-1mRNA表达均较溶剂组下降，P＜0.05和P＜0.01(表1)。
表1.缺血再灌注时脑组织ICAM-1mRNA表达的变化(x±s)
注与缺血组比较△P＜0.01；与缺血再灌注比较#P＞0.05；与溶剂组比较*P＜0.05，**P＜0.01试验实施例2 ICAM-1蛋白质表达水平测定动物模型制备，分组(n＝10)，给药方法同前。取待测脑组织，冰冻切片用SP免疫组织化学染色法进行，DAB显色，结果用CMIAS计算机医学图像分析仪处理，单位以面密度表示。
脑缺血60min时，脑组织中ICAM-1蛋白表达较假手术组由0.02±0.017增加到0.04±0.021(P＜0.05)。缺血再灌注组、溶剂组和SLC治疗组于缺血再灌注1h时，ICAM-1蛋白表达明显增加，而且随着再灌注时间延长呈增加趋势，至24h达高水平。缺血前30min给予SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg后，缺血再灌注脑组织中ICAM-1mRNA表达各时相点均较溶剂组降低(P＜0.05或P＜0.01)。在SLC各治疗组中，ICAM-1蛋白表达与SLC的剂量有较好的量效关系(表2)。
表2.缺血再灌注时脑组织ICAM-1蛋白表达的变化(x±s)
注与缺血组比较△P＜0.01；与缺血再灌注比较#P＞0.05；与溶剂组比较*P＜0.05，**P＜0.01试验实施例3 SLC对缺血再灌注时脑组织中性粒细胞浸润数的影响动物模型制备，分组(n＝10)，给药方法同前。中性白细胞中存在髓过氧化酶(Myeloperoxidase enzyme，MPO)，每个细胞所含酶的量是一定的，约占细胞干重的5％。该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，从而定量出中性粒细胞的数目。其原理为
利用供氢体邻联茴香胺供氢体后生成黄色化合物在440nm处有最大吸收峰，以定量测定酶的活力，从而推导出中性粒细胞的数目。Bradly首先在大鼠皮肤组织中应用MPO法测定了炎症反应时中性粒细胞的的浸润情况，本研究对此法加以改进应用于测定缺血脑组织中的MPO，观察不同情况下脑组织中中性粒细胞浸润的不同。
在缺血再灌注1h后，中性粒细胞浸润数即已开始明显增加，以后在各时相点呈进行性增加趋势，在12h时相点达高峰，至24h无下降趋势。SLC治疗组的变化规律类似于缺血再灌注组，但在程度上则明显低于缺血再灌注组(P＜0.05或P＜0.01)(表3)。
表3.缺血再灌注时脑组织中性粒细胞浸润数的变化(x±s)
注与缺血再灌注比较△P＞0.05；与溶剂组比较*P＜0.01试验实施例4 水飞蓟宾-卵磷脂对脑梗塞面积的影响动物模型制备，分组(n＝10)，给药方法同前。每组沙土鼠随机取5只，断头取脑，低温取右脑视交叉前后2mm做连续冠状切片，置于2％TTC盐水缓冲液中，37℃避光孵育30min。TTC购自Sigma公司，批号8877。TTC染色后，可见正常脑组织被染成红色，坏死组织不着色。以10％福尔马林溶液固定，在CMIAS型计算机图像分析仪上测定脑梗塞面积，计算出脑梗塞面积百分比(梗塞面积/大脑面积×100％)。
TTC染色后，正常脑组织为深红色，梗塞区为苍白色，分界明显。梗塞可累及基底节及皮质区。CMIAS型分析仪上测量梗塞面积，对照组大脑冠状切面上未见梗塞。脑缺血60min时，缺血组的脑梗塞面较对照组明显增加；再灌注30min后，脑梗塞面积由缺血时的17.71±1.97进一步增加到19.16±1.92(P＜0.05)，与溶剂组比较无明显差异。缺血前给予SLC100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg后，脑梗塞面积分别比溶剂组降低29.39％(P＜0.05)，42.29％(P＜0.01)和60.84％(P＜0.01)，具有较好的量效关系(表4)。
表4 SLC对沙土鼠脑梗塞面积的影响(x±s，n＝10)
