专利名称：禽多核苷酸疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及可接种禽类，尤其是鸡的疫苗制剂，还涉及相应的接种方法。
以前已有人提出过针对与鸡病有关的多种病毒的疫苗。
迄今为止发展起来的方法为灭活疫苗或活疫苗，它们的使用提出了效价和稳定性之间相容性的问题。实际上不论是从所用的不同抗原的角度，还是从制剂本身的角度，都必需确保不同疫苗效价之间的相容性。另外还存在的问题是这种联合疫苗的保存及其安全性，尤其是存在佐剂时的安全性。这些疫苗一般十分昂贵。
专利申请WO-A-90 11092，WO-A-92 19183，WO-A-94 21797和WO-A-95 20660利用了最近兴起的多核苷酸疫苗技术。已知这些疫苗使用了质粒，所述质粒能在宿主细胞中表达插入其中的抗原。已提出所有的施用途径(腹膜内，静脉内，肌内，经皮，皮内，粘膜等等)。也可以使用不同的接种方式，如将DNA沉积在金粒表面并投射之以穿入动物皮肤(Tang等，自然(Nature)，356，152-154，1992)，可以同时转染皮肤，肌肉，脂肪组织和乳房组织的液体喷射注射器(Furth等，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，205，365-368，1992)。
多核苷酸疫苗也可以使用裸DNA和经配制的DNA，如脂质或阳离子脂质体内的DNA。
因此，本发明打算提供多价的疫苗制剂，所述制剂可以确保接种能抵抗多种病原性的禽病毒。
本发明的另一目的是提供含有不同效价并满足彼此相容性和效价稳定性所需的所有标准的疫苗制剂。
本发明的另一目的是提供可以在相同载体中含有不同效价的疫苗制剂。
本发明的另一目的是提供使用简单且便宜的疫苗。
本发明的另一目的是提供接种鸡形目动物的方法，所述接种可以得到高效，长期以及安全性良好又不留后患的保护作用，包括多价保护作用。
因此，本发明的目的是禽疫苗制剂，所述制剂含有至少3种效价的多核苷酸疫苗，每种含有一个整合质粒，其可在宿主细胞中体内表达一种禽病原体效价的基因，这些效价选自马立克氏病病毒(MDV)，新城疫病毒(NDV)，Gumboro病病毒(IBDV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性贫血症病毒(CAV)，传染性喉气管炎病毒(ILTV)，脑脊髓炎病毒(AEV或禽白血病病毒ALV)，肺病毒病病毒，和禽瘟病毒，对于每种效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因对于马立克氏病病毒选自gB和gD，对于新城疫病毒选自HN和F，对于Gumboro病病毒选自VP2，对于传染性支气管炎病毒选自S、M和N，对于传染性贫血症病毒选自C+NS1，对于传染性喉气管炎病毒选自gB和gD，对于脑脊髓炎病毒选自env和gag/pro，对于肺病毒病病毒选自F和G，和对于禽瘟病毒选自HA、N和NP。
本发明中的效价应理解成至少一种可提供抗所研究病原体病毒的保护作用的抗原，效价可含有得自一株或多株所研究病原体的一个或多个天然或经修饰的基因作为亚效价。
病原性因子的基因应理解成不仅指完整的基因，也指不同的多种核苷酸序列，包括保持了诱导保护性反应之能力的片段。基因的概念覆盖了等价于实施例中详细描述的序列的核苷酸序列，也就是说，有所不同但编码相同蛋白质的序列。此概念也覆盖了被研究的其它株病原体的核苷酸序列，它可以提供交叉保护作用或特异于株或株群的保护作用。此概念也覆盖了已被修饰以便于由宿主动物在体内表达，但编码相同蛋白质的核苷酸序列。
优选本发明的疫苗制剂含有3种选自马立克氏病、Gumboro病、传染性贫血症和新城疫的效价，也优选在其中加入传染性支气管炎的效价。
在该3，4或5种效价的基础上，可以加入一种或多种选自禽瘟、传染性喉气管炎、肺病毒病和脑脊髓炎的效价。
至于马立克氏病效价，在不同质粒或一个相同质粒中可使用两个编码gB和gD的基因，然而优选仅使用gB基因。
对于新城疫效价而言，优选使用整合至两个不同质粒或一个相同质粒中的HN和F这两个基因。
对于传染性支气管炎的效价而言，优选使用S基因。任选，但较不优选S和M在单个质粒或不同质粒中联合。
对于传染性贫血症的效价而言，优选C和NS1这两个基因在相同的质粒中联合。
对于传染性喉气管炎的效价而言，优选仅使用gB基因。任选，但较不优选gB和gD这两个基因在不同质粒或一个相同质粒中联合。
对于肺病毒病的效价而言，优选使用单个质粒或不同质粒中的F和G这两个基因。
对于禽瘟的效价而言，优选使用HA基因，任选，但较不优选，可以使用不同质粒或一个相同质粒中HA和NP或HA和N的联合。优选在相同疫苗中联合得自一种以上流感病毒株，尤其是得自在自然界发现的不同株的HA序列。另一方面，NP提供了交叉保护作用，因此得自单个病毒株的序列能令人满意。
对于脑脊髓炎的效价而言，优选使用env。
本发明疫苗制剂以0.1-1ml，尤其是0.3-0.5ml的剂量体积提供。
剂量一般为每种质粒类型10ng-1mg，优选为100ng-500μg，优选为0.1μg-50μg。
优选使用简单地置于接种载体，一般为生理盐水等中的裸质粒。当然也可以使用现有技术中已描述的任何多核苷酸疫苗形式，尤其是配制于脂质体中的疫苗形式。
每个质粒都含有启动子，在其控制下可确保插入基因在宿主细胞中的表达。所述启动子一般是强的真核生物启动子，尤其是来源于人或鼠、或任选来源于其它动物如大鼠、猪和豚鼠的巨细胞病毒早期CMV-IE启动子。
