专利名称：细胞凋亡抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞凋亡抑制剂。更详细地说，本发明涉及含有已知的作为中枢神经型前列腺环素受体的特异配基的异卡巴环素(isocarbacyclin)衍生物为有效成分，对神经细胞等的细胞凋亡有优良抑制作用的新型细胞凋亡抑制剂。
细胞凋亡为遗传性的细胞程序性死亡的一种，在形态学上发生以下的过程，即核固缩、细胞缩小、空泡化、细胞表面的平滑化、细胞间隔的扩大、与周围的细胞分离、细胞的片断化(细胞凋亡小体)、巨噬细胞引起的吞噬作用等。此外在生物化学方面，可发生因核酸内切酶活性所致的DNA核粒单位变成180～200碱基长的断片化(今日免疫学(Immunology Today)7115-119，1986；科学(Science)245301-305，1989)。
目前已知，细胞凋亡过程不仅是发育、分化、正常组织和细胞转化的生理机制，而且还和脑梗塞后等的缺血性神经元坏死、肿瘤的退缩、放射线和抗癌药的作用、AIDS等病毒感染引起的淋巴细胞减少、炎症等疾病有关。期待着对调节此过程药物(即细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂)的开发将产生对脑神经系统、癌症和老化等多种疾病有新作用机制的药物。
作为诱导细胞凋亡的物质、因素，已报道有糖皮质激素、谷氨酸等神经递质的毒性、放射线照射、NK细胞、杀伤细胞、肿瘤坏死因子(TNF)、及淋巴细胞毒素(LT)等细胞因子。此外，也有报道表明蛋白质合成抑制剂放线菌酮和RNA合成抑制剂放线菌素D对人白血病细胞HL-60有诱导细胞凋亡的作用。更进一步，最近研制出了对应涉及免疫细胞凋亡的细胞膜分子Fas抗原的抗Fas单克隆抗体，对抗Fas抗体在医药方面的应用作了种种研究。
另一方面，作为抑制细胞凋亡的因子，已报道有白细胞介素1转化酶抑制剂、成纤维细胞生长因子(bFGF)等。此外，还知道bcl-2相关基因的产物可抑制细胞凋亡，具有延长细胞生命的机能。但是，这些细胞凋亡抑制因子都是来源于生物体，还没有以化学合成等的工业手段得到的细胞凋亡抑制物质。
本发明者们在对脑机能的生理作用进行详细的研究过程中，发明了作为中枢神经型前列腺环素受体特异配基的各种异卡巴环素衍生物，申请了专利[特愿平7-51589号(JP-A-245498/96)、特愿平8-243122号(JP-A 87608/98)、特愿平8-260957号(JP-A101610/98)、特愿平9-160320号]。对这些物质生理活性进行进一步研究的结果发现其中有几个化合物显示出显著的细胞凋亡抑制作用。
所以，本申请的发明进一步发展发明者们上述的见解，其目的在于提供能够以化学合成方法大量廉价地制备的新型细胞凋亡抑制剂。
本申请中，作为解决上述课题的第1发明，提供了以下述式(1)所示的15R-异卡巴环素衍生物为有效成分的细胞凋亡抑制剂。
(式中R1表示碳数1～6的烃链，R2表示氢原子或保护基团)在第1发明的细胞凋亡抑制剂中，上述15R-异卡巴环素衍生物优选下述式(2)
所示的15R-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲酯。
更进一步，本申请中，作为第2发明，提供了以下述式(3)所示的15-去氧-异卡巴环素衍生物为有效成分的细胞凋亡抑制剂。
(式中R1表示碳数1～6的烃链，R2表示氢原子或保护基团)在此第2发明中，上述15-去氧-异卡巴环素衍生物优选下述式(4) 所示的15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲酯。
还有，在上述式(1)和(3)中，R2表示的保护基团意思是制剂上允许的盐、酯等，例如表示构成甲酯、乙酯等的烷基。
下面就其实施形式对本发明进行更详细的说明。
图1和图2为表示对海马神经元的细胞凋亡抑制作用的图。
图3是表示合成去氧-TIC的化学流程图。
图4(A)(B)为各标记异卡巴环素衍生物的全脑和丘脑摄取量经时作图而成的图。
作为本申请第1发明的细胞凋亡抑制剂有效成分的15R-异卡巴环素衍生物，例如15R-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素(下面记为15R-TIC)或其甲酯，可按本申请的发明者们先前发明(特开平8-245498号公报)记载的方法制得。
