专利名称：一种用核磁共振筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法，更具体地说，涉及一种应用核磁共振来筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法。
背景技术：
早老性痴呆(阿尔茨海默病)是一种以记忆缺损为特征的进行性精神疾病。中枢胆碱能传导机制的改变是早老性痴呆患者中枢神经系统最显著的病变，并且与痴呆的严重性相关。目前的治疗药物以胆碱酯酶抑制剂为首选。乙酰胆碱酯酶的功能是水解乙酰胆碱，使其失活，进而影响神经突触的正常生理功能。胆碱酯酶抑制剂可延缓乙酰胆碱的水解，提高乙酰胆碱在突触间隙的含量，从而保持中枢神经突触的正常生理功能，产生治疗效果。但目前常用的筛选方法是，用从大鼠大脑皮层中分离得到的乙酰胆碱酯酶(AChE)作为筛选模型，加入试样化合物，再用Ellman′s试剂进行显色，通过比色法进行比较，由此求得乙酰胆碱酯酶抑制活性(例如，可参见中国发明专利申请说明书第1417209号)。
然而，比色测定法的缺点是，需用较多的酶量，而且，显色容易受到干扰。
发明内容
本发明的目的是，是寻找一种快捷简便、不易受干扰的筛选乙酰胆碱脂酶抑制剂的方法。
本发明的乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法采用核磁共振的手段，通过观察试样化合物分子与乙酰胆碱酯酶的结合状态来筛选有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
即，本发明是在下述实验的基础上完成的在作为底物的试样化合物的溶液中加乙酰胆碱酯酶，观察加入乙酰胆碱酯酶前后的试样化合物质子的弛豫性质的变化，如底物分子与酶结合，则底物质子的选择性弛豫速率变快，同时，通过双照射方法测得底物分子的相关运动时间变长；如底物分子与酶未发生结合，则底物的质子在加酶前后的核磁共振性质无明显变化。
因此，本发明提供这样一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，它通过测定作为底物的试样化合物在加入乙酰胆碱酯酶前后的弛豫速率，确定选择性弛豫速率变快的试样化合物为乙酰胆碱酯酶抑制剂。
在上述方法中，所述测定方法可采用翻转恢复法。即应用180度脉冲使要观察的质子磁矢量翻转，在不同的等待时间以后观测磁矢量的恢复程度，根据磁矢量的恢复时间来判断磁豫速率。
质子的非选择性自旋晶格速率(以下简称弛速)Rns为同时照射分子中所有质子时各质子的弛豫速率。质子的选择性自旋晶格速率Rs为照射分子中特定质子时该质子的弛豫速率。Rns和Rs满足以下的等式Rins=Σj≠iρij+Σj≠iσij+ρi*...(1)]]>Ris=Σj≠iρij+ρi*...(2)]]>在等式〔1〕、〔2〕中，ρij为Hi质子被照射后将能量交给其相互偶极的其它质子时对弛豫速率的贡献。σij为相互偶极的两质子同时被照射后相互影响对弛豫速率的贡献，ρi*为其它弛豫机制对Hi弛豫速率的影响。比较〔1〕、〔2〕可看出，〔2〕式中，Rs由于只照射Hi质子，所以无其它被照射质子对Hi的影响项σij。
为进一步检测石杉碱甲与电鳐乙酰胆碱酯酶TnAChE分子间的相互作用，我们应用双照射的方法测定了分子的相关运动时间。从等式〔1〕、〔2〕可知，质子间的交叉弛速σij＝Riij-Ris，Riij为同时照射Hi及与其偶合的质子Hj时测得的Hi质子的驰速。Rs为照射分子中单独照射Hi时该质子的弛豫速率。当酶与底物相互结合、存在一动态平衡体系时，下列等式(3)和(4)成立 σobsij=pfreeσfreeij+pboundσboundij...(4)]]>式中，pfree为溶液中未结合酶的底物比率，pbound为结合酶的底物的比率，σfreeij为未加酶时观察到的交叉驰豫速率，σboundij为计算得到的纯酶结合状态下的交叉驰豫速率。
当以最保守的方法考虑σboundij与σfreeij，即设定酶与底物发生了完全的结合，则pbound＝〔蛋白质〕/〔配位体〕，pfree＝1-pbound。再根据等式〔4〕计算出σboundij的值，应用分子运动相关时间τboundij与σboundij间的关系等式〔5〕，可得出底物与酶结合后的分子相关运动时间。