启动子更一般地讲是来源于病毒或细胞。至于CMV-IE以外的病毒启动子，可提到SV40病毒早期或晚期启动子或Rous肉瘤病毒LTR启动子。也可以是基因来源病毒的启动子，例如基因自身的启动子。
至于细胞启动子，可提到细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Bolmont等，亚显微镜细胞学和病理学(Journal of SubmicroscopicCytology and Pathology)，1990，22，117-122；和Zhenlin等，基因(Gene)，1989，78，243-254)或者肌动蛋白启动子。
当相同质粒中存在几个基因时，它们会存在于相同的转录单位或两个不同的单位中。
优选通过混合表达各种效价之抗原的多核苷酸质粒来达到本发明不同疫苗效价的联合，但也可以设想使几种效价的抗原由相同质粒表达。
本发明的目的还在于单价疫苗制剂，所述制剂含有一个或多个编码得自上述病毒之一的一个或多个基因的质粒，所述基因为上述的那些。除了它们的单价特征外，这些制剂可具有上述有关基因选择，基因联合，质粒组成，剂量体积，剂量等方面的特征。
单价疫苗制剂也可用于(i)制备上述的多价疫苗制剂，(ii)各对抗自己的疾病，(iii)与针对另一种疾病的另一类型(活的或灭活的完整的，重组的，亚单位)的疫苗联合，或(iv)按下述作为疫苗的加强剂。
实际上本发明另一个目的是使用一种或多种本发明的质粒以制备用于接种动物的禽疫苗，所述动物首先已被第一种已知类型的常规疫苗(单价或多价)接种，所述第一种疫苗特别选自活的完整疫苗，灭活的完整疫苗、亚单位疫苗和重组疫苗，所述第一种疫苗具有(也就是说含有或能表达)由所述质粒编码的抗原或提供交叉保护作用的抗原。
值得注意的是，所述多核苷酸疫苗具有强有力的加强效果，可导致免疫应答的增强并可获得长期的免疫力。
一般地讲，第一接种疫苗可选自可从不同的兽用疫苗生产商处购得的疫苗。
本发明的另一目的是接种试剂盒，所述试剂盒将本发明的疫苗制剂和上述第一接种疫苗组配在一起。本发明还涉及附带有说明书的本发明的疫苗制剂，所述说明书指明该制剂可作为上述第一次接种的加强剂来使用。
本发明的另一目的是接种禽的方法，所述方法包括施用有效量的上述疫苗制剂。此接种方法包括施用一剂或更多剂疫苗制剂，这些剂量可以在短时间内连续施用和/或以较长的间隔期连续施用。
在这种接种方法中，通过现有技术中建议的用于多核苷酸接种的不同施用途径并利用已知的施用技术施用本发明的疫苗制剂。
尤其涉及肌内途径，卵内途径，眼内途径，喷雾法和饮水。
向免疫系统呈递抗原的效力随组织的不同而不同。具体地说，呼吸道粘膜是病原体进入的屏障，并与支持局部免疫力的淋巴组织相关。另外，对于大量接种而言，通过与粘膜，特别是颊粘膜，咽粘膜和支气管区域的粘膜接触以施用疫苗当然是有利的。
因此，尤其使用喷雾法或喷射或饮水经粘膜途径施用疫苗形成了本发明优选施用方式的一部分。可在在此意义上应用本发明的疫苗制剂和接种方法。
本发明的另一目的是一种接种方法，所述方法包括按上述进行第一次接种，并用本发明的疫苗制剂加强接种。
在本发明方法的优选实施方案中，首先给动物施用有效剂量的常规疫苗，尤其是灭活的、活的、减毒的或重组的、或亚单位的疫苗以提供第一次接种，一段时间后，优选为2至6周后，施用本发明的多价或单价疫苗。
本发明也涉及一种制备疫苗制剂的方法，即制备不同效价及其混合物的方法，如从此说明书中看到的方法。
下面参照附图，借助于本发明的实施方案更详细地描述本发明。
图1质粒pVR1012
图2质粒pAB045图3质粒pAB080图4Texas GB株NDV HN基因的序列图5质粒pAB046图6Texas GB株NDV F基因的序列图7质粒pAB047图8Faragher株IBDV VP2基因的序列图9质粒pAB048图10Massachusetts 41株IBV S基因的序列图11质粒pAB049图12Massachusetts 41株IBV M基因的序列图13质粒pAB050图14Massachusetts 41株IBV N基因的序列图15质粒pAB051图16质粒pAB054图17质粒pAB055图18质粒pAB076图19质粒pAB089图20质粒pAB086图21质粒pAB081图22质粒pAB082图23质粒pAB077图24质粒pAB078图25质粒pAB088图26质粒pAB079序列表SEQ ID NOSEQ ID NO1寡核苷酸AB062SEQ ID NO2寡核苷酸AB063
SEQ ID NO3寡核苷酸AB148SEQ ID NO4寡核苷酸AB149SEQ ID NO5寡核苷酸AB072SEQ ID NO6寡核苷酸AB073SEQ ID NO7Texas GB株NDV HN基因的序列SEQ ID NO8寡核苷酸AB091SEQ ID NO9寡核苷酸AB092SEQ ID NO10Texas GB株NDV F基因的序列SEQ ID NO11寡核苷酸AB093SEQ ID NO12寡核苷酸AB094SEQ ID NO13Faragher株IBDV VP2“基因”的序列SEQ ID NO14寡核苷酸AB095SEQ ID NO15寡核苷酸AB096SEQ ID NO16Massachusetts 41株IBV S基因的序列SEQ ID NO17寡核苷酸AB097SEQ ID NO18寡核苷酸AB098SEQ ID NO19Massachusetts 41株IBV M基因的序列SEQ ID NO20寡核苷酸AB099SEQ ID NO21寡核苷酸AB100SEQ ID NO22Massachusetts 41株IBV N基因的序列SEQ ID NO23寡核苷酸CD064SEQ ID NO24寡核苷酸CD065SEQ ID NO25寡核苷酸CD066SEQ ID NO26寡核苷酸AB105SEQ ID NO27寡核苷酸AB140SEQ ID NO28寡核苷酸AB141SEQ ID NO29寡核苷酸AB164SEQ ID NO30寡核苷酸AB165SEQ ID NO31寡核苷酸AB160