此外，作为本申请第2发明有效成分的15-去氧-异卡巴环素衍生物，例如15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素(下面记为去氧-TIC)或其甲酯，一样可按本申请的发明者们先前发明(特愿平9-160320号)记载的方法制得。
本发明的细胞凋亡抑制剂，可以是以此卡巴环素衍生物的任一个作为实质性的有效成分制剂化而成的，但优选象下述参考例2所示的，在作用于中枢神经时，考虑向脑内的扩散效率，以其甲酯作为有效成分制剂化而成的。这些甲酯等在脑内转化成15R-TIC或去氧-TIC等的异卡巴环素衍生物，发挥对神经细胞凋亡的抑制作用。此外，以抑制体细胞的细胞凋亡为目的时，可将15R-TIC或去氧-TIC等的异卡巴环素衍生物作为有效成分进行制剂化。此外，本发明的细胞凋亡抑制剂除了含有这些有效成分外，还可含有其它众所周知的细胞凋亡抑制性物质。
本发明的细胞凋亡抑制剂可以以一般的药物制剂形式给予人或动物，例如可以静脉注射、皮下注射或经口给予人或动物。
本发明的细胞凋亡抑制剂含有5μmol/kg以上浓度的异卡巴环素衍生物作为有效成分，可以和其它成分一起进行制剂化。作为其它成分，例如有药物制备通常所使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、稀释剂、赋形剂等。此外，作为药物的剂型，根据治疗目的可能选择各种形式，作为其代表例如有片剂、丸剂、散剂、液体剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂(液体剂、混悬剂等)等。
例如在调制注射剂时，优选将液体剂、乳剂和混悬剂灭菌且使之和血液等张；作为稀释剂，例如可以用水、乙醇、丙二醇、乙氧化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯缩水山梨糖醇脂肪酸酯类等。还有此时为了调制等张性的溶液，可能含有足够量的食盐、葡萄糖、甘油等，此外也可配合助溶剂、缓冲剂、无痛化剂等。
上述各种形式的药物制剂，还可根据需要加入常用的着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂等，此外还可含有其它的药物有效成分。
下面就实施例对本发明进行更详细和具体的说明，但本发明并不仅限于此。
实施例实施例115R-TIC对高氧培养所诱导的海马神经元细胞凋亡的抑制效果。
(1)实验药品异卡巴环素使用帝人株式会社提供的纯品。
15S-TIC用根据特开平8-245498号公报的实施例2制成的15S-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲卡巴环素甲酯，按同一公报实施例3的方法制得。
15R-TIC按特开平8-245498号公报的实施例3相同方法制得。
(2)方法从妊娠20天的云斯特系(Wistar)大鼠无菌地摘出胎儿，从其脑切取海马部分，将此海马部分用含DL-半胱氨酸(0.2mg/ml)、牛血清白蛋白(0.2mg/ml)、葡萄糖(5mg/ml)、DNAseI(0.01％)和木瓜蛋白酶(9单位/ml)的PBS(无钙、镁)振荡孵育30分钟，分散海马神经元。接着，将神经元细胞按5×105细胞/平方厘米的比率接种入装有DME/F-12培养基(含5％马血清和5％牛胎儿血清)的24孔平板(被覆有聚乙烯亚胺)，于5％二氧化碳的培养箱(9％氧气)中培养两天。在这之后，将培养液换成除去血清的DME/F-12培养基(含5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素和5nM黄体酮)，以5μM的浓度往培养基中加入各待测药品，30分钟后移入50％氧气中。在50％氧气中培养48小时后，测定细胞的存活率。在9％氧气中的神经元也被加入各待测药品，并测定细胞的存活率。
此外，细胞存活率是在用4％多聚甲醛固定细胞后，用抗MAP2抗体染色，以DAB发色，从其200倍照片通过计测MAP2阳性细胞而算出。
(3)结果图1给出了在9％或50％氧气中培养的海马神经元的存活率(加入了50nm的待测药品和5μm的其他样品)。在9％氧气中的存活神经元数目被作为对照值。添加了异卡巴环素和15S-TIC时，和对照组一样，海马神经元因高浓度氧所诱导的细胞凋亡而导致存活率大幅度降低。与此相反，添加了本发明的15R-TIC和脱氧-TIC时，可观察到和众所周知的细胞凋亡抑制物质bFGF一样或更高比率的细胞存活率增加。