式中，σboundij为计算得到的纯酶结合状态下的交叉驰豫速率，σboundij为计算得到的纯酶结合状态下的交叉驰豫速率，σfreeij为未加酶时观察到的交叉驰豫速率，Pbound为结合酶的底物的比率，γ是质子的磁旋比值， 是Plank’s常数的修正值， rij是质子Hi和Hj间的距离，为Hi和Hj运动相关时间，ω是质子的Larmor频率。
在本发明的方法中，可根据加入乙酰胆碱酯酶后底物的质子选择性白旋晶格速率Rs的增量是否大于其非选择性自旋晶格速率Rns的增量来确定有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
另外，在本发明的方法中，可根据加入乙酰胆碱酯酶时底物的质子选择性自旋晶格速率Rs大于加入丁酰胆碱酯酶时的质子选择性自旋晶格速率Rs来确定有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
此外，在本发明的方法中，还可以根据加入乙酰胆碱酯酶后底物的分子相关运动时间ωτ是否变长来确定有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
所述分子相关运动时间ωτ变长例如是从小于1转化为大于1。
该方法的优点是1，简便快速将待测样品与酶放在一起，直接应用核磁共振仪测试，10分钟内可看到明显结果。无需苛刻的测试条件和试剂等。2，实时性因酶溶解在体内环境的缓冲液中进行与待测分子的结合观察，因而此方法可检测酶在生物环境、溶液状态下与底物的结合。3，可一次筛选多个成分与酶结合的情况，根据各成分加酶前后的核磁共振信号的改变情况，找出与酶结合的分子。
具体实施例方式
石杉碱甲是由我国科学家首先从中草药蛇足石杉中分离得到的一种天然产物，经测定，是乙酰胆碱酯酶的可逆抑制剂，具有选择性高、毒性低和药效时间长等特点，是目前为止国际上治疗老年痴呆较为理想的候选药物。
在本发明中，本发明者以石杉碱甲、同样从蛇足石杉中分离得到的生物碱石杉碱乙和8-羟基马尾杉碱乙作为试样化合物。
石杉碱甲 石杉碱乙 8-羟基马尾杉碱乙实施例1分析试样的制备和测试石杉碱甲、石杉碱乙和8-羟基马尾杉碱乙系从药用植物千层塔中提取获得，用HPLC提纯，纯度均在99％以上。
所用的乙酰胆碱酯酶为中国丁氏双鳍电鳐乙酰胆碱酯酶，由电鳐电器官经亲和层析方法分离纯化获得，其分解乙酰胆碱活性通过比色法测定。
丁酰胆碱酯酶购于Sigma公司。
所用分析试剂皆为分析纯。
试样配制将石杉碱甲溶于20-100mM pH7.0的重水磷酸盐缓冲液中，再加入含乙酰胆碱酯酶的50mM pH7.0重水磷酸盐缓冲液，配制成含石杉碱甲1μmol/ml+乙酰胆碱酯酶5×10-3μmol/ml的加酶试样。另外，用不含乙酰胆碱酯酶的50mM pH7.0重水磷酸盐缓冲液代替上述酶液作为空白对照，使未加酶试样含石杉碱甲1μmol/ml。
用同样的方法配制石杉碱乙和8-羟基马尾杉碱乙的分析试样。
NMR分析所有实验在美国Varian公司的Varian Inova 600NMR谱仪上以298K进行。化学位移用DSS(4，4-二甲基-4-硅杂戊磺酸钠)定标。质子的弛豫时间应用翻转恢复法测定(是最有效、最简便的方法。弛豫速率通过指数方程求得。
实施例2底物测定浓度的确定底物分子在溶液中的聚合状态的不同可引起化学位移的改变，同时聚合状态也会影响底物中质子的弛豫时间，从而影响到加酶后的弛豫速率的测定。
为此，需要测量未加酶时不同浓度下底物分子的化学位移，以确定底物聚合状态。通过观察0.2～30.0mM范围内的石杉碱甲的H3质子化学位移变化(图2)，发现随浓度的增高，H3质子的化学位移向高场位移。说明有聚集态的发生，但在≤1mM浓度下，分子以单聚态存在。故确定在≤1mM的浓度下测定石杉碱甲的弛豫速率，以使测得的弛豫速率不受分子聚合状态的影响。对石杉碱乙和8-羟基马尾杉碱乙也在同样条件下测定。
实施例3底物分子运动速率的测定质子的非选择性自旋晶格速率(以下简称弛速)Rns为同时照射分子中所有质子时各质子的弛豫速率。质子的选择性自旋晶格速率Rs为照射分子中特定质子时该质子的弛豫速率。Rns和Rs满足以下的等式Rins=Σj≠iρij+Σj≠iσij+ρi*...(1)]]>Ris=Σj≠iρij+ρi*...(2)]]>在等式〔1〕、〔2〕中，ρij为Hi质子被照射后将能量交给其相互偶极的其它质子时对弛豫速率的贡献。σij为相互偶极的两质子同时被照射后相互影响对弛豫速率的贡献，ρi*为其它弛豫机制对Hi弛豫速率的影响。比较〔1〕、〔2〕可看出，〔2〕式中，Rs由于只照射Hi质子，所以无其它被照射质子对Hi的影响项σij。