SEQ ID NO32寡核苷酸AB161SEQ ID NO33寡核苷酸AB150SEQ ID NO34寡核苷酸AB151SEQ ID NO35寡核苷酸AB152SEQ ID NO36寡核苷酸AB153SEQ ID NO37寡核苷酸AB142SEQ ID NO38寡核苷酸AB143SEQ ID NO39寡核苷酸AB144SEQ ID NO40寡核苷酸AB145SEQ ID NO41寡核苷酸AB156SEQ ID NO42寡核苷酸AB158SEQ ID NO43寡核苷酸AB146SEQ ID NO44寡核苷酸AB147实施例实施例1病毒的培养在适当的细胞系统中培养病毒直至得到细胞病变效应。本领域技术人员熟知每种病毒所用的细胞系统。简单地说，用感染复数为1的被研究的病毒株接种对所用病毒敏感的细胞，所述细胞在Eagle最低基本培养基(MEM培养基)或另一种适当的培养基中培养。然后于37℃保温被感染的细胞直至出现完全的细胞病变效应(平均为36小时)。
实施例2提取病毒基因组DNA培养后，收获上清液和被裂解的细胞，于4℃，1000g将全部的病毒悬浮液离心10分钟以除去细胞碎片，然后通过于4℃，400,000g超速离心1小时以收获病毒颗粒。将沉淀物溶解于最少量的缓冲液(10mMTris，1mM EDTA)中，于37℃，在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下(终浓度为0.5％)，用蛋白酶K(终浓度为100μg/ml)将上述浓缩的病毒悬浮液处理2小时。然后用苯酚/氯仿混合物提取病毒DNA，再用2倍体积的无水乙醇沉淀之。于-20℃放置过夜后，于4℃，10,000g将DNA离心15分钟，干燥DNA沉淀物，然后将它溶于最少量的无菌超纯水中，接着可以用限制性酶消化所述DNA。
实施例3分离病毒基因组RNA根据本领域技术人员熟知的技术纯化RNA病毒，然后使用P.Chromczynski和N.Sacchi所述的“硫氰酸胍/苯酚-氯仿”提取技术(分析生物化学，1987，162，156-159)分离各个病毒的基因组病毒RNA。
实施例4分子生物学技术使用J.Sambrook等人(分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行所有的质粒构建。使用“Geneclean”试剂盒(BIO 101 Inc.La Jolla，CA)分离用于本发明的所有限制性片段。
实施例5RT-PCR技术合成多个特异性的寡核苷酸(在其5’末端含有限制性位点以便于克隆经扩增的片段)以使其完全覆盖欲被扩增的基因的编码区(见具体的实施例)。根据标准技术(Sambrook J等人，1989)进行逆转录(RT)反应和聚合酶链反应(PCR)。用一对特异性的扩增引物进行一种RT-PCR反应，所述反应的模板是提取出的病毒基因组RNA。用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取经扩增的互补DNA，然后用限制性酶消化。
实施例6质粒pVR1012质粒pVR1012(图1)得自Vical Inc.，San Diego，CA，USA。其构建描述于J.Hartikka等人(人类基因疗法(Human Gene Therapy)，1996，7，1205-1217)。
实施例7构建质粒pAB045(MDV gB基因)用根据实施例2的技术制备的马立克氏病病毒(MDV)(RB1B株)(L.Ross等，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)，1989，70，1789-1804)基因组DNA和下列寡核苷酸AB062(37聚体)(SEQ ID NO1)5’AAAACTGCAGACTATGCACTATTTTAGGCGGAATTGC 3’AB063(35聚体)(SEQ ID NO2)5’GGAAGATCTTTACACAGCATCATCTTCTGAGTCTG 3’进行PCR反应以从MDV病毒中分离PstI-BglII片段形式的编码gB糖蛋白的基因。纯化之后，用PstI和BglII消化2613bp的PCR产物以分离2602bp的PstI-BglII片段。将此片段与预先经PstI和BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB045(7455bp)(图2)。
实施例8构建质粒pAB080(MDV gD基因)用根据实施例2的技术制备的马立克氏病病毒(MDV)(RB1B株)(L.Ross等，普通病毒学杂志，1991，72，949-954)基因组DNA和下列寡核苷酸AB148(29聚体)(SEQ ID NO3)5’AAACTGCAGATGAAAGTATTTTTTTTTAG 3’AB149(32聚体)(SEQ ID NO4)5’GGAAGATCTTTATAGGCGGGAATATGCCCGTC 3’进行PCR反应以从MDV病毒中分离PstI-BglII片段形式的编码gD糖蛋白的基因。纯化之后，用PstI和BglII消化1215bp的PCR产物以分离1199bp的PstI-BglII片段。将此片段与预先经PstI和BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB080(6051bp)(图3)。