注与对照组比较#P＜0.01；与缺血组比较△P＜0.05；与溶剂组比较*P＜0.05，**P＜0.01试验实施例5 局灶性脑梗塞沙土鼠神经症状的评定动物模型制备，分组(n＝10)，给药方法同前。沙土鼠手术后4h、24h、72h动态进行神经症状评定，记录沙土鼠神经症状。0级无明显异常；I级手术对侧前肢内收或屈曲；II级除I级症状外，尚有向健侧打圈；III级除II级症状外，身体倒向健侧；IV级肢体瘫痪，不能爬行。
沙土鼠术后1h-2h苏醒，按4h、24h、72h进行神经功能评定，对照组未见行为异常，均为0级；溶液组术后可观察到明显的行为障碍。余各组沙土鼠神经症随时间延长于72h有不同程度的缓解，与溶液组比较有统计学意义。SLC对大脑梗塞后沙土鼠神经功能评级的实验结果见表5。
表5 SLC对脑梗塞沙土鼠神经功能评级的影响(x±s，n＝10)
注与对照组比较*P＜0.001；与溶剂组比较△P＜0.05，△△P＜0.01
试验实施例6 局灶性脑梗塞沙土鼠脑组织含水量的测定动物模型制备，分组(n＝10)，给药方法同前。断头取脑，用精密天平称取全脑湿重，于100℃烤箱中烘烤24h。称取干重。按Gotoh方法算含水量(湿重-干重)/湿重×100。
脑缺血60min时，脑组织中的含水量较假手术对照组的40.68±1.86增加到61.38±1.28(P＜0.01)；再灌注30min后，脑组织中的含水量升高至64.32±1.60(P＜0.01)；缺血前给予SLC100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg后，脑组织含水量分别比溶剂组降低10.23％(P＜0.05)，17.73％(P＜0.01)和25.71％(P＜0.01)，且具有较好的量效关系(表6)。
表6 SLC对MCAO沙土鼠脑含水量的影响(x±s，n＝10)
注与对照组比较#P＜0.01；与缺血再灌注比较*P＜0.01；与溶液组比较△P＜0.05，△△P＜0.01试验结果显示SLC具有很好的脑保护作用。SLC可通过以下途径发挥作用的。下调ICAM-1的表达和抑制白细胞的聚集，特别是减少中性粒细胞的聚集和粘附，从而减少蛋白水解酶、溶酶体酶、氧自由基和其他效应分子的释放，使酶类和自由基引起的链锁反应削弱，阻止细胞膜的崩解。抑制缺血再灌注损伤时的PAF和EAA的大量释放，改善神经症状，缩小梗塞面积和减轻脑水肿，从而起到脑保护作用。下面的实施例说明包含本发明提供药物的药用制剂。
制剂实施例1 注射液本发明药物(制备方法同实施例1) 150mg生理盐水 5ml制剂实施例2 胶囊剂按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分本发明药物(制备方法同实施例1) 50mg乳糖 70mg玉米淀粉 25mg硬脂酸镁 1mg合计 146mg
权利要求
1.治疗脑缺血再灌注损伤的药物，其特征在于含有50％以上的水飞蓟宾—卵磷脂复合物。
2.权利要求1所述的治疗脑缺血再灌注损伤的药物，所述药物为胶囊剂。
3.权利要求1所述的治疗脑缺血再灌注损伤的药物，所述药物为注射液。
4.权利要求1所述的治疗脑缺血再灌注损的药物的制备方法，包括下列步骤a.称取水飞蓟宾28～60g，溶入热丙酮中，得暗红色澄明液体，45～58℃保温；b.加入卵磷脂47～70g，搅拌，直至溶液澄明；c.接回流装置，边加热保温边振荡反应0.5～1.5h，拆除回流装置，真空浓缩至反应液体积为135～315ml，迅速加入到烷烃中，得黄色沉淀物，加压过滤，用烷烃洗涤沉淀，干燥，得黄色固体产物。
5.权利要求4所述的治疗脑缺血再灌注损伤的药物的制备方法，其中所述的烷烃为正己烷。
全文摘要
本发明涉及治疗脑缺血再灌注损伤的药物，其中包含的活性组分为水飞蓟宾－卵磷脂复合物(SLC)，该治疗脑缺血再灌注损伤的药物对缺血再灌注脑损伤有一定的治疗作用，本发明还公开了该药物的制备方法。
文档编号A61P9/10GK1810251SQ20051002355
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月25日 优先权日2005年1月25日
发明者吴晓华 申请人:上海市第七人民医院