在本实施例中，我们观察了石杉碱甲、石杉碱乙与乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶结合时石杉碱甲、石杉碱乙中的H2，H3，H7/H8，M10和M16质子的弛豫速率。其它质子由于化学位移相互重叠(如H8、H11)或为多重峰型(如H6，H14同碳质子为AB系统峰型)，无法选择合适的180度软脉冲照射而忽略。被测质子的弛速值示于表1、2中。实验结果表明，加酶前后，质子化学位移无明显变化，即，质子化学位移未受加酶的影响(具体数据未示出)，但几乎所有质子的弛豫速率在加酶后得到增强。而且，Rs增强明显大于Rns。这是因为当小分子与大分子结合后，σij值往往为负值，使得由ρij带来的弛速增强被抵消所致。Rs明显增强说明底物石杉碱甲、石杉碱乙均与酶发生了结合。Rs的影响顺序为H7＝H3＞H2＞M16＞M10，显示石杉碱甲、石杉碱乙中的不饱和羰基共轭环部分与蛋白作用强。比较石杉碱甲、石杉碱乙分别与乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶结合时的Rs，可以发现，石杉碱甲、石杉碱乙与乙酰胆碱酯酶结合的Rs值普遍大于石杉碱甲、石杉碱乙与丁酰胆碱酯酶结合的Rs值，说明石杉碱甲、石杉碱乙与乙酰胆碱酯酶的结合强度较大。
实施例4交叉弛豫速率和分子相关运动时间的测定为进一步检测石杉碱甲与电鳐乙酰胆碱酯酶TnAChE分子间的相互作用，我们应用双照射的方法测定了分子的相关运动时间。从等式〔1〕、〔2〕可知，质子间的交叉弛速σij＝Riij-Ris，Riij为同时照射Hi及与其偶合的质子Hi时测得的Hj质子的驰速。Rs为照射分子中单独照射Hi时该质子的弛豫速率。当酶与底物相互结合、存在一动态平衡体系时，下列等式(3)和(4)成立 σobsij=pfreeσfreeij+pboundσboundij...(4)]]>式中，pfree为溶液中未结合酶的底物比率，pbound为结合酶的底物的比率，σfreeij为未加酶时观察到的交叉驰豫速率，σboundij为计算得到的纯酶结合状态下的交叉驰豫速率。
当以最保守的方法考虑σboundij与σfreeij，即设定酶与底物发生了完全的结合，则pbound＝〔蛋白质〕/〔配位体〕，pfree＝1-pbound。再根据等式〔4〕计算出σboundij的值，应用分子运动相关时间τboundij与σboundij间的关系等式〔5〕，可得出底物与酶结合后的分子相关运动时间。
式中，σboundij为计算得到的纯酶结合状态下的交叉驰豫速率，σboundij为计算得到的纯酶结合状态下的交叉驰豫速率，σfreeij为未加酶时观察到的交叉驰豫速率，pbound为结合酶的底物的比率，γ是质子的磁旋比值， 是Plank’s常数的修正值， rij是质子Hi和Hj间的距离，为Hi和Hj运动相关时间，ω是质子的Larmor频率。本试验中，我们对石杉碱甲相邻的三组质子(H2-H3，H7-H8，H10-H11)进行了双照射试验，结果见表3，其中，交叉驰豫速率变量Δσij为σobsij与σfreeij为二者的差值。可以看出，交叉驰豫速率σij从未结合状态下一个较小的正值转变为结合状态下的一个较大的负值，说明石杉碱甲与TnAChE结合后其分子运动相关速率减慢，使得ωτ即单位时间下的运动相关时间从小于1转化为大于1，这里我们用H2-H3质子作为参考来计算分子运动相关时间，σbound23=-11.2s-1,]]>根据等式[5]，计算得τbound23=40.5]]>毫微秒(ns)，与未结合态相比〔τ一般在微微秒(ps)范围内〕，说明石杉碱甲与TnAChE发生了结合。
比较例1阴性对照试验当生物小分子粘附于蛋白表面，而非结合于蛋白的活性位点时，受蛋白的影响，同样可造成小分子的运动性发生一定的改变从而影响小分子的弛豫性质。为了观察石杉碱甲是否真正地结合于蛋白的活性位点，排除由于粘附现象引起的弛豫性质改变的假象，我们观察了同样从千层塔中分得的另一个与石杉碱甲分子大小相似但结构不同的生物碱-8-羟基马尾杉碱乙在加电鳐乙酰胆碱酯酶前后的质子弛豫时间的改变。应用与上述同样的实验方法，结果显示，加入TnAChE前后，8-羟基马尾杉碱乙的7H，16Me的弛豫性质末发生改变，8-羟基马尾杉碱乙未与TnAChE结合时，7H的Rs＝1.211±0.052s-1，16Me的Rs＝1.584±0.064s-1，8-羟基马尾杉碱乙与TnAChE结合后，7H的Rs＝1.119±0.0346s-1，16Me的Rs＝1.546±0.076s-1，比较结合前后结果无显著差异。说明8-羟基马尾杉碱乙未同TnAChE发生结合。