图2给出了待测药品对海马神经细胞凋亡的剂量依赖性的效果。在图2中使用9％氧气中的神经元存活率作为对照值，加入了各待测药品的神经元存活率用平均值±S.D.(n＝4)表示。从图2可以看出，异卡巴环素和15S-TIC没有任何神经保护效果(在试验浓度范围内)，而15R-TIC和脱氧-TIC显示出剂量依赖性的神经细胞凋亡抑制效果，浓度为3000nM时的存活率与对照组相当。脱氧-TIC和15R-TIC的IC50值分别为Ca.30nM和300nM。
从以上结果可以看出，作为本发明的细胞凋亡抑制剂有效成分的15R-TIC和脱氧-TIC对机体细胞尤其是神经细胞的细胞凋亡有优良的抑制作用。
实施例2体内实验15R-TIC对蒙古沙土鼠缺血损伤诱导的海马CA1锥体神经元细胞凋亡的作用。
为了检验15R-TIC是否能在体内防止神经元死亡，应用渗透微泵，将15R-TIC连续7天(开始于短暂性缺血前2天，结束于其后5天)灌注入已经过短暂前脑缺血3分钟的沙土鼠的左侧室。通过计数尼氏染色部分细胞体大于10μm的神经元来评价CA1锥体神经元的存活数。
通过给药15R-TIC阻断了前脑缺血诱导的CAI锥体神经元死亡。15R-TIC灌注的沙土鼠的神经元数目(20μm厚的部分为984±299，n＝4)和非缺血组沙土鼠相当(1061±220，n＝4)。而且，溶剂灌注的沙土鼠的CA1锥体神经元数目(142±28，n＝4)显著小于对照组(没有缺血处理)的或15R-TIC灌注的沙土鼠。溶剂灌注沙土鼠的锥体神经元发生进行性的变性，伴随着核退缩和细胞排列的破坏。
这些结果表明15R-TIC在体内起着一个有效的神经元存活促进因子的作用，正如实施例1和2中在体外起的作用。
参考例1根据特愿平9-160320号的实施例1的记载，按下述的化学反应式，制备脱氧-TIC。制备过程如附图3所示。
(1)醛化合物(6)的合成往10ml的skulenk管中装入(三苯基正膦亚基)乙醛(21.8mg，71.6μmol)的苯(1.5ml)溶液，接着加入上述醛化合物(5)(23.0mg，65.3μmol)的苯(1.5ml)溶液，回流20小时。反应混合物冷却后除去溶剂，其残渣用己烷和乙酸乙酯的2∶1及1∶1的混合物进行硅胶层析精制，得到醛化合物(6)(14.8mg，61％)。TLC上的Rf为0.55(己烷/乙酸乙酯＝1∶1)。
(2)碳酸酯化合物(7)的合成往10ml的圆底烧瓶中装入上述醛化合物(6)(7.6mg，20.2μmol)的甲醇(1.0ml)溶液，接着加入CeCl7H2O(10mg，27μmol)和NaBH4(2mg，53μmol)，搅拌5分钟。
在此之后往反应混合物中加入乙酸乙酯和水。用乙酸乙酯作为溶剂进行3次抽提。将有机相合并用MgSO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩。
所得的粗生成物装入10ml的圆底烧瓶中，用CH2Cl2(2.0ml)溶解。往此溶液中加入DMAP(37.0mg，0.303mmol)和氯甲酸甲酯(0.015ml，0.194mmol)，搅拌4小时。然后加入NaHCO3的水溶液，用乙酸乙酯进行抽提。合并有机相用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。用己烷和乙酸乙酯4∶1的混合物进行硅胶层析精制，得到上述的碳酸酯化合物(7)(8.0mg，91％)。TLC上的Rf为0.42(己烷/乙酸乙酯＝2∶1)(3)加成体化合物(9)的合成往20ml的skulenk管中加入三(二苯亚甲基丙酮)-二钯(O)-氯仿加成物(2.1mg，2.0μmol)和1，2-二(二苯基膦基)乙烷(1.6mg，4.0μmol)的THF(1.0ml)溶液。往此溶液中加入上述碳酸酯化合物(7)(8.0mg，18.3μmol)和二砜(7.6mg，19.7μmol)的THF(1.0ml)溶液，搅拌15小时。
将反应混合物注入NH4Cl水溶液中，用乙酸乙酯进行抽提。合并有机相用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩。用己烷和乙酸乙酯的2∶1、1∶1的混合物进行硅胶层析精制，得到目的加成体化合物(9)(9.6mg，70％)。TLC上的Rf为0.27(己烷/乙酸乙酯＝1∶1的混合物)。
(4)化合物(10)15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素甲酯的合成往10ml的圆底烧瓶中加入镁(10mg，0.4mmol)，接着加入上述加成体化合物(9)(7.5mg，10.0μmol)的甲醇(1.5ml)溶液，搅拌3小时。
往反应混合物中加入HCl(1N)水溶液，用乙酸乙酯进行抽提。有机相合并用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩。