实施例9构建质粒pAB046(NDV HN基因)用根据实施例3的技术制备的新城疫病毒(NDV)(Texas GB株)基因组RNA和下列寡核苷酸
AB072(39聚体)(SEQ ID NO5)5’ATAAGAATGCGGCCGCCATGGACCGTGCAGTTAGCAGAG 3’AB094(34聚体)(SEQ ID NO6)5’CGCGGATCCTTAAATCCCATCATCCTTGAGAATC 3’根据实施例5的技术进行T-PCR反应以从NDV病毒Texas GB株中分离NotI-BamHI片段形式的编码HN糖蛋白的基因(图4和SEQ IDNO7)。纯化之后，用NotI和BamHI消化1741bp的RT-PCR产物以分离1723bp的NotI-BamHI片段。将此片段与预先经NotI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB046(6616bp)(图5)。
实施例10构建质粒pAB047(NDV F基因)用根据实施例3的技术制备的新城疫病毒(NDV)(Texas GB株)基因组RNA和下列寡核苷酸AB091(37聚体)(SEQ ID NO8)5’AGAATGCGGCCGCGATGGGCTCCAGATCTTCTACCAG 3’AB092(34聚体)(SEQ ID NO9)5’TGCTCTAGATCATATTTTTGTAGTGGCTCTCATC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从NDV病毒Texas GB株中分离NotI-XbaI片段形式的编码F糖蛋白的基因(图6和SEQ IDNO10)。纯化之后，用NotI和XbaI消化1684bp的RT-PCR产物以分离1669bp的NotI-XbaI片段。将此片段与预先经NotI和XbaI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB047(6578bp)(图7)。
实施例11构建质粒pAB048(IBDV VP2基因)用根据实施例3的技术制备的Gumboro病病毒(IBDV)(Faragher株)基因组RNA和下列寡核苷酸AB093(33聚体)(SEQ ID NO11)5’TCAGATATCGATGACAAACCTGCAAGATCAAAC 3’
AB094(38聚体)(SEQ ID NO12)5’AGAATGCGGCCGCTTACCTCCTTATAGCCCGGATTATG 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从IBDV病毒Faragher株中分离EcoRV-NotI片段形式的编码VP2蛋白的序列(图8和SEQ IDNO13)。纯化之后，用EcoRV和NotI消化1384bp的RT-PCR产物以分离1367bp的EcoRV-NotI片段。将此片段与预先经EcoRV和NotI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB048(6278bp)(图9)。
实施例12构建质粒pAB049(IBV S1基因)用根据实施例3的技术制备的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)(Massachusetts 41株)基因组RNA和下列寡核苷酸AB095(32聚体)(SEQ ID NO14)5’ACGCGTCGACATGTTGGTAACACCTCTTTTAC 3’AB096(35聚体)(SEQ ID NO15)5’GGAAGATCTTCATTAACGTCTAAAACGACGTGTTC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从IBV病毒Massachusetts 41株中分离SalI-BglII片段形式的编码S糖蛋白S1亚单位的序列(图10和SEQ ID NO16)。纯化之后，用SalI和BglII消化1635bp的RT-PCR产物以分离1622bp的SalI-BglII片段。将此片段与预先经SalI和BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB049(6485bp)(图11)。
实施例13构建质粒pAB050(IBV M基因)用根据实施例3的技术制备的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)(Massachusetts 41株)基因组RNA和下列寡核苷酸AB097(39聚体)(SEQ ID NO17)5’ATAAGAATGCGGCCGCATGTCCAACGAGACAAATTGTAC 3’AB098(38聚体)(SEQ ID NO18)