表1.在有或无TnAChE(5μM)和丁酰胆碱酯酶(5μM)的存在下测得的石杉碱甲(1mM)的1H NMR P参数(600MHz，溶剂D2O，pH 7.0，T＝298K)
表2.在有或无TnAChE(5μM)和丁酰胆碱酯酶(5μM)的存在下测得的石杉碱乙(1mM)的1H NMR P参数(600MHz，溶剂D2O，pH 7.0，T＝298K)
表3.在有或无乙酰胆碱酯酶(5μM)的存在下测得的石杉碱甲(1mM)的1H NMR交叉弛豫速率和分子相关运动时间(600MHz，溶剂D2O，pH 7.0，T＝298K)
权利要求
1.一种利用核磁共振筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，其特征在于，它通过测定作为底物的试样化合物的溶液中，加入乙酰胆碱酯酶，使乙酰胆碱酶前后的弛豫速率改变，测定底物分子运动速率、交叉驰豫速率、分子相关运动时间，确定选择性弛豫速率变快的试样化合物为乙酰胆碱酯酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，作为底物的试样化合物的溶液为50μMPH＝7.0的重水磷酸盐缓冲液浓度20～100mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入乙酰胆碱脂酶到底物的试样化合物的溶液前，测量未加酶时不同浓度下底物分子的化学位移，确定底物聚合状态。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定方法是翻转恢复法。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，加入乙酰胆碱酯酶后，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂的质子选择性自旋晶格速率Rs的增量大于其非选择性自旋晶格速率Rns的增量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入乙酰胆碱酯酶时，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂的质子选择性自旋晶格速率Rs大于加入丁酰胆碱酯酶时的质子选择性自旋晶格速率Rs。
7根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入乙酰胆碱酯酶后，所述乙酰胆碱酯酶抑制剂用双照射方法测得的分子相关运动时间ωτ变长。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ωτ从小于1转化为大于1。
全文摘要
本发明提供一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，它通过测定作为底物的试样化合物在加入乙酰胆碱酯酶前后的弛豫速率，确定选择性弛豫速率变快的试样化合物为乙酰胆碱酯酶抑制剂。即，在作为底物的试样化合物的溶液中加乙酰胆碱酯酶，观察加入乙酰胆碱酯酶前后的试样化合物质子的弛豫性质的变化，如底物分子与酶结合，则底物质子的选择性弛豫速率变快。同时，用双照射方法可以测得底物分子的相关运动时间变长；如底物分子与酶未发生结合，则底物的质子在加酶前后的核磁共振性质无明显变化。使用本发明的方法，可以快捷简便、只需极少量乙酰胆碱酯酶且不易受干扰地从大量天然产物分子中筛选有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
文档编号A61P25/28GK1808106SQ200510023500
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月21日 优先权日2005年1月21日
发明者李医明, 蒋山好, 朱大元, 杜为红, 黄才国 申请人:中国科学院上海药物研究所