将所得的粗生成物装入10ml的圆底烧瓶中，用醋酸和水的9∶1混合物(2.0ml)溶解。搅拌40小时后，加入乙酸乙酯，用NaHCO3水溶液洗净。有机相用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。接着用3∶1的己烷和乙酸乙酯混合物进行硅胶层析精制，得到目的化合物(10)15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素甲酯(2.2mg，58％)。TLC上的Rf为0.6(己烷/乙酸乙酯＝1∶1的混合物)。
(5)化合物(4)15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素的合成往10ml的试管中装入上述化合物(10)(1.0mg，2.6μmol)的甲醇(0.5ml)溶液，加入NaOH水溶液(3N，0.2ml)，在室温下搅拌12小时。添加NaHCO3后加入乙酸乙酯和水。使之pH成3。
分离有机相，水相用乙酸乙酯抽提。合并有机相用MgSO4干燥，过滤，在减压下浓缩。用CH2Cl2和甲醇的10∶1混合物进行SiO2(0.5g)层析精制，得到目的化合物(4)15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素(0.9mg，94％)。TLC上的Rf为0.39(CH2Cl2/甲醇＝9∶1的混合物)。
参考例2用正电子放射图谱法(PET)测定异卡巴环素衍生物向脑内的摄取量。
(1)实验药品11C标记的15R-TIC-甲酯(RTA)按下述参考例方法制得的15R-TIC-甲酯的16-m-甲苯基的甲基碳用11C标记的标记化合物。
11C标记的15R-TIC-甲酯(RTC)按下述参考例方法制得的15R-TIC-甲酯的16-m-甲苯基的甲酯部分的甲基碳用11C标记的标记化合物。
(2)方法对成年弥猴(体重约8kg)将示踪量(不超过0.2μg/kg)的上述实验药品进行静脉注射，对从静注后到60分钟后脑内被测药品的分布情况用PET装置图像化。从此图像计测ROI(region of interest有关区域)值，根据下式算出摄取量。
(3)结果图4(A)表示各标记化合物在全脑的摄取量，图4(B)表示丘脑的摄取量。RTA和RTC显示出相同的血脑屏障通过率(图4A和B)，但是RTA在脑内的保留时间比RTC长，表明去酯化的11C标记15R-TIC在脑内的保留。换言之，RTA可以作为15R-TIC的前药。从此结果可以确定，全身给予的15R-TIC-甲酯高效地转移到脑内。而且，此标记化合物在给药60分钟后还滞留于脑内，说明15R-TIC-甲酯(15R-TIC的前体)在脑内转化成15R-TIC和前列腺环素受体结合，在脑内发挥其细胞凋亡抑制作用。
从以上详细说明可看出，本发明提供了以可以用化学合成方法简便且便宜地制备的化合物为有效成分的新型细胞凋亡抑制剂。PET等研究表明，作为此药剂有效成分的异卡巴环素衍生物能通过血脑屏障作用于中枢神经系统，因此对于神经细胞细胞凋亡引起的各种疾病的治疗有效。
权利要求
1.以下述式(1)所示的15R-异卡巴环素衍生物为有效成分的细胞凋亡抑制剂， 式中R1表示碳数1～6的烃链，R2表示氢原子或保护基团。
2.根据权利要求1的细胞凋亡抑制剂，其中15R-异卡巴环素衍生物为下述式(2) 所示的15R-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲酯。
3.以下述式(3)所示的15-去氧-异卡巴环素衍生物为有效成分的细胞凋亡抑制剂， 式中R1表示碳数1～6的烃链，R2表示氢原子或保护基团。
4.根据权利要求3的细胞凋亡抑制剂，其中15-去氧-异卡巴环素衍生物为下述式(4) 所示的15-去氧-16-m-甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲酯。
全文摘要
提供以可以用化学合成方法简便且便宜地制备的15R－异卡巴环素衍生物或15－去氧－异卡巴环素衍生物为有效成分的细胞凋亡抑制剂。
文档编号A61P25/00GK1807393SQ200510091779
公开日2006年7月26日 申请日期1998年10月20日 优先权日1997年10月21日
发明者渡边恭良, 铃木正昭, 渡边由美子, 羽里笃夫, 佐藤拓巳 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 羽里笃夫