5’ATAAGAATGCGGCCGCTTTAGGTGTAAAGACTACTCCC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从IBV病毒Massachusetts 41株中分离NotI-NotI片段形式的编码M糖蛋白的基因(图12和SEQ IDNO19)。纯化之后，用NotI消化710bp的RT-PCR产物以分离686bp的NotI-NotI片段。将此片段与预先经NotI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB050(5602bp)，该质粒在相对启动子而言正确的方向上含有IBV M基因(图13)。
实施例14构建质粒pAB051(IBV N基因)用根据实施例3的技术制备的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)(Massachusetts 41株)基因组RNA和下列寡核苷酸AB099(34聚体)(SEQ ID NO20)5’AAAACTGCAGTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTG 3’AB100(33聚体)(SEQ ID NO21)5’CGCGGATCCTCAAAGTTCATTCTCTCCTAGGGC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从IBV病毒Massachusetts 41株中分离PstI-BamHI片段形式的编码N蛋白的基因(图14和SEQ IDNO22)。纯化之后，用PstI和BamHI消化1250bp的RT-PCR产物以分离1233bp的PstI-BamHI片段。将此片段与预先经PstI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB051(6092bp)(图15)。
实施例15构建质粒pAB054(VAC VP1基因)用根据实施例2的技术制备的鸡贫血症病毒(CAV)(Cuxhaven-1株)基因组DNA(B.Meehan等，Arch.Virol，1992，124，301-319)和下列寡核苷酸CD064(39聚体)(SEQ ID NO23)5’TTCTTGCGGCCGCCATGGCAAGACGAGCTCGCAGACCGA3’
CD065(38聚体)(SEQ ID NO24)5’TTCTTGCGGCCGCTCAGGGCTGCGTCCCCCAGTACATG 3’进行PCR反应以分离NotI-NotI片段形式的编码CAV VP1衣壳蛋白的基因。纯化之后，用NotI消化1377bp的PCR产物以分离1359bp的NotI-NotI片段。将此片段与预先经NotI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB054(6274bp)，该质粒在相对启动子而言正确的方向上含有CAV VP1基因(图16)。
实施例17构建质粒pAB055(VAC VP2基因)用根据实施例2的技术制备的鸡贫血症病毒(CAV)(Cuxhaven-1株)基因组DNA(B.Meehan等，Arch.Virol，1992，124，301-319)和下列寡核苷酸CD066(39聚体)(SEQ ID NO25)5’TTCTTGCGGCCGCCATGCACGGGAACGGCGGACAACCGG3’AB105(32聚体)(SEQ ID NO26)5’CGCGGATCCTCACACTATACGTACCGGGGCGG 3’进行PCR反应以分离NotI-BamHI片段形式的编码CAV病毒VP2蛋白的基因。纯化之后，用NotI和BamHI消化674bp的PCR产物以分离659bp的NotI-BamHI片段。将此片段与预先经NotI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB055(5551bp)(图17)。
实施例18构建质粒pAB076(ILTV gB基因)用根据实施例2的技术制备的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)(SA-2株)基因组DNA(K.Kongsuwan等，病毒学(Virology)，1991，184，404-410)和下列寡核苷酸AB140(38聚体)(SEQ ID NO27)5’TTCTTGCGGCCGCCATGGCTAGCTTGAAAATGCTGATC 3’
AB141(36聚体)(SEQ ID NO28)5’TTCTTGCGGCCGCTTATTCGTCTTCGCTTTCTTCTG 3’进行PCR反应以分离NotI-NotI片段形式的编码ILTV病毒gB糖蛋白的基因。纯化之后，用NotI消化2649bp的PCR产物以分离2631bp的NotI-NotI片段。将此片段与预先经NotI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB076(7546bp)，该质粒在相对启动子而言正确的方向上含有ILTV gB基因(图18)。
实施例20构建质粒pAB089(ILTV gD基因)用根据实施例2的技术制备的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)(SA-2株)基因组DNA(M.Johnson等，1994，Genbank序列登记号为L31965)和下列寡核苷酸AB164(33聚体)(SEQ ID NO29)5’CCGGTCGACATGGACCGCCATTTATTTTTGAGG 3’AB165(33聚体)(SEQ ID NO30)5’GGAAGATCTTTACGATGCTCCAAACCAGTAGCC 3’进行PCR反应以分离SalI-BglII片段形式的编码ILTV病毒gD糖蛋白的基因。纯化之后，用SalI和BglII消化1134bp的PCR产物以分离1122bp的SalI-BglII片段。将此片段与预先经SalI-BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB089(5984bp)(图19)。
实施例21构建质粒pAB086(AEV env基因)用根据实施例3的技术制备的禽脑脊髓炎病毒(AEV)(C型)基因组RNA(E.Bieth等，核酸研究(Nucleic Res.)，1992，20，367)和下列寡核苷酸AB160(54聚体)(SEQ ID NO31)5’TTTGATATCATGGAAGCCGTCATTAAGGCATTTCTGACTGGATACCCTGGGAAG 3’
AB161(31聚体)(SEQ ID NO32)5’TTTGGATCCTTATACTATTCTGCTTTCAGGC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以分离EcoRV-BamHI片段形式的编码AEV病毒Env糖蛋白的序列。纯化之后，用EcoRV和BamHI消化1836bp的RT-PCR产物以分离1825bp的EcoRV-BamHI片段。将此片段与预先经EcoRV和BamHI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB086(6712bp)(图20)。
实施例22构建质粒pAB081(AEV gag/pro基因)用根据实施例3的技术制备的禽脑脊髓炎病毒(AEV)(C型)基因组RNA(E.Bieth等，核酸研究，1992，20，367)和下列寡核苷酸AB150(31聚体)(SEQ ID NO33)5’ACGCGTCGACATGGAAGCCGTCATTAAGGTG 3’AB151(32聚体)(SEQ ID NO34)5’TGCTCTAGACTATAAATTTGTCAAGCGGAGCC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以分离SalI-XbaI片段形式的编码AEV病毒Gag和Pro蛋白的序列。纯化之后，用SalI-XbaI消化2125bp的RT-PCR产物以分离2111bp的SalI-XbaI片段。将此片段与预先经SalI和XbaI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB081(6996bp)(图21)。
实施例23构建质粒pAB082(肺病毒G基因)用根据实施例3的技术制备的火鸡鼻气管炎病毒(TRV)(2119株)基因组RNA(K.Juhasz等，普通病毒学杂志，1994，75，2873-2880)和下列寡核苷酸AB152(32聚体)(SEQ ID NO35)5’AAACTGCAGAGATGGGGTCAGAGCTCTACATC 3’AB153(31聚体)(SEQ ID NO36)5’CGAAGATCTTTATTGACTAGTACAGCACCAC 3’
根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以分离PstI-BglII片段形式的编码TRV病毒G糖蛋白的基因。纯化之后，用PstI和BglII消化2165bp的RT-PCR产物以分离1249bp的PstI-BglII片段。将此片段与预先经PstI和BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB082(6101bp)(图22)。
实施例24构建质粒pAB077(禽瘟病毒HA基因，H2N2株)用根据实施例3的技术制备的禽瘟病毒(AIV)(H2N2 Postdam株)基因组RNA(J.Schafer等，病毒学，1993，194，781-788)和下列寡核苷酸AB142(33聚体)(SEQ ID NO37)5’AAACTGCAGCAATGGCCATCATTTATCTAATTC 3’AB143(31聚体)(SEQ ID NO38)5’CGAAGATCTTCATATGCAGATTCTGCATTGC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从禽瘟病毒(H2N2株)分离PstI-BglII片段形式的编码HA糖蛋白的基因。纯化之后，用PstI和BglII消化1709bp的RT-PCR产物以分离1693bp的PstI-BglII片段。将此片段与预先经PstI和BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB077(6545bp)(图23)。
实施例25构建质粒pAB078(禽瘟病毒HA基因，H7N7株)用根据实施例3的技术制备的禽瘟病毒(AIV)(H7N7 Leipzig株)基因组RNA(C.Rohm等，病毒学，1995，209，664-670)和下列寡核苷酸AB144(31聚体)(SEQ ID NO39)5’AAACTGCAGATGAACACTCAAATCCTGATAC 3’AB145(31聚体)(SEQ ID NO40)5’TTTGGATCCTTATATACAAATAGTGCACCGC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从禽瘟病毒(H7N7株)分离PstI-BamHI片段形式的编码HA糖蛋白的基因。纯化之后，用PstI和BamHI消化1707bp的RT-PCR产物以分离1691bp的PstI-BamHI片段。将此片段与预先经PstI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB078(6549bp)(图24)。
实施例26构建质粒pAB088(禽瘟病毒NP基因，H1N1株)用根据实施例3的技术制备的禽流感病毒(AIV)(H1N1 Bavaria株)基因组RNA(M.Gammelin等，病毒学，1989，170，71-80)和下列寡核苷酸AB156(32聚体)(SEQ ID NO41)5’CCGGTCGACATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG 3’AB158(30聚体)(SEQ ID NO42)5’CGCGGATCCTTAATTGTCATACTCCTCTGC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以分离SalI-BamHI片段形式的编码禽流感病毒NP核蛋白的基因。纯化之后，用SalI和BamHI消化1515bp的RT-PCR产物以分离1503bp的SalI-BamHI片段。将此片段与预先经SalI和BamHI消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB088(6371bp)(图25)。
实施例27构建质粒pAB079(禽瘟病毒N基因，H7N1株)用根据实施例3的技术制备的禽瘟病毒(AIV)(H7N1 Rostock株)基因组RNA(J.McCauley，1990，Genbank登记号为X52226)和下列寡核苷酸AB146(35聚体)(SEQ ID NO43)5’CGCGTCGACATGAATCCAAATCAGAAAATAATAAC 3’AB147(31聚体)(SEQ ID NO44)5’GGAAGATCTCTACTTGTCAATGGTGAATGGC 3’根据实施例5的技术进行RT-PCR反应以从禽瘟病毒(H7N1株)分离SalI-BglII片段形式的编码N糖蛋白的基因。纯化之后，用SalI和BglII消化1361bp的RT-PCR产物以分离1350bp的SalI-BglII片段。将此片段与预先经SalI和BglII消化的载体pVR1012(实施例6)连接，得到质粒pAB079(6212bp)(图26)。
实施例28制备和纯化质粒为了制备欲接种动物的质粒，可使用能得到超螺旋形式占优势的纯化质粒悬浮液的任何技术，这些技术是本领域技术人员所熟知的。这里可特别提到J.Sambrook等人(分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的碱裂解技术，接着再在溴化乙锭的存在下，在氯化铯梯度中进行2次连续的超速离心。也可参照专利申请PCT WO 95/21250和PCT WO 96/02658，它们描述了工业化规模生产可用于接种之质粒的方法。为了制备疫苗(见实施例17)，可重新悬浮纯化的质粒以得到适于储存的高浓度溶液(＞2mg/ml)。为此，将质粒重新悬浮于超纯水或TE缓冲液(10mM Tris-HCl；1mM EDTA，pH8.0)中。
实施例29制备联合疫苗从其浓缩溶液(实施例16)开始混合制备联合疫苗所需的多种质粒。制备混合物以使各个质粒的终浓度相当于各个质粒的有效剂量。可用于调节疫苗终浓度的溶液可以是0.9％的NaCl溶液，也可以是PBS缓冲液。
也可以将特殊的制剂，如脂质体，阳离子脂质用于制备疫苗。
实施例30对鸡接种以每种质粒10，50或100μg的剂量接种鸡，通过肌内途径用针头进行注射。注射位点是胸骨(对于2周龄以上的鸡而言)和大腿(对于1天龄或以上的鸡而言)。此时，以0.1至0.3ml的体积施用疫苗剂量。
在成年鸡中(大于20周龄)，也可以使用为接种鸡而特别设计的液体喷射注射装置(不带针头)(如AVIJET装置)，经肌内途径进行注射。此时，注射体积是0.3ml。可在胸骨或大腿上进行注射。类似地，在成年鸡中，也可用针头，经肌内途径以0.3ml的体积对胸骨或大腿进行注射。质粒疫苗的注射也可在卵内进行，此时，可使用实施例29中提到的特殊制剂，注射至18天龄有胚卵中的体积是50至200μl。
权利要求
1.禽疫苗制剂，所述制剂含有至少3种效价的多核苷酸疫苗，每种含有一个整合质粒，其可在宿主细胞中体内表达一种禽病原体效价的基因，这些效价选自马立克氏病病毒、新城疫病毒、Gumboro病病毒、传染性贫血症病毒，对于每种效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因对于马立克氏病病毒选自gB和gD，对于新城疫病毒选自HN和F，对于Gumboro病病毒选自VP2，对于传染性贫血症病毒选自C+NS1。
2.根据权利要求1的疫苗制剂，其特征在于对于马立克氏病病毒的效价而言，所述制剂仅含有gB基因。
3.根据权利要求1的制剂，其特征在于所述制剂在相同质粒或不同质粒中含有新城疫病毒的HN和F基因。
4.根据权利要求1的制剂，其特征在于针对传染性贫血症病毒的质粒在相同质粒中含有C+NS1。
5.根据权利要求1至4中任一项的疫苗制剂，其特征在于所述制剂另外含有至少一种选自传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，脑脊髓炎病毒，肺病毒病病毒，和禽瘟病毒，对于这些效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因选自传染性支气管炎病毒的S、M和N，传染性喉气管炎病毒的gB和gD，脑脊髓炎病毒的env和gag/pro，肺病毒病病毒的F和G，和禽瘟病毒的HA、N和NP。
6.根据权利要求5的疫苗制剂，其特征在于对于传染性支气管炎病毒的效价而言，所述制剂仅含有S基因。
7.根据权利要求5的疫苗制剂，其特征在于对于传染性喉气管炎病毒的效价而言，所述制剂仅含有gB基因。
8.根据权利要求5的疫苗制剂，其特征在于对于肺病毒病病毒的效价而言，所述制剂在不同质粒或一个和相同质粒中含有F和G这两个基因。
9.根据权利要求5的疫苗制剂，其特征在于对于禽瘟病毒效价而言，所述制剂仅含有HA基因。
10.根据权利要求5的疫苗制剂，其特征在于对于脑脊髓炎病毒效价而言，疫苗制剂含有env基因。
11.根据权利要求1至10中任一项的疫苗制剂，其特征在于所述制剂含有10ng-1mg，优选为100ng-500μg，更优选为0.1μg-50μg每种质粒。
12.权利要求1至11中任一项所述的一种或多种质粒用于制备接种动物的禽疫苗的用途，所述动物首先已被第一种选自活的完整疫苗、灭活的完整疫苗、亚单位疫苗和重组疫苗的疫苗接种，所述第一种疫苗具有由该质粒编码的抗原或提供交叉保护作用的抗原。
13.一种接种试剂盒，所述试剂盒将根据权利要求1至11中任一项的疫苗制剂和选自活的完整疫苗、灭活的完整疫苗、亚单位疫苗和重组疫苗的第一种禽疫苗组配在一起，所述第一种疫苗具有由该多核苷酸疫苗编码的抗原或提供交叉保护作用的抗原，在第一次接种时施用第一种疫苗，并将所述疫苗制剂用作加强剂。
14.附带有说明书的根据权利要求1至11中任一项的疫苗制剂，所述说明书指明此制剂能用作选自活的完整疫苗、灭活的完整疫苗、亚单位疫苗和重组疫苗的第一种禽疫苗的加强剂，所述第一种疫苗具有由该多核苷酸疫苗编码的抗原或提供交叉保护作用的抗原。
15.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达新城疫病毒HN基因。
16.权利要求15的疫苗，其中所述质粒还含有F基因。
17.权利要求15的疫苗，其还含有含F基因的质粒。
18.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达传染性粘液囊病病毒VP2基因。
19.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达传染性贫血症病毒C和NS1基因。
20.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达选自gB和gD基因的马立克氏病病毒基因。
21.权利要求20的疫苗，其中质粒含有gB和gD基因。
22.权利要求20的疫苗，其包含含gB基因的质粒和含gD基因的质粒。
23.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达选自gB和gD基因的ILTV基因。
24.权利要求23的疫苗，其中质粒含有gB和gD基因。
25.权利要求23的疫苗，其含有含gB基因的质粒和含gD基因的质粒。
26.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达选自F和G基因的肺病毒病病毒基因。
27.权利要求26的疫苗，其中质粒含有F和G基因。
28.权利要求26的疫苗，其含有含F基因的质粒和含G基因的质粒。
29.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达选自env和gag/pro基因的脑脊髓炎病毒基因。
30.权利要求29的疫苗，其中质粒含有env基因。
31.含有一种质粒和药物可接受载体的禽疫苗，所述质粒含有并在体内表达选自M和N基因的传染性支气管炎病毒基因。
32.权利要求15-31任一项的疫苗，其中所述基因处于选自CMV-IE启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、Rous肉瘤病毒LTR启动子、细胞骨架基因启动子的启动子控制之下。
33.权利要求32的疫苗，其中所述基因处于CMV-IE启动子控制之下。
34.含有选自VP1和VP2基因的传染性贫血症病毒基因的质粒，该质粒允许体内表达所述基因。
全文摘要
禽疫苗制剂，所述制剂含有至少3种效价的多核苷酸疫苗，每种含有一个整合质粒，其可在宿主细胞中体内表达一种禽病原体效价的基因，这些效价选自马立克氏病病毒、新城疫病毒、Gumboro病病毒、传染性贫血症病毒，对于每种效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因对于马立克氏病病毒选自gB和gD，对于新城疫病毒选自HN和F，对于Gumboro病病毒选自VP2，对于传染性贫血症病毒选自C+NS1。
文档编号A61K39/295GK1701788SQ200510066979
公开日2005年11月30日 申请日期1997年7月16日 优先权日1996年7月19日
发明者J-C·奥都尼特, A·布萨都恩, M·里威尔 申请人:梅瑞尔公司